Introduction
Çok hücreli organizmalarda, hücre göçü bu doku ve organların içine hücreleri organizasyonunu sağlayan embriyonun gelişimi için ve doku homeostazında (yara iyileşmesi) ve bağışıklık yer alır erişkin yaşamda, hem esastır. Bu fizyolojik fonksiyonlara ek olarak, hücre göçü, kanser metastazı, dahil olmak üzere, özellikle de çeşitli patolojik durumlarda, katılır.
Hücre göçü düz yüzeylere hücre hareketlerini sağlayan moleküler mekanizmaların genel bir anlayış sağlayarak, yıllardır in vitro analiz edilmiştir. Vivo Bununla birlikte, hücreler daha karmaşık bir çevre tarafından karşı karşıya kalırlar. Açık bir şekilde taşıma kılavuz hücreleri ya da salgılanan kemokinler, komşu gibi hücre dışı matris olarak bir organizma içindeki geçiş dış işaretlere etkilenebilir geçmiş yıllarda ortaya çıkan ve bu tarif edilmiştir ne değişebilir hücre göçü tahrik mekanizmaları <em> in vitro 1,2. Vivo hücre göçü temin eden mekanizmaların in vitro çalışmalar ile karşılaştırıldığında, esas olarak, çünkü artan teknik zorluk, şimdiye kadar daha az ilgi görmüştür. In vivo özellikle hücre göçü analizi göç hücrelere doğrudan optik erişim gerektiren, benzersiz hücreleri etiketlemek için teknikler kendi dinamiklerini ve morfolojisi yanı sıra kazanç veya fonksiyon kaybını görmek için aday genlerin rolü test etmek için yaklaşımlar. Şimdiye kadar, bu özellikleri barındıran bir kaç model sistemler vivo hücre göçü 3 incelemek için kullanılmıştır.
Biz son zamanlarda vivo hücre göçü 4,5 yılında kontrolünde aday genlerin fonksiyonunu değerlendirmek için yeni bir uygun model sistem olarak erken Zebra balığı embriyolarının prospektif prechordal plaka göç kullanılır. (Aynı zamanda, ön mesendoderm olarak da bilinir) Aday prechordal plakası Gast başlangıcında oluşturan hücrelerin bir grup olduğuEmbriyonun sırt tarafında rulation. Gastrulasyon sırasında bu grup topluca Notokordun için prechordal plaka, bir mesendodermal kalınlaşma, anterior oluşturur ve nöral plakayı altta yatan, embriyo 6-8 hayvan kutup doğru göç eder. Posterior kısmı muhtemelen mezoderm 9 kafa katkıda iken prechordal plaka ön kısmı, kuluçka bezinin yol açacaktır. dış gelişme ve balık embriyo optik berraklık sayesinde, hücre göçü, doğrudan ve kolay bir yapı görülür.
Hücre nakli mozaik embriyoların 10 hızlı ve kolay yaratılması için izin veren çok güçlü bir tekniktir. İzole hücrelerin etiketleme nakledilen hücrelerin sonuçlarında floresan sitoskeletal belirteçleri ifade, morfolojisi ve dinamikleri olan kolaylıkla görülebilir. kayıp veya fonksiyon kazancı bu birleştiren izinlerin bir kutu hücre özerk fonksiyonların analizi yaklaşımlarıdidate geni.
Sunulan protokol in vivo 5 hücre göçü ve aktin dinamiklerini kontrol TORC2 bileşeni sin1 işlevini değerlendirildi açıklamaktadır. Sonuçlar belirtilen ve daha fazla ele alındığı gibi Ancak, in vivo olarak, hücre göçü kontrol herhangi bir aday genin potansiyel implikasyonları analiz etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Şekil 1 protokolünün anahat sunar.
Enjeksiyon ve Transplantasyon için iğneler hazırlanması 1.
