Abstract
生きた細胞内での動的なシグナル伝達イベントの可視化が課題でした。我々は、植物細胞内でのシグナル伝達の空間的な分布を監視するタンパク質 - タンパク質相互作用を試験から、タバコ表皮細胞における生体分子蛍光相補性（BIFC）アッセイを確立した一過性発現系を拡大しました。このプロトコルでは、我々は相互作用し、 シロイヌナズナ MAPKKK YODAとMAPK6との間のシグナリングは、原形質膜で起こることを示すためにBIFCアッセイを使用しました。足場タンパク質のBASLを共発現させた場合、YODA-MAPKの相互作用は、再分配と空間的にCFP-BASLとの共偏します。この修正されたタバコの発現システムは、ローカリゼーションおよび動的な変更（4日未満）と蛍光タンパク質の色（少なくとも3）の倍数に対応することができるシグナル伝達の迅速な検査を可能にします。我々はまた、タンパク質の分布（非対称の空間的局在性、または「分極」を定量化する詳細な方法を提示し;）タバコ細胞インチこの高度なタバコ発現系は、生植物細胞の動的シグナリング事象の迅速な試験のために広く使用される可能性を有しています。
Introduction
タンパク質は、予測不可能な細胞環境で発生するほぼすべての生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たして複雑な階層型ネットワークとフォーム複合体内で相互作用します。しかし、成長の応答に対する植物の開発から、だけですぐにも効率的に細胞内レベルでこれらのダイナミックシグナル伝達事象を認識し、モニターすることができない便利なツールの欠如がありました。
タバコ葉表皮における一過性タンパク質発現システムは、生細胞内で蛍光タンパク質を可視化するための利点を訴えています。このシステムは、翻訳後タンパク質修飾とタンパク質の局在の迅速な検査を可能にする半in vivoでの条件を提供します。補完YFP信号を検査することによって、二分子蛍光相補性（BIFC）アッセイは、植物細胞内でのタンパク質 - タンパク質相互作用の可能性を通知します。他の方法に比べて、 例えば、酵母2ハイブリッド（Y2H）と共同-immunoprecipitation（共同IP）、BIFCは、タンパク質 - タンパク質相互作用は、細胞内レベルで発生する可能性があるコンパートメントを可視化する強力な手段を提供します。
非対称細胞分裂（ACD）は、組織/器官の形成のための新たな細胞型の生成中に細胞集団を幹維持するので、真核多細胞を促進するために不可欠な機構である。 シロイヌナズナ気孔発生は、植物にACDを研究するためのモデルシステムとして用いられてきました。前駆細胞、メリステモイド母細胞は、二つの異なる娘細胞を生成するために非対称的に分割し、メリステモイドは（ガード細胞のペアに終了する前に、細胞様の分裂幹受ける）と気孔系統の地上セル（SLGC）は（分裂と分化することができます舗装細胞）、それぞれ（ 図1）。気孔ACDでは、気孔系統における非対称の新規タンパク質のブレイキング（BASL）は分割非対称性を駆動するためにpremitotically偏光されて、どの株式会社リュド物理的な非対称性および細胞運命非対称性1。 MAPKKK YODAとのMAPK、MPK3と6から成るMAPKカスケードは、気孔分割パターニングと運命の採用2,3、4,5のための中心です。
最近、Zhang ら 。 ACD 6気孔シロイヌナズナのYDA-MAPKシグナル伝達経路への極性タンパク質BASLをリンクされています。標準的なYODA-MAPK経路は、MPK3 / 6を通じて、BASLをリン酸化し、その偏光を活性化させます。足場としてリン酸化BASL機能やタンパク質複合体を形成し、細胞表層6でシグナリングを集中するYODA（YDA）とMPK3 / 6を募集しています。 MAPKコンポーネントとBASLとYDA-MAPK経路の間に正のフィードバックループの偏光は、植物細胞中のタンパク質の偏光のための新規メカニズムを表します。局所的に濃縮されたMAPKシグナル伝達は密接に気孔ACD 6（ 図1）における細胞運命の分化にリンクされると仮定されています。 kの一つこのモデルをサポートEY実験データがBASL 6の発現により誘導されたMAPKの空間的な再分配を実証したタバコアッセイから来ました。
