Abstract
在活细胞中的动态信号事件的可视化一直是个挑战。我们扩大建立瞬时表达系统，在烟草表皮细胞的生物分子荧光互补（附设）测定中，从检测蛋白质 - 蛋白质相互作用，以监测在植物细胞中的信号转导的空间分布。在这个协议中，我们所用的附设测定以表明相互作用和拟南芥 MAPKKK YODA和MAPK6之间的信令发生在质膜。当支架蛋白BASL被共表达时，YODA-MAPK相互作用引入并与CFP-BASL空间共极化。此改性烟草表达系统允许信令本地化和动态变化（小于4天），可容纳的荧光蛋白的颜色（至少三个）多个快速检查。我们还提出了具体的方法来定量蛋白质分布（非对称的空间定位，或“两极分化”;）在烟草细胞。这种先进的烟草表达系统具有用于在活的植物细胞动态信令事件的快速测试被广泛使用的潜力。
Introduction
蛋白质错综复杂的分层网络，并形成络合物的发挥，在一个不可预知的细胞环境发生的几乎所有的生物过程的关键角色中进行互动。然而，从植物发育生长的响应，所以一直缺乏方便的工具，不仅可以快速而且有效地在亚细胞水平识别和监控这些动态信号事件。
烟草叶表皮瞬时表达系统已经呼吁优势，为在活细胞中可视化的荧光蛋白质。这个系统提供了半体内条件允许翻译后蛋白质修饰和蛋白质定位快速检查。通过检查补充YFP信号时，双分子荧光互补（附设）测定通知蛋白质 - 蛋白质相互作用的在植物细胞中的可能性。相比其他方法， 如酵母双杂交（Y2H）和Co-immunoprecipitation（联合IP）附设还提供了可视化，其中在亚细胞水平，可能会发生蛋白 - 蛋白相互作用室的有力手段。
因为不对称细胞分裂（ACD）保存干细胞群的同时用于组织/器官形成产生新的细胞类型，它对于促进真核多细胞不可或缺的机制。 拟南芥气孔发展已被用作模型系统，用于在植物中学习的ACD。的前体细胞，拟分生组织母细胞，除以不对称产生两种不同的子细胞中，拟分生组织（经历终止于一对保卫细胞之前干细胞样师）和一个气孔谱系接地单元（SLGC）（可分裂并分化成路面细胞），分别为（ 图1）。在气孔ACD，在天堂气孔不对称的新型蛋白质断裂（BASL）被premitotically极化带动分裂不对称，这INC路得身体不对称和细胞命运的不对称1。该MAPKKK YODA和的MAPKs，MPK3和6组成的MAPK级联是中部的气孔师图案和命运采用2,3，4,5。
近日，张某等人 。联极性蛋白BASL在拟南芥的气孔ACD 6 YDA-MAPK信号通路。规范YODA-MAPK通路，通MPK3 / 6，磷酸BASL并激活它的两极分化。磷酸BASL用作脚手架和募集YODA（YDA）和MPK3 / 6，以形成蛋白复合物，并在细胞皮质6集中的信令。 MAPK信号分量和BASL和YDA-MAPK途径之间的正反馈环的极化表示用于在植物细胞中的蛋白质偏振一种新的机制。当地丰富的MAPK信号是假设紧扣细胞命运分化气孔ACD 6（ 图1）。一项所述的k的一个支持这种模式安永实验数据从表现在BASL 6的诱导表达的的MAPKs的空间再分配烟草检测出来。
在一般情况下，这是不容易来监控发生MAPK信号因为MAPK分子经常发现到处一个细胞的内部。在这项研究中，我们所用的拆分YFP系统可视化的上游激酶和下游的人之间的相互作用暗示其中信令中继发生。我们通过进一步延长使用附设系统的共表达的第三蛋白（CFP-标签）与分割YFP对（暗示蛋白质 - 蛋白质相互作用的）来可视化是否以及如何补充YFP可以由共进行空间调制CFP表达的蛋白质。通过这样做，我们证明在烟草表皮的细胞皮层诱导YDA和MPK 6，之间的相互作用空间重组从均匀分布到极化图案CFP-BASL的共表达人的细胞。因此，这种系统具有用于当细胞被内部或外部刺激挑战监控的条件下在植物细胞中动态信令事件待开发的潜力（ 例如，其它蛋白质，化学应用，病原体攻击，或者环境变化等的共表达。 ）。