Not: İğneler her zaman hazırlanmış ve saklanabilir. modelleme kil bandında, bir Petri kabındaki tutun. tozdan korumak için parafilm çanak mühür.
- Enjeksiyon iğneleri, bir mikropipet çektirmesi ile (Malzeme listesine bakınız) (filamanın (Malzeme listesine bakınız) olmadan, çap 0.58 mm iç çapı 1.0 mm dışında) cam kılcal çekin. bunlar koryon delmek için daha etkin olarak kısa ve ince iğneler (yaklaşık 5 mm'lik konik bölümü tercih).
Not: Enjeksiyon iğneleri tek kullanımlık vardır. - Hücre Nakli iğne
- Mikropipet çektirmenin ile (filamanın (Malzeme listesine bakınız) olmadan, çap 0.78 mm iç çapı 1.0 mm dışında) cam kılcal çekin.
- Uiç çapı (hücre çapından biraz daha transplante edilecek) 35 um olduğu noktada iğne ucu kesilmiş bir microforge (malzemelerin listesine bakınız) şarkı.
- Konik 45 ° 'lik açı ile bir microgrinder (Malzeme listesine bakınız) ile kılcal kesim ekstremite.
- İsteğe bağlı olarak, microforge kullanılarak iğnenin ucundaki dikenlere çekin. Bunun için, konik ucu ile sıcak tel dokunun ve hızla embriyo nüfuz yardımcı olabilecek bir çengel oluşturarak, uzak çekin.
- eden bir şınngaya bağlanmış bir iğne tutucu iğne monte edin. şırınga kullanarak, bir cam artıkları ortadan kaldırmak ve daha sonra aseton ile üç kez durulama% 2 hidroflorik asit ile iğne üç kez iç yıkayın.
Dikkat: hidroflorik asit toksik, eldiven ile, kaputun altında manipüle.
Not: hücre nakli iğneler birkaç kez kullanılabilir.
2. HazırlıkEnjeksiyon ve Hücre Nakli Yemekleri
- Isı tam güçte 1 dakika boyunca bir mikrodalga agaroz 0.5 g ihtiva eden 11 orta embriyonun 50 mi embriyo ortamda% 1 agaroz alır. yaklaşık 60 ° C'ye kadar agaroz jeli soğutun ve bir 90 mm Petri kabı 50 ml dökün. özel olarak tasarlanmış kalıp (malzeme listesine bakınız) ya enjeksiyon çanak hatları ile ya da hücre nakli yemeğin kuyuların ile jel yüzeyinde yerleştirin.
- Agaroz çok sıcak değilse, agaroz kalıp şamandıra gözlemleyin. Agaroz jel ayarlandıktan sonra, forseps ile kalıp (- B Şekil 2A) çıkarın.
Not: yemekler birkaç haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. kurumayı önlemek için, kapalı ıslak kutuda saklayın.
- Agaroz çok sıcak değilse, agaroz kalıp şamandıra gözlemleyin. Agaroz jel ayarlandıktan sonra, forseps ile kalıp (- B Şekil 2A) çıkarın.
- Kullanmadan önce bir 28 ° C inkübatör 30 dakika çanak yerleştirin.
