Abstract
وكانت تصور الأحداث الإشارات الحيوية في الخلايا الحية تحديا. قمنا بتوسيع نظام التعبير عابرة المعمول بها، والجزيئية البيولوجية تكامل فلوري (BiFC) الفحص في خلايا البشرة التبغ، من التفاعل اختبار البروتين البروتين لمراقبة التوزيع المكاني لنقل الإشارة في الخلايا النباتية. في هذا البروتوكول، ونحن استخدام فحص BiFC لإظهار أن التفاعل والإشارات بين نبات الأرابيدوبسيس MAPKKK يودا وMAPK6 تحدث في غشاء البلازما. عندما كان يشارك في اعرب عن بعسل بروتين سقالة، والتفاعل يودا-MAPK توزيعها مكانيا وشارك الاستقطاب مع CFP-بعسل. يسمح هذا النظام التعبير التبغ المعدلة للفحص السريع للإشارات توطين ودينامية التغيرات (أقل من 4 أيام) ويمكن أن تستوعب متعددة الألوان بروتين فلوري (ثلاثة على الأقل). قدمنا أيضا طرق مفصلة لتحديد توزيع البروتين (توطين المكاني غير المتماثلة، أو "الاستقطاب"؛) في الخلايا التبغ. هذا النظام التعبير التبغ متقدمة لديه القدرة على أن تستخدم على نطاق واسع لاختبار سريع للأحداث الإشارات الحيوية في الخلايا النباتية الحية.
Introduction
تتفاعل البروتينات داخل المجمعات شبكة وشكل هرمي المعقدة التي تلعب دورا محوريا في العمليات الحيوية كلها تقريبا التي تحدث في بيئة الخلوية لا يمكن التنبؤ بها. ومع ذلك، من تطوير المصنع لاستجابات النمو، فقد كان هناك نقص في أدوات ملائمة من لا يمكن بسرعة فحسب، بل أيضا في تحديد كفاءة ورصد هذه الأحداث يشير إلى ديناميكية على مستوى التحت خلوية.
نظام بروتين تعبير عابر في البشرة أوراق التبغ وجذابة المزايا لتصور البروتينات الفلورية في الخلايا الحية. ويوفر هذا النظام شبه في الجسم الحي الظروف التي تسمح تعديل البروتين ما بعد متعدية والفحص السريع للتوطين البروتين. عن طريق فحص إشارة YFP تستكمل، وتكامل فلوري (BiFC) الفحص ثنائي الجزيء بإعلام إمكانية التفاعل البروتين البروتين في الخلايا النباتية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، على سبيل المثال، الخميرة اثنين الهجين (Y2H) وشارك-immunoprecipitation (المشارك IP)، ويوفر BiFC أيضا وسيلة قوية للتصور مقصورات حيث قد تحدث تفاعلات البروتين البروتين على مستوى التحت خلوية.
بسبب انقسام الخلايا غير المتماثلة (ACD) يحافظ على وقف سكان الخلية أثناء إنشاء أنواع الخلايا الجديدة لتشكيل نسيج / الجهاز، وهو آلية لا غنى عنها لتعزيز multicellularity حقيقية النواة. وقد استخدمت تنمية نبات الأرابيدوبسيس الثغور كنظام نموذج لدراسة ACD في النباتات. الخلية السلائف، الخلية الأم meristemoid، يقسم غير متماثلة لإنتاج خليتين ابنة مختلفة، وmeristemoid (يخضع لوقف الانقسامات تشبه الخلايا قبل إنهاء في زوج من خلايا الحرس) وخلية الثغور النسب الأرض (SLGC) (قد الانقسام والتمايز إلى خلية الرصيف)، على التوالي (الشكل 1). في خلايا الثغور ACD، والاستقطاب في كسر رواية البروتين من عدم التماثل في النسب الثغور (بعسل) premitotically لدفع التماثل الانقسام، الذي المؤتمر الوطني العراقيعدم التكافؤ المادي lude ومصير خلية التباين 1. وتبدأ عملية متسلسلة MAPK تتألف من MAPKKK يودا وMAPKs، MPK3 و 6 هي المركزية لالزخرفة قسم الثغور واعتماد مصير 2،3، 4،5.
