Abstract
Visualisatie dynamische signaleringsgebeurtenissen in levende cellen is een uitdaging. Breidden we een gevestigde transiënte expressie systeem, de biomoleculaire fluorescerende complementatie (BiFC) test in tabak epidermale cellen, uit het testen van eiwit-eiwit interacties aan het toezicht op de ruimtelijke verdeling van de signaaltransductie in plantencellen. In dit protocol, gebruikten we de BiFC test laten zien dat de interactie en de signalering tussen de Arabidopsis MAPKKK YODA en MAPK6 optreden op de plasmamembraan. Wanneer de scaffold eiwit BASL werd co-expressie, de YODA-MAPK interactie herverdeeld en ruimtelijk co-gepolariseerde van de GVB-BASL. Deze gemodificeerde tabak expressiesysteem maakt een snelle behandeling van signalering lokalisatie en dynamische veranderingen (minder dan 4 dagen) en is geschikt voor meerdere fluorescerende proteïne kleuren (ten minste drie). We hebben ook gepresenteerd gedetailleerde methodes om eiwit distributie (asymmetrische ruimtelijke lokalisatie, of "polarisatie" te kwantificeren;) In tabakscellen. Dit geavanceerde tabak uitdrukking systeem heeft het potentieel om op grote schaal worden gebruikt voor het snel testen van dynamische signalisatie gebeurtenissen in levende plantencellen.
Introduction
Eiwitten interageren in een complex hiërarchisch netwerk en complexen vormen die een centrale rol in bijna alle biologische processen in een onvoorspelbare cellulaire omgeving spelen. Echter, van plantontwikkeling tot groeiresponsen, is er een gebrek aan handige hulpmiddelen die niet alleen snel maar ook efficiënt deze dynamische signaleringsgebeurtenissen op subcellulair niveau identificeren en controleren zijn.
De tijdelijke eiwitexpressie systeem tabaksblad epidermis heeft aantrekkelijke voordelen visualiseren fluorescerende eiwitten in levende cellen. Dit systeem biedt semi- in vivo omstandigheden die post-translationele eiwit modificatie en snelle behandeling van eiwit lokalisatie mogelijk te maken. Aangevuld door onderzoek van de YFP signaal, de bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) test stelt de mogelijkheid van eiwit-eiwit interacties in plantencellen. In vergelijking met andere methoden, bijvoorbeeld gist-twee-hybride (Y2H) en co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC ook een krachtig middel visualiseren compartimenten waarin eiwit-eiwit interacties kunnen plaatsvinden op subcellulair niveau.
Omdat asymmetrische celdeling (ACD) handhaaft stamcelpopulatie terwijl het genereren van nieuwe celtypen te vormen weefsel / orgaan is onontbeerlijk voor het bevorderen eukaryote multicellulariteit. Arabidopsis stomatale ontwikkeling is gebruikt als een modelsysteem voor het bestuderen ACD in planten. De voorlopercel, meristemoid moedercel, verdeelt asymmetrisch twee dochtercellen te produceren, een meristemoid (ondergaat stamcel-achtige verdelingen vóór beëindiging in een paar sluitcellen) en een stomatale lijn gemalen cel (SLGC) (kan verdelen en differentiëren tot trottoir cel), respectievelijk (figuur 1). In stomatale ACD, wordt het nieuwe eiwit Breaking van asymmetrie in de huidmondjes Lineage (BASL) premitotically gepolariseerd om verdeeldheid asymmetrie te rijden, die include fysieke asymmetrie en het lot van de cel asymmetrie 1. Een MAPK cascade bestaat uit de MAPKKK YODA en de MAPKs, MPK3 en 6 is centraal voor stomataire divisie patronen en het lot goedkeuring 2,3, 4,5.
