Introduction
في الكائنات متعددة الخلايا، والهجرة الخلية الأساسية سواء بالنسبة للتطور الجنين حيث أنه يضمن تنظيم الخلايا في الأنسجة والأعضاء، ولحياة البالغين، حيث يشارك في توازن الأنسجة (التئام الجروح) والحصانة. وبالإضافة إلى هذه الوظائف الفسيولوجية، والهجرة الخلية هي أيضا متورطة في حالات المرضية المختلفة، بما في ذلك، على وجه الخصوص، الانبثاث السرطان.
وقد تم تحليل هجرة الخلايا في المختبر لعقود من الزمن، وتوفير فهم شامل من الآليات الجزيئية ضمان الحركات خلية على الأسطح المستوية. في الجسم الحي ومع ذلك، تواجه الخلايا عن طريق بيئة أكثر تعقيدا. ويبدو واضحا في السنوات الماضية أن الهجرة داخل كائن حي قد يتأثر بعوامل خارجية مثل المصفوفة خارج الخلية، وخلايا أو كيموكينات يفرز الهجرة توجيه المجاورة، وأن آليات القيادة الهجرة الخلية قد تختلف من ما تم وصفه <em> في المختبر 1،2. وقد تلقى آليات ضمان في هجرة الخلايا المجراة اهتماما أقل حتى الآن، وذلك أساسا بسبب صعوبة التقنية وزيادة، مقارنة مع الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي يتطلب تحليل هجرة الخلايا على وجه الخصوص وصول البصرية مباشرة إلى الخلايا المهاجرة، وتقنيات لتسمية الخلايا فريدة من نوعها في لمعرفة ديناميتها والتشكل، وكذلك ربح أو خسارة وظيفة النهج لاختبار دور الجينات المرشحة. حتى الآن، وقد استخدمت سوى عدد قليل من النظم نموذج إيواء هذه الخصائص لتشريح الجسم الحي في خلية الهجرة 3.
كنا مؤخرا هجرة لوحة القردودية المقدمة المحتملين في الأجنة الزرد الأولى كنظام نموذج مناسب الجديد لتقييم وظيفة الجينات مرشح في السيطرة في الجسم الحي خلية الهجرة 4،5. لوحة القردودية المقدمة المحتملين (المعروف أيضا باسم mesendoderm الأمامي) هي مجموعة من الخلايا التي تشكل في بداية جاستrulation على الجانب الظهري للجنين. خلال المعيدة هذه المجموعة تهاجر بشكل جماعي نحو القطب الحيواني من الجنين 6-8، لتشكل لوحة القردودية المقدمة، سماكة mesendodermal، الأمامي إلى الحبل الظهري، والكامنة لوحة العصبية. والجزء الأمامي من لوحة القردودية المقدمة تؤدي إلى الغدة الفقس، بينما الجزء الخلفي لها من المرجح أن يساهم لرئاسة الأديم المتوسط 9. بفضل التطور الخارجية والوضوح البصري للجنين الأسماك وهجرة الخلايا ويمكن ملاحظة مباشرة وبسهولة في هذا الهيكل.
زرع الخلايا هي تقنية قوية جدا التي تسمح لخلق السريع والسهل للأجنة الفسيفساء 10. معربا عن علامات هيكل الخلية الفلورسنت في الخلايا المزروعة النتائج في وضع العلامات على الخلايا المعزولة، والتشكل وديناميكية والتي يمكن ملاحظتها بسهولة. الجمع بين هذا إلى الخسارة أو الربح من وظيفة النهج تصاريح تحليل وظائف خلايا مستقلة من علبةالجينات didate.
يصف بروتوكول المعروضة كيف يمكننا تقييم وظيفة Sin1 عنصر TORC2 في السيطرة على الهجرة الخلية وأكتين ديناميكية في الجسم الحي 5. ولكن، كما هو مذكور في النتائج ومناقشتها أبعد من ذلك، يمكن استخدامها لتحليل الآثار المحتملة من أي الجينات مرشح في السيطرة على الهجرة خلية في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يعرض الشكل 1 الخطوط العريضة للبروتوكول.
1. إعداد إبر للحقن وزرع
ملاحظة: الإبر يمكن أن تكون مستعدة في أي وقت وتخزينها. الاحتفاظ بها في طبق بيتري، على عصابة من الصلصال. ختم الطبق مع بارافيلم للحماية من الغبار.
- لإبر الحقن، وسحب الزجاج الشعرية (خارج القطر 1.0 ملم، داخل القطر 0.58 مم، من دون خيوط (انظر قائمة المواد)) مع مجتذب micropipette (انظر قائمة المواد). تفضل الإبر قصيرة ورقيقة (جزء مدبب من حوالي 5 ملم) لأنها أكثر كفاءة لاختراق المشيمه.
ملاحظة: إبر الحقن ذات الاستخدام الواحد. - إبرة لزرع الخلايا
- سحب الزجاج الشعرية (خارج القطر 1.0 ملم، داخل القطر 0.78 مم، من دون خيوط (انظر قائمة المواد)) مع مجتذب micropipette.
- Uالغناء microforge (انظر قائمة المواد)، وقطع رأس الإبرة عند نقطة حيث القطر الداخلي 35 ميكرون (أكثر قليلا من قطر الخلايا المراد زرعها).
