Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Avbildning Rumslig Reorganisation av ett MAPK-signalvägen Använda Tobacco Transient Expression System

Published: March 20, 2016 doi: 10.3791/53790

Abstract

Visualisering av dynamisk signalering händelser i levande celler har varit en utmaning. Vi utökat ett etablerat transient expressionssystem, den biomolekylära fluorescerande komplemente (BiFC) -analys i tobaks epidermala celler, från testning protein-proteininteraktion att övervaka rumsliga fördelningen av signaltransduktion i växtceller. I detta protokoll använde vi BiFC-analysen som visar att interaktionen och signaleringen mellan Arabidopsis MAPKKK YODA och MAPK6 inträffar vid plasmamembranet. När ställningen protein BASL samuttrycktes, den YODA-MAPK interaktion omfördelas och rumsligt sam-polariserad med GFP-BASL. Denna modifierade tobak expressionssystem möjliggör en snabb undersökning av signal lokalisering och dynamiska förändringar (mindre än 4 dagar) och kan rymma flera av fluorescerande protein färger (minst tre). Vi presenterade också detaljerade metoder för att kvantifiera proteinfördelningen (asymmetrisk spatial lokalisering, eller "polarisering";) I tobaksceller. Denna avancerade tobak expressionssystem har en potential att användas i stor utsträckning för snabba tester av dynamisk signalering händelser i levande växtceller.

Introduction

Proteiner interagerar inom en invecklad hierarkiskt nätverk och bildar komplex som spelar en central roll i nästan alla biologiska processer som sker i en oförutsägbar cellulär miljö. Men från växtutveckling till tillväxtsvar, har det funnits en brist på praktiska verktyg som kan inte bara snabbt utan också effektivt identifiera och övervaka dessa dynamiska signalering händelser på subcellulära nivå.

Den övergående proteinuttryck systemet i tobaksbladhuden har tilltalande fördelar för att visualisera fluorescerande proteiner i levande celler. Detta system ger semi- vivo förhållanden som tillåter posttranslationell proteinmodifiering och snabb undersökning av protein lokalisering. Genom att undersöka den kompletteras YFP-signalen informerar bimolekylära fluorescerande komplemente (BiFC) assay möjligheten att protein-proteininteraktion i växtceller. Jämfört med andra metoder, till exempel, jäst-två hybrid (Y2H) samt co-immunoprecipitation (Co-IP), ger BiFC också ett kraftfullt medel att visualisera avdelningar där protein-proteininteraktioner kan uppstå på subcellulär nivå.

Eftersom asymmetrisk celldelning (ACD) bibehåller stamcellspopulation samtidigt generera nya celltyper för vävnad / organbildning, är det en oumbärlig mekanism för att främja eukaryot flercellighet. Arabidopsis stomata utveckling har använts som ett modellsystem för att studera ACD i växter. Prekursorn cell, meristemoid modercell, delar upp asymmetriskt för att producera två olika dotterceller, en meristemoid (undergår stamcellsliknande divisioner innan avslutning in i ett par vaktceller) och en stomatal härstamning markcell (SLGC) (kan dela sig och differentiera till en trottoar cell), respektive (Figur 1). I stomata ACD, är det nya proteinet Breaking asymmetri i stomata Lineage (BASL) polariserad premitotically att driva division asymmetrier som include fysisk asymmetri och cell öde asymmetri 1. En MAPK kaskad bestående av MAPKKK YODA och MAPK, MPK3 och 6 är central för stomata division mönstring och öde adoption 2,3, 4,5.

Nyligen Zhang et al. kopplat polariteten protein BASL till YDA-MAPK signalväg i Arabidopsis stomata ACD 6. Den kanoniska YODA-MAPK-vägen, genom MPK3 / 6, fosforylerar BASL och aktiverar dess polarisation. Fosforylerade BASL fungerar som en byggnadsställning och rekryterar YODA (YDA) och MPK3 / 6 för att bilda ett proteinkomplex och koncentrera signaleringen vid cell cortex 6. Polarisering av MAPK komponenter och positiv återkoppling mellan BASL och YDA-MAPK-vägen representerar en ny mekanism för protein polarisering i växtceller. Lokalt berikat MAPK signaleringen hypotes att vara nära kopplad till cell öde differentiering stomata ACD 6 (Figur 1). En av de key experimentella data som stödde denna modell kom från tobaks analyser som visade den rumsliga omfördelning av MAPK inducerade av uttrycket av BASL 6.