Onlangs, Zhang et al. koppelde de polariteit eiwit BASL de YDA-MAPK signaalroute in Arabidopsis stomatale ACD 6. De canonieke YODA-MAPK pathway, door middel van MPK3 / 6, fosforyleert BASL en activeert de polarisatie. Gefosforyleerd BASL fungeert als een scaffold en rekruteert YODA (YDA) en MPK3 / 6 aan een eiwit te vormen en concentreren de signalering bij de cel cortex 6. Polarisatie van de MAPK componenten en de positieve feedback loop tussen BASL en de YDA-MAPK pathway vertegenwoordigt een nieuw mechanisme voor eiwit polarisatie in plantencellen. Lokaal verrijkt MAPK signalering wordt verondersteld nauw worden gekoppeld aan lot van de cel differentiatie in stomataire ACD 6 (figuur 1). Een van de key experimentele gegevens dat dit model ondersteund kwam van de tabak assays die de ruimtelijke verdeling van MAPK's geïnduceerd door de expressie van BASL 6 aangetoond.
In het algemeen is het niet gemakkelijk te controleren wanneer MAPK signalering gebeurt omdat MAPK moleculen vaak opwekken werden gevonden in een cel. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de split-YFP systeem om de interactie te visualiseren tussen het stroomopwaartse kinase en downstream degenen te stellen wanneer de signalering relais optreedt. We verder uitgebreid het gebruik van het systeem BiFC door co-expressie een derde eiwit (CFP-tag) met de splitsing YFP paar (suggestief voor eiwit-eiwit interactie) te visualiseren of en hoe de aangevuld YFP ruimtelijk kan worden gemoduleerd door gelijktijdige uitgedrukt GVB eiwit. Door dit te doen, hebben we aangetoond dat co-expressie van de GVB-BASL geïnduceerde ruimtelijke reorganisatie van de interacties tussen YDA en MPK6, van gelijkmatige verdeling naar gepolariseerd patroonvorming in de cel cortex van de tabak EpiDermAl cellen. Dit systeem heeft daardoor de kansen worden ontwikkeld om toezicht dynamische signaleringsgebeurtenissen in plantencellen onder omstandigheden wanneer de cellen uitgedaagd door interne of externe stimuli (bijvoorbeeld co-expressie van andere eiwitten, chemische toepassing pathogeen aanval of omgevingsveranderingen, enz. ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmide Bouw
- Genereren van de constructen door klonering techniek zoals hiervoor beschreven 1,6.
- Gebruik eerst een high fidelity DNA polymerase met geschikte primers om de coderende sequenties van BASL amplificeren, YDA en MPK6 en subkloon ze in invoer vectoren. Vind de gedetailleerde protocol in 7.
- De dominante negatieve versies van MPK6 en YDA (DNmpk6 8 en DNyda 4 respectievelijk) genereert, gebruikt de datum van plasmiden MPK6 en YDA als template en introduceren puntmutaties door plaatsgerichte mutagenese methode 9.
- Om de constructen voor tabak voorbijgaande assays te bouwen, uit te voeren standaard LR (attL x attR recombinatie) reacties (gedetailleerde procedure in 7) naar BASL integreren in pH35CG 10, DNyda en DNmpk6 in pXNGW en pXCGW vectoren 11, respectievelijk.
- Bevestig de resulterende plasmiden door enzymdigestie en sequencing. Zodra sUccessful, transformeren de binaire constructen in de Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 12 en groeien ze op selectie platen bij 28 ° C gedurende 2-3 dagen.
2. Bereiding van Agrobacterium infiltratie Solution
- Inoculeren enkele vers getransformeerde Agrobacterium kolonies in 10 ml Luria-Bertani (LB) medium met geschikte antibiotica (Gentamycine 25 ug / ml, rifamycine 25 ug / ml spectinomycine 100 ug / ml voor pH35CG, pXNGW en pXCGW construeert, dezelfde concentraties gentamycine en kanamycine rifamycine met 50 ug / ml voor P19 (expressie eiwitten tegen transgene silencing) 13.