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Protocol
1.质粒构建
- 产生由如前所述1,6-克隆技术的构建体。
- 先用适当的引物高保真DNA聚合酶扩增BASL的编码序列，YDA和MPK 6和它们子克隆到条目的载体。查找7的详细协议。
- 以生成（分别DNmpk6 8和DNyda 4）MPK 6和YDA的显性负版本，使用MPK 6和YDA的条目的质粒为模板，通过定点诱变方法9引入点突变。
- 要建立烟草瞬时测定的结构，进行标准的LR（attL位点¯x重组的attR），反应（7详细过程），以BASL融入pH35CG 10，DNyda和DNmpk6到pXNGW和pXCGW分别载体11。
- 确认通过酶切和测序产生的质粒。一旦ŝuccessful，变换二进制构建入根癌农杆菌菌株GV3101 12和在28℃生长他们选择平板2 - 3天。
2. 农杆菌渗透溶液的制备
- 接种几新鲜转化的土壤杆菌的菌落到10ml的Luria-BERTANI（LB）具有适当的抗生素培养基（庆大霉素25微克/毫升，利福霉素25微克/毫升，壮观霉素100μg/ ml的对pH35CG，pXNGW和pXCGW构造;同样的浓度的庆大霉素和利福霉素与卡那霉素50微克/毫升为P19（表达抗转基因的沉默蛋白质）13。
- 生长在28°C摇床农杆菌培养在200转的速度约16小时，然后测量外径600（估计达到1.5 - 1.8）（ 图2A-B）。降速文化在2500 XG 10分钟。重悬和WAsh的含MgCl 2的10mM的（渗透液）的细胞沉淀。
- 再次降速培养并重新暂停与浸润溶液适量粒料达到最终OD 600 = 0.5（ 图 2C-D）。浸润植物之前，离开在室温下将细胞混合物为1 - 3小时。此步骤有助于维持细胞稳态。
3.卷烟厂和叶注射液
- 使用烟草（ 本生烟），增长4 -第5周龄在一个标准的植物生长室（23℃，16小时光照/ 8小时黑暗的循环）14叶注射液。
注意：在此阶段，烟草植物通常具有6叶（2大，2培养基，和2小）。这两个中等大小的叶子是最优化的叶注射液（这两个路数太旧了，而两个小的往往是太年轻）。 - 浸润前一天，浇灌tobac合植物饱和的土壤中。
- 在浸润天，预孵育在黑暗中的植物为1 - 3小时。此步骤允许气孔在表皮广开，渗透到叶表皮细胞时，极大地方便了根 。
- 使用标有日期的颜色条，旗叶进行渗透。标记区域用黑色粗Sharpie笔渗入（可选的;渗入领域是被感染后可见）。
- 取农杆菌再悬浮等体积并在通过温和涡旋（ 图2E）100×15毫米的培养皿混合。注：在我们的例子中，我们混合1毫升P19的1毫升CFP-BASL的1毫升DNyda-nYFP和1ml DNmpk-cYFP的。
- 在浸润的过程中，填充渗透混合物3mL的无针注射器（1 - 2毫升）中，推入烟草叶（ 图2F）的底侧（背面）。而渗透，它是有帮助用一只手推，另一只手轻轻支撑上侧（正面，对抗推压力）。
注意：一旦渗透混合物被成功注入，受感染的区域将成为在表皮容易辨认。然而，渗透可能会失败，由于恶劣的注射液（组织损伤）或推不足（没有液体渗透）。对于每个测试，我们建议在两个独立的叶子至少两个注射（来自不同的植物）。 - 放置感染植物放回生长室。一般来说，蛋白质的表达都是经过48小时以下的渗透检测。
4.共焦成像
- 在48小时后浸润，用打孔器从注射部位切除叶盘（通常为3 - 4个磁盘/可以生产区）（ 图2G）。使用镊子轻轻的叶盘水珠转移到幻灯片（远轴朝上），并安装它们。避免过压哈日在盖滑移ð因为挤压/受损细胞不会在共聚焦显微镜（ 图2H）下显示良好。