I allmänhet är det inte lätt att följa där MAPK signaleringen beror MAPK molekyler ofta överallt inne i en cell. I denna studie, utnyttjade vi split-YFP-systemet att visualisera interaktionen mellan uppströms kinas och ettor nedströms att föreslå var signalerings reläet inträffar. Vi utvidgade vidare användningen av BiFC systemet genom co-uttrycker ett tredje protein (GFP-tagged) med split YFP paret (tecken på protein-protein-interaktion) att visualisera om och hur kompletteras YFP kunde spatialt moduleras av co- uttryckte GFP-proteinet. Genom att göra så, visade vi att samexpression av CFP-BASL inducerad rumslig omorganisation av interaktioner mellan YDA och MPK6, från jämn fördelning till polariserad mönstring vid cell cortex hos tobaks EpiDermal celler. Detta system har därför potential att utvecklas för att övervaka dynamisk signalering händelser i växtceller under förhållanden när cellerna utmanas av de interna eller externa stimuli (t.ex. samexpression av andra proteiner, kemiska ansökan, patogen attack eller miljöförändringar, osv. ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmidkonstruktion

  1. Generera konstruktionerna genom kloningsteknik som tidigare beskrivits 1,6.
    1. Först använda en high fidelity-DNA-polymeras med lämpliga primrar för att amplifiera de kodande sekvenserna av BASL, YDA och MPK6 och sub-klona dem in i inträdes vektorer. Hitta den detaljerade protokoll 7.
    2. För att generera de dominerande negativa versioner av MPK6 och YDA (DNmpk6 8 och DNyda 4, respektive), använda posten plasmider av MPK6 och YDA som mall och införa punktmutationer genom en riktad mutagenes metod 9.
  2. Att bygga konstruktioner för tobaks transienta analyser, genomföra standard LR (attL x attR rekombination) reaktioner (detaljerad förfarande 7) för att integrera BASL i pH35CG 10, DNyda och DNmpk6 i pXNGW och pXCGW vektorer 11, respektive.
    1. Bekräfta de resulterande plasmiderna med enzymklyvning och sekvensering. en gång äruccessful, omvandla binära konstruktionerna i Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 12 och odla dem på selektionsplattor vid 28 ° C under 2 - 3 dagar.

2. Beredning av Agrobacterium Infiltration Lösning

  1. Ympa några nyligen transformerade Agrobacterium kolonier in i 10 ml Luria-Bertani (LB) medium med lämpliga antibiotika (Gentamycin 25 | ig / ml, Rifamycin 25 | ig / ml, Spectinomycin 100 ^ g / ml för pH35CG, pXNGW och pXCGW konstruerar; samma koncentrationer gentamycin och Rifamycin med Kanamycin 50 pg / ml för P19 (uttrycka proteiner mot transgen tyst) 13.
  2. Väx Agrobacterium kulturer i en 28 ° C skakare vid en hastighet av 200 varv per minut under cirka 16 timmar och sedan mäta OD 600 (uppgå till 1,5-1,8) (Figur 2A-B). Centrifugera ner kulturerna vid 2500 xg under 10 min. Återsuspendera och wash cellpelletarna med 10 mM MgCl2 (infiltrationen lösning).
  3. Centrifugera ner kulturerna igen och återsuspendera pellets med lämplig mängd av infiltration lösningen för att nå den slutliga OD 600 = 0,5 (Figur 2C-D). Innan infiltrera växter, lämnar cellblandningarna vid rumstemperatur under 1-3 h. Detta steg hjälper till att upprätthålla cell homeostas.