- Agrobacterium culturen groeien in een 28 ° C schudder bij de snelheid van 200 rpm gedurende ongeveer 16 uur en meet de OD 600 (geschat bereikt 1,5-1,8) (Figuur 2A-B). Spin down het kweken bij 2500 xg gedurende 10 min. Re-schorten en wash de celpellets met 10 mM MgCl2 (infiltratie oplossing).
- Spin down de kweken opnieuw en resuspendeer de pellets met de juiste hoeveelheid van de infiltratie oplossing voor de uiteindelijke OD 600 = 0,5 bereikt (figuur 2C-D). Voordat infiltreren planten, verlaat de cel mengsels bij kamertemperatuur gedurende 1-3 uur. Deze stap helpt naar cel homeostase.
3. Tabak Plant en Leaf Injection
- Gebruik tabaksplanten (Nicotiana benthamiana), geteeld 4-5 weken oud in een standaard plantengroei kamer (23 ° C met cycli van 16 uur licht / 8 uur donker) 14 voor het blad injectie.
Opmerking: In dit stadium tabaksplanten hebben gewoonlijk 6 bladen (2 grote, 2 medium, en 2 kleine). De twee middelgrote bladeren zijn de meest optimale voor blad injectie (de twee grote bedrijven zijn te oud, terwijl de twee kleintjes zijn vaak te jong). - Voordat de infiltratie dag, water de Tobacco planten om de grond te verzadigen.
- Op de dag infiltratie, pre-incubeer de planten in het donker gedurende 1-3 uur. Deze stap kan huidmondjes in de epidermis mogelijkheden voor toegang, die sterk vergemakkelijkt de Agrobacterium bij het betreden in het blad epidermale cellen.
- Het gebruik van kleur tapes gelabeld met data, de vlag van de bladeren te worden geïnfiltreerd. Markeer de gebieden die moeten worden geïnfiltreerd met een zwarte dikke sharpie (optioneel, het geïnfiltreerde gebieden zijn zichtbaar na besmetting.).
- Neem gelijke volumes van de Agrobacterium re-ophanging en meng ze in een 100 x 15 mm petrischaal door voorzichtig zwenken (figuur 2E). Opmerking: In ons geval, gemengd we 1 ml p19 met 1 ml van de GVB-BASL, 1 ml DNyda-nYFP en 1 ml DNmpk-cYFP.
- In het proces van infiltratie, vult een 3 ml naaldloze spuit met de infiltratie mengsel (1-2 ml) en duwen de onderzijde (abaxiale) van het tabaksblad (figuur 2F). Terwijl infiltreren, is het nuttigop één hand te duwen en de andere hand voorzichtig ondersteunen bovenzijde (adaxial tegen de duwkracht).
Opmerking: Als de infiltratie mengsel succes wordt geïnjecteerd, zal de besmette gebieden herkenbaar in de epidermis worden. Echter, de infiltratie mislukken als gevolg van strenge injectie (weefselschade) of onvoldoende push (geen vloeistof penetratie). Voor elke proef stellen we tenminste twee injecties in twee onafhankelijke bladeren (van verschillende planten). - Plaats de besmette planten terug in de groei kamer. In het algemeen, eiwitexpressies detecteerbaar na 48 uur na infiltratie.
4. Confocale Imaging
- Op 48 uur na infiltratie, gebruik maken van een perforator om een blad schijf te snijden uit het geïnjecteerde gebied (normaal 3-4 disks / gebied kan worden geproduceerd) (figuur 2G). Gebruik een pincet om het blad schijven voorzichtig over te dragen aan een dia (de abaxiale naar boven) en monteer ze met water druppels. Druk niet te hard op de cover slip omdat geperst / beschadigde cellen zal niet goed zien onder de confocale microscoop (figuur 2H).
- Voordat confocale imaging, scannen de gemonteerde samples op een epi-fluorescente samengestelde microscoop om de expressie te controleren. Opmerking: Op basis van onze ervaring, zijn de cellen die tussenliggende expressie tonen het best vertegenwoordigd onder de confocale microscoop.
