Abstract
Visualização de eventos de sinalização dinâmicos em células vivas tem sido um desafio. Nós expandido um sistema de expressão transiente estabelecida, a complementação fluorescente (BiFC) biomolecular ensaio em células epidérmicas de tabaco, a partir de testes de interacção proteína-proteína para controlo da distribuição espacial da transdução de sinal em células de plantas. Neste protocolo, foi utilizado o ensaio BiFC para demonstrar que a interacção e a sinalização entre a Arabidopsis MAPKKK Yoda e MAPK6 ocorrem na membrana plasmática. Quando o basl proteínas scaffold foi co-expressa, a interação YODA-MAPK redistribuído e espacialmente co-polarizado com o CFP-basl. Este sistema de expressão modificado tabaco permite a análise rápida de sinalização de localização e dinâmicas mudanças (menos do que 4 dias) e pode acomodar várias cores de proteína fluorescente (pelo menos três). Também apresentamos métodos detalhados para quantificar a distribuição de proteínas (localização espacial assimétrica, ou "polarização";) Nas células do tabaco. Este sistema de expressão de tabaco avançado tem um potencial a ser amplamente utilizado para o teste rápido de eventos de sinalização dinâmicos em células de plantas vivas.
Introduction
As proteínas interagem dentro de uma intrincada rede e complexos de forma hierárquica, que desempenham um papel fundamental em quase todos os processos biológicos que ocorrem num ambiente celular imprevisível. No entanto, desde o desenvolvimento de respostas de crescimento da planta, tem havido uma falta de ferramentas conveniente que não só pode rapidamente mas também identificam eficientemente e monitorizar esses eventos de sinalização dinâmica ao nível subcelular.
O sistema de expressão de proteína transiente na epiderme da folha de tabaco tem vantagens atraentes para a visualização de proteínas fluorescentes em células vivas. Este sistema proporciona semi condições in vivo que permitem a modificação de proteínas pós-translacional e rápido exame de localização de proteínas. Ao examinar o sinal de YFP complementadas, o ensaio de complementação bimolecular fluorescente (BiFC) informa a possibilidade de interacção proteína-proteína em células de plantas. Em comparação com outros métodos, como por exemplo, a levedura de dois híbridos (y2h) e co-immunoprecipitation (Co-PI), BiFC também fornece um meio poderoso de visualizar compartimentos onde as interações proteína-proteína podem ocorrer ao nível subcelular.
Uma vez que a divisão celular assimétrica (ACD) mantém a população de células estaminais ao gerar novos tipos de células para a formação de tecido / órgão, é um mecanismo indispensável para promover multicelularidade eucariótica. Estomática desenvolvimento de Arabidopsis foi usado como um sistema modelo para o estudo em plantas ACD. A célula precursora, célula mãe meristemoid, divide assimetricamente para produzir duas células-filhas diferentes, um meristemoid (passa-tronco divisões celulares-like antes de terminar em um par de células-guarda) e uma célula estomática linhagem solo (SLGC) (pode dividir e diferenciar em uma célula pavimento), respectivamente (Figura 1). Em ACD estomática, o romance quebra de proteína de assimetria na Lineage estomática (basl) é polarizada premitotically para conduzir assimetrias divisão, que incassimetria física lude e destino celular assimetria 1. Uma cascata MAPK composto pelo MAPKKK Yoda e as MAPKs, MPK3 e 6, são fundamentais para padronização divisão estomática e adoção destino 2,3, 4,5.
Recentemente, Zhang et al. ligada a basl proteína polaridade para a via de sinalização YDA-MAPK em Arabidopsis stomatal ACD 6. O canônica via YODA-MAPK, através MPK3 / 6, fosforila basl e ativa a sua polarização. Fosforilados funções basl como um andaime e recruta YODA (YDA) e MPK3 / 6 para formar um complexo de proteína e concentrar a sinalização no córtex de 6 células. Polarização dos componentes MAPK e o ciclo de feedback positivo entre basl ea via YDA-MAPK representa um novo mecanismo para a polarização de proteínas em células vegetais. Sinalização MAPK localmente enriquecido é a hipótese de estar intimamente ligado à diferenciação destino celular no stomatal ACD 6 (Figura 1). Um dos kEY dados experimentais que este modelo suportado veio a partir dos ensaios de tabaco que demonstraram a redistribuição espacial das MAPKs induzida pela expressão de basl 6.