Embriyoların ve Enjeksiyon 3. Koleksiyonu
- Enjeksiyon solüsyonu hazırlanması
Not: Aktin bağlama alanımCherry bağlı gibi LifeAct olarak protein 140 (ABP-140) bağlanma maya aktin çıkıntılı etkinliğini analiz etmek için, hücre içinde polimerize aktin görselleştirmek için kullanılır (ABP140 mCherry olarak da adlandırılır). Aday gen (baskın negatif ya da yapısal olarak aktif bir yapı örneğin mRNA veya morfolino oligonükleotitler) fonksiyonunu test etmek için başka bir bileşik ekleyin. (Şekil 3), biz Morfolino oligonükleotidleri kullanılan sonuç tarif edildiği gibi sin1 fonksiyonlarını değerlendirmek. Bir kontrol olarak, sin1 morfolino ama bu kontrol morfolino hedef RNA'yı eşleşmediğini şekilde dizisi boyunca dağıtılmış 5 nükleotidler denk bir morfolino kullanılır.- Çözülme sin1 ve 5-uyumsuzluğu kontrol morpholinos (2 mM stok çözeltileri) ve buz üzerinde ABP140 mCherry mRNA'lar. MRNA 375 ng (75 ng / nihai uL) ve sin1 ya da 5-uyumsuzluğu kontrol morfolino ya da 0.75 ul (0.3 mM nihai) Danieau tampon maddesi (58 mM NaCI, 0.7 mM eklemeKCI, 0.4 mm (3) 2, 5.0 mM HEPES, pH 7.6), 5 ul toplam hacme ulaşmak için, 0.6 mM Ca 4 MgSO.
- embriyo Koleksiyon
Not: Bu deneysel kurmak için hem donör ve host embriyolar transgenik olan müstakbel prechordal plaka 11 görselleştirmek için goosecoid (GSC) kontrolü destekleyicisi altında GFP ifade.- (: GFP gsc) yumurta Tg toplayın. embriyo orta ile dolu bir 90 mm Petri kabı, yaklaşık 80 yumurta yerleştirin ve 28 ° C'de inkübe edin.
- Donör Embriyolar enjekte
- Bir stereomikroskop altında, yavaşça embriyo orta ile dolu bir enjeksiyon çanak satırlara forseps ile toplanan embriyolar sıkın. forseps kullanarak, üste doğru hücrelerle embriyolar yönlendirmek. Embriyolar 4-hücreli sahne (1 saat sonra döllenme) ulaşana kadar 28 ° C'de inkübatör enjeksiyon çanak yerleştirin.
- 2 ul bir enjeksiyon iğnesi yükEnjeksiyon çözeltisi. Bir hava Transjektör için (malzeme listesine bakınız), bir mikro-manipülatör yerleştirilir ve politetrafloroetilen (PTFE) tüp (Malzeme listesine bakınız) ile bağlı bir iğne tutucu (malzeme listesine bakınız) içinde iğneyi (malzeme listesini görmek ).
- yavaşça ince forseps ile ucu dokunarak kılcal açın. Gerekirse, kendi ekstremite kısma açık kılcal kesti.
- iğne ile dört hücrelerden birini girin ve hücre hacmi (2 nl)% 70 doldurmak için hücre içinde çözüm enjekte. 30 embriyolar enjekte edilir.
Not: Plazma zarı yumuşak olduğu hücrede iğne alma, zor olabilir. hücre ve yumurta sarısı arasında kavşakta hedefleyen iğne penetrasyonu kolaylaştırır. - onlar küre sahne (4 saat sonra döllenme) ulaşana kadar 28 ° C inkübatör embriyolar yerleştirin.
Hücre transplant için Embriyolar 4. hazırlanmasıiyon
- 200 ul penisilin / streptomisin (malzeme listesine bakınız) (Pen / Strep EM) ile embriyonun orta 20 ml hazırlayın.
- küre aşamasında embriyo dechorionation (4 saat sonra döllenme)
Not: Dechorionated embriyolar çok kırılgan ve hava veya plastik ile temas halinde patlayacak. Dolayısıyla agaroz kaplı tabaklara yerleştirilir ve yangın cilalı cam Pasteur pipetler ile transfer edilmesi gerekir.- Bir plastik Pasteur pipeti kullanarak, embriyo ortamda% 1 agaroz ile kaplı ve Pen / Strep EM ile dolu iki adet 35 mm Petri kapları içine adım 3.3 enjekte adım 3.2 toplanan konak embriyolar ve donör embriyolar transfer. iki ayrı yemekler ev sahibi embriyolar ve donör embriyolar tutun.
