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Developmental Biology

विश्लेषण doi: 10.3791/53792 Published: April 29, 2016

Introduction

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बहुकोशिकीय जीवों में, सेल प्रवास दोनों भ्रूण जहां यह ऊतकों और अंगों में कोशिकाओं के संगठन यह सुनिश्चित करता है के विकास के लिए और वयस्क जीवन है, जहां यह ऊतक homeostasis (घाव भरने) और प्रतिरक्षा करने के लिए भाग लेता है के लिए आवश्यक है। इन शारीरिक कार्यों के अलावा, सेल प्रवास भी, सहित विशेष रूप से कैंसर मेटास्टेसिस, विविध रोग स्थितियों में शामिल है।

सेल प्रवास दशकों के लिए इन विट्रो में विश्लेषण किया गया है, फ्लैट सतहों पर सेल आंदोलनों सुनिश्चित आणविक तंत्र का एक समग्र समझ प्रदान करते हैं। विवो में हालांकि, कोशिकाओं को एक अधिक जटिल माहौल का सामना कर रहे हैं। यह स्पष्ट रूप से इस तरह के बाह्य मैट्रिक्स के रूप में पिछले कुछ वर्षों में दिखाई दिया कि एक जीव के भीतर प्रवास बाहरी संकेतों से प्रभावित किया जा सकता है, पड़ोसी कोशिकाओं या स्रावित chemokines प्रवास मार्गदर्शक है, और उस तंत्र सेल प्रवास ड्राइविंग क्या वर्णित किया गया है से भिन्न हो सकते हैं <em> इन विट्रो 1,2। विवो सेल प्रवास में सुनिश्चित तंत्र मुख्य रूप से वृद्धि हुई तकनीकी कठिनाई की वजह से अब तक कम ध्यान प्राप्त हुआ है, इन विट्रो अध्ययन की तुलना में। में विवो विशेष रूप से सेल प्रवास के विश्लेषण के पलायन कोशिकाओं के लिए सीधी ऑप्टिकल उपयोग की आवश्यकता है, आप में अनूठा कोशिकाओं लेबल तकनीक के क्रम में उनकी गतिशीलता और आकृति विज्ञान, साथ ही लाभ या समारोह के नुकसान देखने के लिए उम्मीदवार जीन की भूमिका का परीक्षण करने के लिए दृष्टिकोण। अब तक केवल कुछ मॉडल प्रणाली इन विशेषताओं को शरण देने विवो सेल प्रवास 3 में काटना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

हमने हाल ही में विवो सेल प्रवास 4,5 में नियंत्रित करने में उम्मीदवार जीन के समारोह का आकलन करने के लिए एक नया सुविधाजनक मॉडल प्रणाली के रूप में जल्दी zebrafish भ्रूण में भावी prechordal प्लेट के पलायन का इस्तेमाल किया। भावी prechordal प्लेट (पूर्वकाल भी mesendoderm के रूप में जाना जाता है) Gast की शुरुआत में कोशिकाओं के गठन का एक समूह हैभ्रूण के पृष्ठीय पक्ष पर rulation। Gastrulation के दौरान इस समूह को सामूहिक रूप से भ्रूण 6-8 के पशु ध्रुव की ओर migrates, prechordal थाली, एक mesendodermal उमड़ना, पृष्ठदंड के लिए पूर्वकाल फार्म, और तंत्रिका प्लेट अंतर्निहित। जबकि इसके पीछे भाग संभावना mesoderm 9 सिर करने के लिए योगदान देता है prechordal प्लेट का अग्र भाग, अंडे सेने ग्रंथि को जन्म देगा। बाहरी विकास और मछली भ्रूण के ऑप्टिकल स्पष्टता के लिए धन्यवाद, सेल प्रवास सीधे और आसानी से इस संरचना में मनाया जा सकता है।

कोशिका प्रत्यारोपण एक बहुत शक्तिशाली तकनीक है कि मूसा की भ्रूण 10 के तेजी से और आसान बनाने के लिए अनुमति देता है। अलग कक्षों की लेबलिंग में प्रतिरोपित कोशिकाओं परिणामों में फ्लोरोसेंट cytoskeletal मार्करों व्यक्त, आकृति विज्ञान और गतिशीलता जिनमें से आसानी से देखा जा सकता है। हानि या समारोह के लाभ के लिए इस संयोजन परमिट दृष्टिकोण एक कर सकते हैं की सेल स्वायत्त कार्यों का विश्लेषणdidate जीन।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि कैसे हम इन विवो 5 में सेल प्रवास और actin गतिशीलता को नियंत्रित करने में TORC2 घटक Sin1 के समारोह का आकलन किया। लेकिन, जैसा कि परिणामों में उल्लेख किया है और आगे की चर्चा की, यह विवो में सेल प्रवास को नियंत्रित करने में किसी भी उम्मीदवार जीन की संभावित निहितार्थ का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

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नोट: चित्रा 1 प्रोटोकॉल की रूपरेखा प्रस्तुत करता है।

इंजेक्शन और प्रत्यारोपण के लिए सुई की 1. तैयारी

नोट: सुई किसी भी समय तैयार किया जा सकता है और संग्रहीत। उन्हें एक पेट्री डिश में रखें क्ले मॉडलिंग के एक बैंड पर। धूल से बचाने के लिए parafilm के साथ पकवान सील।

  1. इंजेक्शन सुइयों के लिए, (बाहर व्यास 1.0 मिमी व्यास के अंदर 0.58 मिमी, रेशा (सामग्री की सूची देखें) के बिना) एक गिलास केशिका खींच एक micropipette खींचने के साथ (सामग्री की सूची देखें)। छोटी और पतली सुई (लगभग 5 मिमी पतला हिस्सा) वे जरायु भेदी के लिए और अधिक कुशल हैं के रूप में पसंद करते हैं।
    नोट: इंजेक्शन सुई एकल उपयोग कर रहे हैं।
  2. कोशिका प्रत्यारोपण के लिए सुई
    1. एक गिलास केशिका खींचो (बाहर व्यास 1.0 मिमी, अंदर व्यास 0.78 मिमी, रेशा (सामग्री की सूची देखें) के बिना) एक micropipette खींचने के साथ।
    2. यूएक microforge (सामग्री की सूची देखें) गाते हैं, बिंदु पर सुई की नोक कटौती जहां अंदर व्यास 35 माइक्रोन (कोशिकाओं के व्यास की तुलना में थोड़ा अधिक प्रत्यारोपित किया जा करने के लिए) है।
    3. बेवल 45 डिग्री के कोण के साथ एक microgrinder (सामग्री की सूची देखें) के साथ केशिका की कटौती सिरा।
    4. वैकल्पिक रूप से, सुई एक microforge का उपयोग कर के अंत पर एक कंटिया खींच। इस के लिए, बेवल की नोक के साथ गर्म रेशा स्पर्श और तेजी से इसे दूर खींच, एक कंटिया भ्रूण मर्मज्ञ मदद कर सकते हैं बनाने।
    5. एक सुई एक सिरिंज से जुड़ी धारक पर सुई माउंट। सिरिंज का प्रयोग, कांच के अवशेषों को खत्म करने, और उसके बाद एसीटोन के साथ तीन बार कुल्ला करने के लिए 2% Hydrofluoric एसिड के साथ सुई तीन बार के अंदर कुल्ला।
      सावधानी: Hydrofluoric एसिड विषाक्त है, हुड के तहत हेरफेर दस्ताने के साथ।
      नोट: सेल प्रत्यारोपण सुई कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है।