Em geral, não é fácil de monitorizar a sinalização MAPK, onde ocorre porque as moléculas de MAPK foram frequentemente encontrados em toda a parte no interior de uma célula. Neste estudo, utilizou-se o sistema split-YFP para visualizar a interacção entre a cinase a montante e a jusante os sugerir onde ocorre o relé de sinalização. Nós estendido ainda mais a utilização do sistema BiFC por co-expressão de uma terceira proteína (PCP-tag), com a divisão par YFP (sugestivo de interacção proteína-proteína) para visualizar se e como a YFP complementada podiam ser espacialmente modulado pela co- expressa a proteína PCP. Ao fazer isso, nós demonstramos que a co-expressão de CFP-basl induzida reorganização espacial das interações entre YDA e MPK6, a partir de uma distribuição uniforme para padronização polarizada no córtex célula da epiderme tabacocélulas al. Por conseguinte, este sistema tem o potencial de ser desenvolvido para monitorar eventos de sinalização dinâmica em células vegetais sob condições em que as células são desafiadas pelos estímulos internos ou externos (por exemplo, a co-expressão de outras proteínas, a aplicação química, ataque de agentes patogénicos ou alterações ambientais, etc. ).
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Protocol
1. O plasmídeo Construção
- Gerar as construções por tecnologia de clonagem como descrito anteriormente 1,6.
- Em primeiro lugar utilizar uma polimerase DNA de alta fidelidade com iniciadores adequados para amplificar as sequências de codificação de basl, YDA e MPK6 e sub-clonar-los em vectores de entrada. Encontre o protocolo detalhado no 7.
- Para gerar as versões negativos dominantes de MPK6 e YDA (DNmpk6 8 e DNyda 4, respectivamente), utilizar os plasmídeos de entrada e MPK6 YDA como molde e introduzir as mutações pontuais por um método de mutagénese dirigida ao local 9.
- Para construir as construções para ensaios transientes de tabaco, realizar reações LR standard (attL x attR recombinação) (procedimento detalhado no 7) para integrar basl em pH35CG 10, DNyda e DNmpk6 em pXNGW e pXCGW vetores 11, respectivamente.
- Confirmar os plasmídeos resultantes de digestão enzimática e sequenciamento. Uma vez que éuccessful, transformar as construções binários na estirpe de Agrobacterium tumefaciens GV3101 12 e fazê-los crescer em placas de selecção a 28 ° C durante 2 - 3 dias.
2. Preparação da solução de Agrobacterium Infiltração
- Inocular algumas colónias Agrobacterium recém-transformadas em 10 ml de meio com antibióticos apropriados de Luria-Bertani (LB) (Gentamicina 25 ug / ml, A rifamicina 25 ug / ml, espectinomicina 100 ug / ml para pH35CG, pXNGW e pXCGW constrói; as mesmas concentrações a rifamicina de gentamicina e canamicina com 50 ug / ml para P19 (que expressa proteínas contra o silenciamento transgénico) 13.
- Crescer culturas de Agrobacterium em um agitador de 28 ° C à velocidade de 200 rpm durante cerca de 16 horas e, em seguida, medir a OD 600 (estimado para alcançar 1,5-1,8) (Figura 2A-B). Girar as culturas a 2500 xg durante 10 min. Re-suspender e wash as peletes de células com 10 mM de MgCl 2 (a solução de infiltração).
- Girar as culturas novamente e re-suspender as pelotas com a quantidade apropriada de solução de infiltração para alcançar o DO final 600 = 0,5 (Figura 2C-D). Antes de se infiltrar plantas, deixar as misturas de células à temperatura ambiente durante 1-3 h. Este passo ajuda a manter a homeostase celular.
3. Tobacco Plant and Injection Folha
- Use plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana), cultivadas 4-5 semanas de idade em uma câmara de crescimento da planta normal (23 ° C com ciclos de 16 horas-luz / 8 h escuro) 14 para injeção de folha.
Nota: Nesta fase, as plantas de tabaco normalmente têm 6 folhas (2 grandes, 2 médias e 2 pequenos). As duas folhas de tamanho médio são os mais ideal para injecção folha (os dois maiores são muito antigas, enquanto os dois pequenos são muitas vezes demasiado jovens). - Antes que o dia de infiltração, regar o TobacAs instalações de co para saturar o solo.