- Elle ince cımbız (malzeme listesine bakınız) ile chorions embriyolar ayıklayın.
- onlar kalkan sahne (6 saat sonra döllenme) ulaşana kadar 28 ° C inkübatör embriyolar yerleştirin.
5. Hücre Nakli
- Hücre Nakli Embriyolar düzenleyin.
- Bir floresan stereomikroskop altında seçin donör embriyolar kalkan (yeşil) içinde ABP140-mCherry (kırmızı) ifade.
- Bir yangın cilalı Pastör pipeti kullanarak, Pen / Strep EM ile dolu hücre nakli plakasının gözenekleri içinde embriyo aktarımı. Komşu satırda bir satırda konak embriyolar ve donör embriyolar yerleştirin.
- bir kirpik kullanarak, dikkatle kalkan up ile embriyolar yönlendirmek.
Not: Kalkanın pozisyon GFP tarafından değerlendirilir ya da anatomik olabilir.
- Transplantasyon Sistemi Kurulumu.
Not: Transplantasyon sistemi mikro sürücü ile donatılmış bir Hamilton şırıngaya (malzeme listesine bakın) PTFE tüp (Malzeme listesine bakınız) ve bir tüp konnektörü (Malzeme listesine bakınız) ile bağlantılı bir iğne tutucu oluşur (listeye bakın Malzemelerin). iğne tutucu3-yollu mikromanipülatör üzerine monte edilir (Malzeme listesine bakınız).- eden bir şınngaya bağlanmış bir iğne tutucu kullanılarak,% 70 etanol ile hücre transplantasyonu için iğne yıkayın. iğne içine havayı emerek kuru. Bu toz iğne konik kısmında sıkışmış neden olabileceğinden, esen kuru etmeyin.
- yukarı konik, Hamilton şırınga bağlı iğne tutucu iğne takın.
- Kalkan-to-kalkan Hücre Transplantasyonu
- transplantasyon iğne ile donör embriyo kalkanını girin ve ABP140-mCherry etiketli yaklaşık 10-20 hücreleri hazırlamak. Dikkatle sarısı çizim kaçının.
- ev sahibi embriyo kalkanı içine hücreleri nakli. Tüm ev sahibi embriyolar nakledilen kadar tekrarlayın.
- Bir yangın cilalı Pasteur pipeti ile hasarlı embriyolar çıkarın. 28 ° C inkübatör nakledilen embriyoların yerleştirin ve onları yaklaşık 30 dakika süreyle geri verelim.
- Bir iğne kullanarakBir şırınga bağlı tutucu, su ile hücre nakli iğne durulayın ve modelleme kil bandında bir Petri kabındaki geri yerleştirin. parafilm çanak mühür.
6. (İSTEĞE BAĞLI) Tek Hücre Nakli
Not: nakli iğne tek bir hücre çizmek zor olacak şekilde embriyo, hücreler birbirine yapışır. Biz kolayca tek prechordal plaka progenitör hücreler nakli için modifiye edilmiş bir protokol geliştirmiştir. Fikir transplantasyon öncesinde hücreleri ayırmak etmektir. İzole prechordal plaka progenitör hücrelerin kimliklerini kaybetme eğilimindedir, çünkü biz genetik Sox32 transkripsiyon faktörü yokluğunda, Düğüm sinyalizasyon yolunun aktive ederek, ileriye dönük prechordal plaka kimlik bunları empoze. Biz bu uyarılmış hücreleri, endojen prechordal plaka progenitör hücrelerin 8 gibi davranır doğruladıktan. Aşağıda tek bir hücre nakli gerçekleştirmek için belirli adımlar vardır. hücre dissociation, kalsiyum içermeyen Ringer 11 embriyolar yerleştirerek bir eksplant kesme ve mekanik olarak karıştırılarak elde edilir.