- Begin met de 40X (NA 1,3) lens op een confocale microscoop. Stel de slede in de gewenste positie, zodat de cellen die middelmatige concentraties van fluorescente eiwit in het midden blijven. De excitatie / emissie spectra voor GVB en YFP zijn 458 nm / 480-500 nm en 514 nm / 520-540 nm, respectievelijk.
- Activeer de "Live" knop om een voorbeeld van de afbeeldingen aan te passen dan laser intensiteit en slimme winst voor de meest evenwichtige fluorescentie-intensiteit / ruisverhouding. Om beeldkwaliteit te verbeteren, verhogen scannen pixels en / of frame / lijn gemiddelde. Ten slotte past u de focus knop om reach de mediaan focal plane en klik op "Capture" om het beeld te nemen.
Opmerking: Het GVB en YFP afbeeldingen kunnen na elkaar of gelijktijdig worden gevangen door te controleren of uitschakelen van de optie van de "sequentiële" scanning mode, respectievelijk. - Wanneer Z-projectie gewenst is de gedetailleerde weergave van de cellen, selecteer "xyz" imaging mode, bepalen de diepte van het scanbereik (10-15 urn) en laat de beelden van de top naar de bodem van de doelcel . Compileren van de verkregen beelden met de Leica software door rechts te klikken op de opname te selecteren "hernoemen" en afbeeldingen exporteren als tiff-bestanden.
- Afbeelding 30-40 cellen kwantificatieanalyse.
5. Beeldverwerking en kwantificering Analyse
- Gebruik Fiji software (http://fiji.sc/Fiji) om beelden te verwerken en uit te voeren kwantificering.
- Plot van de fluorescentie-intensiteit grafieken.
- Om beter te visualiseren of de CFP / YFP expressiegelijkmatig verdeeld, gebruiken Fiji om de signaalsterkte van het GVB en YFP tonen langs de cel periferie. Om dit te bereiken, eerste lancering Fiji selecteer "File" en "Open" om het beeld te starten. Klik op "lijn" op het gereedschap menu en selecteer "gesegmenteerde lijn" door rechts te klikken. Beslis het gebied van belang en trek een lijn langs de cel periferie naar het GVB of de YFP signaal (figuur 3A-C) op te sporen.
Opmerking: Fiji meet de absolute fluorescentie-intensiteit waarde langs de gesegmenteerde lijnen. - Selecteer de drop-down menu "Analyseren" en "Plot Profile" om een grafiek met de positie en de intensiteit waarden die de niveaus van CFP / YFP langs de gesegmenteerde lijn vertegenwoordigen genereren. Indien gewenst, dupliceren de intensiteit waarden (door het selecteren van het menu "Copy") in Excel of andere grafische software om vergelijkbare intensiteit grafieken te genereren.
- Om beter te visualiseren of de CFP / YFP expressiegelijkmatig verdeeld, gebruiken Fiji om de signaalsterkte van het GVB en YFP tonen langs de cel periferie. Om dit te bereiken, eerste lancering Fiji selecteer "File" en "Open" om het beeld te starten. Klik op "lijn" op het gereedschap menu en selecteer "gesegmenteerde lijn" door rechts te klikken. Beslis het gebied van belang en trek een lijn langs de cel periferie naar het GVB of de YFP signaal (figuur 3A-C) op te sporen.
- Kwantificeren polariteit graad.
- Verzamel ongeveer 20 vertegenwoordiger cellen uit 3 repliceren experimenten om de polariteit mate van GVB en YFP in tabak cellen te evalueren. Bereken de polariteit mate gebaseerd op de verhouding van de hoge fluorescentie-intensiteit (gedefinieerd als H) via lage fluorescentie-intensiteit (gedefinieerd als L). Opmerking: De kwantificering methode is toegelicht in figuur 3.
- Om de H en L-waarden te meten, trek een gesegmenteerde lijn langs de betrokken regio aan de cel periferie (hierboven beschreven), klikt u op "Analyseer" uit het drop-down menu, en selecteer "Meten". Als er een venster "Results" verschijnt, gebruik "Mean" waarden kwantificering uit te voeren.