3. tobaksplanta och Leaf Injection

  1. Använd tobaksplantor (Nicotiana benthamiana), odlas 4-5 veckor gamla i en vanlig växt tillväxtkammare (23 ° C med cykler av 16 timmar ljus / 8 timmar mörker) 14 för blad injektion.
    Obs: I det här skedet, tobaksplantor har typiskt 6 blad (2 stora, två medel, och två små). De två medelstora blad är den mest optimala för blad injektion (de två stora hålen är för gamla, medan de två små är ofta alltför unga).
  2. Innan infiltration dag, vattna tobacco växter för att mätta jorden.
  3. På infiltration dag, pre-inkubera växterna i mörker i 1 - 3 h. Detta steg möjliggör stomata i epidermis att öppna kraftigt, vilket avsevärt underlättar Agrobacterium när tränger in i blad epidermala celler.
  4. Använda färg band märkta med datum, flagga bladen för att infiltreras. Markera de områden som ska infiltreras med en svart tjock sharpie (tillval, de infiltrerade områdena är synlig efter att ha smittats.).
  5. Ta lika stora volymer av Agrobacterium resuspension och blanda dem i en 100 x 15 mm petriskål av försiktig rotering (Figur 2E). Obs: I vårt fall blandades vi 1 ml p19 med 1 ml av CFP-BASL, 1 ml DNyda-nYFP och 1 ml DNmpk-cYFP.
  6. I processen för infiltration, fylla en 3 ml nållös spruta med infiltrationen blandning (1 - 2 ml) och skjut in i den undre sidan (abaxial) av tobaksblad (Figur 2F). Medan infiltrera, är det braatt använda en hand för att driva och den andra handen för att försiktigt stödja den övre sidan (adaxial, mot tryckkraften).
    Obs: När infiltration blandningen framgångsrikt injiceras, kommer de infekterade områdena blir lätt att känna igen i överhuden. Emellertid kan infiltrationen misslyckas på grund av hårda injektion (vävnadsskada) eller otillräcklig push (ingen vätskepenetration). För varje test, föreslår vi åtminstone två injektioner i två oberoende blad (från olika växter).
  7. Placera de infekterade växterna tillbaka i tillväxtkammaren. Generellt proteinuttryck kan detekteras efter 48 timmar efter infiltration.

4. Confocal avbildning

  1. Vid 48 timmar efter infiltration, använder en hålslaget att skära ett blad skiva från det injicerade området (normalt 3 - 4 diskar / område kan framställas) (Figur 2G). Använd pincett för att försiktigt överföra bladskivor till en bild (den abaxial uppåt) och montera dem med vattendroppar. Undvik att trycka alltför HARd på locket glida eftersom pressade / skadade celler inte kommer att visa bra under konfokalmikroskop (Figur 2H).
  2. Innan konfokal avbildning, skanna monterade proverna på en epi-fluorescerande mikroskop för att kontrollera expressionsnivåer. Obs: Baserat på vår erfarenhet, är de celler som uppvisar mellanexpressionsnivåer bäst representerade under konfokalmikroskop.
  3. Börja med 40X (NA 1,3) objektiv på en konfokalmikroskop. Justera bilden till önskad position så att cellerna uttrycker mellannivåer fluorescerande protein kvar i centrum. De excitation / emissionsspektra för GFP och YFP är 458 nm / 480-500 nm och 514 nm / 520-540 nm, respektive.
  4. Aktivera "Live" för att förhandsgranska bilderna justera sedan laser intensitet och smart vinst för den mest balanserade fluorescensintensiteten / brusförhållande. För att förbättra bildkvalitet, öka skanningspunkter och / eller ram / linjegenomsnitt. Slutligen, justera fokuseringsratten till reach median fokalplanet och klicka på "Capture" för att ta bilden.
    Obs: Den gemensamma fiskeripolitiken och YFP bilder kan tas i följd eller samtidigt genom att kontrollera på eller stänga av alternativet "sekventiell" scanning, respektive.
  5. När Z-projektion önskas för den fördjupade vy av cellerna, välj "xyz" bildåtergivningsläge, definierar djupet på avsökningsområde (10-15 ^ m) och samla bilder från toppen till botten av målcellen . Sammanställa de erhållna bilderna med Leica programvara genom att högerklicka på bildfilen för att välja "döpa" och exportera bilder som TIFF-filer.
  6. Bild 30 - 40 celler för kvantifiering analys.