- Adım 2.1 yerine Embriyo Orta Kalsiyum içermeyen Ringer% 1 agaroz ile nakli yemek hazırlamak.
- Aşama 3.1 'de, ABP140 mCherry RNA ve sin1 morfolino ilave olarak, 2, 3 (nihai 0.6 ng / | il) Düğüm reseptör Taram-A aktif formunu kodlayan RNA'lar ng ve sox32 karşı morfolino 1.25 ul (stok çözeltisi ekleyin mM, dolayısıyla 0.5 mM nihai).
- Aşama 4, transfer yangın cilalı Pastör pipeti kullanarak Pen / Strep kalsiyumsuz Ringer dolu hücre transplantasyonu için çanak seçilen üç donör embriyolar sonra. ince cımbız ile enjekte hücreleri (ABP140 mCherry etiketli hücreler) içeren bir eksplant teşrih. Hızla embriyoların kalanını atın.
- Hücreler ayırmak kadar bir kirpik ile hafifçe eksplant karıştırın.
- transplantasyon iğne tek bir izole hücre çizinve bir ev sahibi embriyo kalkan içine nakli.
- Bir yangın cilalı Pastör pipeti kullanarak, Pen / Strep EM ile dolu bir agaroz kaplı tabak embriyolar aktarılır. 30 dakika boyunca 28 ° C'de inkübatör içinde embriyo yerleştirin.
Montaj 7. Embriyo
- Görüntüleme Odası
- Yöntem 1: Bir tarafta 3 mm yüksekliğinde kenarlı 4 delikli (5.5 mm çap), (Şekil 2C - D) ile delinmiş bir plastik slayt (75 x 25 x 0.5 mm) oluşan bir görüntüleme haznesi. siyanoakrilat yapıştırıcı (süper yapıştırıcı) ile arka tarafta bir cam lamel, Tutkal.
Not: Deney sonunda, lamel kaldırmak ve zımpara kağıdı ile tutkal artıkları kurtulmak için bir gece suda odasına yerleştirin. - Yöntem 2: 10 mm delik olan 35 mm Mattek cam alt yemekleri (Malzeme listesine bakınız) kullanın.
- Yöntem 1: Bir tarafta 3 mm yüksekliğinde kenarlı 4 delikli (5.5 mm çap), (Şekil 2C - D) ile delinmiş bir plastik slayt (75 x 25 x 0.5 mm) oluşan bir görüntüleme haznesi. siyanoakrilat yapıştırıcı (süper yapıştırıcı) ile arka tarafta bir cam lamel, Tutkal.
- embriyo Montaj
- embriyo ortamda sıcak% 0.2 agaroz 1 ml cam şişe doldurun.ısı blokunda 42 ° C'de tutun.
- Floresan stereomikroskop altında, kırmızı nakledilen hücrelerin yeşil etiketli prospektif prechordal plaka (yani kırmızı nakledilen hücrelerin yeşil prospektif prechordal plaka içindedir, ve hayvan kutup doğru göç başlamıştır) bir parçası olduğu bir embriyo seçin.
- Bir yangın cilalı Pastör pipeti ile agaroz çözeltisi içine seçilen bir embriyo transferi. pipetle embriyo orta fazlalığı atın. agaroz ile pipet embriyo çizmek ve agaroz bir damla yatırılması, görüntüleme odasında embriyo transferi. agaroz ayarlanır önce, bir kirpik ile embriyo yönlendirmek. dik bir mikroskop ile görüntüleme için yukarı muhtemel prechordal plaka yerleştirin veya bir ters mikroskop ile görüntüleme için cam alt. Agaroz odasının yanındaki kuyuda başka embriyo monte etmeden önce (oda sıcaklığına bağlı olarak yaklaşık 1 dakika) ayarlanır kadar bekleyin.
Not: Bir görüntüleme chamber 4 kuyu içeren 4 embriyolar kadar montaj sağlar. - agaroz ayarlandığında, kurumasını önlemek için Pen / Strep EM ile odasını doldurun.