MAPK分子は、しばしば、細胞の内部にどこでも発見されたため、MAPKシグナル伝達が起こる場合、一般的には、監視することは容易ではありません。本研究では、シグナリングリレーが発生する場所を示唆するために、上流キナーゼおよび下流のものとの間の相互作用を可視化するために、分割YFPシステムを利用しました。我々はさらに、どのように補完YFPが空間的に共同によって変調することができるかどうかを可視化する（タンパク質 - タンパク質相互作用を示唆する）、分割YFPペアと第3のタンパク質を（CFPタグ付き）を共発現することによりBIFCシステムの使用を拡張しましたCFPタンパク質を発現しました。そうすることによって、我々はタバコ表皮の細胞表層で偏パターニングに均一な分布からYDAとMPK6、間の相互作用の空間的な再編成を誘導されたCFP-BASLの共発現を示しましたら細胞。このシステムは、したがって、細胞は、内部または外部刺激（ 例えば、他のタンパク質の同時発現、化学的応用、病原体攻撃または環境の変化などによりチャレンジされたときの条件の下で、植物細胞中で動的シグナル伝達事象を監視するために開発される可能性があります。 ）。
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Protocol
1.プラスミド構築
- 以前に1,6に記載されているような技術をクローニングすることによって構築物を生成します。
- 最初BASLのコード配列を増幅するために適切なプライマーを用いた高忠実度DNAポリメラーゼを使用し、YDAとMPK6とエントリーベクターにそれらをサブクローン。 7での詳細なプロトコルを検索します。
- MPK6とYDAのドミナントネガティブバージョン（DNmpk6 8とDNyda 4、それぞれ）を生成するには、テンプレートとしてMPK6とYDAのエントリープラスミドを使用して、部位特異的突然変異誘発法9により、点変異を導入します。
- タバコ一過性アッセイのための構築物を構築するには、pH35CG 10にBASLを統合するために、標準的なLR（attL部位のx attRの組換え）の反応（7における詳細な手順を）行い、pXNGWとpXCGWにDNydaとDNmpk6はそれぞれ、11ベクトル 。
- 酵素消化と配列決定によって得られたプラスミドを確認してください。一度です3日- uccessful、GV3101 12株と2 28℃で選択プレート上で生育するアグロバクテリウム・ツメファシエンスにバイナリー構築物を形質転換します。
アグロバクテリウム浸潤液の調製
- 構築pH35CG、pXNGWとpXCGW用を100μg/ mlのルリア-ベルターニ（LB）適切な抗生物質を含む培地10mlに、いくつかの新たに形質転換されたアグロバクテリウムのコロニーを接種する（ゲンタマイシンを25μg/ mlで、リファマイシンを25μg/ mlで、スペクチノマイシン、同じ濃度P19のためのカナマイシンを50μg/ mlのゲンタマイシン及びリファマイシン（トランスジェニックサイレンシングに対してタンパク質を発現する）13の。
- 約16時間、200回転の速度で28℃のシェーカーでアグロバクテリウム培養液を成長した後、OD 600（1.5達する見込み- 1.8）を測定する（ 図2A-B）を 。 10分間、2500×gでの文化をスピンダウン。再懸濁し、WAMgCl 2 10mMの（浸透液）で細胞ペレットをshに。
- 最終OD 600 = 0.5（ 図 2C-D）に到達するために、再度の文化をスピンダウンし、浸透液の適切な量の再懸濁ペレット。 3時間 - 植物を浸潤する前に、1、室温での細胞の混合物を残します。この工程は、細胞の恒常性を維持するのに役立ちます。
3.タバコ工場、リーフ・インジェクション
- 葉注射のために（16時間光/ 8時間暗のサイクルで23°C）標準植物成長チャンバー内で5週齢の14から4成長タバコ植物（ ベンサミアナタバコ）を 、使用してください。
注：この段階では、タバコ植物は、典型的には6葉（2大、2培地、および2小）を有します。 2中型の葉は葉の注入（二つの小さなものは、多くの場合、あまりにも若いうち二つの大きなものは、あまりにも古いです）のために最も最適です。 - 浸潤の日の前に、水tobac共同植物は土壌を飽和させます。