5. Bildbehandling och kvantifiering analys

  1. Använd Fiji programvara (http://fiji.sc/Fiji) att bearbeta bilder och utföra kvantifiering.
    1. Rita fluorescensintensiteten grafer.
      1. För att bättre visualisera om GFP / YFP uttryck ärlikformigt fördelade, använd Fiji att demonstrera signalstyrkan för GFP och YFP längs cellens periferi. För att uppnå detta, först lansera Fiji välj sedan "File" och "Open" för att starta bilden. Klicka på "line" på verktygsmenyn och välj "Segmenterad line" genom att högerklicka. Bestäm regionen av intresse och dra en linje längs cellperiferin att spåra GFP eller YFP signal (Figur 3A-C).
        Obs: Fiji mäter absolut fluorescensintensitetsvärdet längs segmente linjer.
      2. Välj rullgardinsmenyn "Analysera" och "Plot profil" för att generera en graf med positions och intensitetsvärden som representerar nivåerna av GFP / YFP längs den segmenterade linjen. Om så önskas, duplicera intensitetsvärdena (genom att välja menyn "Kopiera") till Excel eller annat grafiskt program för att generera jämförbara intensitetsdiagram.
    2. Kvantifiera polaritet grad.
      1. Samla cirka 20 repretiva celler från 3 upprepade experiment för att utvärdera polariteten graden av GFP och YFP i tobaksceller. Beräkna polaritet grad baserat på förhållandet av den höga fluorescensintensitet (definierad som H) över den låga fluorescensintensitet (definierad som L). Notera: Kvantifieringen metoden förklaras i figur 3.
        1. För att mäta de H- och L-värden, rita en segmenterad linje längs den berörda regionen vid cell periferi (beskriven ovan), klicka på "Analysera" i rullgardinsmenyn och välj sedan "Measure". När en "resultat" fönster dyker upp, använder "Mean" värden för att utföra kvantifiering.
        2. Från de celler som uppvisar relativt likformig uttryck av GFP och YFP, t.ex., CFP-BASL (figur 3A) eller YFP kompletteras från samuttryck av DNyda-nYFP och DNmpk6-cYFP (figur 3B), erhålla de H- och L-värden genom att mäta två slumpmässigt utvalda perifera segment med samma längd.
        3. <li> Från celler som uppvisar uppenbara polär anhopning av fluorescerande proteiner, i detta fall samexpression av GFP-BASL, DNyda-nYFP och DNmpk6-cYFP (figur 3C), samla in timvärden från randområden med anrikade fluorescenssignaler och Ls från regioner med låg / ingen fluorescens ackumulering.
        4. Pool de resulterande förhållanden för H / L från 20 celler tillsammans och testa för normalfördelning. Beräkna p-värden vid Students t-test (för normalfördelningen) eller Kolmogorov-Smirnov (KS) test (för icke-normalfördelning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att förhindra celldöd inducerad av den hyperaktiva MAPK signaleringsades de kinas inaktiva versioner av YDA (DNyda) och MPK6 (DNmpk6) som används i samexpression analys i tobaksceller. Varken interaktionen mellan DNyda och DNmpk6 avslöjades genom BiFC nor CFP-BASL självt genererade ojämna fördelningsmönster (Figur 3A-B). Emellertid, när GFP-BASL infördes i DNyda-DNmpk6 interaktionsparet, var båda GFP och YFP signaler omfördelas till en starkt polariserad sätt (figur 3C). Denna omfördelning tyder på att BASL interagerar med YDA och MPK6 att spatialt omorganisera MAPK signalväg i växtceller. Fosforyleringen status BASL har differential påverkar polariteten graden av MAPK signaleringen: a fosfor liknande version av BASL genereras mycket stark polaritet, medan en fosfor-brist version visade svagare aktivitet 6. Dessa data stöds vår arbetsmodell av en positiv feedback reglering mellan BASL och YDA-MAPK-vägen för att generera cell polaritet 6.