- 共焦成像之前，扫描于外延荧光化合物显微镜安装样本，以检查的表达水平。注：根据我们的经验，这表明中间表达水平的细胞共聚焦显微镜下最好代表。
- 开始对共聚焦显微镜的40X（NA 1.3）镜头。调节滑动到所需的位置，从而使表达荧光蛋白的中等水平的细胞保持在中心。对于CFP和YFP激发/发射光谱是458海里/ 480 - 500纳米和514纳米/ 520 - 540分别纳米。
- 激活“实时”按钮来预览图像，然后调整激光强度和智能增益最均衡的荧光强度/噪音比。以改善成像质量，增加扫描像素和/或帧/线平均。最后，调整调焦旋钮，REACH中间焦平面并点击“捕获”采取的形象。
注意：CFP和YFP的图片可通过打开或关闭的“连续”扫描分别模式，选项检查被顺序地或同时捕获。 - 当Z-投影期望的细胞的深入视图中选择“XYZ”摄像模式时，限定的扫描范围的深度（10 - 15微米），并收集从顶部图像到目标小区的底。编译通过在图像文件右键点击徕卡软件获得的图像，选择“重命名”，并导出图像为.tiff文件。
- 图片30 - 40细胞定量分析。
5.图像处理与定量分析
- 使用斐济软件（http://fiji.sc/Fiji）来处理图像并进行量化。
- 绘制荧光强度图。
- 为了更好地可视化CFP / YFP表达是否均匀分布的，使用斐济证明CFP和YFP的信号强度沿着电池周边。要做到这一点，首先启动斐济，然后选择“文件”和“打开”开始图像。单击工具菜单中的“行”，并通过右键单击选择“分段线”。决定的感兴趣的区域，并绘制沿着电池周边的线迹在CFP或YFP的信号（ 图3A-C）。
注意：斐济测量沿着分段线的绝对荧光强度值。 - 选择下拉菜单中的“分析”和“剧情资料”来生成与代表CFP / YFP沿分割线的水平位置和强度值的曲线图。如果需要的话，重复的强度值（通过选择菜单中的“复制”）到Excel或其它图形软件生成可比强度的曲线图。
- 为了更好地可视化CFP / YFP表达是否均匀分布的，使用斐济证明CFP和YFP的信号强度沿着电池周边。要做到这一点，首先启动斐济，然后选择“文件”和“打开”开始图像。单击工具菜单中的“行”，并通过右键单击选择“分段线”。决定的感兴趣的区域，并绘制沿着电池周边的线迹在CFP或YFP的信号（ 图3A-C）。
- 量化极性程度。
- 收集大约20 represen从3重复实验对准焦点细胞，以评估CFP和YFP的烟草细胞的极性程度。计算在低荧光强度（定义为L）的基础上的高荧光强度（定义为H）的比率的极性程度。注意：定量方法在图3中说明。
- 为了测量H和L值，得出沿小区外围（如上所述）感兴趣区域分割的线，请从下拉菜单中选择“分析”，然后选择“测量”。当一个“结果”窗口弹出时，用“中庸”的价值观进行量化。
- 从显示CFP和YFP， 例如相对均匀表达的细胞，CFP-BASL（ 图3A）或YFP的从DNyda-nYFP和DNmpk6-cYFP（ 图3B）的共表达补充，通过测量得到的H和L的值两个随机选择的圆周段具有相等的长度。 <li>从呈现荧光蛋白的明显极性积累，在这种情况下，细胞，CFP-BASL，DNyda-nYFP和DNmpk6-cYFP（ 图3C），的共表达收集来自周边区域轰值与富集的荧光信号从低/无荧光积累区域LS。
- 池H / L的所得比率从20个细胞一起并测试正态分布。通过计算学生的t检验的p值（正态分布）或柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫（KS）测试（非正态分布）。
- 收集大约20 represen从3重复实验对准焦点细胞，以评估CFP和YFP的烟草细胞的极性程度。计算在低荧光强度（定义为L）的基础上的高荧光强度（定义为H）的比率的极性程度。注意：定量方法在图3中说明。