- No dia infiltração, pré-incubar as plantas no escuro, durante 1-3 h. Este passo permite estomas na epiderme para abrir amplamente, o que facilita muito o Agrobacterium ao penetrar nas células da epiderme da folha.
- Usando fitas de cores marcadas com datas, bandeira das folhas para ser infiltrada. Marque as áreas a serem infiltradas com um sharpie grosso preto (opcional; as áreas infiltradas são visíveis depois de ser infectado.).
- Tome volumes iguais da Agrobacterium re-suspensão e misturá-los em um 100 x 15 mm placa de Petri por agitação suave (Figura 2E). Nota: No nosso caso, misturou-se 1 ml de p19 com 1 ml de PFR-basl, 1 ml de DNyda-NYFP e 1 ml de DNmpk-cYFP.
- No processo de infiltração, encher uma seringa sem agulha de 3 ml com a mistura de infiltração (1 - 2 mL) e empurrar para o lado inferior (abaxial) da folha de tabaco (Figura 2F). Enquanto infiltrante, é útilde usar uma mão para empurrar e o outro lado para suportar suavemente o lado superior (adaxial, contra a força de impulsão).
Nota: Uma vez que a mistura de infiltração é injetado com sucesso, as áreas infectadas se tornará facilmente reconhecível na epiderme. No entanto, a infiltração pode falhar devido à injeção dura (danos nos tecidos) ou de pressão insuficiente (sem penetração de líquidos). Para cada teste, sugerimos pelo menos duas injeções em duas folhas independentes (a partir de plantas diferentes). - Coloque as plantas infectadas de volta para a câmara de crescimento. Geralmente, as expressões proteína são detectáveis depois de 48 horas a seguir a infiltração.
4. Imagem Confocal
- Em 48 horas após a infiltração, use um furador para excisar um disco de folha da área injetada (normalmente 3 - 4 discos / área pode ser produzido) (Figura 2G). Use uma pinça para transferir suavemente os discos de folhas para um slide (o lado abaxial para cima) e montá-los com gotas de água. Evite pressionar muito hard na lamela porque espremido células / danificados não mostrará bem sob o microscópio confocal (Figura 2H).
- Antes de imagem confocal, a varredura das amostras montado em um microscópio composto epi-fluorescente para verificar os níveis de expressão. Nota: Com base em nossa experiência, as células que apresentam níveis de expressão intermédias são melhor representadas sob o microscópio confocal.
- Comece com o (1,3 NA) na lente de 40X de um microscópio confocal. Ajustar a corrediça para a posição desejada de modo a que as células que expressam níveis médios de proteína fluorescente permanecer no centro. Os espectros de excitação / emissão para PCP e YFP estão 458 nm / 480-500 nm e 514 nm / 520-540 nm, respectivamente.
- Ativar o botão "Live" para pré-visualizar as imagens, em seguida, ajustar a intensidade do laser e ganho inteligente para o rácio de intensidade de fluorescência / ruído mais equilibrada. Para melhorar a qualidade de imagem, aumentar pixels de digitalização e / ou média frame / linha. Finalmente, ajuste o botão de focagem para reach o plano focal mediana e clique em "Capture" para tomar a imagem.
Nota: O PCP e imagens YFP pode ser capturada sequencialmente ou simultaneamente, verificando ou desligar a opção de modo de digitalização "sequencial", respectivamente. - Quando Z-projeção é desejado para a visão em profundidade das células, selecione o modo de imagem "xyz", define a profundidade da gama de varredura (10 - 15 mm) e recolher as imagens a partir do topo para o fundo da célula alvo . Compilar as imagens obtidas com o software Leica com o botão direito no arquivo de imagem para selecionar "Renomear" e exportar imagens como arquivos .tiff.
- Imagem 30 - 40 células para análise de quantificação.
Processamento 5. Imagem e Análise de Quantificação
- Use um software de Fiji (http://fiji.sc/Fiji) para processar imagens e realizar a quantificação.
- Plotar os gráficos de intensidade de fluorescência.