- Van de cellen die relatief uniforme expressie van CFP en YFP, bijvoorbeeld CFP-BASL (Figuur 3A) of YFP aangevuld door co-expressie van DNyda-nYFP en DNmpk6-cYFP (figuur 3B), verkrijgen de H en L waarden door meting twee willekeurig gekozen omtrekssegmenten met gelijke lengte. <li> Van de cellen vertonen duidelijke polaire ophoping van fluorescerende eiwitten, in dit geval, de co-expressie van de GVB-BASL, DNyda-nYFP en DNmpk6-cYFP (figuur 3C), het verzamelen van de H-waarden uit de perifere regio's met verrijkte fluorescentiesignalen en de Ls uit de regio's met een lage / no fluorescentie accumulatie.
- Verzamel de resulterende verhouding van H / L van 20 cellen elkaar en test voor normale verdeling. Bereken de p-waarden van t-test van de Student's (voor de normale verdeling) of de Kolmogorov-Smirnov (KS) -test (voor niet-normale verdeling).
- Verzamel ongeveer 20 vertegenwoordiger cellen uit 3 repliceren experimenten om de polariteit mate van GVB en YFP in tabak cellen te evalueren. Bereken de polariteit mate gebaseerd op de verhouding van de hoge fluorescentie-intensiteit (gedefinieerd als H) via lage fluorescentie-intensiteit (gedefinieerd als L). Opmerking: De kwantificering methode is toegelicht in figuur 3.
- Plot van de fluorescentie-intensiteit grafieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celdood geïnduceerd door de hyperactieve MAPK signalering te voorkomen, werden de kinase inactieve versies van YDA (DNyda) en MPK6 (DNmpk6) van de co-expressie assay tabakscellen. Noch de interactie tussen DNyda en DNmpk6 onthuld door BiFC noch GVB-BASL zelf gegenereerde ongelijke verdeling patroon (figuur 3A-B). Wanneer echter CFP-BASL werd in de DNyda-DNmpk6 interactie pair, zowel CFP en YFP signalen werden herverdeeld om een sterk gepolariseerde wijze (Figuur 3C). Deze herverdeling suggereert dat BASL interageert met YDA en MPK6 ruimtelijk reorganiseren de MAPK signaalroute in plantencellen. De fosforylering status van BASL heeft differentiële effecten op de polariteit mate van de MAPK signalering: een fosfo nabootsen versie van BASL gegenereerd zeer sterke polariteit, terwijl een fosfo-deficiënte versie vertoonden zwakkere activiteit 6. Deze gegevens worden ondersteund onze werkend model van een positieve feedback regulatie tussen BASL en de YDA-MAPK pathway in het genereren van cel polariteit 6.