في الآونة الأخيرة، وتشانغ وآخرون. ربط بعسل البروتين القطبية إلى مسار الإشارات YDA-MAPK في نبات الأرابيدوبسيس خلايا الثغور ACD 6. الكنسي يودا-MAPK الطريق، من خلال MPK3 / 6، phosphorylates بعسل وينشط الاستقطاب. وظائف بعسل فسفرته كما سقالة ويجند يودا (YDA) وMPK3 / 6 لتشكيل مجمع البروتين ويركز الإشارات في الخلية قشرة 6. الاستقطاب من المكونات MAPK وحلقة التغذية المرتدة الإيجابية بين بعسل ومسار YDA-MAPK يمثل آلية جديدة لاستقطاب البروتين في الخلايا النباتية. وافترض المخصب محليا مما يشير الى MAPK أن تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا التمايز مصير خلية في خلايا الثغور ACD 6 (الشكل 1). واحدة من كإرنست و يونغ البيانات التجريبية التي دعمت هذا النموذج جاء من المقايسات التبغ التي أظهرت إعادة توزيع المكاني للMAPKs الناجم عن التعبير عن بعسل 6.
بشكل عام، فإنه ليس من السهل لمراقبة حيث تحدث MAPK إشارات لأن جزيئات MAPK وكثيرا ما وجدت في كل مكان داخل الخلية. في هذه الدراسة، ونحن الاستفادة من نظام تقسيم YFP لتصور التفاعل بين كيناز المنبع والمصب منها تشير إلى مكان حدوث تتابع الإشارات. مددنا كذلك استخدام نظام BiFC عن طريق المشاركة في التعبير عن بروتين الثالث (CFP الموسومة) مع انقسام YFP الزوج (موحية للتفاعل البروتين البروتين) لتصور ما إذا كانت وكيف YFP تستكمل يمكن التضمين مكانيا من قبل المشارك وأعرب البروتين CFP. وبذلك، أثبتنا أن شارك في التعبير عن الحراجية المعتمدة بعسل الناجم عن إعادة تنظيم المكاني للالتفاعلات بين جمعية تنمية الشباب وMPK6، حتى من توزيعها على الزخرفة الاستقطاب في القشرة خلية من epiderm التبغخلايا تنظيم. ولهذا النظام لديه القدرة على أن تكون المتقدمة لرصد الأحداث إشارات حيوية في خلايا النبات تحت ظروف عندما تحدى الخلايا عن طريق المحفزات الداخلية أو الخارجية (على سبيل المثال، وشارك في التعبير عن البروتينات الأخرى، تطبيق الكيميائية، مهاجمة مسببات الأمراض أو التغيرات البيئية وغيرها. ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. البلازميد البناء
- توليد بنيات بواسطة تكنولوجيا الاستنساخ كما هو موضح سابقا 1،6.
- أول استخدام البلمرة DNA عالية الدقة مع الاشعال المناسبة لتضخيم متواليات ترميز بعسل، جمعية تنمية الشباب وMPK6 ودون استنساخ لهم في ناقلات دخول. العثور على بروتوكول مفصلة في 7.
- لتوليد إصدارات السلبية السائدة في MPK6 وجمعية تنمية الشباب (DNmpk6 8 و DNyda 4 على التوالي)، استخدام البلازميدات دخول MPK6 وYDA كقالب وإدخال الطفرات نقطة بطريقة الطفرات موقع الموجه 9.
- لبناء بنيات لفحوصات عابرة التبغ، وإجراء LR القياسية (attL س ATTR إعادة التركيب) ردود الفعل (إجراءات مفصلة في 7) لدمج بعسل إلى pH35CG 10، DNyda وDNmpk6 إلى pXNGW وpXCGW ناقلات 11، على التوالي.