8. Canlı Görüntüleme
- 40X su daldırma uzun menzilli lensi kullanın. GFP görüntü GFP ve mCherry (uygun filtre setleri kullanın:; uyarma BP 470/40, ışın ayırıcı FT 510 ve emisyon BP 540/50 MCherry için: uyarma BP 578/21, ışın ayırıcı FT 596 ve emisyon LP 641 / 75). Görüntü dinamiklerini optimize etmek için poz süresini ayarlayın.
- plaka tüm hücreler görüntü için (ektoderm) prospektif prechordal plaka üzerinde bir kaç mikron başlayan ve (sarısında) prospektif prechordal plaka altında birkaç mikron biten, z-yığınları kazanır. 2 um z-adım kullanın. satın alma hızını optimize etmek için, z-yığınlarının arasında yerine kare arasında renkleri geçiş.
Bu yeşil ve kırmızı görüntüler arasında hafif farklılıklara yol açabilir, ancak kesin co beri bir sorun değil: Notyeşil ve kırmızı sinyaller arasındaki -localization gereklidir. Işık daha fazla görüntüleme süresi ve maruziyeti azaltmak için, yeşil yalnızca bir kez prechordal plaka progenitör hücreleri tanımlamak için yeterlidir her 5 kez puan elde edilebilir. - çıkıntı sıklığını ve yönünü analiz etmek gereklidir iki dakikalık bir zaman aralığı içinde 4 embriyolar, görüntü gibi ayarları kullanma. çıkıntı ömür boyu analizi için, yüksek zaman çözünürlüğü elde etmek için 30 saniye zaman aralığını azaltmak. % 80 epiboly% 60 epiboly görüntü.
9. Hücre Dinamiği Analizi
- ImageJ 4D görüntüleri yüklemek
Not: edinimi için kullanılan yazılıma bağlı olarak, görüntüler farklı biçimlerde saklanır (görüntü başına bir dosya, z-yığınının başına bir dosya, bütün deney için bir dosya). Bazı ImageJ Eklentiler 4D yığınları açmak için online olarak hazırdır. Bizim verilerimiz z-yığınının başına bir dosya olarak saklanır. Veri kümesi büyük olduğundan, bunun sadece bir kısmını (bazı tim açmak için uygun olabilire noktaları, ya da z-yığını veya 8-bit bir Subpart) ... görüntüleri dönüştürülür. Biz talep üzerine dağıtmak için mutlu olurdu ki, bunu yapmak için bir ısmarlama ImageJ eklenti kullanmak. - Yönlendirme ve analizi Hücre çıkıntıların sıklığı
- prospektif prechordal plaka göçün ana yönünü belirlemek için GFP görüntüleri kullanın. Hücre çıkıntılar açı ölçümleri için bir referans olarak alır. Bu referans yönü görüntünün bir tarafına paralel olacak şekilde, yığın döndürün.
- Bir hücre izleyin. Seç açı aracı. Her kare ve her çıkıntı için, çıkıntı ve referans yönü (Şekil 3A) arasındaki açıyı ölçmek için açı aracını kullanın. (Klavyede basın veya M) değeri saklamak için ölçün / Analiz komutunu kullanın. bir txt dosyası olarak sonuçları kaydedin. Bir sonraki hücreye ile tekrarlayın.
- histogramlar olarak R ve arsa açısı dağılımı veri almak. Farklı koşullar karşılaştırmak için Kolmogorov-Smirnov testi (R ks.test) kullanın.
Not: açı aracı klasik istatistiksel testler ve dairesel değil testlerin kullanımına izin veren, 0 ° ve 180 ° arasını kapsayan değerler sağlar. - Bu veri seti ile, dakikada hücre başına uzantı sayısı emisyon frekansı hesaplayabilir. Kullanım Student t-testi (R t.test) farklı koşullar karşılaştırmak için.