- 3時間 - 浸潤の日に、1のために暗闇の中で植物をプレインキュベートします。このステップでは、葉の表皮細胞内に浸透するとき大幅にアグロバクテリウムを容易にする、表皮内の気孔が広く開くことができます。
- 日付で標識された色のテープを使用して、潜入する葉にフラグを設定。マーク黒の太いシャーピーで浸潤する分野（オプション;浸透した領域が感染された後に表示されています。）。
- アグロバクテリウムの再懸濁液の等しい体積を取り、穏やかに旋回（ 図2E）によって100×15ミリメートルペトリ皿にそれらを混ぜます。注：私たちのケースでは、我々はDNmpk-cYFPのCFP-BASLの1ミリリットル、DNyda-nYFPの1ミリリットルと1ミリリットルでのp19の1ミリリットルを混合しました。
- 浸潤の過程では、浸潤混合物で3ミリリットルの無針注射器を埋める（1〜2ミリリットル）およびタバコの葉の下側（背軸）（ 図2F）に押し込みます。浸潤が、それは便利ですプッシュする一方の手を使用すると、他の手は優しく（押圧力に抗して、向軸）上側をサポートします。
注：浸潤混合物が正常に注入されると、感染した領域は表皮に容易に認識になります。しかし、浸潤が原因で、過酷な注入（組織損傷）又は不十分なプッシュ（無液体の浸透）に失敗することがあります。各試験のために、我々は、（異なる植物からの）は、2つの独立した葉の中の少なくとも2回の注射を示唆しています。 - バック成長チャンバ内に感染した植物を置きます。一般的に、タンパク質発現は、浸潤、次の48時間後に検出可能です。
4.共焦点イメージング
- （ - 4ディスク/領域を製造することができる通常3）（ 図2G）48時間後の浸潤では、注入された領域からリーフディスクを切除するために穴パンチャーを使用します。静かにスライド（上向きの背軸側）にリーフディスクを転送し、水滴でそれらをマウントするためにピンセットを使用してください。あまりにもHAR押す避けてくださいカバースリップ上のdが絞ら/損傷を受けた細胞は、共焦点顕微鏡（ 図2H）の下でうまく表示されませんので。
- 共焦点イメージングの前に、発現レベルを確認するために、エピ蛍光化合物顕微鏡に搭載されたサンプルをスキャンします。注意：私たちの経験に基づいて、中間の発現レベルを示す細胞が最高の共焦点顕微鏡下で表現されます。
- 共焦点顕微鏡上の40X（NA 1.3）レンズを開始します。蛍光タンパク質の培地レベルを発現する細胞が中心に残るように任意の位置にスライドを調整します。それぞれ540 nmの、 - 500 nmおよび514 nmの/ 520 - CFPとYFPの励起/発光スペクトルは、458nmで/ 480です。
- レーザー強度と最もバランスのとれた蛍光強度/ノイズ比のためのスマートゲインを調整後、画像をプレビューする「ライブ」ボタンを有効にします。結像品質を改善するために、走査画素および/またはフレーム/ライン平均値を増加させます。最後に、REAに焦点調節ノブを調整chの中央値は焦点面とは、画像を撮影するために、「取得」をクリックします。
注：CFPとYFPの画像は、それぞれ、「順次」走査モードのオプションをオンまたはオフチェックすることにより、連続的にまたは同時に捕捉することができます。 - Z投影が「XYZ」の撮影モードを選択し、セルの詳細なビューのために所望される場合、走査範囲の深さを定義する（10 - は15μm）にし、標的細胞の上から下へ画像を収集。 .TIFFファイルとして選択し、「名前の変更」に画像ファイルを右クリックして、ライカのソフトウェアで得られた画像をコンパイルし、輸出画像。
- 画像30 - 定量分析のための40の細胞。
5.画像処理および定量分析
- 画像を処理し、定量を行うためにフィジーソフトウェア（http://fiji.sc/Fiji）を使用します。
- 蛍光強度のグラフをプロットします。
- より良いCFP / YFPの発現があるかどうかを視覚化するために、均一に分布し、細胞周囲に沿ってCFPとYFPの信号強度を示すためにフィジーを使用しています。これを達成するために、最初のイメージを起動するには「ファイル」と「開く」を選択し、フィジーを起動します。ツールメニューの「行」をクリックし、右クリックして「セグメント化された行」を選択します。関心領域を決定し、CFPまたはYFP信号（ 図3A-C）をトレースする細胞周辺に沿って線を引きます。