- 绘制荧光强度图。
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Representative Results
为了防止由过度活跃的MAPK信号诱导的细胞死亡，YDA（DNyda）和MPK 6（DNmpk6）的激酶非现行版本在烟草细胞共表达测定中使用。既不通过附设也不CFP-BASL本身产生不均匀分布图案（ 图3A-B）揭示DNyda和DNmpk6之间的相互作用。然而，当CFP-BASL引入DNyda-DNmpk6相互作用对，两者CFP和YFP信号被重新分配给一个高度偏振的方式（ 图3C）。这种重新分布表明BASL与YDA和MPK 6相互作用在植物细胞中以在空间重新组织的MAPK信号传导途径。 BASL的磷酸化状态对MAPK信号的极性程度不同的影响：产生很强的极性BASL的磷酸模仿版本，而一个磷酸化缺陷的版本显示弱活动6。这些数据支持了我们的工作模式 BASL，并生成细胞极性6 YDA-MAPK通路之间的正反馈调节。
图1图中BASL-YDA-MPK6极性情结在气孔不对称分裂（ACD）在 拟南芥 中 ，在叶表皮，气孔行数从protodermal细胞，从而扩大成为ACD前体细胞中，拟分生组织母细胞启动（MMC卡）。一个MMC经历一个ACD创建一个拟分生组织和一个SLGC（气孔谱系接地单元），其可分裂并最终分别分化为气孔保卫细胞和路面细胞。在ACD的前体细胞（MMC卡）的小区皮质，BASL新兵MAPK途径的两种组分，所述MAPKKK YDA和MAPK MPK 6，以形成极性复杂，调节气孔ACD。OM /文件/ ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
变换质粒窝藏CFP-BASL 图2.图中烟叶表皮注射过程中，（A），DNyda-nYFP，DNmpk6-cYFP和P19 转化根癌农杆菌 GV3101和发展他们各自的选择板（从上到下一个）。 （B）拿起从（A）的菌落接种液体培养过夜增长。 （C）收获细胞纺，倒出上清液。简单地移液和洗涤颗粒后，再次降速细胞。 （D）的重悬并稀释的渗透溶液中的细胞沉淀（见协议），以实现最终的OD 600 = 0.5。 （E）轻轻地混合次e重新悬浮的细胞在培养皿中。 （F）的使用无针注射器的渗透混合物推入烟草叶子的背面侧。 （G）浸润后约48小时，叶子是准备共焦成像。包含感染关长叶盘细胞与周围的浸润区域打孔器。虚线圆圈表示切除离开磁盘。 （H）使用的水到叶片上安装到对于共焦成像的标准滑动。在阴影区域的框图说明注入烟草叶的蛋白质极化检测。蛋白质大小不是规模。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3显示和极性形成的定量。 >（AC）共聚焦图像显示在烟草表皮细胞CFP和YFP花期。青色指示CFP的表达。黄色表示YFP的表达。独CFP-BASL的（A）过表达。 （B）的DNyda-nYFP和DNmpk6-cYFP的共表达。当两种蛋白相互作用的YFP表达补充。 （C）CFP-BASL，DNyda-nYFP和DNmpk6-cYFP的共表达。分布不均（极性）是两个CFP和YFP明显。比例尺= 50微米（AC）。 （DF）图形绘制沿虚线（品红）（AC）在CFP / YFP的荧光强度。品红三角形标记用于强度绘制区域的起点和终点。在烟草细胞的极性程度Quantifications都提出了下面。荧光强度（H高和L低）的值是从红色达跟踪的区域测量和收集斐济棚（AC）线。对于每个样本，从20单元格的值的平均，显着性检验。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