- تأكيد البلازميدات الناتجة بواسطة انزيم الهضم والتسلسل. مرة واحدة قuccessful، تحويل بنيات الثنائية في الأجرعية المورمة سلالة GV3101 12 وتنمو لهم على لوحات مختارة عند 28 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
2. إعداد الحل الأجرعية تسلل
- تطعيم عدد قليل من المستعمرات الأجرعية تحولت حديثا إلى 10 مل من المتوسط مع المضادات الحيوية المناسبة لوريا، Bertani (LB) (جنتاميسين 25 ميكروغرام / مل، ريفاميسن 25 ميكروغرام / مل، سبيكتينومايسين 100 ميكروغرام / مل لpH35CG، pXNGW وpXCGW يبني، ونفس تركيزات من الجنتاميسين وريفاميسن مع كانامايسين 50 ميكروغرام / مل لP19 (التعبير عن البروتينات ضد إسكات المعدلة وراثيا) 13.
- تنمو الثقافات الأجرعية في 28 درجة مئوية شاكر بسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة ومن ثم قياس OD 600 (يتوقع أن يصل إلى 1،5-1،8) (الشكل 2A-B). تدور باستمرار الثقافات في 2500 x ج لمدة 10 دقيقة. اعادة تعليق وواSH الكريات الخلايا مع 10 ملم من MgCl 2 (الحل تسلل).
- تدور باستمرار الثقافات مرة أخرى واعادة تعليق الكريات مع كمية مناسبة من الحل تسلل للوصول الى OD النهائي 600 = 0.5 (الشكل 2C-D). قبل التسلل النباتات، وترك المزيج من الخلايا في درجة حرارة الغرفة ل1-3 ساعة. هذه الخطوة تساعد على الحفاظ على التوازن الخلية.
3. التبغ نبات ورقة حقن
- استخدام نباتات التبغ (النيكوتين benthamiana)، ونمت 4 - القديم أسابيع 5 في غرفة نمو النبات القياسية (23 درجة مئوية مع دورات 16 ساعة الضوء / 8 ساعات الظلام) 14 للحقن ورقة.
ملاحظة: في هذه المرحلة، نباتات التبغ وعادة ما يكون 6 أوراق (2 كبير، 2 متوسطة، و 2 صغيرة). واثنين من يترك المتوسطة الحجم هي الاكثر الأمثل للحقن ورقة (وهما الكبيرة هي قديمة جدا، في حين أن اثنين من الشركات الصغيرة غالبا ما تكون صغيرة جدا). - قبل يوم تسلل، يسقي tobacمحطات شارك إلى تشبع التربة.
- في اليوم تسلل، قبل احتضان النباتات في الظلام لمدة 1-3 ساعة. هذه الخطوة تسمح الثغور في البشرة لفتح على نطاق واسع، مما يسهل كثيرا من الأجرعية عند اختراق في خلايا ورقة البشرة.
- باستخدام الأشرطة اللون المسمى مع التمر والعلم الأوراق مخترقة. كافة المجالات التي سيتم تسلل مع sharpie سميك أسود (اختياري، والمناطق تسلل واضحة بعد إصابتها.).
- أخذ كميات متساوية من الأجرعية اعادة تعليق ومزجها في 100 × 15 ملم طبق بيتري من قبل يحوم طيف (الشكل 2E). ملاحظة: في حالتنا، نحن مختلطة 1 مل من P19 مع 1 مل من الحراجية المعتمدة بعسل، 1 مل من DNyda-nYFP و 1 مل من DNmpk-cYFP.
- في عملية تسلل، وملء 3 مل حقنة needleless مع مزيج تسلل (1-2 مل)، ودفع إلى الجانب السفلي (مجافي المحور) من أوراق التبغ (الشكل 2F). في حين اختراق، فإنه من المفيدلاستخدام يد واحدة لدفع واليد الأخرى لدعم بلطف الجانب العلوي (متجه نحو المحور، ضد قوة دفع).