2. की तैयारीइंजेक्शन और सेल प्रत्यारोपण के लिए व्यंजन

  1. गर्मी माध्यम से 11 भ्रूण की 50 मिलीलीटर पूर्ण सत्ता में 1 मिनट के लिए माइक्रोवेव में agarose की 0.5 ग्राम युक्त भ्रूण माध्यम में 1% agarose पाने के लिए। के बारे में 60 डिग्री सेल्सियस के लिए agarose जेल शांत और एक 90 मिमी पेट्री डिश में 50 मिलीलीटर डालना। जेल में एक विशेष रूप से डिजाइन मोल्ड (सामग्री की सूची देखें), या तो इंजेक्शन डिश के लिए लाइनों के साथ या सेल प्रत्यारोपण के पकवान के लिए कुओं के साथ की सतह पर रखें।
    1. agarose पर मोल्ड नाव का निरीक्षण करें, अगर agarose बहुत गर्म नहीं है। बाद agarose जेल सेट किया गया है, संदंश के साथ मोल्ड (- बी 2A चित्रा) को हटा दें।
      नोट: व्यंजन, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है कुछ सप्ताह तक। उन्हें एक बंद गीला बॉक्स में रखें, सुखाने से बचने के लिए।
  2. उपयोग करने से पहले एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर 30 मिनट में पकवान रखें।

3. भ्रूण और इंजेक्शन का संग्रह

  1. इंजेक्शन समाधान तैयारी
    नोट: एक्टिन बाध्यकारी डोमेनखमीर actin बाध्यकारी mCherry के लिए बाध्य ऐसे Lifeact के रूप में प्रोटीन 140 (एबीपी-140) की कोशिका के भीतर polymerized actin कल्पना करने के लिए, आदेश उत्क्षेपणशील गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है (जैसा कि ABP140-mCherry करने के लिए कहा गया है)। एक और परिसर में एक उम्मीदवार जीन (प्रमुख नकारात्मक या अनिवार्यता से सक्रिय निर्माण के जैसे mRNA, या morpholino oligonucleotides) के समारोह का परीक्षण करने के लिए जोड़ें। परिणाम (चित्रा 3), हम morpholino oligonucleotides इस्तेमाल में वर्णित के रूप में Sin1 के कार्यों का आकलन करने के लिए। एक नियंत्रण के रूप में, हम एक morpholino sin1 morpholino करने के लिए, लेकिन 5 अनुक्रम के साथ वितरित इतना है कि इस पर नियंत्रण morpholino लक्ष्य शाही सेना से मेल नहीं खाता न्यूक्लियोटाइड के लिए समान इस्तेमाल किया।
    1. पिघलना sin1 और 5 बेमेल नियंत्रण morpholinos (2 मिमी स्टॉक समाधान), और बर्फ पर ABP140-mCherry mRNAs। MRNAs का 375 एनजी (75 एनजी / अंतिम μl) और या तो sin1 या 5-बेमेल नियंत्रण morpholino की 0.75 μl (0.3 मिमी अंतिम) Danieau बफर (58 मिमी NaCl, 0.7 मिमी में जोड़ेKCl, 0.4 मिमी MgSO 4, 0.6 मिमी सीए (सं 3) 2, 5.0 मिमी HEPES पीएच 7.6), 5 μl की कुल मात्रा तक पहुँचने के लिए।
  2. भ्रूण संग्रह
    नोट: इस प्रयोगात्मक की स्थापना दोनों दाता और मेजबान भ्रूण ट्रांसजेनिक हैं, के क्रम में संभावित prechordal प्लेट 11 कल्पना करने में goosecoid (GSC) के नियंत्रण प्रमोटर के तहत व्यक्त GFP।
    1. (: GFP GSC) अंडे टीजी लीजिए। एक 90 मिमी पेट्री डिश में भ्रूण मध्यम से भरा बारे में 80 अंडे की जगह और 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. दाता भ्रूण इंजेक्षन
    1. एक stereomicroscope के तहत, धीरे भ्रूण मध्यम से भरा एक इंजेक्शन पकवान की तर्ज में संदंश के साथ एकत्र भ्रूण निचोड़। संदंश का प्रयोग, ऊपर की ओर कोशिकाओं के साथ भ्रूण उन्मुख। 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में इंजेक्शन पकवान प्लेस जब तक भ्रूण 4 सेल चरण (1 घंटा बाद निषेचन) पर पहुंच गया है।
    2. के 2 μl के साथ एक इंजेक्शन सुई लोडइंजेक्शन समाधान। एक सुई धारक (सामग्री की सूची देखें) कि (सामग्री की सूची देखें) एक हवाई transjector के लिए एक माइक्रो-जोड़तोड़ में रखा गया है और साथ polytetrafluoroethylene (PTFE) टयूबिंग (सामग्री की सूची देखें) से जुड़ा हुआ है में सुई डालें (सामग्री की सूची देखें )।
    3. धीरे ठीक संदंश के साथ टिप छू द्वारा केशिका खोलें। यदि आवश्यक हो, केशिका इसका सिरा pinching द्वारा खुले में कटौती।
    4. सुई के साथ चार कोशिकाओं में से एक दर्ज करें और क्रम में सेल की मात्रा (2 NL) के 70% भरने के लिए कोशिका के भीतर समाधान इंजेक्षन। 30 भ्रूण इंजेक्षन।
      नोट: सेल में सुई हो रही है, मुश्किल हो सकता है के रूप में प्लाज्मा झिल्ली नरम है। सेल और जर्दी के बीच जंक्शन पर लक्ष्य सुई प्रवेश की सुविधा।
    5. 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में भ्रूण रखें, जब तक वे क्षेत्र मंच (4 घंटे के बाद निषेचन) पर पहुंच गया है।