注：フィジーは、セグメント化された線に沿って、絶対蛍光強度値を測定します。 - セグメント化された線に沿ってCFP / YFPのレベルを表す位置と強度値でグラフを生成するには、ドロップダウンメニュー「分析」と「プロット・プロファイル」を選択します。必要であれば、同等の強度のグラフを生成するために、Excelや他のグラフィックソフトに（メニュー「コピー」を選択することで）強度値を複製します。
- より良いCFP / YFPの発現があるかどうかを視覚化するために、均一に分布し、細胞周囲に沿ってCFPとYFPの信号強度を示すためにフィジーを使用しています。これを達成するために、最初のイメージを起動するには「ファイル」と「開く」を選択し、フィジーを起動します。ツールメニューの「行」をクリックし、右クリックして「セグメント化された行」を選択します。関心領域を決定し、CFPまたはYFP信号（ 図3A-C）をトレースする細胞周辺に沿って線を引きます。
- 極性の程度を定量化。
- 約20 represenを収集3回の反復実験からtative細胞はタバコ細胞でのCFPとYFPの極性度を評価しました。 （Lとして定義される）低い蛍光強度を超える（Hとして定義される）高い蛍光強度の比に基づいて、極性度を計算します。注：定量方法は、図3で説明されています。
- HとLの値を測定するには、「測定」をドロップダウンメニューから「分析」して、[選択]をクリックし、（上記の）細胞周辺での関心領域に沿ってセグメント化された線を引きます。 「結果」ウィンドウがポップアップ表示された場合、値が定量化を行うために「平均」を使用します。
- CFPとYFPの比較的均一な発現を示す細胞から、 例えば 、CFP-BASL（ 図3A）またはYFPがDNyda-nYFPとDNmpk6-cYFP（ 図3B）の共発現から補完、測定することにより、HとLの値を取得2はランダムに同じ長さで、周辺のセグメントを選択しました。 <李>は、この場合には、蛍光タンパク質の明白な極性蓄積を示す細胞から、CFP-BASL、DNyda-nYFPとDNmpk6-cYFP（ 図3C）、の共発現は、濃縮された蛍光信号と周辺領域からH値を収集しますおよび低/無蛍光の蓄積と地域からLsを。
- 20細胞を一緒正規分布のための試験からのH / Lの結果の比率をプール。 （正規分布の場合） スチューデントのt検定によりp値または（非正規分布の場合）コルモゴロフ-スミルノフ（KS）テストを計算します。
- 約20 represenを収集3回の反復実験からtative細胞はタバコ細胞でのCFPとYFPの極性度を評価しました。 （Lとして定義される）低い蛍光強度を超える（Hとして定義される）高い蛍光強度の比に基づいて、極性度を計算します。注：定量方法は、図3で説明されています。
- 蛍光強度のグラフをプロットします。
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Representative Results
過活動MAPKシグナル伝達によって誘導される細胞死を防止するために、YDA（DNyda）及びMPK6（DNmpk6）のキナーゼ不活性バージョンは、タバコ細胞における共発現アッセイに使用しました。 BIFCによって明らかになったDNydaとDNmpk6の間の相互作用も、CFP-BASL自体はいずれも、不均一な分布パターン（ 図3A-B）を生成しました。 CFP-BASLがDNyda-DNmpk6の相互作用ペアに導入したときただし、CFPとYFP信号の両方を高度に分極方法（ 図3C）に再分配されました。この再分配はBASLが空間的に植物細胞におけるMAPKシグナル伝達経路を再編成するYDAとMPK6と相互作用することを示唆しています。リン酸欠乏のバージョンが弱い活動6を示した一方で、非常に強い極性生成BASLのリン酸化模倣バージョン：BASLのリン酸化状態は、MAPKシグナル伝達の極性度の差動影響を与えます。これらのデータは、当社の作業モデルをサポート BASLと細胞極性6を生成する際にYDA-MAPK経路との間に正のフィードバック調節。