ملاحظة: عندما يتم حقن خليط تسلل بنجاح، سوف المناطق المصابة تصبح التعرف عليها بسهولة في البشرة. ومع ذلك، قد تفشل تسلل بسبب حقن القاسي (تلف الأنسجة) أو دفع كافية (لا اختراق السائل). لكل اختبار، نقترح اثنين على الأقل من الحقن في اثنين من يترك مستقلة (من نباتات مختلفة). - وضع النباتات المصابة مرة أخرى في غرفة النمو. عموما، والتعابير البروتين يمكن اكتشافها بعد 48 ساعة تسلل التالية.
4. متحد البؤر التصوير
- في 48 ساعة بعد تسلل، استخدم الناخس حفرة لاستئصال قرص ورقة من منطقة حقن (عادة 3-4 أقراص / منطقة يمكن أن تنتج) (الشكل 2G). استخدام ملاقط لنقل بلطف الأقراص ورقة إلى شريحة (الجانب مجافي المحور الصاعد) وجبل لهم قطرات الماء. تجنب الضغط هار جداد على غلاف زلة لأنه لن تقلص / الخلايا التالفة لا تظهر بشكل جيد تحت المجهر متحد البؤر (الشكل 2H).
- قبل التصوير متحد البؤر، تفحص عينات التي شنت على مجهر مركب برنامج التحصين الموسع الفلورسنت للتحقق من مستويات التعبير. ملاحظة: استنادا إلى تجربتنا، فإن الخلايا التي تظهر مستويات التعبير وسيطة هي أفضل ممثلة تحت المجهر متحد البؤر.
- نبدأ مع 40X (NA 1.3) عدسة على المجهر متحد البؤر. ضبط الشريحة إلى الموضع المطلوب بحيث تبقى الخلايا معربا عن مستويات متوسطة من البروتين الفلورسنت في المركز. أطياف الإثارة / انبعاث لCFP و YFP هي 458 نانومتر / 480-500 نانومتر و 514 نانومتر / 520-540 نانومتر، على التوالي.
- تفعيل زر "لايف" لمعاينة الصور ثم ضبط كثافة الليزر وزيادة الذكية للحصول على نسبة مضان كثافة / الضوضاء الأكثر توازنا. لتحسين جودة التصوير، وزيادة بكسل مسح و / أو المتوسط إطار / خط. وأخيرا، وضبط مقبض التركيز على الجرميةالفصل البؤري متوسط وفوق "لقطة" لاتخاذ صورة.
ملاحظة: CFP والصور YFP يمكن التقاط أو بالتتابع في وقت واحد عن طريق فحص أو إيقاف خيار "متسلسلة" وضع المسح الضوئي، على التوالي. - عند الرغبة Z-الإسقاط للرأي في عمق الخلايا، حدد "س ع ص" واسطة التصوير، وتحديد عمق نطاق المسح (10-15 ميكرون)، وجمع الصور من أعلى إلى أسفل الخلية المستهدفة . تجميع الصور التي تم الحصول عليها مع برنامج لايكا عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على ملف الصورة لتحديد "إعادة تسمية" وتصدير الصور على هيئة ملفات TIFF..
- صورة 30 - 40 خلايا للتحليل الكمي.
تجهيز 5. صورة والتحليل الكمي
- استخدام البرمجيات فيجي (http://fiji.sc/Fiji) لمعالجة الصور وإجراء القياس الكمي.
- رسم الرسوم البيانية كثافة مضان.
- لتصور أفضل ما إذا كان التعبير CFP / YFP هوبشكل موحد وزعت، استخدم فيجي للتدليل على قوة إشارة CFP و YFP على طول محيط الخلية. ولتحقيق ذلك، إطلاق أول فيجي ثم حدد "ملف" و "فتح" لبدء صورة. انقر على "خط" في القائمة أداة وحدد "خط مجزأة" طريق النقر على الحق. تقرر المنطقة من اهتمام ورسم خط على طول محيط الخلية لتتبع CFP أو إشارة YFP (الشكل 3A-C).