Figuur 1. Schematische weergave van het BASL-YDA-MPK6 Polariteit Complex Tijdens huidmondjes asymmetrische celdeling (ACD) in Arabidopsis. In het blad epidermis, de stomatale linage initieert van de protodermal cellen, die uit te breiden naar ACD voorloper cellen, de Meristemoid Moeder Cells (MMC). Een MMC ondergaat een ACD één Meristemoid en één SLGC (stomataire lineage grond cel), die kunnen delen en uiteindelijk differentiëren tot stomatale sluitcellen en bestrating cellen, respectievelijk te creëren. Bij de cel cortex van de ACD voorlopercellen (MMC), BASL rekruteert twee componenten van een MAPK route, de MAPKKK YDA en MAPK MPK6, een polariteit te vormen en reguleren stomatale ACD.OM / files / ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Schema van de Injectie Procedure in Tobacco Leaf epidermis. (A) Transformeer de plasmiden GVB-BASL, DNyda-nYFP, DNmpk6-cYFP en P19 in Agrobacterium tumefaciens GV3101 en groeien ze op respectieve selectie platen (van boven naar beneden in EEN). (B) Pick up kolonies van (A) tot vloeibare kweek te enten voor groei gedurende de nacht. (C) Oogst cellen door het draaien en decanteer de bovenstaande vloeistof. Na een korte pipetteren en het wassen van de pellets, spin down de cellen weer. (D) opnieuw op te schorten (het protocol te zien) en verdun de cel pellets met de infiltratie oplossing voor de finale te bereiken OD 600 = 0,5. (E) Meng voorzichtig the geresuspendeerd cellen in een petrischaal. (F) Gebruik een naaldloze injectiespuit aan de infiltratie mengsel duwen in de abaxiale zijde van de tabaksbladeren. (G) Ongeveer 48 uur na infiltratie, de bladeren zijn klaar voor confocale beeldvorming. Accijnzen bladschijven met besmette cellen met een perforator rond de infiltratie regio. Binnen de cirkels geven weggesneden verlof schijven. (H) Gebruik water om het blad schijven op een standaard glijbaan voor confocale beeldvorming monteren. De box diagrammen in het gearceerde gebied te beschrijven de eiwitten geïnjecteerd in tabaksbladeren voor polarisatie assay. Eiwit maten zijn niet in de schaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Display en kwantificering van Polariteit Formation. (AC) confocale beelden naar GVB en YFP bloei in tabak epidermale cellen vertonen. Cyan geeft aan dat de expressie van het GVB. Geel geeft de expressie van YFP. (A) Overexpressie van de GVB-BASL alleen. (B) Co-expressie van DNyda-nYFP en DNmpk6-cYFP. De YFP expressie wordt aangevuld wanneer twee eiwitten interageren. (C) Co-expressie van de GVB-BASL, DNyda-nYFP en DNmpk6-cYFP. Ongelijke verdeling (polariteit) is duidelijk voor zowel GVB en YFP. Schaal bar = 50 micrometer (AC). (DF) Grafisch uitzetten van de CFP / YFP fluorescentie-intensiteit langs de stippellijnen (Magenta) in (AC). Magenta driehoeken markeren het begin en eindpunt van de voor intensiteit plotten regio's. Kwantificering van de polariteit graad in tabak cellen eronder gepresenteerd. De waarden van fluorescentie intensiteit (H voor hoog en L voor laag) worden gemeten en verzameld door Fiji van de getraceerd met rode da regioloods lijnen in (AC). Voor elk monster, worden de waarden uit 20 cellen gemiddeld voor significantietoets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Algemeen gebruik en mogelijke wijzigingen van de tabak Transient Expression System Signaaltransductie: Overexpressie van fluorescerend eiwit (FP) gemerkte eiwitten in de tabak epidermis met succes gebruikt voor het snel onderzoeken van eiwit subcellulaire lokalisatie in plantencellen. Echter, het bestuderen van dynamische signalisatie verdeling van eiwit complex in planta is een uitdagend onderwerp te ingewikkeld subcellulaire contexten, voorbijgaande eiwit-eiwit interacties en signaaltransductie gebeurtenissen. Om deze uitdaging aan te pakken, hebben we geprofiteerd van de BiFC systeem om MAPK signalisatie gebeurtenissen te onderzoeken. Door co-expressie YDA-nYFP en MPK6-cYFP de teruggewonnen YFP signaal aangegeven dat de activering van de MAPK signalering relais kan optreden op de plasmamembraan.
Het zou ideaal zijn co-express fluorescent gelabeld YDA en MPK6 in Arabidopsis en de dynamische MAPK signalisatie in vivo te onderzoeken. Echter, generating transgene planten is tijdrovend, met name wanneer meerdere constructen gewenst. Eiwit tijdelijke expressie in tabak cellen snel inleidende test voor de in vivo expressie in Arabidopsis of andere planten. Het andere voordeel dat de tabak transiënt expressiesysteem biedt, maar kan niet gemakkelijk worden bereikt door het genereren van transgene planten is dat tot 4 of 5 fusie-eiwitten kunnen gelijktijdig co-expressie gebracht en onderzocht met confocale microscopie wanneer de combinatie haalbaar.