सेल Transplantat के लिए भ्रूण की तैयारी 4.आयन

  1. 200 μl पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (सामग्री की सूची देखें) (पेन / Strep ईएम) के साथ भ्रूण माध्यम से 20 मिलीलीटर की तैयारी।
  2. क्षेत्र स्तर पर भ्रूण के dechorionation (4 घंटा बाद निषेचन)
    नोट: Dechorionated भ्रूण बहुत कमजोर हैं और हवा या प्लास्टिक के साथ संपर्क के मामले में विस्फोट हो जाएगा। वे इस प्रकार agarose लेपित बर्तन में रखा जाएगा, और आग पॉलिश कांच पाश्चर pipettes के साथ स्थानांतरित की जरूरत है।
    1. एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, दो 35 मिमी पेट्री भ्रूण माध्यम में 1% agarose के साथ लेपित और पेन / Strep ईएम के साथ भरा बर्तन में 3.2 कदम पर एकत्र मेजबान भ्रूण और दाता भ्रूण 3.3 कदम पर इंजेक्शन हस्तांतरण। दो अलग-अलग व्यंजन में मेजबान भ्रूण और दाता भ्रूण रखें।
    2. मैन्युअल रूप से ठीक चिमटी (सामग्री की सूची देखें) के साथ उनके chorions से भ्रूण को निकाल सकते हैं।
    3. 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में भ्रूण रखें, जब तक वे ढाल मंच (6 घंटा बाद निषेचन) पर पहुंच गया है।

5. सेल ट्रांसप्लांटेशन

  1. कोशिका प्रत्यारोपण के लिए भ्रूण की व्यवस्था।
    1. एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope के तहत, का चयन दाता भ्रूण शील्ड (हरा) के भीतर ABP140-mCherry (लाल) व्यक्त।
    2. एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक का प्रयोग, कोशिका प्रत्यारोपण पेन / Strep ईएम के साथ भरा पकवान के कुओं में भ्रूण हस्तांतरण। एक पंक्ति में मेजबान भ्रूण और दाता भ्रूण पड़ोसी पंक्ति में रखें।
    3. एक बरौनी का प्रयोग, ध्यान ढाल के साथ भ्रूण उन्मुख।
      नोट: ढाल की स्थिति या anatomically GFP अभिव्यक्ति द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।
  2. ट्रांसप्लांटेशन सिस्टम सेट-अप।
    नोट: प्रत्यारोपण प्रणाली (सामग्री की सूची देखें) PTFE ट्यूबिंग (सामग्री की सूची देखें) और एक ट्यूब कनेक्टर (सामग्री की सूची देखें) के साथ जुड़ा हुआ एक हैमिल्टन एक सूक्ष्म ड्राइव के साथ सुसज्जित सिरिंज के लिए एक सुई धारक से बना है (सूची देखें सामग्री की)। सुई धारकएक 3-तरह micromanipulator पर मुहिम शुरू की है (सामग्री की सूची देखें)।
    1. एक सुई एक सिरिंज से जुड़ी धारक का प्रयोग, 70% इथेनॉल के साथ सेल प्रत्यारोपण के लिए सुई कुल्ला। सुई में हवा को चूसने से सूखी। , उड़ाने से सूखी नहीं है के रूप में इस में धूल सुई का पतला भाग में अटक रही हो सकता है।
    2. बेवल ऊपर की तरफ से, सुई हैमिल्टन सिरिंज से जुड़े धारक में सुई डालें।
  3. शील्ड के लिए ढाल सेल प्रत्यारोपण
    1. प्रत्यारोपण सुई के साथ एक दाता भ्रूण की ढाल दर्ज करें और 10-20 के बारे में कोशिकाओं ABP140-mCherry के साथ लेबल आकर्षित। ध्यान की जर्दी ड्राइंग से बचें।
    2. मेजबान भ्रूण की ढाल में कोशिकाओं का प्रत्यारोपण। दोहराएँ जब तक सभी मेजबान भ्रूण प्रत्यारोपित किया गया है।
    3. एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक के साथ किसी भी क्षतिग्रस्त भ्रूण निकालें। 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में प्रत्यारोपित भ्रूण रखें और उनके बारे में 30 मिनट के लिए वसूली करते हैं।
    4. एक सुई का प्रयोगएक सिरिंज से जुड़ी धारक, पानी के साथ कोशिका प्रत्यारोपण सुई कुल्ला और क्ले मॉडलिंग के एक बैंड पर एक पेट्री डिश में इसे वापस जगह है। parafilm के साथ पकवान सील।

6. (वैकल्पिक) सिंगल सेल ट्रांसप्लांटेशन

नोट: भ्रूण में, सेल, एक दूसरे का पालन इतना है कि यह प्रत्यारोपण सुई में केवल एक सेल आकर्षित करने के लिए मुश्किल है। हम एक संशोधित प्रोटोकॉल आसानी से एकल prechordal प्लेट पूर्वज कोशिकाओं का प्रत्यारोपण करने के लिए विकसित की है। विचार पहले प्रत्यारोपण कोशिकाओं को अलग कर देना है। क्योंकि पृथक prechordal प्लेट पूर्वज कोशिकाओं अपनी पहचान खो देते हैं, हम आनुवंशिक रूप से उन्हें एक भावी prechordal प्लेट पहचान, अधिरोपित नोडल संकेतन मार्ग को सक्रिय करने, Sox32 प्रतिलेखन कारक के अभाव में से। हम सत्यापित किया है कि इन कोशिकाओं को प्रेरित अंतर्जात prechordal प्लेट पूर्वज कोशिकाओं 8 की तरह व्यवहार करते हैं। नीचे दिए गए एकल कोशिका प्रत्यारोपण प्रदर्शन करने के लिए विशेष कदम उठाए हैं। सेल dissociation कैल्शियम मुक्त घंटी 11 में भ्रूण रखने, एक explant विदारक और यंत्रवत् यह सरगर्मी से हासिल की है।