ملاحظة: فيجي يقيس قيمة كثافة مضان المطلقة على طول خطوط مجزأة. - اختر من القائمة المنسدلة "تحليل" و "الملف مؤامرة" لإنشاء رسم بياني مع الموقف وشدة القيم التي تمثل مستويات CFP / YFP على طول خط مجزأة. إذا رغبت في ذلك، مكررة قيم الكثافة (من خلال اختيار قائمة "نسخ") في EXCEL أو غيرها من برامج الرسم لتوليد الرسوم البيانية كثافة مماثلة.
- لتصور أفضل ما إذا كان التعبير CFP / YFP هوبشكل موحد وزعت، استخدم فيجي للتدليل على قوة إشارة CFP و YFP على طول محيط الخلية. ولتحقيق ذلك، إطلاق أول فيجي ثم حدد "ملف" و "فتح" لبدء صورة. انقر على "خط" في القائمة أداة وحدد "خط مجزأة" طريق النقر على الحق. تقرر المنطقة من اهتمام ورسم خط على طول محيط الخلية لتتبع CFP أو إشارة YFP (الشكل 3A-C).
- قياس درجة القطبية.
- جمع ما يقرب من 20 تمثيلا وخلايا tative من 3 تجارب تكرار لتقييم درجة قطبية CFP و YFP في الخلايا التبغ. حساب درجة الاستقطاب على أساس نسبة كثافة عالية مضان (كما هو موضح H) على مدى كثافة مضان منخفضة (كما هو موضح L). ملاحظة: يتم شرح طريقة الكمي في الشكل (3).
- لقياس القيم H و L، رسم خط مجزأة على طول المنطقة المهتمة في محيط الخلية (المذكورة أعلاه)، انقر فوق "تحليل" من القائمة المنسدلة، ثم حدد "القياس". عندما ملوثات العضوية الثابتة "نتائج" نافذة تصل، استخدم "يعني" القيم لأداء الكمي.
- من الخلايا التي تظهر التعبير موحدة نسبيا من CFP و YFP، على سبيل المثال، الحراجية المعتمدة بعسل (الشكل 3A) أو YFP تستكمل من شارك في التعبير عن DNyda-nYFP وDNmpk6-cYFP (الشكل 3B)، للحصول على القيم H و L عن طريق قياس اثنين تم اختيارها عشوائيا قطاعات هامشية على قدم المساواة مع الطول. <li> من الخلايا العارضة تراكم القطبي واضح من البروتينات الفلورية، في هذه الحالة، وشارك في التعبير عن الحراجية المعتمدة بعسل، DNyda-nYFP وDNmpk6-cYFP (الشكل 3C)، وجمع القيم H من المناطق الطرفية مع إشارات مضان المخصب وليرة سورية من المناطق مع عدم وجود تراكم منخفض / مضان.
- تجمع النسب الناتجة من H / L من 20 زنزانة معا، واختبار للتوزيع الطبيعي. حساب القيم p بواسطة اختبار ر الطالب (على التوزيع الطبيعي) أو اختبار كولموجوروف-سميرنوف (KS) (للتوزيع غير عادي).
- جمع ما يقرب من 20 تمثيلا وخلايا tative من 3 تجارب تكرار لتقييم درجة قطبية CFP و YFP في الخلايا التبغ. حساب درجة الاستقطاب على أساس نسبة كثافة عالية مضان (كما هو موضح H) على مدى كثافة مضان منخفضة (كما هو موضح L). ملاحظة: يتم شرح طريقة الكمي في الشكل (3).