- Hücre Çıkıntılar ömür boyu analizi
- Her hücre ve her çıkıntı, ölçü çıkıntı süresi (çıkıntı kareler arasında mevcut x zaman aralığıdır sırasında kare sayısı) için.
- Farklı koşullar karşılaştırmak için R. Kullanım Student T-testi (R t.test) veri almak.
Not: Diğer göç özellikleri hücre göçü karakterize etmek amacıyla analiz ilginç olabilir. Bu hız, yön ve sebat ölçümleri veya hücre morfolojisi, hücre parçaları içerir. Bazı ticari yazılım uygulamaları bu özellikleri ölçmek için kullanılabilir, ancak açık kaynak yazılım başvurunun çok sayıdaÖrneğin morphodynamics 12 analiz etmek ADAPT olarak katyonlar ve ImageJ eklentileri de mevcuttur, diper göç 14 sırasında hücre sınırlarını izlemek için hücre yörüngeleri ve yön kalıcılık 13, CellTrack bakmak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunulan teknik vivo hücre göçü kontrol, sin1, Tor karmaşık 2 (TORC2) çekirdek bileşenlerinden biri rolünü analiz etmek için kullanıldı. hücre nakli kullanımı izole hücreler ve hücre özerk etkilerinin analizi etiketleme izin verir. Film S1 nakledilen prechordal plaka progenitör hücrelerin göçünü gösteriyor. ABP140 ile Aktin etiketleme aktin zengin sitoplazmik uzantıların kolay görüntüleme sağlar. Biz onların sıklığını ve yönünü ölçülür. Yabani tip hücrelerin göç yönüne (Şekil 3B), yani hayvan kutup yönünde yönlendirilmiş sık sık büyük bir sitoplazmik çıkıntılar üretir. Sin1 fonksiyon kaybı aktin zengin çıkıntı oluşumu kontrol sin1 önemini gösteren geri kalanları bir ciddi çıkıntıların sayısının azaltılması ve rasgele yol açar. İlginçtir, bu fenotip e tarafından kurtarıldı olabilirRac1 15 konstitütif olarak aktif bir formunun XPression güçlü TorC2 Rac1 (Şekil 3B) ile aktin dinamikleri ve hücre çıkıntı oluşumu kontrol düşündürmektedir.
Sunulan teknik aynı zamanda, hücre dinamikleri 4, ARPIN, ARP2 / 3 kompleksinin en son tespit inhibitör rolü karakterize etmek için kullanıldı. ARPIN fonksiyon kaybı çıkıntı frekansı (verilen bir zamanda bir çıkıntı barındıran hücrelerin ortalama hızı) bir artışa yol açar. Bu, ya daha sık uzantı oluşumu ya da çıkıntı stabilitesinde artışa bağlı olabilir. Çıkıntı kullanım Ölçüm ARPIN yokluğunda, çıkıntı zamansal kalıcılık (Şekil 3C) iki kat, ortaya koymuştur. Bu uzantı geri çekme kolaylaştıracak bir ARP2 / 3 inhibitör olarak ARPIN rolü ile tutarlıdır ve ARPIN yerine, çıkıntı stabilitesini modüle ederek çıkıntı frekans etki olduğunu göstermektedirçıkıntı başlatma.