気孔非対称細胞分裂 シロイヌナズナ における（ACD）の間にBASL-YDA-MPK6極性コンプレックスの図1.ダイアグラム 。葉の表皮では、気孔の行数は、メリステモイド母細胞ACD前駆細胞になるように拡大protodermal細胞から開始します（MMCは）。 MMCは分裂し、最終的にそれぞれ、気孔孔辺細胞と舗装細胞に分化することができる1メリステモイドと1 SLGC（気孔系統の地上セル）を、作成するために、ACDを受けます。 ACD前駆細胞（のMMC）の細胞皮質において、BASL極性複合体を形成し、気孔ACDを調節する、MAPK経路の二つの成分、MAPKKK YDAおよびMAPK MPK6を動員します。オム/ファイル/ ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
タバコの葉の表皮内注入手順の図2.図。（A）CFP-BASLを保有するプラスミドをトランスフォーム、 アグロバクテリウムへのDNyda-nYFP、DNmpk6-cYFPとP19は、GV3101 ツメファシエンスとで上から下に（それぞれの選択プレート上に成長させますA）。 （B）一晩の成長のための液体培養物を接種するために（A）からコロニーをピックアップ。紡績、上清をデカントすることにより（C）細胞を回収します。簡単にピペッティングし、ペレットを洗浄した後、再び細胞をスピンダウン。 （D）最終OD 600 = 0.5を達成するために、（プロトコルを参照）に再懸濁し、浸潤溶液で細胞ペレットを希釈。 （E）は静かに目を混ぜますEのペトリ皿に細胞を再懸濁しました。 （F）は、タバコの葉の背軸側に浸潤混合物をプッシュする無針注射器を使用してください。 （G）浸潤後約48時間で、葉は共焦点イメージングのための準備が整いました。浸潤領域の周囲穴パンチャーで感染した細胞を含む物品税の葉のディスク。破線の円を切り出し休暇ディスクを示しています。 （H）、共焦点イメージングのための標準的なスライド上に葉のディスクをマウントするために水を使用してください。斜線部分でのボックス図は、タバコに注入されたタンパク質は、偏光アッセイのために残し説明します。タンパク質のサイズはスケールではありません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.ディスプレイと極性形成の定量化。 >（AC）共焦点画像タバコ表皮細胞にCFPとYFPの蛍光を表示します。シアンは、CFPの発現を示します。黄色はYFPの発現を示します。単独でCFP-BASLの（A）の過剰発現。 （B）DNyda-nYFPとDNmpk6-cYFPの同時発現。 2つのタンパク質が相互作用したときにYFPの発現が補完されます。 （C）CFP-BASL、DNyda-nYFPとDNmpk6-cYFPの同時発現。偏在（極性）は、CFPとYFPの両方に明らかです。 （AC）中=50μmのスケールバー。 （DF）をグラフィカルに破線（マゼンタ）（AC）に沿って、CFP / YFPの蛍光強度をプロットします。マゼンタの三角形は、強度プロットに使用する領域の開始と終了点をマーク。タバコ細胞における極性度の定量化は、下に提示されています。蛍光強度（ハイとローのためのLのためのH）の値は、赤いダでトレース地域からフィジーで測定し、収集され（AC）の行を流しました。各サンプルについて、20細胞からの値は、有意差検定について平均化されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
一般的な使用およびシグナル伝達のためのタバコ一過性発現系の可能な修正：蛍光タンパク質の過剰発現（FP）が正常に植物細胞内でタンパク質の細胞内局在の高速検査に使用されてきたタバコの表皮中のタンパク質をタグ付き。しかし、 植物体中のタンパク質複合体の動的シグナリング分布を研究することは、複雑な細胞内のコンテキスト、一過性のタンパク質-タンパク質相互作用およびシグナル伝達イベントに挑戦し話題です。この課題に対処するために、我々はMAPKシグナル伝達事象を調べるためにBIFCシステムを利用しました。共発現YDA-nYFPとMPK6-cYFPすることにより、回収されたYFP信号は、MAPKシグナル伝達リレーの活性化は、原形質膜で発生する可能性があることを示しました。
これは、蛍光シロイヌナズナでYDAとMPK6をタグ付けし、 生体内でのシグナリングダイナミックMAPKを検討することを共発現することが理想的です。しかし、GEトランスジェニック植物をneratingは、複数の構築物が所望される場合は特に、時間がかかります。タバコ細胞におけるタンパク質の一過性発現は、 シロイヌナズナや他の植物におけるin vivo発現のための迅速な予備試験することができます。タバコの一過性発現システムが提供するが、容易にトランスジェニック植物を生成することによって達成することができない他の利点は、最大4または5の融合タンパク質を同時に共発現との組み合わせが実現可能である場合、共焦点顕微鏡で観察することができることです。
植物細胞におけるMAPKシグナル伝達を調べるためにタバコ表皮細胞を使用することは、さらに、他のシグナル伝達経路に、異なる環境条件下で実施することができます。発現している細胞は、ローカルH 2 O 2のアプリケーション（MAPKシグナル刺激）で処理された場合例えば、YDA-MAPKの相互作用は、その強度や位置を変更するのでしょうか？このようなアッセイは、迅速に設計され、仕様に対処するために行うことができますIFIC質問。複数のメンバーは、MAPKカセットの各階層に存在する（3 - 一般的には4段）が、どのようにシグナル伝達特異性は、植物や他のシステムで達成されるには、ほとんどわかっていません。 MAPKとMAPKKs、またはMAPKKsでMAPKKKsの異なる組み合わせを作ることにより、タバコの一過性発現系だけでなく、タンパク質 - タンパク質相互作用の比較的大規模な分析だけでなく、植物細胞におけるシグナリングフローの空間的な組織化を可能にします。
カスタマイズされたタンパク質の偏光の調査のための共発現とBIFCアッセイ：細胞生物学における一つの長年の基本的な問題は、特定の発達段階で、または特定の環境条件下でそれらの特異性を達成する方法をユニバーサルシグナル伝達経路、 例えば、MAPKは、あります。タバコ細胞におけるYDAとMPK6のBIFC成分と極性タンパク質BASLは、私たちはYDA-MAPKの相互作用およびシグナル伝達が空間的に再-Dであることを実証することができました共発現BASLの存在、気孔ACD中に特定の極性タンパク質によってistributed。したがって、YDA-MAPKシグナル伝達の特異性は、細胞極性および非対称分裂を促進するBASLとの相互作用によって達成することができます。
それは普遍的な現象ではないですが、かなりの数のタンパク質は、 例えば 、低分子量GTPaseのROP 15、オーキシンeffluxerのPINタンパク質16とそのレギュレータ17、ホウ素トランスポーター18といくつかの未知のタンパク質（OCTOPUS 19、不均一に植物細胞内に分布していることが見出されました、POLAR 20、及びBRX 21）。このプロトコルは、特定のタンパク質の偏光経路における遺伝的または物理的なパートナーを検索することを意図していなかったが、可能性のROP、ピンまたは他の人と相互作用するタンパク質は、植物細胞における極性複合体を形成することができるかどうかをテストするのに有用であろう。タバコ細胞を用いて、偏光のイベントをシミュレートしようとしたときただし、1は合併症ということを覚えておいてくださいアッセイで発生することがあります。複数のコンポーネントは、アッセイに収容することができるものよりも要求される場合、例えば、 シロイヌナズナ分極イベントは、特に、タバコ細胞において再現されないことがあります。タバコ背景、必ずしも検査中のタンパク質に由来するいくつかの未知の分子は、分極事象を誘発に関与し得ます。したがって、タバコにおける厳格なコントロール実験を設定し、 シロイヌナズナや他の植物でデータを検証することが不可欠です。
実験で成功するために重要な要素：まず、緑がかった、健康なタバコ植物を使用する必要があります。定量化は、種々の細胞からのデータをプールする必要が解析ので、一貫して健康な細胞と繁栄タバコ植物を使用することが重要です。第二に、中タンパク質レベルを発現する細胞は、共焦点イメージングのために使用されるべきです。低い発現レベルは、アッセイのために十分なタンパク質および飽和表現リットルを提供することはできませんevelsは、偏光/転位効果をマスクすることになります。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
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