- رسم الرسوم البيانية كثافة مضان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لمنع موت الخلايا الناجم عن إشارات MAPK مفرط، تم استخدام الإصدارات كيناز غير نشطة من YDA (DNyda) وMPK6 (DNmpk6) في فحص شاركت في التعبير في الخلايا التبغ. لا التفاعل بين DNyda وDNmpk6 التي كشفت عنها BiFC ولا الحراجية المعتمدة بعسل نفسها ولدت نمط التوزيع غير المتكافئ (الشكل 3A-B). ومع ذلك، عندما قدم الحراجية المعتمدة بعسل إلى الزوج التفاعل DNyda-DNmpk6، تم توزيعها على حد سواء CFP وإشارات YFP إلى نحو الاستقطاب عالية (الشكل 3C). وتشير إعادة التوزيع هذه أن بعسل يتفاعل مع جمعية تنمية الشباب وMPK6 إلى مكانيا إعادة تنظيم مسار MAPK الإشارات في الخلايا النباتية. وضع الفسفرة من بعسل له آثار مختلفة على درجة قطبية إشارة MAPK: نسخة محاكية الفوسفات من بعسل ولدت قطبية قوية جدا، في حين إصدار الفوسفات نقص أظهر ضعف النشاط 6. هذه البيانات تدعم نموذج عملنا ل تنظيم ردود الفعل الإيجابية بين بعسل ومسار YDA-MAPK في توليد خلايا قطبية 6.
الشكل 1. رسم تخطيطي لمجمع التقاطب بعسل-YDA-MPK6 خلال الثغور انقسام الخلايا غير المتماثلة (ACD) في نبات الأرابيدوبسيس. في البشرة ورقة، وعدد الأسطر الثغور يبدأ من الخلايا protodermal، التي تتمدد لتصبح خلايا السلائف ACD، خلايا Meristemoid الأم (المركبه). وMMC يخضع لحوار التعاون الاسيوى لإنشاء واحد Meristemoid واحد SLGC (الثغور خلية النسب الأرض)، والتي قد تفرق وتميز في النهاية إلى خلايا حارس الثغور والخلايا الرصيف، على التوالي. في القشرة خلية من خلايا ACD السلائف (المركبه)، بعسل المجندين عنصرين من مسار MAPK، وMAPKKK YDA وMAPK MPK6، لتشكيل مجمع الاستقطاب وتنظيم الثغور ACD.ام / ملفات / ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. رسم تخطيطي لإجراء الحقن في أوراق التبغ البشرة. (A) تحويل البلازميدات إيواء الحراجية المعتمدة بعسل، DNyda-nYFP، DNmpk6-cYFP وP19 إلى الأجرعية المورمة GV3101 وتنمو لهم على لوحات مختارة منها (من أعلى إلى أسفل في ا). (ب) التقط المستعمرات من (A) لتطعيم ثقافة السائل للنمو بين عشية وضحاها. خلايا (C) الحصاد من خلال الدوران وصب طاف. بعد pipetting لفترة وجيزة وغسل الكريات، وتدور أسفل الخلايا مرة أخرى. (د) إعادة تعليق وتمييع الكريات الخلايا مع الحل تسلل (انظر البروتوكول) لتحقيق التطوير التنظيمي النهائي 600 = 0.5. (E) المزيج بلطف عشرالبريد خلايا إعادة علقت في طبق بتري. (F) استخدام حقنة needleless لدفع خليط تسلل إلى الجانب مجافي المحور من أوراق التبغ. (G) حوالي 48 ساعة بعد تسلل، ويترك جاهزة للتصوير متحد البؤر. الأقراص رقة المكوس التي تحتوي على خلايا مصابة الناخس حفرة في جميع أنحاء المنطقة تسلل. الدوائر متقطع تشير رفعه الأقراص الإجازة. (H) استخدام المياه لتركيب الأقراص ورقة على شريحة القياسية للتصوير متحد البؤر. الرسوم البيانية مربع في المنطقة المظللة تصف البروتينات حقنها أوراق التبغ لفحص الاستقطاب. أحجام البروتين ليست في نطاق. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. عرض والكمي لتشكيل قطبية. (AC) متحد البؤر لإظهار CFP و YFP الإزهار في خلايا البشرة التبغ. السماوي يدل على التعبير عن CFP. يشير اللون الأصفر التعبير عن YFP. (A) overexpression من الحراجية المعتمدة بعسل وحدها. (ب) المشاركة في التعبير عن DNyda-nYFP وDNmpk6-cYFP. ويكمل تعبير YFP عندما تتفاعل اثنين من البروتينات. (ج) المشاركة في التعبير عن الحراجية المعتمدة بعسل، DNyda-nYFP وDNmpk6-cYFP. التوزيع غير المتكافئ (القطبية) هو واضح لكل من CFP و YFP. شريط مقياس = 50 ميكرومتر في (AC). (DF) بالتآمر بيانيا كثافة مضان CFP / YFP على طول الخطوط المتقطعة (أرجواني) في (AC). مثلثات أرجواني تشكل بداية ونقطة نهاية من المناطق تستخدم لالتآمر كثافة. وتعرض التحديد الكمي لدرجة الاستقطاب في الخلايا التبغ تحتها. يتم قياس قيم كثافة الإزهار (H لارتفاع وL لمنخفض) والتي تم جمعها من فيجي من المناطق تتبع مع دا الأحمرإلقاء خطوط في (AC). لكل عينة، وبلغ متوسط قيم من 20 خلايا لاختبار أهمية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الاستخدام العام والتعديلات الممكنة للنظام التعبير عابر التبغ لنقل الإشارة: overexpression من البروتين الفلوري (FP) -tagged البروتينات في البشرة التبغ استخدمت بنجاح لفحص سريع للبروتين توطين التحت خلوية في الخلايا النباتية. ومع ذلك، ودراسة توزيع الإشارات الديناميكي للمجمع البروتين في أخمص هو موضوع تحديا بسبب سياقات التحت خلوية معقدة، عابرة تفاعل البروتين البروتين والأحداث نقل الإشارة. لمواجهة هذا التحدي، اتخذنا الاستفادة من نظام BiFC لدراسة MAPK يشير الأحداث. عن طريق المشاركة في التعبير عن YDA-nYFP وMPK6-cYFP، أشارت إشارة YFP تعافى أن تفعيل تتابع الإشارات MAPK قد تحدث في غشاء البلازما.
سيكون من المثالي للمشاركة في التعبير عن الموسومة fluorescently YDA وMPK6 في نبات الأرابيدوبسيس ودراسة الإشارات MAPK الحيوية في الجسم الحي. ومع ذلك، جنرال الكتريكnerating النباتات المعدلة وراثيا هو مضيعة للوقت، وخصوصا عندما هو المطلوب أكثر من واحد يبني. البروتين التعبير عابر في الخلايا التبغ يمكن أن يكون اختبار أولي سريع للتعبير في الجسم الحي في نبات الأرابيدوبسيس أو غيرها من النباتات. الميزة الأخرى التي يوفرها النظام التعبير عابرة التبغ، ولكن لا يمكن أن يتحقق بسهولة عن طريق توليد النباتات المعدلة وراثيا، هو أن البروتينات تصل إلى 4 أو 5 الانصهار يمكن أن يشترك في نفس الوقت أعرب وفحصها بواسطة المجهر متحد البؤر عندما مزيج قابل للتحقيق.
باستخدام خلايا البشرة التبغ للتحقيق في إشارة MAPK في الخلايا النباتية يمكن مواصلة تنفيذها لمسارات الإشارات الأخرى وتحت ظروف بيئية مختلفة. على سبيل المثال، فإن التفاعل بين YDA-MAPK تتغير شدته أو الموقع عندما يتم التعامل مع الخلايا معربا مع H المحلي 2 O 2 تطبيق (أ يشير التحفيز MAPK)؟ هذه المقايسات ويمكن تصميم بسرعة وأداء لمعالجة المواصفاتالأسئلة IFIC. توجد عدة أعضاء في كل صف من أشرطة MAPK (3-4 طبقات بشكل عام)، ولكن كيف يتحقق مما يشير إلى خصوصية في النباتات أو أنظمة أخرى لا تزال مجهولة إلى حد كبير. من خلال جعل مجموعات مختلفة من MAPKKKs مع MAPKKs، أو MAPKKs مع MAPKs، ونظام التعبير عابرة التبغ يسمح للتحليل واسع النطاق نسبيا ليس فقط تفاعل البروتين البروتين، ولكن أيضا التنظيم المكاني للتدفق الإشارات في الخلايا النباتية.