一般使用和信号转导的烟草瞬时表达系统的可能的修改：荧光蛋白的过表达（FP）-tagged在烟草表皮蛋白已成功用于在植物细胞中蛋白的亚细胞定位的快速检测。然而，在植物中研究蛋白质复合物的动态信令分配是一项具有挑战性的主题，由于复杂的亚细胞环境中，瞬时蛋白质-蛋白质相互作用和信号转导事件。为了应对这一挑战，我们采取了附设系统的优势，研究MAPK信号的事件。通过共表达YDA-nYFP和MPK 6-cYFP，将回收的YFP的信号表明，MAPK信号继电器的激活可能发生在细胞膜。
这将是理想的，以共表达荧光标记YDA和MPK 6 拟南芥和检查体内动态MAPK信号。但是，GEnerating的转基因植物是费时，特别是当一个以上的构造是理想的。在烟草细胞蛋白瞬时表达可以是在拟南芥或其他植物体内表达的快速初步检测。另一优点是，烟草瞬时表达系统提供，但不能通过产生的转基因植物可以轻松实现，是多达4个或5个融合蛋白可同时共表达并通过共聚焦显微镜检查时的组合是可以实现的。
使用烟草表皮细胞，调查在植物细胞中MAPK信号可以进一步实现为其他信号传导途径和不同的环境条件下。例如，将YDA-MAPK的相互作用改变其强度或位置时，表达细胞与当地的H 2 O 2应用程序（MAPK信号刺激）治疗？此类测定法可快速的设计和执行，以解决规范IFIC的问题。多个成员在MAPK盒每一层存在（3 - 4层一般），但如何信号特异性植物或其他系统实现仍是未知。通过用MAPKKs，或MAPKKs用的MAPKs使得MAPKKKs的不同组合，烟草瞬时表达系统不仅允许蛋白质 - 蛋白质相互作用的规模比较大的分析，也可在植物细胞中的信令流的空间组织。
定制的共表达和附设测定蛋白质极化的调查：在细胞生物学中一个长期存在的根本问题是如何普遍的信号通路， 如家系，在特定的发育阶段或特定的环境条件下实现自己的特殊性。共表达YDA和MPK6在烟草细胞中附设成分的极性蛋白BASL使我们能够证明YDA-MAPK互动和信令空间重新-D由BASL的存在下，气孔ACD在特定极性的蛋白质istributed。因此，YDA-MAPK信号的特异性可以通过互动与BASL达到促进细胞极性和不对称分裂。
虽然这不是一个普遍现象，已发现相当多的蛋白质也可以不均匀地分布在植物细胞中， 例如 ，小GTP酶的ROP 15，生长素effluxer PIN蛋白16和其调节17，硼转运18和一些未知的蛋白质（章鱼19 ，POLAR 20和21 BRX）。该协议的目的不是为了搜索的遗传或物理的合作伙伴在一个特定的蛋白质极化途径，但很可能会测试带有ROP，PIN码或他人相互作用蛋白是否可能形成在植物细胞极性复杂有用的。然而，尝试使用烟草细胞来模拟偏振事件的时候，我们应该记住，并发症在测定中，可能会发生。例如， 拟南芥属偏振事件可能不会在烟草细胞，当需要比可被容纳在测定多种组分概括，尤其如此。从烟草背景，不一定被检查的蛋白的一些未知的分子，可能参与诱导极化事件。因此，有必要设置在烟草严格对照实验，并验证在拟南芥或其他植物中的数据。
首先，绿色的，健康的烟草植株，应使用：关键要素，在实验中获得成功 。因为量化分析需要从各种细胞汇集数据，关键的是使用兴旺的烟草植物与一贯健康细胞。其次，表达介质蛋白水平的细胞应该用于共焦成像。低表达水平可能不提供用于测定足够的蛋白质和饱和表达升evels会掩盖极化/易位的影响。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
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