Figur 1
Figur 1. Diagram över BASL-YDA-MPK6 polaritet Complex Under stomata Asymmetrisk celldelning (ACD) i Arabidopsis. I bladet epidermis, initierar stomata Linage från protodermal celler, som expanderar för att bli ACD prekursorceller, de Meristemoid moderceller (MMC). En MMC undergår en ACD för att skapa en Meristemoid och en SLGC (stomata lineage markcell), som kan dela sig och så småningom differentiera till stomatala vaktceller och trottoar celler, respektive. Vid cell cortex av ACD prekursorceller (MMC), BASL rekryterar två komponenter i en MAPK väg, till MAPKKK YDA och MAPK MPK6 bildar en polaritet komplex och reglera stomata ACD.om / filer / ftp_upload / 53.790 / 53790fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Diagram över injektionsproceduren i Tobacco Leaf epidermis. (A) Trans plasmiderna som hyser GFP-BASL, DNyda-nYFP, DNmpk6-cYFP och P19 i Agrobacterium tumefaciens GV3101 och odla dem på respektive selektionsplattor (från topp till botten i EN). (B) Plocka upp kolonier från (A) för att ympa flytande kultur för tillväxt över natten. (C) Harvest celler genom att snurra och dekantera supernatanten. Efter en kort pipettering och tvättning av pellets, spinn ner cellerna igen. (D) Återsuspendera och späd cellpelletarna med infiltrationen lösning (se protokollet) för att uppnå den slutliga OD 600 = 0,5. (E) Blanda försiktigt the re-suspenderades cellerna i en petriskål. (F) Använd en nållös spruta för att trycka infiltration blandningen i abaxial sidan av tobaksbladen. (G) Om 48 h efter infiltrering, bladen är redo för konfokal avbildning. Punktbladskivor innehållande infekterade celler med en hålslag runt infiltration regionen. Streckade cirklar indikerar utskurna ledighet skivor. (H) Använd vatten för att montera bladskivor på ett standardobjektglas för konfokal avbildning. Boxen diagrammen i det skuggade området beskriver de proteiner som injiceras i tobaksblad för polarisering analys. Protein storlekar är inte i skala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Display och kvantifiering av polaritet Formation. (AC) Confocal bilder för att visa GFP och YFP fluorescens i tobaks hudceller. Cyan visar uttrycket av GFP. Gult anger ett uttryck för YFP. (A) Överuttryck av CFP-BASL enbart. (B) Samuttryck av DNyda-nYFP och DNmpk6-cYFP. YFP expression kompletteras när två proteiner interagerar. (C) Samuttryck av GFP-BASL, DNyda-nYFP och DNmpk6-cYFP. Ojämn fördelning (polaritet) är uppenbar för både GFP och YFP. Skalstreck = 50 | im i (AC). (DF) Grafiskt plotta GFP / YFP fluorescensintensiteten längs de streckade linjerna (Magenta) i (AC). Magenta trianglar markerar start- och slutpunkt av de regioner som används för intensitets plottning. Kvantifieringar av polariteten examen i tobaksceller presenteras under. Värdena för fluorescensintensitet (H för hög och L för låg) mäts och samlas in av Fiji från regionerna spåras med röd dashed linjer i (AC). För varje prov, värdena från 20 celler i genomsnitt för signifikanstest. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Allmän användning och eventuella ändringar i tobaks Transient Expression System för Signaltransduktion: Överuttryck av fluorescerande protein (FP)-märkt proteiner i tobaks epidermis har använts med framgång för snabb undersökning av protein subcellulär lokalisering i växtceller. Men studera dynamiska fördelningen av proteinkomplex signalering i planta är en utmanande ämne som komplicerade subcellulära sammanhang, övergående interaktion protein-protein och signaltransduktionshändelser. Att ta itu med denna utmaning, tog vi fördel av BiFC systemet att undersöka MAPK signaleringshändelser. Genom sam-uttryckande YDA-nYFP och MPK6-cYFP, den återvunna YFP-signalen indikerade att aktiveringen av MAPK-signalering reläet kan inträffa vid plasmamembranet.

Det skulle vara perfekt att samuttrycka fluorescensmärkta YDA och MPK6 i Arabidopsis och undersöka den dynamiska MAPK signaleringen in vivo. Dock generating transgena växter är tidskrävande, särskilt när fler än en konstrukt önskas. Protein övergående uttryck i tobaksceller kan vara en snabb förberedande test för uttrycket in vivo i Arabidopsis eller andra växter. Den andra fördelen att tobaks transient expression system erbjuder, men kan inte lätt uppnås genom att generera transgena växter, är att upp till 4 eller 5 fusionsproteiner kan samuttryckas samtidigt och undersöktes med konfokalmikroskopi när kombinationen är realiserbart.

Använda tobak epidermal celler för att undersöka MAPK signaleringen i växtceller kan genomföras till följd av andra signalvägar och under olika miljöförhållanden. Till exempel, skulle växelverkan av YDA-MAPK ändra dess intensitet eller plats när uttryckande cell behandlas med lokal H2O 2 ansökan (a MAPK signalerings stimulus)? Sådana analyser kan snabbt utformas och genomföras för att ta itu med specIFIC frågor. Flera medlemmar finns i varje grupp av MAPK kassetter (3 - 4 nivåer i allmänhet), men hur signalering specificitet uppnås i växter eller andra system fortfarande i stort sett okända. Genom att göra olika kombinationer av MAPKKKs med MAPKKs eller MAPKKs med MAPK, tillåter tobaken transienta expressionssystemet en relativt storskalig analys av inte bara protein-proteininteraktion, men också den rumsliga organisationen av signaleringsflödes i växtceller.