تخصيص المشارك التعبير وBiFC الفحص للتحقيق في الاستقطاب البروتين: واحد السؤال الجوهري الذي طال أمده في بيولوجيا الخلية هو كيف مسارات الإشارات العالمية، على سبيل المثال، MAPKs، وتحقيق خصوصيتها في بعض مرحلة التطوير أو تحت ظروف بيئية معينة. وقد سمح شارك في التعبير عن بعسل البروتين القطبية مع مكونات BiFC من YDA وMPK6 في الخلايا التبغ لنا لإثبات أن التفاعل YDA-MAPK والإشارات ومكانيا إعادة دistributed عن وجود بعسل، والبروتينات القطبية محددة خلال خلايا الثغور ACD. ولذلك، فإن خصوصية يشير YDA-MAPK يمكن تحقيقه من خلال التفاعل مع بعسل لتعزيز القطبية الخلية والانقسام غير المتماثلة.
على الرغم من أنها ليست ظاهرة عالمية، تم العثور على عدد غير قليل من البروتينات ليتم توزيعها بشكل غير متساو في الخلايا النباتية، على سبيل المثال، GTPase صغير روبس 15، البروتينات أوكسين effluxer PIN 16 ومنظميها 17، النقل البورون 18 وبعض البروتينات غير معروفة (الأخطبوط 19 ، POLAR 20، وBRX 21). لم يكن الهدف من هذا البروتوكول إلى بحث الشركاء وراثية أو البدني في بروتين معين الاستقطاب الطريق، ولكن من المرجح أن تكون مفيدة لاختبار ما إذا كانت البروتينات التفاعل مع نظام الحماية من الانقلاب، ودبابيس أو غيرها قد شكل مجمع القطبية في الخلايا النباتية. ومع ذلك، عند محاولة لمحاكاة الحدث الاستقطاب باستخدام خلايا التبغ، ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا أن المضاعفاتقد تحدث في المقايسات. على سبيل المثال، قد لا تلخيصها الحدث نبات الأرابيدوبسيس الاستقطاب في الخلايا التبغ، لا سيما عندما يطلب المزيد من العناصر مما يمكن استيعابها في الفحص. بعض الجزيئات غير معروفة المستمدة من خلفية التبغ، وليس بالضرورة البروتينات قيد البحث والدراسة، قد يكون متورطا في الأمر الذي أدى إلى حالة الاستقطاب. لذلك، فمن الضروري لاقامة التجارب رقابة صارمة في التبغ، والتحقق من صحة البيانات في نبات الأرابيدوبسيس أو غيرها من النباتات.
عناصر أساسية للنجاح في التجارب: أولا، ينبغي أن تستخدم نباتات التبغ الأخضر وصحية. منذ الكمي يحلل تحتاج إلى تجميع البيانات من خلايا مختلفة، لا بد من استخدام مزدهرة نباتات التبغ مع الخلايا السليمة باستمرار. ثانيا، إن الخلايا معربا عن مستويات البروتين المتوسطة وينبغي أن تستخدم للتصوير متحد البؤر. قد لا توفر مستويات التعبير منخفضة البروتينات الكافية للمقايسة والمشبعة التعبير لسوف evels تخفي تأثير الاستقطاب / النبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أعلنت أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
- Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
- Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
- Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
- Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
- Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).
- Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
- Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
- Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
- Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
- Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
- Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).