  1. 2.1 चरण में भ्रूण मध्यम के बजाय कैल्शियम मुक्त घंटी में 1% agarose के साथ प्रत्यारोपण के पकवान तैयार करते हैं।
  2. 3.1 कदम पर, ABP140-mCherry शाही सेना और sin1 morpholino के अलावा, 2 पर नोडल रिसेप्टर Taram-ए का सक्रिय रूप एन्कोडिंग (0.6 एनजी / μl अंतिम) RNAs के 3 एनजी और sox32 के खिलाफ morpholino की 1.25 μl (शेयर समाधान जोड़ने मिमी, 0.5 मिमी इसलिए अंतिम)।
  3. चरण 4, स्थानांतरण पेन / Strep कैल्शियम मुक्त घंटी एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक का उपयोग के साथ भरा सेल प्रत्यारोपण के लिए डिश में तीन चयनित दाता भ्रूण के बाद। ठीक चिमटी के साथ, इंजेक्शन कोशिकाओं (ABP140-mCherry लेबल की कोशिकाओं) से युक्त एक explant काटना। तेजी से भ्रूण के बाकी त्यागें।
  4. एक बरौनी के साथ, धीरे explant हलचल जब तक कोशिकाओं को अलग कर देना।
  5. प्रत्यारोपण सुई में एक अलग सेल ड्राऔर यह एक मेजबान भ्रूण की ढाल में प्रत्यारोपण।
  6. एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक का प्रयोग, एक agarose लेपित पेन / Strep ईएम के साथ भरा पकवान में भ्रूण हस्तांतरण। 30 मिनट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में भ्रूण रखें।

7. भ्रूण बढ़ते

  1. इमेजिंग कक्ष
    1. विधि 1: एक इमेजिंग एक प्लास्टिक स्लाइड (75 * 25 * 0.5 मिमी) एक तरफ 4 छेद (5.5 मिमी व्यास), 3 मिमी उच्च किनारों के साथ (चित्रा -2 सी - डी) के साथ छेद से बना चैम्बर का उपयोग करें। पीछे की ओर एक गिलास coverslip, cyanoacrylate गोंद (सुपर गोंद) के साथ गोंद।
      नोट: प्रयोग के अंत में, coverslip हटाने और रेत कागज के साथ गोंद अवशेषों से छुटकारा पाने के लिए एक रात के लिए पानी में चैम्बर जगह है।
    2. विधि 2: एक 10 मिमी छेद के साथ 35 मिमी MatTek गिलास नीचे व्यंजन (सामग्री की सूची देखें) का उपयोग करें।
  2. भ्रूण बढ़ते
    1. भ्रूण माध्यम में गर्म 0.2% agarose के 1 मिलीलीटर के साथ एक कांच की शीशी भरें।एक गर्मी-ब्लॉक में 42 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. फ्लोरोसेंट stereomicroscope के तहत, एक भ्रूण जिसमें Red प्रतिरोपित कोशिकाओं भावी prechordal प्लेट हरे रंग में लेबल (यानी लाल प्रतिरोपित कोशिकाओं हरी भावी prechordal प्लेट के भीतर हैं, और पशु ध्रुव की ओर पलायन शुरू कर दिया है) का हिस्सा हैं का चयन करें।
    3. एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक के साथ agarose समाधान में एक चयनित भ्रूण स्थानांतरण। पिपेट से भ्रूण माध्यम से अधिक त्यागें। agarose के साथ पिपेट में भ्रूण ड्रा, और इमेजिंग कक्ष में भ्रूण स्थानांतरण, agarose की एक बूंद जमा। इससे पहले agarose सेट है, एक बरौनी के साथ भ्रूण उन्मुख। एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग के लिए ऊपर की तरफ भावी prechordal प्लेट जगह है, या एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग के लिए कांच के तल पर। जब तक agarose कक्ष के बगल में अच्छी तरह से में एक और भ्रूण बढ़ते से पहले (करीब 1 मिनट, कमरे के तापमान पर निर्भर करता है) सेट किया जाता है रुको।
      नोट: एक इमेजिंग चाmber 4 कुओं युक्त 4 भ्रूण अप करने के लिए बढ़ते अनुमति देता है।
    4. जब agarose सेट है, सुखाने से बचने के लिए पेन / Strep ईएम के साथ चैम्बर भरें।

8. लाइव इमेजिंग

  1. एक 40x पानी विसर्जन लंबी दूरी के लेंस का प्रयोग करें। GFP के लिए छवि GFP और mCherry (करने के लिए उपयुक्त फिल्टर सेट का उपयोग करें:; उत्तेजना बीपी 470/40, बीम फाड़नेवाला एफटी 510, और उत्सर्जन बीपी 540/50 mCherry के लिए: उत्तेजना बीपी 578/21, बीम फाड़नेवाला एफटी 596, और उत्सर्जन एल.पी. 641 / 75)। आदेश की छवि गतिशीलता का अनुकूलन करने में जोखिम अवधि को समायोजित करें।
  2. छवि प्लेट में सभी कोशिकाओं के लिए, जेड के ढेर के अधिग्रहण, भावी prechordal प्लेट के ऊपर कुछ माइक्रोन (बाह्य त्वक स्तर में) शुरू करने और भावी prechordal प्लेट के नीचे कुछ माइक्रोन (जर्दी में) समाप्त। 2 माइक्रोन की एक z कदम का प्रयोग करें। अधिग्रहण की गति का अनुकूलन करने के लिए, जेड के ढेर के बीच के बजाय फ्रेम के बीच रंग स्विच।
    नोट: यह हरे और लाल छवियों के बीच मामूली मतभेद पैदा हो सकती है, लेकिन कोई सटीक सह के बाद से एक समस्या नहीं हैहरे और लाल संकेतों के बीच -localization आवश्यक है। प्रकाश के लिए आगे इमेजिंग समय और जोखिम को कम करने के लिए, हरी केवल एक बार हर 5 समय कहते हैं, जो prechordal प्लेट पूर्वज कोशिकाओं की पहचान करने के लिए पर्याप्त है प्राप्त किया जा सकता है।
  3. ऐसे सेटिंग्स छवि दो मिनट का समय अंतराल जो आवश्यक है फलाव आवृत्ति और अभिविन्यास का विश्लेषण करने के भीतर 4 भ्रूण अप करने के लिए उपयोग करना,। फलाव जीवन भर के विश्लेषण के लिए, उच्च समय संकल्प पाने के लिए 30 सेकंड के लिए समय अंतराल को कम। 80% से 60% epiboly epiboly से छवि।

9. सेल गतिशीलता विश्लेषण

  1. ImageJ में 4 डी छवियों को लोड
    नोट: अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर पर निर्भर करता है, छवियों विभिन्न स्वरूपों में जमा हो जाती है (छवि के प्रति एक फ़ाइल प्रति जेड ढेर एक फ़ाइल, पूरे प्रयोग के लिए एक फ़ाइल)। कुछ ImageJ प्लगइन्स 4D ढेर खोलने के लिए ऑनलाइन उपलब्ध हैं। हमारे आंकड़ों के अनुसार जेड ढेर एक फ़ाइल के रूप में जमा हो जाती है। क्योंकि डाटासेट बड़ा हो सकता है, यह इसे का ही हिस्सा है (कुछ टिम खोलने के लिए सुविधाजनक हो सकता हैई अंक या जेड ढेर, या 8 बिट के एक subpart छवियों परिवर्तित ...)। हम एक कस्टम बनाया ImageJ प्लगइन का उपयोग करने के लिए ऐसा करते हैं, जो हम अनुरोध पर वितरित करने के लिए खुश हो जाएगा।
  2. अभिविन्यास का विश्लेषण और सेल उभार की आवृत्ति
    1. भावी prechordal प्लेट प्रवास के मुख्य दिशा निर्धारित करने के लिए GFP छवियों का प्रयोग करें। सेल उभार कोण मापन के लिए एक संदर्भ के रूप में यह लो। ढेर घुमाएँ, ताकि इस संदर्भ दिशा छवि के एक तरफ के समानांतर है।
    2. एक सेल का पालन करें। कोण उपकरण का चयन करें। प्रत्येक फ्रेम और प्रत्येक फलाव के लिए, फलाव और संदर्भ दिशा (चित्रा 3) के बीच के कोण को मापने के लिए कोण उपकरण का उपयोग करें। (कीबोर्ड पर या प्रेस एम) मूल्य की दुकान के लिए विश्लेषण / उपाय आदेश का उपयोग करें। एक txt फ़ाइल के रूप में परिणाम को बचाओ। अगले सेल के साथ दोहराएँ।
    3. histograms के रूप में आर और साजिश कोण वितरण में डेटा आयात करें। विभिन्न परिस्थितियों की तुलना करने के Kolmogorov-Smirnov टेस्ट (आर में ks.test) का प्रयोग करें।
      नोट: कोण उपकरण शास्त्रीय सांख्यिकीय परीक्षण और परिपत्र नहीं परीक्षण के उपयोग की अनुमति, 0 डिग्री और 180 डिग्री के बीच शामिल मूल्यों प्रदान करता है।
    4. इस डेटा सेट के साथ, प्रति मिनट सेल प्रति उभार की संख्या के रूप में उत्सर्जन आवृत्ति की गणना। उपयोग छात्र टी परीक्षण (आर में t.test) अलग अलग परिस्थितियों की तुलना करें।
  3. सेल उभार लाइफटाइम का विश्लेषण
    1. प्रत्येक कोशिका और प्रत्येक फलाव, उपाय के फलाव अवधि (फ्रेम की संख्या के दौरान जो फलाव फ्रेम के बीच वर्तमान एक्स समय अंतराल है) के लिए।
    2. आर उपयोग छात्र टी परीक्षण (आर में t.test) में डेटा आयात विभिन्न स्थितियों की तुलना करें।
      नोट: अन्य प्रवास सुविधाओं आदेश सेल प्रवास को चिह्नित करने में विश्लेषण करने के लिए दिलचस्प हो सकता है। ये सेल पटरियों, गति, दिशा और दृढ़ता माप, या सेल आकृति विज्ञान के लिए शामिल हैं। कुछ व्यावसायिक सॉफ्टवेयर अनुप्रयोगों इन सुविधाओं को मापने के लिए उपलब्ध हैं, लेकिन खुला स्रोत सॉफ्टवेयर appli की एक बड़ी संख्याफैटायनों और ImageJ plugins भी उपलब्ध हैं, के रूप में उदाहरण के लिए morphodynamics 12 विश्लेषण करने के लिए अनुकूल है, DiPer सेल trajectories और दिशात्मक हठ 13, CellTrack को देखने के लिए प्रवास के दौरान 14 सेल सीमाओं को ट्रैक करने के लिए।

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Representative Results

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प्रस्तुत तकनीक, Sin1, टो जटिल 2 (TORC2) के मुख्य घटक से एक की भूमिका का विश्लेषण करने के लिए विवो सेल प्रवास में नियंत्रित करने में इस्तेमाल किया गया था। कोशिका प्रत्यारोपण का उपयोग अलग कक्षों और सेल स्वायत्त प्रभाव के विश्लेषण की लेबलिंग परमिट। मूवी एस 1 प्रत्यारोपित prechordal प्लेट पूर्वज कोशिकाओं के प्रवास से पता चलता है। ABP140 साथ actin लेबलिंग actin-अमीर cytoplasmic उभार की आसान दृश्य अनुमति देता है। हम उनकी आवृत्ति और ओरिएंटेशन मापा। जंगली प्रकार की कोशिकाओं लगातार बड़े cytoplasmic पशु ध्रुव की दिशा में उन्मुख उभार, प्रवास की दिशा (चित्रा 3 बी) में यानी उत्पादन। Sin1 के समारोह के नुकसान उभार की संख्या की भारी कमी है, और शेष लोगों की यादृच्छिकीकरण की ओर जाता है, actin अमीर फलाव गठन को नियंत्रित करने में sin1 के महत्व का प्रदर्शन है। दिलचस्प है, इस phenotype ई से बचाया जा सकता हैRac1 15 की एक अनिवार्यता से सक्रिय रूप से है xpression, दृढ़ता से सुझाव है कि TorC2 Rac1 (चित्रा 3 बी) के माध्यम से actin गतिशीलता और सेल फलाव गठन को नियंत्रित करता है।

प्रस्तुत तकनीक भी Arpin, Arp2 / 3 परिसर के एक हाल ही में पहचान अवरोध की भूमिका को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था सेल गतिशीलता 4 पर। Arpin समारोह के नुकसान फलाव आवृत्ति (एक निश्चित समय पर एक फलाव शरण कोशिकाओं की औसत दर) में वृद्धि हो जाती है। यह या तो अधिक लगातार फलाव गठन के लिए या फलाव स्थिरता में वृद्धि के कारण हो सकता है। मापने फलाव जीवन भर से पता चला है कि, Arpin के अभाव में, फलाव अस्थायी हठ दोगुनी है (चित्रा 3 सी)। यह एक Arp2 / 3 अवरोध है, जो फलाव त्याग सुविधा होगी के रूप में Arpin की भूमिका के साथ संगत है, और पता चलता है कि Arpin बजाय, फलाव स्थिरता नियमन द्वारा फलाव आवृत्ति को प्रभावित करता हैफलाव दीक्षा।

आकृति 1
चित्रा 1:। प्रक्रिया की रूपरेखा टीजी (GSC: GFP) भ्रूण 4 सेल चरण (1 घंटा बाद निषेचन) में इंजेक्ट किया जाता है। 28 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटे के बाद, भ्रूण के भीतर ढाल (GFP +) पॉजिटिव कोशिकाओं दिखा ABP140-mCherry दाता भ्रूण के रूप में चुने गए हैं। शील्ड कोशिकाओं के प्रत्यारोपण सुई के भीतर तैयार की और एक मेजबान भ्रूण की ढाल में स्थानांतरित कर रहे हैं। वसूली के 0.5 घंटे के बाद, मेजबान भ्रूण मुहिम शुरू की और एक epifluorescent माइक्रोस्कोप (40x उद्देश्य) के साथ imaged हैं। HPF:। घंटे के बाद निषेचन यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Transplantatiडिश और इमेजिंग कक्ष। (ए) व्यक्तिगत कुओं के साथ ट्रांसप्लांटेशन पकवान पर। (बी) कोशिका प्रत्यारोपण डिश के लिए मोल्ड। (सी) घर का बना इमेजिंग कक्ष। (डी) घर का बना इमेजिंग चैम्बर के योजनाबद्ध ड्राइंग। स्केल बार = 1 सेमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। सेल से परिणाम गतिशीलता विश्लेषण (ए) फलाव कोण की माप की योजना। (बी) सेल फलाव अभिविन्यास और आवृत्ति का विश्लेषण। Sin1 (मो Sin1) के अभाव में, कोशिकाओं को कम उभार फेंकना और शेष उभार बेतरतीब ढंग से उन्मुख होते हैं। इस phenotype GTPase Rac1 (मो पाप के एक अनिवार्यता से सक्रिय रूप की अभिव्यक्ति से बचाया जा सकता है1 + CA-Rac1)। DUMORTIER और डेविड, 2015 5। (सी) फलाव जीवन भर के विश्लेषण से संशोधित। Arpin (मो Arpin) के अभाव में, फलाव आवृत्ति बढ़ जाती है। इस फलाव जीवन में वृद्धि के कारण है। एक Arpin आरएनए morpholino के प्रति असंवेदनशील reintroducing इस अति उत्क्षेपणशील phenotype पुनर्स्थापित करता है। से डांग एट अल। संशोधित, 2013 4। स्केल बार = 10 माइक्रोन। एक: पूर्वकाल; पी: पीछे, एल: वाम, आर:। सही कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

फिल्म 1
फिल्म 1: सेल उभार की Sin1 नियंत्रण गठन, Rac1 के माध्यम से (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। प्रत्यारोपित prechordal प्लेट पूर्वज कोशिकाओं, के साथ इंजेक्शनABP140-mCherrry RNAs और एक नियंत्रण morpholino, या sin1 morpholino, या sin1 morpholino और RNAs Rac1 के विधान फार्म के लिए। फलाव आवृत्ति और ओरिएंटेशन इन छवियों पर मापा गया।

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल विवो में, लाइव इमेजिंग के साथ सेल प्रत्यारोपण का उपयोग कर chimeric भ्रूण के निर्माण के संयोजन से सेल प्रवास में एक उम्मीदवार जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक आसान तरीका प्रस्तुत करता है।

पच्चीकारी भ्रूण का निर्माण

एक सेल की गतिशीलता के अध्ययन के cytoplasmic एक्सटेंशन का विश्लेषण करने के लिए अपने समोच्च के दृश्य की आवश्यकता है। या अलग लेबल - - पर्यावरण, इस प्रकार अच्छा दृश्य विपरीत पेशकश यह एक अन्यथा लेबल हटाया गया में अलग कक्षों लेबलिंग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

एक आसान तरीका है प्रसंभात्य भ्रूण में कोशिकाओं के एक हिस्से को लेबल करने के लिए 1 सेल चरण 16 में plasmidic डीएनए इंजेक्षन है। इंजेक्शन प्लास्मिड समुच्चय है कि बेतरतीब ढंग से और असमान कोशिका विभाजन के दौरान कोशिकाओं में अलग कर रहे हैं के रूप में। यह कोशिकाओं के एक यादृच्छिक सबसेट में प्लाज्मिड की अभिव्यक्ति की ओर जाता है, और इस तरह मो पैदा करने के लिए एक बहुत ही तेजी से, आसान और गैर इनवेसिव विधि का प्रतिनिधित्व करता हैSAIC भ्रूण। हालांकि, इंजेक्शन प्लाज्मिड व्यक्त कोशिकाओं समूहों के रूप में करते हैं, और भावी prechordal थाली में कुछ व्यक्त अलग कक्षों युक्त भ्रूण पाने की संभावना काफी कम है। इसके अलावा, plasmidic डीएनए के उपयोग के इंजेक्शन निर्माण की अभिव्यक्ति के स्तर के बहुत सीमित नियंत्रण प्रदान करता है। कोशिका प्रत्यारोपण द्वारा कैमेरिक भ्रूण की रचना हालांकि तकनीकी रूप से अधिक कठिन plasmidic डीएनए इंजेक्शन की तुलना में, लाभ के एक नंबर प्रदान करता है: प्रतिरोपित कोशिकाओं की संख्या के नियंत्रण, निर्माणों (आरएनए इंजेक्शन) की अभिव्यक्ति के स्तर का नियंत्रण है, और पिछले नहीं बल्कि कम से कम , सेल प्रत्यारोपण, सेल स्वायत्त प्रभाव का परीक्षण करने के लिए पच्चीकारी भ्रूण जिसमें प्रतिरोपित कोशिकाओं हानि या समारोह निर्माणों का लाभ शामिल बनाने के द्वारा अनुमति देते हैं। इसके विपरीत, प्रत्यारोपण भी भ्रूण कि संशोधित किया गया है में जंगली प्रकार की कोशिकाओं के प्रत्यारोपण द्वारा पर्यावरण के गैर स्वायत्त भूमिका का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस परीक्षण के लिए विशेष रुचि का हो सकता हैउदाहरण के लिए, बाह्य मैट्रिक्स घटक है कि सेल प्रवास के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैं के समारोह।

सेल प्रत्यारोपण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पहले से ही 10 में वर्णित किया गया है। इस प्रोटोकॉल की तुलना में, हम अपनी प्रक्रिया में दो मुख्य मतभेदों पर चर्चा करना चाहते हैं।

पहली अंतर दाता भ्रूण इंजेक्शन के मंच से संबंधित है। हमारे अनुभव के अनुसार, भ्रूण कोशिका में RNAs की एक अधूरी प्रसार के कारण एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन ही ढंग सभी कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन, व्यक्त नहीं करते की RNAs के साथ 1 सेल मंच पर इंजेक्शन। चार कोशिकाओं में से एक में 4 सेल मंच पर दाता भ्रूण इंजेक्शन कोशिकाओं का एक सजातीय क्लोन, विशेष रुचि का है जो जब फ्लोरोसेंट प्रोटीन की RNAs सह इंजेक्शन अन्य RNAs कि मिल नहीं रहे हैं के साथ कर रहे हैं पाने के लिए अनुमति देता है।

दूसरा मुख्य अंतर transplantat में तेल के बजाय हवा का इस्तेमाल होता हैआयन सिरिंज। एक हवा से भरे प्रणाली के मुख्य दोष जड़ता हवा की लोच से उत्पन्न होता है। तेल पर इसके विपरीत, असंपीड्य जा रहा है, सक्शन और दबाव का अच्छा नियंत्रण प्रदान करता है। हालांकि, एक छोटे से प्रशिक्षण के साथ, और सुई की पतली, पतला भाग में हवा और भ्रूण माध्यम के बीच इंटरफेस बनाए रखने के द्वारा, एक हवा से भरे प्रणाली के साथ सक्शन और दबाव के नियंत्रण ढाल चरण में कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए पर्याप्त है। बाद के चरणों के लिए, के रूप में कोशिकाओं के छोटे और अधिक एकजुट हो जाते हैं, सक्शन एक उच्च दबाव है, जो एक हवा से भरे सेटअप के साथ हासिल नहीं किया जा सकता है बहुत ठीक नियंत्रित किए जाने की जरूरत है कि आवश्यकता है। आसान बनाता तेल के बजाय हवा के प्रयोग से व्यवस्था किसी भी हवाई बुलबुले के बिना तेल के साथ प्रणाली भरने के रूप में, मुश्किल है। इसके अलावा, यह तेल के साथ प्रत्यारोपण सुई भरने से बचा जाता है। यह प्रत्यारोपण सुई पुन: उपयोग किया जा सकता है, और इसलिए सावधानी से तैयार रहने की अनुमति देता है। हमें लगता है तेज किनारों के बिना और सही व्यास का एक सुई succe के लिए महत्वपूर्ण है किssful प्रत्यारोपण। यह प्रत्यारोपण कदम स्पष्ट रूप से प्रोटोकॉल है, जो आसानी से किया जा रहा से पहले अभ्यास की आवश्यकता है में महत्वपूर्ण कदमों में से एक है।

हम भी पहले प्रत्यारोपण कोशिकाओं को अलग कर, आदेश प्रत्यारोपण सुई में एक अद्वितीय सेल आकर्षित करने के लिए में होते हैं, जो एकल कक्षों, रोपाई के लिए एक विशेष प्रक्रिया का प्रस्ताव किया है। इसका मतलब है कि क्षणिक सेल हदबंदी अपनी पहचान और / या व्यवहार में बदलाव नहीं करेगी। prechordal प्लेट पूर्वज कोशिकाओं के लिए, हम आनुवंशिक रूप से सेल पहचान थोपना, और ध्यान से जाँच की है कि इन कोशिकाओं को गैर-अलग लोगों की तरह व्यवहार करते हैं। हालांकि, हम औपचारिक रूप से है कि हदबंदी को बाहर नहीं कर सकते और / या आनुवंशिक प्रेरण कोशिकाओं में किसी का ध्यान नहीं संशोधनों प्रेरित। उन्हें अलग कर के बिना एकल कोशिकाओं के प्रत्यारोपण संभव है। कोशिकाओं के प्रत्यारोपण सुई में सावधानी से तैयार किया जाना चाहिए। हालांकि, हमारे हाथ में कम से कम, सफलता की दर काफी कम है, क्योंकि या तो एक से अधिक सेल Nee में हो जाता हैdle, क्योंकि या सेल कैंची जब तक खींचा और सुई में मर जाता है या एक बार प्रत्यारोपित किया।

Epifluorescence बनाम तेजी confocal इमेजिंग

कोशिका प्रत्यारोपण के उपयोग पच्चीकारी भ्रूण बनाने के लिए अलग कक्षों की लेबलिंग, अन्य लेबल की कोशिकाओं से अलग करने के लिए अनुमति देता है। इस संदर्भ में, सेल आकृति विज्ञान और गतिशीलता का अच्छा इमेजिंग के रूप में प्रोटोकॉल में प्रस्तावित है, मानक epifluorescence माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त किया जा सकता है। यह एक अपेक्षाकृत व्यापक प्रसार के उपकरण और एक कम लागत और अधिक महंगा confocal इमेजिंग सिस्टम के लिए वैकल्पिक होने का स्पष्ट लाभ दिया है।

सटीक subcellular localizations के लिए, confocal इमेजिंग संकल्प में सुधार करने के लिए, विशेष रूप से अक्षीय संकल्प में इस्तेमाल किया जा सकता है। अभी भी पर्याप्त अस्थायी समाधान प्राप्त करने के लिए, तेजी से confocal इमेजिंग का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। हमारे अनुभव से, कताई डिस्क माइक्रोस्कोप संकल्प, गति और फोटो विषाक्तता के बीच एक अच्छा समझौता प्रदान करते हैं। तेजी से स्कैनिंग confocal microscopes (गुंजयमान स्कैनिंग माइक्रोस्कोप की तरह) अच्छा विकल्प के रूप में अच्छी तरह से लगातार कम और अधिक महंगे हैं, लेकिन।

cytoskeleton लेबलिंग

एक्टिन तंतु और उनकी गतिशीलता का अच्छा लेबलिंग actin आधारित सेल प्रवास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि झिल्ली ही सीमित फ्लोरोसेंट मार्करों अधिक सेल रूपरेखा का विश्लेषण करने के लिए कुशल हैं, actin लेबलिंग सेल उभार का एक बेहतर दृश्य की अनुमति देता। विशेष रूप से, अगर तीन लेबल की कोशिकाओं के संपर्क में मिलता है, यह बहुत मुश्किल एक cytoplasmic विस्तार की रूपरेखा और पड़ोसी कोशिकाओं को मिलाया जा सकता हो की झिल्ली के रूप में दो पड़ोसी की कोशिकाओं के बीच स्थित विस्तार की पहचान है। एक्टिन तंतु लेबल actin आधारित सेल उभार, जिस पर हम ध्यान केंद्रित का स्पष्ट पता लगाने के लिए अनुमति देता है। सेल आकृति विज्ञान मात्रा निर्धारित किया जा रहा था, तो एक झिल्ली लेबलिंग बेहतर होगा। एक अन्य विकल्प या तो का उपयोग कर 3-रंग इमेजिंग (एक ट्रांसजेनिक ली के लिए, दोनों लेबलिंग का उपयोग करने के लिए हैne, actin के लिए एक और झिल्ली के लिए एक), या द्वारा GFP झिल्ली लेबलिंग। ट्रांसजेनिक लाइन में, GFP cytoplasmic है, और goosecoid-GFP सकारात्मक कोशिकाओं को इस तरह से पहचाना जा सकता है, भले ही झिल्ली GFP लेबल है।

पिछले वर्षों में, जांच की एक संख्या को लाइव नमूनों में actin लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। पहले वाले actin monomers के लिए सीधी fusions थे। इन दो प्रमुख कमियां प्रस्तुत किया। पहला, वे सब actin और नहीं विशेष रूप से polymerized actin लेबल। दूसरा, वे अक्सर विषाक्त थे। जांच के वर्तमान में उपयोग में filamentous actin बाध्यकारी फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से जुड़े हुए डोमेन हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम ABP140, जो वर्तमान में filamentous actin के लिए सबसे अक्सर इस्तेमाल किया मार्कर है, और सभी filamentous actin लेबल 17 (खमीर actin बाध्यकारी प्रोटीन 140 के actin बाध्यकारी डोमेन) का इस्तेमाल किया। 18 (calponin अनुरूपता डोमेन) Utrophin भी filamentous actin लेबल, लेकिन केवल स्थिर तंतु लेबल करने के लिए प्रकट होता है। इस अंतर को पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैtify गतिशील एक्टिन तंतु, लोगों Utrophin 19 नहीं ABP140 द्वारा लेबल और के रूप में।

हाल ही में यह मक्खी ABP140 और Utrophin लंबे अभिव्यक्ति 20 से अधिक विषाक्त प्रभाव, विशेष रूप से हो सकता है कि में सूचना दी गई है। हालांकि हम ABP140 लेबल की कोशिकाओं में किसी भी प्रवास दोष नहीं देखा है, हम बाहर नहीं कर सकते कि ABP140 अभिव्यक्ति अंतर्जात actin गतिशीलता उपद्रव हो सकती है। Filamentous actin के लिए एक तीसरा जांच हाल ही में 21 की सूचना मिली थी। एफ tractin (चूहा inositol triphosphate 3-काइनेज से actin बाध्यकारी डोमेन) filamentous actin के एक वफादार संवाददाता, जो विषाक्त प्रभाव 20,22 नहीं दिखा सकते हैं के रूप में वर्णित किया गया है। हमारे ज्ञान करने के लिए, एफ tractin का उपयोग अभी तक zebrafish में सूचना नहीं दी गई है।

actin के अलावा, कई अन्य सेल घटकों के सेल प्रवास के बारे में हमारी समझ में सुधार करने के लिए लेबल किया जा सकता है। इस मायोसिन जैसे अन्य cytoskeletal घटकों, सूक्ष्मनलिकाएं, तारक काय, साथ ही केएन शामिलसेल प्रवास के स्वयं के नियामकों (छोटे GTPases रो, आरएसी और Cdc42, PIP3 के लिए फ्लोरोसेंट जांच के सक्रिय रूपों ...) या सेल आसंजन में शामिल प्रोटीन (इंटेग्रिन, cadherins ...)।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल विवो में सेल प्रवास को नियंत्रित करने में एक उम्मीदवार जीन की भागीदारी का परीक्षण करने के लिए एक तेजी से और आसान प्रणाली का प्रस्ताव करने के लिए पहले से वर्णित उपकरणों और तकनीकों का एक नंबर regroups। हम भावी prechordal प्लेट प्रवास इस्तेमाल के रूप में यह निर्देश दिया सामूहिक पलायन का एक दिलचस्प मॉडल है, और उपलब्ध ट्रांसजेनिक लाइन लेबलिंग यह की वजह से। हालांकि, एक समान प्रोटोकॉल अन्य माइग्रेशन घटनाओं विकास के दौरान होने वाली विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) Harvard Apparatus 300085 standard thickness
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) Harvard Apparatus 300085 thin-walled
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml
fine tweezers Dumont Fine Science Tools 11254-20 5F
glass bottom dishes MatTek P35G-0-10-C
Air transjector Eppendorf 5246
Micro-forge Narishige MF-900
Microgrinder Narishige EG-44
Micromanipulator (for injection) Narishige MN-151
Micromanipulator (for cell transplantation) Leica Leica Micromanipulator
Hammilton Syringe Narishige IM-9B
Micropipette puller David Kopf Instruments Model 720
Transplantation mold Adapative Science Tools PT-1
Needle holder Narishige HI-7
Tube connector Narishige CI-1
PTFE tubing Narishige CT-1

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References

  1. Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, (12), 813-824 (2014).
  2. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188, (1), 11-19 (2010).
  3. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, (7), 445-457 (2009).
  4. Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. (2013).
  5. Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
  6. Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17, (11), 931-939 (1995).
  7. Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130, (22), 5375-5384 (2003).
  8. Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1-6 (2012).
  9. Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127, (5), Cambridge, England 921-932 (2000).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
  11. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). (2000).
  12. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209, (1), 163-180 (2015).
  13. Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9, (8), 1931-1943 (2014).
  14. Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24, (14), 1647-1649 (2008).
  15. Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259, (2), 318-335 (2003).
  16. Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141, (22), 4332-4342 (2014).
  17. Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5, (7), 605-607 (2008).
  18. Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64, (11), 822-832 (2007).
  19. Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18, (2), 226-236 (2010).
  20. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393, (2), 209-226 (2014).
  21. Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20, (24), 5166-5180 (2009).
  22. Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23, (5), 834-852 (2012).
विश्लेषण<em&gt; Vivo</em&gt; सेल प्रवास zebrafish भ्रूण में सेल प्रत्यारोपण और समय चूक इमेजिंग का उपयोग कर
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Giger, F. A., Dumortier, J. G., David, N. B. Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (110), e53792, doi:10.3791/53792 (2016).More

Giger, F. A., Dumortier, J. G., David, N. B. Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (110), e53792, doi:10.3791/53792 (2016).

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