Anpassade Samuttryck och BiFC analys för undersökning av protein Polarisering: En långvariga grundläggande fråga i cellbiologi är hur universella signalvägar, till exempel MAPK, uppnå deras specificitet på vissa utvecklingsstadiet eller under särskilda miljöförhållanden. Samuttrycker polariteten protein BASL med BiFC komponenterna i YDA och MPK6 i tobaksceller har gett oss möjlighet att visa att YDA-MAPK interaktion och signalering rumsåter distributed genom närvaron av BASL, en specifik polaritet proteiner under stomatal ACD. Därför kan YDA-MAPK signaleringsspecificitet uppnås genom interaktion med BASL att främja cellens polaritet och asymmetrisk division.

Även om det inte är ett universellt fenomen, har en hel del proteiner visat sig vara ojämnt fördelad i växtceller, t.ex. små GTPas ROPs 15, auxin effluxer PIN proteiner 16 och deras regulatorer 17, bor transportörer 18 och några okända proteiner (octopus 19 , POLAR 20, och BRX 21). Detta protokoll var inte avsedd att söka genetiska eller fysiska partner i ett visst protein polarisering vägen, men kommer sannolikt att vara användbart för att testa om de interagerande proteiner med ROPS, PIN-koder eller andra kan bilda en polaritet komplex i växtceller. Men när man försöker simulera en polarisering händelse med hjälp av tobaksceller, bör man ha i åtanke att komplikationerkan förekomma i analyserna. Till exempel kan Arabidopsis polariserings händelsen inte rekapituleras i tobaksceller, i synnerhet när flera komponenter krävs än vad som kan rymmas i analysen. Några okända molekyler som härrör från tobaks bakgrund, inte nödvändigtvis proteinerna som undersöks, kan vara inblandade i att framkalla en polarisering händelse. Därför är det viktigt att sätta upp strikta kontrollexperiment i tobak och att validera data i Arabidopsis eller andra växter.

Viktigaste faktorerna för att lyckas i Experiment: För det första bör grönaktiga och friska tobaksplantor användas. Eftersom kvantifiering analyser behöver samla data från olika celler, är det viktigt att använda blomstrande tobaksplantor med genomgående friska celler. För det andra bör de celler som uttrycker medelproteinnivåer användas för konfokal avbildning. Låga uttrycksnivåer kan inte ge tillräckliga proteiner för analysen och mättad uttryck levels skulle maskera polarisationen / transloka effekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion DNA polymerase New England Biolabs M0530S
pENTR/D/TOPO Life Technologies K2400-20
QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit Agilent Technology 200521
LB broth AMRESCO J106-2KG
Bacto Agar AMRESCO J673-1KG
Gentamycin Sigma-Aldrich G3632-1G
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501-1G
Kanamycin Sigma-Aldrich K4000-25G
Spectinomycin Sigma-Aldrich S4014-5G
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100G
25 x 75 mm Slide VWR 16004-382
24 x 50 mm Cover glass VWR 48393-241
Laser scanning confocal microscope Leica  TCS SP5 II LAS AF Lite software
40X objective lens Leica HCX Plan APO  HCX Plan APO, NA 1.30
Centrifuge Thermo Scientific SORVALL 6+
Hole puncher Staples
50 ml falcon tubes Genesee Scientific 21-108
No. 5 Forceps Canemco & Marivac 205EQA-Spec

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
  2. Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
  3. Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
  4. Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
  5. Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
  6. Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
  7. Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
  8. Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
  9. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
  10. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
  11. Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
  12. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
  13. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
  14. Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).
  15. Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
  16. Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
  17. Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
  18. Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
  19. Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
  20. Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
  21. Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).

Tags

Molekylärbiologi Protein övergående uttryck bimolekylära fluorescerande komplemente (BiFC) analys tobak epidermala celler polarisation MAPK komponenter BASL
Avbildning Rumslig Reorganisation av ett MAPK-signalvägen Använda Tobacco Transient Expression System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Dong, J. Imaging SpatialMore

Zhang, Y., Dong, J. Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System. J. Vis. Exp. (109), e53790, doi:10.3791/53790 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter