Introduction
Em organismos multicelulares, a migração celular é essencial tanto para o desenvolvimento do embrião em que assegura a organização de células em tecidos e órgãos, e para a vida adulta, em que participa a homeostase do tecido (cicatrização de ferimentos) e imunidade. Em adição a estas funções fisiológicas, a migração de células, também está envolvido em diversas situações patológicas, incluindo, em particular, a metástase do cancro.
A migração celular foi analisado in vitro ao longo de décadas, proporcionando uma compreensão global dos mecanismos moleculares que garantem movimentos celulares em superfícies planas. In vivo no entanto, as células são confrontados por um ambiente mais complexo. É claramente apareceu nos últimos anos que a migração dentro de um organismo pode ser influenciada por estímulos externos, tais como a matriz extracelular, as células ou quimioquinas segregadas orientadores migração vizinha, e que os mecanismos de condução migração de células pode variar do que foi descrito <em> in vitro 1,2. Os mecanismos que garantam na migração celular vivo têm recebido menos atenção até agora, principalmente por causa do aumento da dificuldade técnica, em comparação com estudos in vitro. In vivo análise da migração celular em particular requer acesso óptico direto para as células migram, técnicas para marcar células únicas em a fim de ver a sua dinâmica e morfologia, assim como o ganho ou a perda de função de abordagens para testar o papel dos genes candidatos. Até agora, apenas alguns sistemas modelo que albergam estas características têm sido utilizadas para dissecar na migração celular in vivo 3.
Recentemente, utilizou a migração da placa pré-cordal prospectivo em embriões de peixe-zebra iniciais como um novo sistema modelo conveniente para avaliar a função de genes candidatos para controlar a migração celular in vivo em 4,5. placa pré-cordal prospectivo (também conhecido como mesendoderm anterior) é um grupo de formação de células no início de Gastrulation no lado dorsal do embrião. Durante a gastrulação este grupo migra em conjunto em direcção ao polo animal do embrião 6-8, para formar a placa pré-cordal, um espessamento mesendodermal, anterior ao da notocorda e da placa neural subjacente. A parte anterior da placa precordial dará origem à glândula incubação, enquanto a sua parte posterior provavelmente contribui para a cabeça mesoderme 9. Graças ao desenvolvimento externo e clareza óptica do embrião de peixe, a migração de células pode ser facilmente e directamente observado nesta estrutura.
O transplante celular é uma técnica muito potente que permite a criação rápida e fácil de embriões de mosaico 10. Expressando marcadores fluorescentes do citoesqueleto em células transplantadas resultados na marcação de células isoladas, a morfologia e a dinâmica das quais pode ser facilmente observado. Combinando isso a perda ou ganho de função se aproxima permite a análise de funções das células-autônoma de uma latagene didata.
O protocolo apresentado descreve como avaliamos a função do componente SIN1 TORC2 no controle da migração celular e actina dinâmica in vivo 5. Mas, como mencionado nos resultados discutidos e ainda mais, que poderia ser utilizado para analisar a implicação potencial de qualquer gene candidato para controlar a migração celular in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: A Figura 1 apresenta o esquema do protocolo.
1. Preparação das agulhas para injeção e Transplante
Nota: As agulhas podem ser preparados em qualquer momento e armazenado. Mantê-los em uma placa de Petri, em uma faixa de massa de modelar. Selar o prato com parafilme para proteger da poeira.
- Para agulhas de injeção, puxar um capilar de vidro (diâmetro externo 1,0 mm de diâmetro interno 0,58 milímetros, sem filamentos (ver lista de materiais)) com um extrator micropipeta (ver lista de materiais). Prefere agulhas curtas e finas (parte afunilada de cerca de 5 mm), como eles são mais eficientes para perfurar o córion.
Nota: As agulhas de injecção são de uso único. - Agulhas para Transplante de Células
- Puxar um capilar de vidro (diâmetro externo 1,0 mm de diâmetro interno 0,78 milímetros, sem filamentos (ver lista de materiais)) com um extrator micropipeta.
- vocêcantar uma microforge (ver lista de materiais), corte a ponta da agulha no ponto em que o diâmetro interno é de 35 uM (um pouco mais do que o diâmetro das células a serem transplantadas).
- Bevel a extremidade cortada do capilar com um microgrinder (ver lista de materiais) com um ângulo de 45 °.
- Opcionalmente, puxar uma barbela sobre a extremidade da agulha utilizando um microforge. Para isso, tocar o filamento quente com a ponta do bisel e rapidamente o puxar para fora, criando uma farpa que pode ajudar a penetração do embrião.
- Montar a agulha num suporte de agulha ligada a uma seringa. Usando a seringa, lavar o interior da agulha três vezes com ácido fluorídrico a 2% para eliminar os resíduos de vidro, e em seguida enxaguar três vezes com acetona.
Cuidado: o ácido fluorídrico é tóxico, manipular sob o capô, com luvas.
Nota: As agulhas de transplantação de células pode ser utilizado várias vezes.
2. Preparação daLoiça para injeção e Transplante de Células
- Calor 50 ml de embrião médio 11, que contém 0,5 g de agarose, num forno de microondas durante 1 minuto na potência máxima para obter 1% de agarose em forma de embriões. Arrefece-se a gel de agarose a cerca de 60 ° C e verter 50 ml em uma placa de Petri de 90 mm. Coloque na superfície do gel de um molde especialmente projetado (ver lista de materiais), ou com linhas para o prato de injecção ou com poços para o prato transplante de células.
- Observe o flutuador mofo no agarose, se a agarose não é muito quente. Depois o gel de agarose é definido, remover o molde com uma pinça (Figura 2A - B).
Nota: os pratos podem ser armazenadas a 4 ° C, até algumas semanas. Mantê-los em uma caixa molhada fechada, para evitar a secagem.
- Observe o flutuador mofo no agarose, se a agarose não é muito quente. Depois o gel de agarose é definido, remover o molde com uma pinça (Figura 2A - B).
- Colocar a cápsula num incubador de 28 ° C 30 min antes da utilização.
3. Recolha de embriões e Injection
- Injecção Preparação de Solução
Nota: domínio de ligação à actinada levedura proteína 140 (SPA-140) tal como Lifeact obrigado a mCherry se liga à actina (referido como ABP140-mCherry) é usado para visualizar actina polimerizada no interior da célula, a fim de analisar a actividade protuberante. Adicione outro composto a testar a função de um gene candidato (por exemplo, ARNm de construção negativo dominante ou constitutivamente activa, ou oligonucleótidos morfolino). Para avaliar as funções de SIN1 como descrito nos resultados (Figura 3), foram utilizados oligonucleótidos morfolino. Como um controlo, foi utilizado um morfolino idêntico ao morfolino SIN1 mas durante 5 nucleótidos distribuídos ao longo da sequência de modo a que este morfolino controlo não coincidir com o ARN alvo.- SIN1 Thaw e morpholinos de controlo de 5 de incompatibilidade (2 solução de ações mm) e ABP140-mCherry mRNAs no gelo. Adicionar 375 ng de mRNAs (75 ng / mL final) e 0,75 mL de quer morfolino controle SIN1 ou 5-incompatibilidade (0,3 mM final) em tampão Danieau (NaCl 58 mM, 0,7 mMKCl, 0,4 mM de MgSO4, 0,6 mM de Ca (NO3) 2, 5,0 mM de HEPES pH 7,6), para alcançar um volume total de 5 mL.
- de colheita de embriões
Nota: para esta montagem experimental ambos os embriões de dadores e de acolhimento são transgênicos, expressando a GFP sob o controle do Goosecoid (GSC) promotor, a fim de visualizar a placa precordial prospectivo 11.- Recolha Tg (GSC: GFP) ovos. Colocar cerca de 80 ovos em um prato de 90 milímetros de Petri cheio com o meio de embrião e incubar a 28 ° C.
- Injetar embriões doadores
- Sob um microscópio estereoscópico, esprema delicadamente embriões coletadas com pinça na linhas de um prato de injeção preenchido com meio embrião. Utilizando uma pinça, orientar os embriões com as células em direção ao topo. Colocar o prato de injecção na incubadora a 28 ° C até os embriões terem atingido o estádio de 4 células (1 h após a fertilização).
- Coloque uma agulha de injecção com 2 ul desolução de injecção. Inserir a agulha em um suporte de agulha (ver lista de materiais) que é colocado em um micro-manipulador (ver lista de materiais) e conectado com politetrafluoretileno (PTFE) tubo (ver lista de materiais) para um Transjector ar (ver lista de materiais ).
- Abra o capilar tocando delicadamente a ponta com uma pinça fina. Se necessário, cortar o capilar aberto por beliscar sua extremidade.
- Entre uma das quatro células, com a agulha e injectar a solução no interior da célula, a fim de preencher 70% do volume da célula (2 nl). Injectar 30 embriões.
Nota: Obtendo a agulha na célula pode ser difícil, porque a membrana plasmática é macio. Visando a junção entre a célula ea gema facilita a penetração da agulha. - Coloque os embriões em 28 ° C incubadora até que tenham atingido a fase esfera (4 horas após a fertilização).
4. Preparação dos embriões para o celular Transplantatíon
- Prepare 20 ml de meio de embrião com 200 mL de penicilina / estreptomicina (ver lista de materiais) (Pen / Strep EM).
- Dechorionation dos embriões na fase esfera (4 h após a fertilização)
Nota: embriões dechorionated são muito frágeis e vai explodir em caso de contacto com o ar ou plástico. Eles precisam, portanto, ser colocado em pratos revestidos com agarose, e transferido por meio de pipetas de Pasteur de vidro polido ao fogo.- Usando uma pipeta de Pasteur de plástico, transferir embriões de acolhimento recolhidos no passo 3.2 e embriões de dadores injetados no passo 3.3 em duas 35 milímetros placas de Petri revestidas com agarose a 1% em meio embrião e preenchidos com Pen / Strep EM. Manter embriões de acolhimento e embriões de dadores em dois pratos separados.
- extrair manualmente os embriões de seus córions com uma pinça fina (ver lista de materiais).
- Coloque os embriões no C incubadora de 28 ° até que tenham atingido a fase escudo (6 horas após a fertilização).
Transplante 5. celular
- Organizar os embriões para o transplante de células.
- Sob um microscópio estereoscópico fluorescente, selecione embriões doadores expressar ABP140-mCherry (vermelho) dentro do escudo (verde).
- Usando uma pipeta de Pasteur polida ao fogo, transferir os embriões nos poços do prato de transplante de células preenchido com Pen / Strep EM. Coloque os embriões de acolhimento em uma linha e os embriões de dadores na linha limítrofe.
- Usando um cílio, orientar cuidadosamente os embriões com o escudo para cima.
Nota: a posição da blindagem pode ser avaliado por expressão da GFP ou anatomicamente.
- Transplante System Set-up.
Nota: O sistema de transplante é composto por um suporte de agulha (ver lista de materiais) ligado com um tubo de PTFE (veja lista de Materiais) e um conector do tubo (ver lista de materiais) a uma seringa Hamilton equipado com um micro-drive (ver lista de Materiais). O suporte de agulhaestá montado sobre um micromanipulador de 3 vias (ver lista de Materiais).- Utilizando um suporte de agulha ligada a uma seringa, a agulha para lavar o transplante de células com 70% de etanol. Seca-se por sucção de ar para dentro da agulha. Não secar por sopro, pois isso pode resultar em pó ficar preso na parte afilada da agulha.
- Inserir a agulha no suporte de agulha ligada à seringa Hamilton, com o bisel para cima.
- Shield-to-escudo Transplante de Células
- Digite o escudo de um embrião doador com a agulha transplante e elaborar cerca de 10-20 células marcadas com ABP140-mCherry. Cuidadosamente evitar o desenho gema.
- Transplante as células para a blindagem do embrião hospedeiro. Repita até que todos os embriões de acolhimento foram transplantados.
- Remova todos os embriões danificados com uma pipeta de Pasteur polida-fogo. Colocar os embriões transplantados na incubadora a 28 ° C e deixá-los recuperar durante cerca de 30 min.
- Usando uma agulhatitular ligada a uma seringa, lave a agulha transplante de células com água e colocá-lo de volta em uma placa de Petri em uma faixa de massa de modelar. Selar o prato com parafilme.
6. (Opcional) Transplante de Células Individual
Nota: No embrião, as células aderem umas às outras, de modo que é difícil tirar apenas uma célula em que a agulha transplante. Nós desenvolvemos um protocolo modificado para transplantar facilmente células progenitoras placa precordial individuais. A ideia é a dissociar-se as células antes de transplante. Como as células progenitoras placa precordial isolados tendem a perder a sua identidade, nós geneticamente impor-lhes uma identidade placa precordial prospectivo, pela ativação da via de sinalização Nodal, na ausência do fator de transcrição Sox32. Verificamos que estas células induzidas se comportam como células progenitoras placa precordial endógenos 8. Abaixo estão os passos específicos para realizar transplantes de células individuais. dissocia celularção é conseguida pela colocação em embriões Ringer isenta de cálcio 11, dissecando um explante e mecanicamente agitando-o.
- No passo 2.1, preparar o prato transplante com 1% de agarose em Ringer livre de cálcio em vez de Embryo Médio.
- No passo 3.1, em adição a ABP140-mCherry ARN e morfolino SIN1, adicionar 3 ng de ARN que codificam para a forma activa do receptor nodal taram-A (0,6 ng / mL final) e 1,25 ul de morfolino contra sox32 (solução mãe a 2 mM, 0,5 mM, consequentemente, final).
- Após o passo 4, a transferência de três embriões doadores selecionados no prato para o transplante de células preenchido com Pen / Strep Ringer livre de cálcio usando uma pipeta de Pasteur polida-fogo. Com uma pinça fina, dissecar um explante contendo as células injetadas (ABP140-mCherry células marcadas). Eliminar rapidamente o resto dos embriões.
- Com um cílio, agitar suavemente o explante até que as células se dissociam.
- Elaborar uma única célula isolada na agulha transplantee transplantá-la para a blindagem de um embrião hospedeiro.
- Usando uma pipeta de Pasteur polida ao fogo, transferir os embriões numa placa revestida de agarose-preenchido com Pen / Strep EM. Colocar os embriões na incubadora a 28 ° C durante 30 min.
7. Embrião de montagem
- imagiologia Câmara
- Método 1: usar uma câmara de imagem composta de uma lâmina de plástico (75 * 25 * 0.5 mm) perfurado com 4 furos (5,5 mm de diâmetro), com bordas de 3 mm em um lado (Figura 2C - D). Cole uma lamela de vidro na parte de trás, com cianoacrilato cola (super cola).
Nota: No final do experimento, coloque a câmara na água por uma noite para remover a lamela e se livrar de resíduos de cola com papel de areia. - Método 2: Usar 35 mm Mattek vidro pratos inferiores (ver lista de materiais) com um buraco de 10 mm.
- Método 1: usar uma câmara de imagem composta de uma lâmina de plástico (75 * 25 * 0.5 mm) perfurado com 4 furos (5,5 mm de diâmetro), com bordas de 3 mm em um lado (Figura 2C - D). Cole uma lamela de vidro na parte de trás, com cianoacrilato cola (super cola).
- montagem embrião
- Encher um frasco de vidro com 1 ml de agarose quente 0,2% em meio embrião.Mantê-la a 42 ° C num bloco de calor.
- Sob o microscópio estereoscópico fluorescente, selecionar um embrião nas quais o Red células transplantadas são parte da placa precordial prospectivo marcados em verde (ou seja, células transplantadas vermelhas estão dentro da placa precordial prospectivo verde, e já começaram a migrar para o pólo animal).
- Transferir um embrião seleccionado para a solução de agarose com uma pipeta de Pasteur polida ao fogo. Descartar o excesso de meio de embrião a partir da pipeta. Desenhar o embrião na pipeta com agarose, e transferência do embrião na câmara de imagem, depositar uma gota de agarose. Antes de agarose é definido, orientar o embrião com um cílio. Colocar a placa pré-cordal potencial para cima para imagiologia com um microscópio vertical, ou na parte inferior de vidro para imagiologia com um microscópio invertido. Aguardar até que a agarose é definida (cerca de 1 min, dependendo da temperatura ambiente) antes de montar outra embrião no poço seguinte da câmara.
Nota: um cha de imagemmber contendo 4 poços permite a montagem de até 4 embriões. - Quando a agarose é definido, encher a câmara com Pen / Strep EM para evitar a secagem.
8. Imagens ao vivo
- Use um 40X de imersão em água da lente de longo alcance. Use filtros adequados para a imagem GFP e mCherry (para GFP: excitação BP 470/40, divisor de feixe FT 510, e emissão BP 540/50; para mCherry: excitação BP 578/21, divisor de feixe FT 596 e LP emissão de 641 / 75). Ajuste a duração da exposição, a fim de otimizar a dinâmica de imagem.
- Para imagem todas as células na placa, adquirir z pilhas, começando alguns microns uma por cima da placa pré-cordal prospectivo (em ectoderme) e terminando uma alguns microns abaixo da placa pré-cordal prospectivo (na gema). Usar um passo de Z-2 uM. Para otimizar a velocidade de aquisição, mudar as cores entre Z-stacks, em vez de entre os quadros.
Nota: Isto pode levar a pequenas diferenças entre as imagens vermelhas e verdes, mas não é um problema, já que nenhum co preciso-localization entre os sinais de verde e vermelho é necessária. Para reduzir ainda mais o tempo de imagem e exposição à luz, verde pode ser adquirida apenas uma vez a cada 5 pontos no tempo, o que é suficiente para identificar as células progenitoras placa precordial. - Usando essas configurações, a imagem até 4 embriões dentro do intervalo de tempo de dois minutos que é necessário analisar a frequência protrusão e orientação. Para a análise do ciclo de vida protrusão, reduzir o intervalo de tempo para 30 segundos para obter maior resolução de tempo. Imagem de 60% a 80% epiboly epiboly.
Análise 9. Dynamics celular
- Carregar imagens 4D em ImageJ
Nota: Dependendo do software utilizado para a aquisição, as imagens são armazenadas em formatos diferentes (um arquivo por imagem, um arquivo por z-stack, um arquivo para todo o experimento). Alguns Plugins ImageJ estão disponíveis on-line para abrir pilhas 4D. Nossos dados são armazenados como um arquivo por z-stack. Uma vez que o conjunto de dados pode ser grande, pode ser conveniente para abrir apenas uma parte dele (cerca de time pontos, ou uma sub do z-stack, ou 8-bit convertido imagens ...). Nós usamos uma custom-made ImageJ plugin para fazê-lo, o que nós ficaríamos felizes para distribuir a pedido. - Análise da Orientação e Freqüência de saliências celulares
- Use imagens GFP para determinar a direção principal da migração placa precordial prospectivo. Leve isso como uma referência para as medições angulares saliências celulares. Girar a pilha, de modo que este sentido de referência é paralelo a um dos lados da imagem.
- Siga uma célula. Ferramenta Selecionar ângulo. Para cada quadro e cada protuberância, utilizar a ferramenta ângulo para medir o ângulo entre a saliência e a direcção de referência (Figura 3A). Use o comando Analisar / Medir para armazenar o valor (ou pressione M no teclado). Salvar os resultados como um arquivo txt. Repita com a próxima célula.
- Importe os dados para distribuição ângulo trama R e como histogramas. Use o teste de Kolmogorov-Smirnov (ks.test em R) para comparar diferentes condições.
Nota: A ferramenta ângulo fornece valores compreendidos entre 0 ° e 180 °, permitindo a utilização de testes estatísticos clássicos e os testes não circulares. - Com este conjunto de dados, calcular a frequência de emissão, conforme o número de protuberâncias por célula por minuto. Use Student t-test (t.test em R) para comparar diferentes condições.
- Análise do celular Saliências Lifetime
- Para cada célula e cada saliência, medida duração saliência (número de quadros durante o qual a saliência está presente X intervalo de tempo entre os quadros).
- Importe os dados para R. Use Student t-test (t.test em R) para comparar diferentes condições.
Nota: Outras características de migração pode ser interessante analisar, a fim de caracterizar a migração celular. Estes incluem faixas de células, para velocidade, direção e medidas de persistência, ou morfologia celular. Alguns aplicativos de software comerciais estão disponíveis para medir estas características, mas um grande número de apli software open-sourcecátions e plugins ImageJ também estão disponíveis, como, por exemplo, adaptar-se a analisar morfodinâmica 12, diper olhar para trajetórias celulares e persistência direcional 13, CellTrack para rastrear limites da célula durante a migração 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A técnica apresentada foi utilizado para analisar o papel da SIN1, um dos principais componentes do Tor complexa 2 (TORC2), no controle da migração celular vivo. O uso do transplante de células permite marcação de células isoladas e análise dos efeitos em células-autônoma. Filme S1 mostra a migração de células progenitoras da placa pré-cordal transplantados. rotulagem actina com ABP140 permite a visualização fácil de saliências citoplasmáticos ricas em actina. Nós medimos a sua frequência e orientação. As células do tipo selvagem produzir frequentemente grandes citoplasmáticos saliências orientadas na direcção do polo animal, isto é, a direcção da migração (Figura 3B). A perda da função de SIN1 conduz a uma redução drástica do número de saliências, e a randomização dos restantes, demonstrando a importância de controlar a formação de SIN1 em saliência ricos em actina. Curiosamente, este fenótipo pode ser resgatado por eXpression de uma forma constitutivamente activa de 15 Rac1, sugerindo fortemente que controla TORC2 dinâmica de actina e formação de protrusão célula através Rac1 (Figura 3B).
A técnica apresentada também foi utilizado para caracterizar o papel da Arpin, um inibidor recentemente identificado do complexo Arp2 / 3, 4 sobre a dinâmica de células. A perda da função Arpin leva a um aumento da frequência saliência (taxa média de células albergando uma saliência num dado momento). Isto pode ser devido quer à formação de saliência mais frequente ou a um aumento na estabilidade da saliência. Medição de tempo de vida saliência revelou que, na ausência de Arpin, protrusão persistência temporal é duplicado (Figura 3C). Isto é consistente com o papel de Arpin como um inibidor Arp2 / 3, o que facilitaria a saliência de retracção, e sugere que afecta Arpin frequência saliência modulando estabilidade saliência, em vez deiniciação protrusão.
Figura 1:. Delinear o processo de Tg (GSC: GFP) embriões são injetados na fase de 4 células (1 h após a fertilização). Depois de 5 h a 28 ° C, mostrando embriões ABP140-mCherry células positivas dentro da blindagem (GFP +) são seleccionados como embriões de dadores. células de blindagem são elaboradas dentro da agulha transplante e transferido para o escudo de um embrião hospedeiro. Após 0,5 horas de recuperação, embriões de acolhimento são montados e fotografada com um microscópio de epifluorescência (objetiva de 40X). HPF:. horas após a fertilização Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Transplantatisobre Dish and Imaging Câmara. (A) prato Transplantação com poços individuais. (B) O molde para o prato transplante de células. Câmara de imagem (C) feito em casa. (D) Desenho esquemático da câmara de imagem feito em casa. Barra de escala = 1 cm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Os resultados de celular Dynamics Analysis (A) Esquema de medição do ângulo de protrusão. (B) Análise da orientação protrusão célula e frequência. Na ausência de SIN1 (Mo-SIN1), células emitem menos saliências e as saliências restantes são orientados aleatoriamente. Este fenótipo pode ser resgatado por expressão de uma forma constitutivamente activa da GTPase Rac1 (Mo-Sin1 + CA-Rac1). Modificado de Dumortier e David de 2015 5. (C) Análise de vida protrusão. Na ausência de Arpin (Mo-Arpin), a frequência é aumentada saliência. Isto é devido a um aumento no tempo de vida saliência. Reintrodução de um RNA Arpin insensível à morfolino restaura este fenótipo hiper protrusive. Modificado de Dang et ai., 2013 4. A barra de escala = 10 uM. A: Anterior; P: Posterior, L: esquerda, R: Sim. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: controles SIN1 formação de saliências celulares, por meio de Rac1 (clique com o botão direito para baixar). Células progenitoras placa precordial transplantado, injetados comABP140-mCherrry ARN e um controlo morfolino, ou o morfolino SIN1, ou o morfolino e SIN1 ARN para a forma constitutiva da Rac1. frequência protrusão e orientação foram medidos nas imagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo apresenta uma forma fácil para estudar o papel de um gene candidato na migração de células in vivo, através da combinação da criação de embriões quiméricos que utilizam o transplante de células com imagens ao vivo.
Criação de embriões mosaico
O estudo da dinâmica de uma célula requer a visualização do seu contorno para analisar extensões citoplasmáticas. Isto pode ser conseguido por marcação das células isoladas numa outra forma não marcado - ou diferentemente rotulados - ambiente, oferecendo, assim, um bom contraste visual.
Uma maneira fácil de rotular estocasticamente uma porção de células em que o embrião é para injectar o DNA plasmídico na fase 1-célula 16. Os plasmídeos injectados formar agregados que são de forma aleatória e desigual segregadas em células durante a divisão celular. Isto conduz à expressão do plasmídeo em um subconjunto aleatório de células e, assim, representa um método muito rápido, fácil e não-invasiva para a geração de MOembriões SAIC. No entanto, as células que expressam o plasmídeo injetados tendem a formar aglomerados, e a probabilidade de encontrar embriões que contêm poucas células que expressam isoladas na placa precordial prospectivo é bastante baixa. Além disso, a utilização de ADN plasmídico oferece um controlo muito limitada do nível do construto de expressão injectado. A criação de embriões quiméricos por transplante de células, embora tecnicamente mais difícil do que a injecção de ADN plasmídico, oferece um número de vantagens: o controle do número de células transplantadas, o controlo do nível de uma das construções (injecção de ARN) expressão, e por último, mas não menos importante , transplantes de células para permitir testar os efeitos de células-autónoma, através da criação de embriões de mosaico em que as células transplantadas conter perda ou ganho de construções de função. Por outro lado, transplantes também pode ser utilizado para avaliar o papel não autónomo do meio ambiente através do transplante de células do tipo selvagem em embriões que foram modificados. Isto pode ser de particular interesse para o testepor exemplo, a função de componentes da matriz extracelular que são particularmente relevantes para a análise de migração celular.
Um protocolo detalhado para o transplante de células já foi descrito 10. Em comparação com este protocolo, que gostaria de discutir duas principais diferenças em nosso procedimento.
A primeira diferença é relacionada com a fase de injecção embriões de dadores. De acordo com a nossa experiência, os embriões injectados no estádio de uma célula com-RNAs de uma proteína fluorescente que não expressam a proteína fluorescente homogeneamente em todas as células, devido a uma difusão incompleta dos ARN na célula. A injecção de embriões de dadores no estádio de 4 células em uma das quatro células permite a obtenção de um clone de células homogénea, o que é de particular interesse quando o ARN da proteína fluorescente são co-injectados com outros RNAs que não são rastreáveis.
A segunda diferença principal é a utilização de ar em vez de óleo na transplantatseringa de iões. A principal desvantagem de um sistema cheio de ar é a inércia resultante da elasticidade do ar. Oil, pelo contrário, sendo incompressível, oferece bom controle de sucção e pressão. No entanto, com uma pequena formação, e através da manutenção da interface entre o ar e meio de embriões na parte fina, afilada da agulha, o controlo de aspiração e de pressão com um sistema cheio de ar é suficiente para o transplante de células na fase de escudo. Para fases posteriores, as células tornam-se menores e mais coesa, a sucção requer uma alta pressão que tem de ser muito precisamente controlado, que não pode ser alcançado com uma configuração cheia de ar. Utilizando ar em vez de óleo facilita a configuração, como preencher o sistema com óleo sem qualquer bolha de ar é complicado. Além disso, evita-se o enchimento da agulha com o transplante de óleo. Isso permite que as agulhas transplante para ser reutilizado e, portanto, de ser cuidadosamente preparada. Nós sentimos que uma agulha, sem arestas cortantes e do diâmetro correto é a chave para succetransplante ssful. Esta etapa transplante é claramente uma das etapas críticas do protocolo, que requer prática antes de ser facilmente realizado.
Também propuseram um procedimento específico para o transplante de células individuais, que consiste em células antes do transplante de dissociação, a fim de chamar uma célula única em que a agulha transplante. Isto implica que a dissociação de células transientes não irá modificar a sua identidade e / ou comportamento. Para as células progenitoras placa precordial, nós geneticamente impor identidade da célula, e verificou cuidadosamente que estas células se comportam como os não-dissociada. No entanto, não podemos excluir formalmente que a dissociação e / ou indução genética induzir modificações despercebidos nas células. Transplante de células individuais sem dissociar-los é viável. As células devem ser elaborados cuidadosamente na agulha transplante. No entanto, pelo menos em nossas mãos, a taxa de sucesso é muito baixa, porque mais de uma célula entra no needle, ou porque as tesouras celulares quando elaborados e morre na agulha ou uma vez transplantados.
Epifluorescência contra imagem confocal rápido
O uso do transplante de células para criar embriões mosaico permite a marcação de células isoladas, separadas de outras células marcadas. Neste contexto, uma boa imagem da morfologia celular e dinâmica pode ser obtida com microscopia de epifluorescência padrão, tal como proposto no protocolo. Isto tem a vantagem óbvia de ser um equipamento relativamente generalizada e uma alternativa de baixo custo para sistemas de imagem confocal mais caros.
Para localizações subcelulares precisos, imagem confocal pode ser usado para melhorar a resolução, em especial a resolução axial. Para ainda obter resolução temporal suficiente, imagens rápidas confocal deve ser usado. Pela nossa experiência, microscópios-disco giratório oferecer um bom compromisso entre a resolução, velocidade e foto-toxicidade. Digitalização rápida mic confocalroscopes (como microscópios de varredura de ressonância) são boas opções também, mas menos frequentes e mais caro.
rotulagem citoesqueleto
Bom rotulagem dos filamentos de actina e a sua dinâmica é crucial para estudar os mecanismos de migração de células à base de actina. Embora marcadores fluorescentes ligadas à membrana são mais eficientes para analisar os contornos celulares, rotulagem actina permite uma muito melhor visualização das protuberâncias celulares. Em particular, se três células marcadas entrar em contacto, é muito difícil de identificar uma extensão citoplasmática localizado entre duas células vizinhas como o contorno da extensão e a membrana das células vizinhas podem se misturam. Rotular filamentos de actina permite a detecção inequívoca de saliências celulares à base de actina, em que nos concentramos. Se a morfologia das células foi quantificada a ser, uma marcação da membrana seria preferível. Outra opção é usar tanto de rotulagem, quer utilizando imagiologia de 3 cores (uma para o Li transgénicoNE, uma para a actina e para uma membrana), ou por GFP rotulagem da membrana. Na linha transgénica, a GFP é citoplasmática, e as células positivas para GFP-Goosecoid pode assim ser identificado, mesmo que a membrana é GFP marcado.
Nos últimos anos, um número de sondas têm sido utilizados para marcar a actina em amostras vivas. Os primeiros eram fusões diretos monómeros de actina. Estes apresentaram dois grandes inconvenientes. Em primeiro lugar, eles todos rotulados actina e actina polimerizada não especificamente. Em segundo lugar, eles eram frequentemente tóxicos. As sondas atualmente em uso são domínios de ligação de actina filamentosos fundidos a repórteres fluorescentes. Neste protocolo, usamos ABP140 (domínio de ligação de actina da levedura de ligação proteína actina 140) 17, que atualmente é o marcador mais utilizado para a actina filamentosa, e as etiquetas toda a actina filamentosa. Utrophin 18 (domínio de homologia calponina) também rótulos actina filamentosa, mas parece rotular filamentos única estáveis. Esta diferença foi usado para identificar os filamentos de actina dinâmica, como aqueles marcados por ABP140 e não utrophin 19.
Recentemente, foi relatado que na mosca ABP140 e utrophin poderia ter efeitos tóxicos, em particular durante longos expressão 20. Mesmo que não tenha notado quaisquer defeitos de migração em células ABP140-rotulados, não podemos excluir que a expressão ABP140 pode perturbar a dinâmica de actina endógenos. Uma terceira sonda para a actina filamentosa Recentemente, foi relatado 21. F-tractin (domínio de ligação da actina a partir de trifosfato de inositol de rato 3-cinase) foi descrito como um repórter fiel de actina filamentosa, que não apresentam efeitos tóxicos 20,22. Para nosso conhecimento, a utilização de F-tractin não foi reportado no peixe-zebra ainda.
Além de actina, muitos outros constituintes celulares podiam ser rotulados de modo a melhorar a nossa compreensão da migração celular. Isto inclui outros componentes do citoesqueleto tais como miosina, microtúbulos, centrossomas, bem como kNreguladores próprios de migração celular (formas activadas da pequena GTPases Rho, Rac e Cdc42, sondas fluorescentes para PIP3 ...) ou de proteínas envolvidas na adesão celular (integrinas, as caderinas ...).
No geral, este protocolo reúne uma série de ferramentas e técnicas descritas anteriormente para propor um sistema rápido e fácil de testar o envolvimento de um gene candidato no controle da migração de células in vivo. Usamos a migração placa precordial prospectivo, pois é um modelo interessante de migração coletiva dirigida, e por causa da rotulagem linhagem transgênica disponível lo. No entanto, um protocolo semelhante poderia ser adaptado para analisar outros eventos de migração que ocorrem durante o desenvolvimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
- Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), Cambridge, England 921-932 (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
- Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
- Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
- Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
- Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
- Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