- شطبة قطع أقصى الشعرية مع microgrinder (انظر قائمة المواد) مع زاوية 45 درجة.
- اختياريا، وسحب شوكة في نهاية الإبرة باستخدام microforge. لهذا، المس خيوط الساخن مع غيض من شطبة وسحب بسرعة بعيدا، وخلق الشائكة التي يمكن أن تساعد اختراق الجنين.
- جبل الإبرة على حامل إبرة تعلق على حقنة. باستخدام حقنة، وشطف الداخل من ثلاث مرات إبرة مع حمض الهيدروفلوريك 2٪ للقضاء على مخلفات الزجاج، ثم شطف ثلاث مرات مع الأسيتون.
تحذير: حمض الهيدروفلوريك سام، التلاعب تحت غطاء محرك السيارة، مع قفازات.
ملاحظة: الإبر زرع الخلايا يمكن استخدامها عدة مرات.
2. إعدادأطباق للحقن وزرع الخلايا
- الحرارة 50 مل من الجنين المتوسطة 11 تحتوي على 0.5 غرام من الاغاروز في الميكروويف لمدة 1 دقيقة في السلطة الكاملة للحصول على 1٪ الاغاروز في المتوسط الجنين. تبريد هلام الاغاروز إلى حوالي 60 درجة مئوية، وصب 50 مل في 90 مم طبق بيتري. وضع على السطح من هلام قالب المصممة خصيصا (انظر قائمة المواد)، إما مع خطوط لطبق حقن أو مع الآبار للطبق زرع الخلايا.
- مراقبة تعويم العفن على الاغاروز، إذا كان الاغاروز ليست ساخنة جدا. بعد تعيين agarose هلام، وإزالة القالب مع ملقط (الشكل 2A - B).
ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق في 4 درجات مئوية، وتصل إلى بضعة أسابيع. الاحتفاظ بها في صندوق الرطب مغلقة، لتجنب الجفاف.
- مراقبة تعويم العفن على الاغاروز، إذا كان الاغاروز ليست ساخنة جدا. بعد تعيين agarose هلام، وإزالة القالب مع ملقط (الشكل 2A - B).
- وضع الطبق في 28 درجة مئوية الحاضنة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
3. جمع الأجنة وحقن
- إعداد الحل الحقن
ملاحظة: نطاق ملزم أكتينمن الأكتين الخميرة البروتين 140 (ABP-140) مثل Lifeact بد أن mCherry ملزمة (ويشار إلى ABP140-mCherry) يستخدم لتصور الأكتين بلمرة داخل الخلية، وذلك لتحليل النشاط تبارزي. إضافة مركب آخر لاختبار وظيفة الجين مرشح (على سبيل المثال مرنا من المهيمن بناء سلبي أو نشط بشكل جوهري، أو [أليغنوكليوتيد Morpholino). لتقييم وظائف Sin1 كما هو موضح في النتائج (الشكل 3)، استخدمنا أليغنوكليوتيد Morpholino. كعنصر تحكم، استخدمنا morpholino مطابق لmorpholino sin1 ولكن لمدة 5 النيوكليوتيدات موزعة على طول تسلسل بحيث هذه السيطرة morpholino لا تطابق الحمض النووي الريبي الهدف.- sin1 ذوبان وmorpholinos السيطرة 5-عدم تطابق (2 الحلول الأسهم ملم)، وABP140-mCherry من mRNAs على الجليد. إضافة 375 نانوغرام من من mRNAs (75 نانوغرام / ميكرولتر النهائي) و 0.75 ميكرولتر من أي sin1 أو 5-عدم تطابق morpholino التحكم (0.3 ملي النهائي) في المخزن Danieau (58 ملي كلوريد الصوديوم، 0.7 مليMgSO بوكل، 0.4 مم 4، 0.6 ملي كا (NO 3) 2، 5.0 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.6)، للوصول إلى الحجم الكلي لل5 ميكرولتر.
- مجموعة الجنين
ملاحظة: لتعيين هذه التجريبية حتى كلا المانحة والمضيفة الأجنة المعدلة وراثيا، معربا عن GFP تحت سيطرة goosecoid (GSC) المروج من أجل رؤية لوحة القردودية المقدمة المحتملين 11.- جمع تيراغرام (GSC: GFP) البيض. وضع حوالي 80 البيض في صحن 90 ملم بيتري مليئة المتوسطة الجنين واحتضان عند 28 درجة مئوية.
- حقن الأجنة المانحة
- تحت مجهر تشريحي، والضغط بلطف الأجنة التي تم جمعها مع ملقط في خطوط طبق حقن مليئة المتوسطة الجنين. باستخدام ملقط، توجيه الأجنة مع الخلايا نحو الأعلى. وضع طبق حقن في الحاضنة عند 28 درجة مئوية حتى وصلت إلى الأجنة في مرحلة 4 خلايا (1 ساعة بعد الإخصاب).
- تحميل إبرة الحقن مع 2 ميكرولتر منحل الحقن. ادخال الإبرة في حامل إبرة (انظر قائمة المواد) التي يتم وضعها في تتلاعب الصغير (انظر قائمة المواد) ومتصلة مع تترافلوروإيثيلين (PTFE) أنابيب (انظر قائمة المواد) إلى transjector الهواء (انظر قائمة المواد ).
- فتح الشعيرات الدموية عن طريق لمس بلطف غيض مع ملقط غرامة. إذا لزم الأمر، وقطع شعري مفتوح من قبل معسر أقصى لها.
- أدخل إحدى الخلايا الأربع مع الإبرة وحقن محلول داخل الخلية وذلك لملء 70٪ من حجم الخلية (2 NL). ضخ 30 الأجنة.
ملاحظة: الحصول على إبرة في الخلية قد يكون صعبا، لأن غشاء البلازما هي لينة. تهدف إلى تقاطع بين الخلية وصفار البيض يسهل اختراق الإبرة. - وضع الأجنة في 28 درجة مئوية الحاضنة حتى وصلت إلى مرحلة المجال (4 ساعات بعد الإخصاب).
4. إعداد الأجنة لخلية: زرعأيون
- إعداد 20 مل من المتوسط الجنين مع 200 ميكرولتر البنسلين / الستربتومايسين (انظر قائمة المواد) (القلم / بكتيريا EM).
- Dechorionation من الأجنة في مرحلة المجال (4 ساعات بعد الإخصاب)
ملاحظة: الأجنة Dechorionated هشة للغاية وسوف تنفجر في حالة ملامسة الهواء أو البلاستيك. وبالتالي فإنها تحتاج إلى أن توضع في أطباق المغلفة الاغاروز، ونقل مع ماصات باستور الزجاج المصقول النار.- باستخدام البلاستيك ماصة باستير، ونقل الأجنة المضيفة التي تم جمعها في الخطوة 3.2 و الأجنة المانحة حقن في خطوة 3.3 إلى اثنين 35 مم أطباق بتري المغلفة مع 1٪ الاغاروز في وسط جنين ومليئة القلم / بكتيريا EM. إبقاء الأجنة المضيفة والمانحة الأجنة في طبقين منفصلين.
- يدويا استخراج الأجنة من chorions مع ملاقط غرامة (انظر قائمة المواد).
- وضع الأجنة في 28 درجة مئوية الحاضنة حتى وصلت إلى مرحلة درع (6 ساعات بعد الإخصاب).
زراعة 5. خلية
- ترتيب الأجنة لزرع الخلايا.
- تحت مجهر تشريحي الفلورسنت، حدد الأجنة المانحة عبرت عن ABP140-mCherry (أحمر) داخل درع (الخضراء).
- باستخدام ماصة باستير النار مصقول، ونقل الأجنة في آبار طبق زرع الخلايا مليئة القلم / بكتيريا EM. وضع الأجنة المضيفة في صف واحد والأجنة المانحة في الصف المجاورة.
- باستخدام رمش، توجيه بعناية الأجنة مع درع يصل.
ملاحظة: موقف الدرع يمكن تقييم من قبل التعبير GFP أو تشريحيا.
- زرع نظام مجموعة المتابعة.
ملاحظة: يتكون نظام زرع حامل الإبرة (انظر قائمة المواد) متصلة مع أنابيب PTFE (انظر قائمة المواد) وموصل أنبوب (انظر قائمة المواد) إلى حقنة هاملتون مجهزة مع محرك الصغير (انظر قائمة من المواد). حامل إبرةهي التي شنت على 3 في اتجاه micromanipulator (انظر قائمة المواد).- استخدام حامل إبرة تعلق على حقنة، وشطف إبرة لزرع الخلايا مع 70٪ من الإيثانول. قبل جاف امتصاص الهواء إلى إبرة. لا تجف التي تهب، لأن هذا قد يؤدي في الغبار يعلقوا في الجزء مدبب من الإبرة.
- ادخال الإبرة في حامل إبرة متصلة حقنة هاميلتون، مع شطبة صعودا.
- درع إلى درع زرع الخلايا
- أدخل درع الجنين المانحة مع الإبرة زرع ووضع حوالي 10-20 الخلايا المسمى مع ABP140-mCherry. بعناية تجنب لفت الصفار.
- زرع الخلايا في درع الجنين المضيف. كرر حتى تم زرع الأجنة المضيفة.
- إزالة أي أجنة التالفة مع ماصة باستير النار مصقول. وضع الأجنة المزروعة في الحاضنة عند 28 درجة مئوية والسماح لهم استعادة لحوالي 30 دقيقة.
- باستخدام إبرةحامل تعلق على حقنة، شطف إبرة زرع الخلايا بالماء ووضعه مرة أخرى في طبق بيتري على عصابة من الصلصال. ختم الطبق مع parafilm.
6. (اختياري) واحد زرع الخلايا
ملاحظة: في الجنين، والخلايا تلتصق مع بعضها البعض، بحيث من الصعب استخلاص خلية واحدة فقط في إبرة الزرع. قمنا بتطوير بروتوكول تعديل لزرع خلايا بسهولة لوحة السلف واحدة القردودية المقدمة. والفكرة هي لفصل الخلايا قبل الزرع. لأن معزولة خلايا لوحة السلف القردودية المقدمة تميل الى فقدان هويتهم، ونحن نفرض وراثيا لهم المحتملين هوية لوحة القردودية المقدمة، من خلال تفعيل مسار الإشارات العقدية، في غياب عامل النسخ Sox32. لقد تحققنا من أن هذه الخلايا التي يسببها تتصرف مثل خلايا الذاتية القردودية المقدمة لوحة السلف 8. وفيما يلي الخطوات المحددة لإجراء عمليات زرع خلية واحدة. dissocia خليةويتحقق نشوئها عن طريق وضع الأجنة في خالية من الكالسيوم قارع الأجراس 11، تشريح ويزدرع وميكانيكيا التحريك.
- في خطوة 2.1، وإعداد طبق زرع 1٪ الاغاروز في قارع الأجراس خالية من الكالسيوم بدلا من الجنين المتوسطة.
- في خطوة 3.1، بالإضافة إلى ABP140-mCherry RNA وmorpholino sin1، إضافة 3 نانوغرام من الرنا ترميز شكل نشط من مستقبلات العقدية Taram-A (0.6 نانوغرام / نهائي ميكرولتر) و 1.25 ميكرولتر من morpholino ضد sox32 (حل الأوراق المالية في 2 ملي، وبالتالي 0.5 ملي النهائي).
- بعد الخطوة 4، ونقل ثلاثة أجنة المانحة المختارة في طبق لزرع الخلايا مليئة القلم / بكتيريا قارع الأجراس خالية من الكالسيوم باستخدام ماصة باستير النار مصقول. مع ملاقط غرامة، تشريح ويزدرع التي تحتوي على حقن الخلايا (ABP140-mCherry الخلايا المسمى). بسرعة تجاهل بقية الأجنة.
- مع رمش، وإثارة بلطف يزدرع حتى تنفصل الخلايا.
- وضع زنزانة انفرادية واحدة في الإبرة زرعوغرسها في درع الجنين المضيف.
- باستخدام ماصة باستير النار مصقول، ونقل الأجنة في طبق المغلفة الاغاروز مليئة القلم / بكتيريا EM. وضع الأجنة في الحاضنة عند 28 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
7. الأجنة تركيب
- غرفة التصوير
- الأسلوب 1: استخدام غرفة التصوير تتألف من شريحة بلاستيكية (75 * 25 * 0.5 مم) وتتخللها ثقوب 4 (5.5 مم)، مع 3 مم حواف عالية على جانب واحد (الشكل 2C - D). الغراء ساترة الزجاج على الجانب الخلفي، مع cyanoacrylate الغراء (سوبر الغراء).
ملاحظة: في نهاية التجربة، وضع الغرفة في الماء لمدة ليلة واحدة لإزالة ساترة والتخلص من بقايا الغراء مع الرمل ورقة. - الطريقة 2: استخدام 35 ملم ماتيك الزجاج أطباق السفلية (انظر قائمة المواد) مع وجود ثقب 10 ملم.
- الأسلوب 1: استخدام غرفة التصوير تتألف من شريحة بلاستيكية (75 * 25 * 0.5 مم) وتتخللها ثقوب 4 (5.5 مم)، مع 3 مم حواف عالية على جانب واحد (الشكل 2C - D). الغراء ساترة الزجاج على الجانب الخلفي، مع cyanoacrylate الغراء (سوبر الغراء).
- جنين تركيب
- ملء قارورة زجاجية مع 1 مل من الملفات الساخنة 0.2٪ الاغاروز في المتوسط الجنين.يبقيه في 42 درجة مئوية في حرارة كتلة.
- تحت مجهر تشريحي الفلورسنت، حدد الجنين الذي أحمر الخلايا المزروعة هي جزء من لوحة القردودية المقدمة المحتملين المسمى باللون الأخضر (أي الخلايا المزروعة الحمراء هي ضمن لوحة القردودية المقدمة المحتملين الخضراء، وبدأت الهجرة نحو القطب الحيواني).
- نقل الجنين المحددة في الحل الاغاروز مع ماصة باستير النار مصقول. تجاهل تتجاوز المتوسطة الجنين من ماصة. رسم الجنين في ماصة مع الاغاروز، ونقل الأجنة في غرفة التصوير، إيداع قطرة الاغاروز. قبل تعيين الاغاروز، توجيه الجنين مع رمش. وضع لوحة القردودية المقدمة المحتملين صعودا للتصوير مع المجهر تستقيم، أو على الجزء السفلي من الزجاج للتصوير مع مجهر مقلوب. انتظر حتى يتم تعيين الاغاروز (حوالي 1 دقيقة، اعتمادا على درجة حرارة الغرفة) قبل التركيب جنين أخر في البئر المقبل للغرفة.
ملاحظة: لتشا التصويرmber تحتوي على 4 آبار يسمح متزايدة تصل إلى 4 أجنة. - عندما يتم تعيين الاغاروز، وملء الغرفة مع القلم / بكتيريا EM لتجنب الجفاف.
8. تصوير لايف
- استخدام 40X الغمر بالمياه عدسة طويلة المدى. استخدام مجموعات مرشح المناسبة لصورة GFP وmCherry (لGFP: الإثارة BP 470/40، شعاع الخائن FT 510، والانبعاثات BP 540/50، لmCherry: الإثارة BP 578/21، شعاع الخائن FT 596، وليرة لبنانية انبعاث 641 / 75). ضبط مدة التعرض من أجل تحسين ديناميكيات الصورة.
- لصورة كل الخلايا في لوحة، والحصول على مداخن ض، وبدأ عدد قليل من ميكرون فوق لوحة القردودية المقدمة المحتملين (في الأديم الظاهر) وتنتهي بضعة ميكرون تحت لوحة القردودية المقدمة المحتملين (في صفار البيض). استخدام خطوة ض 2 ميكرون. لتحسين سرعة الاستحواذ، تبديل الألوان بين ض مداخن وليس بين الإطارات.
ملاحظة: هذا قد يؤدي إلى اختلافات طفيفة بين الصور الخضراء والحمراء، ولكن ليست مشكلة لأنه لا شارك دقيقةمطلوب -localization بين الإشارات الخضراء والحمراء. للحد من المزيد من الوقت التصوير والتعرض للضوء، ويمكن الحصول الأخضر مرة واحدة فقط كل نقطة زمنية 5، وهو ما يكفي لتحديد الخلايا لوحة السلف القردودية المقدمة. - استخدام هذه الإعدادات، صورة تصل إلى 4 أجنة ضمن الفاصل الزمني لمدة دقيقتين وهو أمر ضروري لتحليل الترددات نتوء والتوجه. لتحليل مدى الحياة نتوء، والحد الفاصل الزمني إلى 30 ثانية للحصول على دقة أعلى الوقت. صورة من 60٪ إلى 80٪ اكتفار اكتفار.
تحليل 9. حيوية الخلية
- تحميل الصور 4D في ImageJ
ملاحظة: اعتمادا على البرمجيات المستخدمة للحصول على، يتم تخزين الصور في أشكال مختلفة (ملف واحد لكل صورة، ملف واحد لكل ض المكدس، ملف واحد للتجربة الكاملة). ويمكن الاطلاع على لفتح مداخن 4D بعض الإضافات يماغيج. يتم تخزين البيانات على النحو ملف واحد لكل ض المكدس. لأن مجموعة البيانات يمكن أن تكون كبيرة، قد يكون مناسب لفتح الجزء الوحيد من ذلك (بعض تيمنقاط الإلكترونية، أو الفرعي للض المكدس، أو 8 بت تحويل الصور ...). ونحن نستخدم يماغيج المساعد مصنوعة خصيصا للقيام بذلك، ونحن سوف نكون سعداء لتوزيع عند الطلب. - تحليل التوجيه والتردد من النتوءات خلية
- استخدام الصور GFP لتحديد الاتجاه الرئيسي للالمحتملين الهجرة لوحة القردودية المقدمة. أغتنم هذه كمرجع لقياس نتوءات خلية زاوية. تدوير المكدس، بحيث هذا الاتجاه إشارة موازية إلى جانب واحد من الصورة.
- اتبع خلية واحدة. أداة تحديد زاوية. لكل إطار وكل نتوء، استخدم أداة زاوية لقياس الزاوية بين نتوء واتجاه إشارة (الشكل 3A). استخدام تحليل / قياس الأوامر لتخزين القيمة (أو اضغط على المفتاح M على لوحة المفاتيح). حفظ النتائج كملف النص. كرر مع الخلية التالية.
- استيراد البيانات إلى R وزاوية المؤامرة التوزيع ورسوم بيانية. استخدام اختبار كولموجوروف-سميرنوف (ks.test في R) للمقارنة بين ظروف مختلفة.
ملاحظة: توفر هذه الأداة زاوية القيم تضم بين 0 درجة و 180 درجة، مما يتيح استخدام الاختبارات الإحصائية الكلاسيكية والاختبارات لا دائرية. - مع هذه المجموعة البيانات، وحساب تردد الانبعاثات حيث بلغ عدد نتوءات لكل خلية في الدقيقة الواحدة. استخدام الطلاب T-اختبار (t.test في R) للمقارنة بين ظروف مختلفة.
- تحليل الخلية النتوءات مدى الحياة
- لكل خلية وكل نتوء وقياس مدة بروز (عدد الإطارات خلالها بروز موجودا س الوقت الفاصل الزمني بين الإطارات).
- استيراد البيانات إلى R. استخدام الطلاب T-اختبار (t.test في R) للمقارنة بين ظروف مختلفة.
ملاحظة: ميزات الهجرة أخرى يمكن أن تكون مثيرة للاهتمام لتحليل من أجل توصيف الهجرة الخلية. وتشمل هذه المسارات الخلية، لسرعة والتوجيه والقياسات استمرار، أو مورفولوجيا الخلايا. تتوفر لقياس هذه الميزات بعض تطبيقات البرمجيات التجارية، ولكن عددا كبيرا من تطبيق صحيفة البرمجيات مفتوحة المصدرالكاتيونات والإضافات يماغيج وتتوفر أيضا، وعلى سبيل المثال التكيف مع تحليل morphodynamics 12، DiPer للنظر في مسارات الخلية واستمرار الاتجاه 13، CellTrack لتتبع حدود الخلية أثناء الترحيل 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدمت هذه التقنية المقدمة إلى تحليل دور Sin1، واحدة من المكونات الأساسية للتور معقدة 2 (TORC2)، في السيطرة على الهجرة خلية الجسم الحي. استخدام زرع الخلايا يسمح بوضع العلامات على الخلايا المعزولة وتحليل الآثار خلية مستقلة. يظهر الفيلم S1 هجرة الخلايا الاولية لوحة القردودية المقدمة المزروعة. الأكتين وضع العلامات مع ABP140 يسمح التصور سهل من نتوءات هيولي الأكتين الغنية. قمنا بقياس وتيرتها والتوجه. البرية من نوع الخلايا تنتج المتكررة نتوءات هيولي كبيرة موجهة في اتجاه القطب الحيواني، أي في اتجاه الهجرة (الشكل 3B). فقدان وظيفة Sin1 يؤدي إلى انخفاض حاد في عدد نتوءات، والتوزيع العشوائي للما تبقى منها، مما يدل على أهمية sin1 في السيطرة على تشكيل نتوء الأكتين الغنية. ومن المثير للاهتمام، وهذا النمط الظاهري يمكن إنقاذهم عن طريق البريدxpression من النموذج النشط جوهري من RAC1 15، مما يشير بقوة إلى أن TorC2 تسيطر على ديناميات الأكتين وتشكيل خلية نتوء من خلال RAC1 (الشكل 3B).
تم استخدام تقنية عرض أيضا لتوصيف دور Arpin، مثبط حددت مؤخرا من مجمع Arp2 / 3، على ديناميات الخلية 4. فقدان وظيفة Arpin يؤدي إلى زيادة في وتيرة بروز (متوسط معدل خلايا إيواء نتوء في وقت معين). هذا قد يكون عائدا إما إلى تشكيل نتوء أكثر تواترا أو إلى زيادة في الاستقرار نتوء. قياس بروز عمر كشف أنه في غياب Arpin، وتضاعف نتوء استمرار الزمني (الشكل 3C). وهذا يتفق مع دور Arpin مثل مثبط Arp2 / 3، والتي من شأنها أن تسهل بروز تراجع، ويشير إلى أن Arpin يؤثر تردد نتوء عن طريق تحوير الاستقرار نتوء، بدلا مننتوء بدء.
الشكل 1: مخطط إجراء تيراغرام (GSC: GFP) تحقن الأجنة في مرحلة 4 خلايا (1 ساعة بعد الإخصاب). بعد 5 ساعة على 28 درجة مئوية، والأجنة تظهر ABP140-mCherry الخلايا إيجابية داخل درع (GFP +) يتم اختيار الأجنة كما المانحة. يتم رسم الخلايا درع في غضون الإبرة زرع ونقل إلى درع من الجنين المضيف. بعد 0.5 ساعة من الانتعاش، هي التي شنت الأجنة المضيفة وتصوير مع مجهر epifluorescent (الهدف 40X). HPF: آخر ساعة الإخصاب الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: Transplantatiعلى صحن وغرفة التصوير. (A) طبق زرع مع الآبار الفردية. (ب) القالب للطبق زرع الخلايا. غرفة التصوير (C) محلية الصنع. (د) رسم تخطيطي للغرفة التصوير محلية الصنع. مقياس شريط = 1 سم. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): النتائج من خلية حيوية تحليل (أ) مخطط قياس زاوية نتوء. (ب) تحليل التوجه خلية نتوء والتردد. في غياب Sin1 (مو-Sin1)، وخلايا تنبعث أقل نتوءات ونتوءات المتبقية موجهة بشكل عشوائي. هذا النمط الظاهري يمكن انقاذهم من قبل تعبير عن شكل نشط بشكل جوهري من GTPase RAC1 (مو سين1 + CA-RAC1). تعديل من DUMORTIER وديفيد 2015 5. (C) تحليل مدى الحياة نتوء. في غياب Arpin (مو-Arpin)، وتزداد وتيرة بروز. ويرجع ذلك إلى زيادة في عمر بروز هذا. إعادة العمل على RNA arpin غير مبالين لmorpholino يعيد هذا النمط الظاهري تبارزي المفرط. تعديل من دانغ وآخرون، 2013 (4). شريط مقياس = 10 ميكرون. ج: الأمامي. P: مؤخره، L: يسار، R: الحق الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1: الضوابط Sin1 تشكيل نتوءات خلية، من خلال RAC1 (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). بزرع خلايا لوحة السلف القردودية المقدمة، حقنABP140-mCherrry الرنا وmorpholino السيطرة، أو morpholino sin1، أو morpholino sin1 والرنا للنموذج التأسيسي RAC1. تم قياس تردد نتوء والتوجه على هذه الصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويعرض هذا البروتوكول وسيلة سهلة لدراسة دور الجينات مرشح في الهجرة خلية في الجسم الحي، من خلال الجمع بين خلق أجنة خيالية باستخدام زراعة الخلايا مع التصوير الحي.
خلق الأجنة الفسيفساء
دراسة ديناميات خلية يتطلب التصور من كفاف لتحليل ملحقات هيولي. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق وضع العلامات خلايا معزولة في خلاف ذلك غير المسماة - أو المسمى بشكل مختلف - بيئة، مما يتيح النقيض البصرية جيدة.
طريقة سهلة لتسمية عشوائيا جزء من الخلايا في الجنين هي حقن الحمض النووي plasmidic في مرحلة 1-خلية 16. البلازميدات حقن تشكل المجاميع التي يتم بشكل عشوائي وغير متكافئ فصل في الخلايا أثناء انقسام الخلية. وهذا يؤدي إلى التعبير عن البلازميد في مجموعة فرعية عشوائية من الخلايا، وبالتالي يمثل طريقة سريعة جدا وسهلة وغير الغازية لتوليد موالأجنة المتطورة. ومع ذلك، الخلايا معربا عن البلازميد حقن تميل إلى تشكيل مجموعات، واحتمال العثور على الأجنة التي تحتوي على عدد قليل من خلايا معزولة التعبير في لوحة القردودية المقدمة المحتملين منخفض جدا. وعلاوة على ذلك، واستخدام الحمض النووي plasmidic يوفر سيطرة محدودة جدا من مستوى التعبير لبناء حقن. خلق أجنة خيالية بواسطة زرع الخلايا، وعلى الرغم من الناحية الفنية أكثر صعوبة من حقن الحمض النووي plasmidic، ويقدم عددا من المزايا: السيطرة على عدد من الخلايا المزروعة، والسيطرة على مستوى التعبير من بنيات (حقن RNA)، وأخيرا وليس آخرا ، زرع خلية تسمح لاختبار آثار خلية مستقلة، من خلال خلق الأجنة الفسيفساء التي زرعها خلايا تحتوي على الخسارة أو الربح من بنيات وظيفة. على العكس من ذلك، زرع يمكن أن تستخدم أيضا لتقييم دور غير المستقل للبيئة عن طريق زرع خلايا من النوع البري في الأجنة التي تم تعديلها. وهذا يمكن أن تكون ذات أهمية خاصة للاختبارعلى سبيل المثال، وظيفة مكونات المصفوفة خارج الخلية التي هي ذات أهمية خاصة لتحليل الهجرة الخلية.
وقد سبق ووصف بروتوكول مفصلة لزرع الخلايا 10. بالمقارنة مع هذا البروتوكول، نود أن نناقش اثنين من الاختلافات الرئيسية في إجراءاتنا.
ويرتبط الفرق الأول لمرحلة حقن الأجنة المانحة. وفقا لتجربتنا، حقن الأجنة في مرحلة 1-الخلية مع الرنا من بروتين فلوري لا تعبر عن متجانس البروتين الفلوري في جميع الخلايا، وذلك بسبب انتشار غير كامل من الرنا في الخلية. حقن الأجنة المانحة في مرحلة 4 خلايا في واحدة من الخلايا الأربعة يسمح للحصول على استنساخ متجانس من الخلايا، والتي هي ذات أهمية خاصة عندما الرنا من البروتين الفلوري هي شارك في حقن الرنا الأخرى التي لا يمكن عزوها.
والفرق الرئيسي الثاني هو استخدام الهواء بدلا من النفط في: زرعأيون حقنة. العيب الرئيسي لنظام مليئة بالهواء هو الجمود الناجمة عن مرونة الهواء. النفط على العكس من ذلك، يجري ينضغط، ويوفر سيطرة جيدة الشفط والضغط. ومع ذلك، مع قليل من التدريب، والحفاظ على واجهة بين الهواء والمتوسطة الجنين في جزء مدبب رقيقة من الإبرة، والسيطرة على شفط وضغط مع نظام مليئة بالهواء كافية لزرع خلايا في مرحلة الدرع. لمراحل لاحقة، عندما تصبح الخلايا أصغر حجما وأكثر تماسكا، وشفط يتطلب الضغط العالي التي تحتاج إلى أن تسيطر على وجه التحديد جدا، والتي لا يمكن أن يتحقق مع الإعداد مليئة بالهواء. باستخدام الهواء بدلا من النفط يخفف الإعداد، وملء النظام مع النفط دون أي فقاعة الهواء صعبة. وعلاوة على ذلك، فإنه يتجنب ملء الإبرة زرع مع النفط. وهذا يسمح الإبر الزرع لإعادة استخدامها، وبالتالي لتكون مستعدة بعناية. ونحن نرى أن إبرة دون حواف حادة والقطر الصحيح هو المفتاح لSUCCEزرع ssful. هذه الخطوة زرع بشكل واضح واحدة من الخطوات الحاسمة في البروتوكول الذي يتطلب ممارسة قبل أن يؤديها بسهولة.
اقترحنا أيضا على إجراء محدد لزرع الخلايا واحدة، والتي تتمثل في عدم الربط الخلايا السابقة لزراعة الأعضاء، من أجل استخلاص خلية فريدة من نوعها في إبرة الزرع. وهذا يعني أن عابر تفكك خلية لن تعدل هويتهم و / أو السلوك. للخلايا لوحة السلف القردودية المقدمة، فإننا فرض وراثيا هوية الخلية، ولقد دققت أن هذه الخلايا تتصرف مثل تلك غير فصلها. ومع ذلك، لا يمكننا استبعاد رسميا أن التفكك و / أو تحريض الجيني لحث على التعديلات دون أن يلاحظها أحد في الخلايا. زرع الخلايا واحد دون الفصل بين لهم ممكنا. ينبغي وضع خلايا تصل بعناية في الإبرة زرع. ومع ذلك، على الأقل في أيدينا، ومعدل النجاح منخفض جدا، إما لأكثر من خلية واحدة يحصل في نيDLE، أو لأن القص الخلية عندما وضعت ويموت في إبرة أو مرة واحدة زرعها.
Epifluorescence مقابل التصوير متحد البؤر سريع
استخدام زرع الخلايا لتخليق أجنة الفسيفساء يسمح لوضع العلامات على الخلايا المعزولة، وفصلها عن الخلايا المسمى أخرى. في هذا السياق، والتصوير جيد للمورفولوجيا الخلايا وديناميكية يمكن أن يتحقق مع المجهر epifluorescence القياسية، على النحو المقترح في البروتوكول. وهذا له ميزة واضحة لكونها المعدات نسبيا واسعة الانتشار ومنخفضة التكلفة بديل لأنظمة متحد البؤر التصوير أكثر تكلفة.
لتعريب التحت خلوية دقيقة، والتصوير متحد البؤر يمكن استخدامها لتحسين القرار، ولا سيما القرار المحوري. للا يزال الحصول على قرار زمني يكفي، يجب استخدام التصوير متحد البؤر سريع. من تجربتنا، والمجاهر الغزل القرص تقدم حلا وسطا جيدا بين قرار والسرعة والصور سمية. مسح سريع هيئة التصنيع العسكري متحد البؤرroscopes (مثل المجاهر المسح الرنانة) هي خيارات جيدة أيضا، ولكن أقل تواترا وأكثر تكلفة.
الهيكل الخلوي الوسم
وضع العلامات الجيدة من خيوط الأكتين وديناميتها أمر بالغ الأهمية لدراسة آليات الهجرة الخلية على أساس الأكتين. على الرغم من علامات الفلورسنت بغشاء أكثر كفاءة لتحليل الخطوط العريضة الخلية، الأكتين وضع العلامات يسمح التصور أفضل بكثير من نتوءات خلية. على وجه الخصوص، إذا الحصول على ثلاث خلايا المسمى في الاتصال، فإنه من الصعب جدا تحديد امتداد حشوية تقع بين خليتين المجاورة مثل الخطوط العريضة للتمديد وغشاء الخلايا المجاورة يمكن أن تختلط. وسم خيوط الأكتين يسمح للكشف لا لبس فيه نتوءات خلية القائم الأكتين، والتي ركزنا. إذا كان شكل الخلية ليكون كميا، فإن وضع العلامات غشاء يكون من الأفضل. وثمة خيار آخر هو استخدام كل من وضع العلامات، وإما باستخدام التصوير 3-لون (واحد لى المعدلة وراثياشمال شرق، واحدة للالأكتين واحدة لغشاء)، أو عن طريق GFP صفها الغشاء. في خط المعدلة وراثيا، GFP هو حشوية، وبالتالي يمكن تحديد خلايا إيجابية goosecoid-GFP، حتى لو كان الغشاء GFP المسمى.
على مدى السنوات الماضية، وقد استخدمت عددا من تحقيقات لتسمية الأكتين في عينات حية. وكانت تلك أول اندماج المباشرة لمونومرات الأكتين. قدمت هذه عيبين. أولا، أنها وصفت كل الأكتين والأكتين لا بلمرة على وجه التحديد. ثانيا، أنهم كانوا في كثير من الأحيان السامة. تحقيقات حاليا في استخدام هي المجالات ملزمة أكتين الخيطية تنصهر للصحفيين الفلورسنت. في هذا البروتوكول، وكنا ABP140 17 (الأكتين مجال الربط من الخميرة الأكتين بروتين ملزمة 140)، الذي يشغل حاليا منصب علامة الأكثر استخداما لالأكتين الخيطية، وتصف كل الأكتين الخيطية. Utrophin 18 (المجال تناظر calponin) التسميات أيضا الأكتين الخيطية، ولكن يبدو أن تسمية خيوط مستقرة فقط. وقد استخدم هذا الاختلاف لايدنمنظمة حددت خيوط الأكتين الحيوية، مثل تلك التي وصفت ABP140 وليس Utrophin 19.
في الآونة الأخيرة فقد أفيد في الطيران أن ABP140 وUtrophin يمكن أن يكون لها آثار سامة، ولا سيما على المدى التعبير 20. على الرغم من أننا لم نلحظ أي عيوب الهجرة في الخلايا المسمى ABP140، لا يمكننا استبعاد أن ABP140 التعبير قد التشويش على ديناميات الأكتين الذاتية. وأفادت التحقيق الثالث للالأكتين الخيطية مؤخرا 21. وقد وصفت F-tractin (المجال أكتين من الفئران اينوزيتول ثلاثي 3-كيناز) كمراسلة المؤمنين أكتين الخيطية، التي لن تظهر التأثيرات السامة 20،22. على حد علمنا، لم يتم الإبلاغ عن استخدام F-tractin في الزرد حتى الان.
بالإضافة إلى الأكتين، يمكن وصفها العديد من مكونات الخلايا الأخرى لتحسين فهمنا للهجرة الخلايا. وهذا يشمل المكونات الأخرى هيكل الخلية مثل الميوسين، الأنابيب الدقيقة، جسيم مركزي، فضلا عن KNالمنظمين الخاصة للهجرة الخلية (أشكال تفعيلها من GTPases رو صغير، راك وCdc42، تحقيقات الفلورسنت لPIP3 ...) أو البروتينات المشاركة في التصاق الخلية (integrins، cadherins ...).
وعموما، هذا البروتوكول تحتضن عددا من الأدوات والتقنيات التي سبق وصفها إلى اقتراح نظام سريع وسهل لاختبار تورط الجينات مرشح في السيطرة على الهجرة خلية في الجسم الحي. كنا المحتملين الهجرة لوحة القردودية المقدمة كما هو نموذج للاهتمام من الهجرة الجماعية الموجهة، وبسبب متاح وصفها خط المعدلة وراثيا ذلك. ومع ذلك، يمكن تكييفها على بروتوكول مماثل لتحليل أحداث الهجرة الأخرى التي تحدث أثناء التطور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
- Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), Cambridge, England 921-932 (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
- Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
- Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
- Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
- Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
- Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