Het gebruik van tabak epidermale cellen om MAPK signalisatie in plantencellen onderzoeken kan verder worden uitgevoerd om andere signaalwegen en onder verschillende omstandigheden. Bijvoorbeeld zou de interactie van YDA-MAPK verandert de intensiteit of locatie wanneer de cel tot expressie wordt behandeld met lokale H 2 O 2 applicatie (een MAPK signalering stimulus)? Dergelijke testen kunnen snel worden opgezet en uitgevoerd om spec te pakkenific vragen. Meerdere leden bestaan in elke laag van de MAPK cassettes (3-4 tiers in het algemeen), maar hoe het signaleren specificiteit wordt bereikt in planten of andere systemen blijven grotendeels onbekend. Door verschillende combinaties van MAPKKKs met MAPKKs of MAPKKs met MAPK's, de tabak transiënt expressiesysteem kan een relatief grootschalige analyse van niet alleen eiwit-eiwit interactie, maar ook de ruimtelijke organisatie van de signalering stroming in plantencellen.
Aangepaste Co-expressie en BiFC test voor Onderzoek van Protein Polarisatie: Een langdurige fundamentele vraag in de celbiologie is hoe universele signaalwegen, bijvoorbeeld MAPK's, het bereiken van hun specificiteit op bepaalde ontwikkelingsstadium of onder bijzondere omstandigheden. Co-uiting van de polariteit eiwit BASL met de BiFC componenten van YDA en MPK6 in tabak cellen heeft ons toegelaten om aan te tonen dat de YDA-MAPK interactie en signalering ruimtelijk opnieuw wordt distributed door de aanwezigheid van BASL een bepaalde polariteit eiwitten tijdens stomatale ACD. Daarom kan de YDA-MAPK signalering specificiteit worden bereikt door interactie met BASL tot celpolariteit en asymmetrische verdeling bevorderen.
Hoewel het geen universeel fenomeen, hebben heel wat eiwitten bleken ongelijk verdeeld in plantencellen, bijvoorbeeld kleine GTPase ROP 15, auxine effluxer PIN eiwitten 16 en hun regulatoren 17, boor transporteurs 18 en andere onbekende eiwitten (OCTOPUS 19 , POLAR 20 en BRX 21). Dit protocol is niet de bedoeling om naar de genetische of fysieke partners in een bepaald eiwit polarisatie route, maar zal waarschijnlijk nuttig zijn om te testen of de interactie eiwitten met ROPs, pincodes of anderen een polariteit complex in plantencellen kan vormen. Echter, wanneer het proberen om een polarisatie evenement te simuleren het gebruik van tabak cellen, moet men in gedachten houden dat complicaties houdenkan optreden in de assays. Bijvoorbeeld kan de Arabidopsis polarisatie geval worden gekaderd tabakcellen, in het bijzonder wanneer meer componenten vereist dan kan worden opgenomen in de test. Een onbekende moleculen afgeleid van de tabak achtergrond, niet noodzakelijkerwijs de proteïnen onderzoek kan worden betrokken bij het induceren van een polarisatie gebeurtenis. Daarom is het essentieel om via strikte controle-experimenten in tabak en de gegevens in Arabidopsis of andere planten valideren.
Belangrijke elementen om te slagen in de experimenten: Ten eerste moet groen en gezond tabaksplanten worden gebruikt. Sinds kwantificering analyses moeten datapool uit verschillende cellen, is het cruciaal om te gebruiken bloeiende tabaksplanten met consequent gezonde cellen. Ten tweede moet de cellen die medium eiwitniveaus worden gebruikt voor confocale beeldvorming. Lage expressieniveaus niet voldoende eiwitten voor de assay en verzadigde expressie l biedenevels zou de polarisatie / translocatie effect maskeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
- Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
- Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
- Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
- Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
- Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).
- Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
- Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
- Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
- Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
- Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
- Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).