- Para visualizar melhor se a expressão CFP / YFP éuniformemente distribuída, use Fiji para demonstrar a força do sinal da PCP e YFP ao longo da periferia da célula. Para conseguir isso, primeiro lançamento de Fiji, em seguida, selecione "Arquivo" e "Abrir" para iniciar a imagem. Clique em "linha" no menu de ferramentas e selecione "linha segmentada" clicando com o botão direito. Decidir a região de interesse e desenhar uma linha ao longo da periferia celular para rastrear o PCP ou o sinal YFP (Figura 3A-C).
Nota: Fiji mede o valor da intensidade de fluorescência absoluta ao longo das linhas segmentadas. - Selecione o menu drop-down "Analisar" e "Perfil Plot" para gerar um gráfico com valores de posição e intensidade que representam os níveis de CFP / YFP ao longo da linha segmentada. Se desejar, duplicar os valores de intensidade (selecionando o menu "Copiar") para o Excel ou outro software gráfico para gerar gráficos de intensidade comparáveis.
- Para visualizar melhor se a expressão CFP / YFP éuniformemente distribuída, use Fiji para demonstrar a força do sinal da PCP e YFP ao longo da periferia da célula. Para conseguir isso, primeiro lançamento de Fiji, em seguida, selecione "Arquivo" e "Abrir" para iniciar a imagem. Clique em "linha" no menu de ferramentas e selecione "linha segmentada" clicando com o botão direito. Decidir a região de interesse e desenhar uma linha ao longo da periferia celular para rastrear o PCP ou o sinal YFP (Figura 3A-C).
- Quantificar grau de polaridade.
- Recolha aproximadamente 20 represencélulas tivos a partir de 3 experiências duplicadas para avaliar o grau de polaridade do PCP e YFP em células de tabaco. Calcular o grau de polaridade com base na proporção da intensidade de fluorescência elevada (definido como H) através da intensidade de fluorescência baixa (definido como L). Nota: O método de quantificação é explicado na Figura 3.
- Para medir os valores de H e L, desenhe uma linha segmentada ao longo da região interessados na periferia da célula (descrito acima), clique em "Analisar" no menu drop-down e selecione "Measure". Quando um "Resultados" janela aparece, use "Mean" valores para executar quantificação.
- A partir das células que exibem expressão relativamente uniforme de PCP e YFP, por exemplo, CFP-basl (Figura 3A) ou da YFP complementadas com co-expressão de DNyda-NYFP e DNmpk6-cYFP (Figura 3B), obter os valores de H e L medindo dois selecionados aleatoriamente segmentos periféricos com igual duração. <li> a partir de células que exibem acumulação polar óbvia de proteínas fluorescentes, neste caso, a co-expressão de PCP-basl, DNyda-NYFP e DNmpk6-cYFP (Figura 3C), recolher os valores de H a partir das regiões periféricas com sinais de fluorescência enriquecidos e os Ls das regiões com baixo nenhuma acumulação / fluorescência.
- Reúnem-se os índices resultantes de H / L de 20 células juntos e teste para a distribuição normal. Calcule os valores de p pelo teste t de Student (para distribuição normal) ou o teste de Kolmogorov-Smirnov (KS) (para distribuição não normal).
- Recolha aproximadamente 20 represencélulas tivos a partir de 3 experiências duplicadas para avaliar o grau de polaridade do PCP e YFP em células de tabaco. Calcular o grau de polaridade com base na proporção da intensidade de fluorescência elevada (definido como H) através da intensidade de fluorescência baixa (definido como L). Nota: O método de quantificação é explicado na Figura 3.
- Plotar os gráficos de intensidade de fluorescência.
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Representative Results
Para evitar a morte celular induzida pela sinalização MAPK hiperactivo, as versões inactivos cinase de YDA (DNyda) e MPK6 (DNmpk6) foram usadas no ensaio de co-expressão em células de tabaco. Nem a interação entre DNyda e DNmpk6 revelado por BiFC nem a própria gerado padrão de distribuição desigual (Figura 3A-B) CFP-basl. No entanto, quando PCP-basl foi introduzido no par interacção DNyda-DNmpk6, tanto PCP e sinais YFP foram redistribuídas para uma forma altamente polarizada (Figura 3C). Isto sugere que a redistribuição basl interage com YDA e MPK6 espacialmente para reorganizar a via de sinalização MAPK em células vegetais. O estado de fosforilação de basl tem impactos diferenciados sobre o grau de polaridade da sinalização MAPK: uma versão de imitando fosfo de basl gerado muito forte polaridade, enquanto uma versão fosfo-deficiente mostraram atividade mais fraca 6. Estes dados apoiaram nosso modelo de trabalho de um regulação feedback positivo entre basl ea via YDA-MAPK na geração de polaridade celular 6.
Figura 1. Diagrama do Complexo Polaridade basl-YDA-MPK6 Durante estomática celular assimétrica Division (ACD) em Arabidopsis. Na epiderme da folha, da linhagem dos estômatos inicia a partir das células protodérmicas, que se expandem para se tornarem células precursoras ACD, as células Meristemoid mãe (MMCs). Um MMC sofre uma ACD para criar um Meristemoid e um SLGC (célula estomática linhagem chão), o qual pode, eventualmente, se dividem e se diferenciam em células guarda e células estomatais pavimento, respectivamente. No córtex celular das células precursoras ACD (MMCs), basl recruta dois componentes de uma via de MAPK, o MAPKKK YDA e a MAPK MPK6, para formar um complexo de polaridade e regular estomática ACD.om / files / ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Diagrama do procedimento de injeção em Tobacco Epiderme de folha. (A) Transformar os plasmídeos contendo CFP-basl, DNyda-NYFP, DNmpk6-cYFP e P19 em Agrobacterium tumefaciens GV3101 e cultivá-las nas respectivas placas de selecção (de cima para baixo na UMA). (B) Pegar colónias a partir de (A) para inocular cultura líquida para o crescimento durante a noite. Células (C) Colheita por fiação e decantar o sobrenadante. Depois de pipetagem brevemente e lavar as pelotas, girar as células novamente. (D) Re-suspender e dilui-se os sedimentos celulares com a solução de infiltração (ver o protocolo) para atingir o DO final 600 = 0,5. (E) Misture suavemente thcélulas e re-suspenso em uma placa de Petri. (F) utilizar uma seringa sem agulha para empurrar a mistura de infiltração para o lado abaxial da folha de tabaco. (G) entre cerca de 48 h após a infiltração, as folhas estão prontos para imagiologia confocal. discos de folha especial de consumo contendo células infectadas com um furador torno da região de infiltração. círculos tracejadas indicam excisadas discos de licença. (H) Use água para montar os discos de folhas sobre uma lâmina padrão para a imagem confocal. Os diagramas de caixa na área sombreada descrever as proteínas injetadas em folhas de tabaco para o ensaio de polarização. Tamanhos de proteína não estão em escala. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Visualização e Quantificação de Formação Polaridade. (AC) confocal para mostrar PCP e YFP fluorescência nas células epidérmicas de tabaco. Ciano indica a expressão da PCP. O amarelo indica a expressão da YFP. (A) A superexpressão do sozinha CFP-basl. (B) Co-expressão de DNyda-NYFP e DNmpk6-cYFP. A expressão YFP é complementado quando duas proteínas interagem. (C) Co-expressão de CFP-basl, DNyda-NYFP e DNmpk6-cYFP. distribuição desigual (polaridade) é evidente tanto para PCP e YFP. Barra de escala = 50 um de (CA). (DF) traçando graficamente a intensidade da fluorescência PCP / YFP ao longo das linhas tracejadas (Magenta) em (AC). triângulos magenta marcar o ponto de início e fim das regiões utilizado para trama de intensidade. Quantificações do grau de polaridade em células de tabaco são apresentados abaixo. Os valores de intensidade de fluorescência (H em alta e L para baixo) são medidos e coletados por Fiji das regiões traçadas com da vermelhoderramado linhas (AC). Para cada amostra, os valores de 20 células são médias calculadas para o teste de significância. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Uso geral e possíveis modificações do sistema de expressão transiente de tabaco para transdução do sinal: A sobre-expressão da proteína fluorescente (FP) tagged proteínas na epiderme do tabaco tem sido usado com sucesso para a análise rápida de proteína de localização subcelular em células vegetais. No entanto, o estudo de distribuição de sinalização dinâmica do complexo proteína in planta é um tema difícil, devido aos contextos subcelulares complicado, interacção proteína-proteína transiente e eventos de transdução de sinal. Para enfrentar esse desafio, tiramos vantagem do sistema BiFC para examinar eventos de sinalização MAPK. Por co-expressando YDA-NYFP e MPK6-cYFP, o sinal de YFP recuperada indicou que a activação do relé de sinalização MAPK pode ocorrer na membrana plasmática.
Seria ideal para co-Express fluorescente etiquetado YDA e MPK6 em Arabidopsis e examinar a sinalização MAPK dinâmica in vivo. No entanto, a GEnerating plantas transgénicas é demorado, particularmente quando mais do que um construções é desejada. A proteína de expressão transiente em células de tabaco pode ser um teste preliminar rápida para a expressão in vivo em Arabidopsis ou de outras plantas. A outra vantagem de que o sistema de expressão transiente de tabaco oferece, mas não pode ser facilmente alcançado através da geração de plantas transgénicas, é que as proteínas de até 4 ou 5 de fusão podem ser co-expressos em simultâneo e examinadas por microscopia confocal, quando a combinação é realizável.
Usando células epidérmicas de tabaco para investigar sinalização MAPK em células de plantas podem ser adicionalmente aplicado para outras vias de sinalização e sob diferentes condições ambientais. Por exemplo, se a interacção de YDA-MAPK alterar a sua intensidade ou localização quando a célula que expressa é tratada com H 2 O local de aplicação 2 (um estímulo de sinalização MAPK)? Tais ensaios podem ser rapidamente concebida e realizada para tratar a especificaçãoperguntas ific. existem vários membros em cada camada das cassetes MAPK (3 - 4 níveis em geral), mas como especificidade sinalização é atingido em plantas ou outros sistemas permanecem largamente desconhecidos. Fazendo diferentes combinações das MAPKKKs com MAPKKs, ou MAPKKs com MAPKs, o sistema de expressão transiente de tabaco permite uma análise relativamente grande escala de não só a interacção proteína-proteína, mas também a organização espacial do fluxo de sinalização em células vegetais.
Personalizado Co-expressão e BiFC Ensaio para a Investigação de Polarização Proteína: Uma questão fundamental de longa data em biologia celular é como vias de sinalização universal, por exemplo, MAPKs, alcançar a sua especificidade em determinado estágio de desenvolvimento ou sob determinadas condições ambientais. Que co-expressam a proteína basl polaridade com os componentes de BIFC YDA e MPK6 em células de tabaco nos permitiu demonstrar que a interacção YDA-MAPK e de sinalização é espacialmente re-distributed pela presença de basl, uma polaridade proteínas específicas durante ACD estomática. Por conseguinte, a especificidade de sinalização MAPK-YDA pode ser conseguida através da interacção com basl para promover a polaridade celular e divisão assimétrica.
Embora não seja um fenômeno universal, algumas proteínas bastante foram encontrados para ser distribuídos de forma desigual nas células vegetais, por exemplo, pequena GTPase ROPs 15, proteínas auxina effluxer PIN 16 e seus reguladores 17, transportadores de boro 18 e algumas proteínas desconhecidas (Octopus 19 , POLAR 20, e BRX 21). Este protocolo não foi destinado para pesquisar os parceiros genéticas ou físicas numa via de polarização proteína particular, mas será provavelmente útil para testar se as proteínas que interagem com ROPs, PINs ou outros, podem formar um complexo de polaridade em células vegetais. No entanto, ao tentar simular um evento de polarização usando células de tabaco, deve-se ter em mente que complicaçõespode ocorrer nos ensaios. Por exemplo, o evento de Arabidopsis polarização não pode ser recapitulado em células de tabaco, em especial quando são necessários mais componentes do que o que pode ser acomodado no ensaio. Algumas moléculas desconhecidos derivados do fundo do tabaco, mas não necessariamente as proteínas sujeitas a exame, podem estar envolvidos na indução de um evento de polarização. Portanto, é essencial para configurar experimentos de controle rigoroso do tabaco e para validar os dados em Arabidopsis ou outras plantas.
Elementos-chave para ter sucesso no Experiments: Em primeiro lugar, as plantas de tabaco esverdeados e saudáveis devem ser usados. Desde quantificação analisa precisa reunir dados de várias células, é crucial para usar prosperando plantas de tabaco com células consistentemente saudáveis. Em segundo lugar, as células que expressam níveis de proteína meio deve ser usado para imagiologia confocal. baixos níveis de expressão não pode fornecer proteínas suficientes para o ensaio e expressão saturada levels se mascarar o efeito de polarização / translocação.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
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