Şekil 1:. Usul Anahat Tg (gsc: GFP) embriyolar 4-hücreli aşamasında (1 saat sonrası fertilizasyon) enjekte edilir. 28 ° C'de 5 saat sonra, embriyolar ABP140 mCherry kalkan (GFP +) içindeki pozitif hücrelerin yok donör embriyolar seçilir. Kalkan hücreleri nakli iğne içinde hazırlanan ve bir ev sahibi embriyo kalkanı aktarılır. iyileşme 0.5 saat sonra, ana embriyolar monte edilir ve epifluorescent mikroskobu (40X objektif) ile görüntülendi. hpf. saat sonra döllenme bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: TransplantatiDish ve bireysel kuyuları ile Görüntüleme Odası. (A) Transplantasyon çanak. Hücre transplantasyonu yemek için (B) Kalıp. (C) Ev yapımı görüntüleme odası. (D) ev yapımı görüntüleme odasının şematik çizimi. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Hücre sonuçları Dinamiği Analizi çıkıntı açı ölçümü (A) Şema. Hücre çıkıntı yönünde ve frekans (B) analizi. SIN 1 (Mo-sin1) yokluğunda, hücreler daha az çıkıntı verir ve geri kalan çıkıntılar rasgele yönlendirilmiştir. Bu fenotip, GTPaz Rac1 (Mo-Sin konstitütif olarak aktif bir formu sentezlenmesiyle kurtarılabilecek1 + CA-Rac1). DUMORTIER ve David, 2015 5 çıkıntı ömür boyu. (C) Analiz modifiye. ARPIN (Mo-ARPIN) yokluğunda, çıkıntı frekansı yükselir. Bu çıkıntı ömrü artışa bağlıdır. Morfolino duyarsız bir ARPIN RNA reintroducing bu hiper çıkıntılı fenotip geri yükler. Dan Dang ve diğ. Modifiye, 2013 4. Ölçek çubuğu = 10 mm. A: Ön; P: Posterior L: Sol, R:. Sağ bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 1: Hücre çıkıntılar sin1 kontrolleri oluşumu, Rac1 aracılığıyla (Sağ indirmek için tıklayın). Enjekte nakledilen prechordal plaka progenitör hücreler,ABP140-mCherrry RNA ve Rac1 konstitütif form için bir kontrol morfolino ya da sin1 morfolino ya da sin1 morfolino ve RNA'lar. Çıkıntı sıklığı ve oryantasyon bu görüntüler üzerinde ölçüldü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, in vivo olarak, canlı görüntüleme hücre transplantasyonu ile kimerik embriyo oluşturulmasını birleştirerek hücre göçü bir aday genin rolünü araştırmak için kolay bir yol sunar.
mozaik embriyoların Yaratılış
Bir hücrenin dinamiklerini incelenmesi sitoplazmik uzantıları analiz etmek onun konturu görselleştirme gerektirir. böylece iyi bir görsel kontrast sunan, çevre - ya da farklı etiketli - Bu bir başka etiketsiz izole hücrelerin etiketlenmesi ile elde edilebilir.
Stokastik embriyo hücrelerinin bir kısmını etiketlemek için kolay bir yol 1-hücre aşamasında 16 de plasmidic DNA enjekte edilmesidir. Enjekte plazmidler rastgele ve eşitsiz hücre bölünmesi sırasında hücrelerde ayrılmış olan agregalar oluşturabilirler. Bu hücrelerin rastgele alt grubunda plazmid ifade yol açar ve böylece mo üretmek için çok hızlı, kolay ve non-invaziv bir yöntem temsilSAIC embriyolar. Bununla birlikte, enjekte edilen plazmid ifade eden hücreler kümeler oluşturma eğilimi ve potansiyel prechordal plaka birkaç ifade eden izole edilmiş hücreleri içeren embriyolar bulma ihtimali oldukça düşüktür. Bundan başka, plasmidic DNA kullanımı enjekte yapının ifade seviyesinin çok sınırlı kontrol sağlar. plasmidic DNA enjeksiyonu daha teknik olarak daha zor olmasına rağmen hücre nakli ile kimerik embriyolar, yaratılması, bir dizi avantaj sunmaktadır: nakledilen hücrelerin sayısının kontrolünü, yapıları (RNA enjeksiyon) ifadesi düzeyi kontrol ve son ama en az hücre nakilleri hücreleri kaybı ya da fonksiyon yapıları kazanç ihtiva nakledilen hangi mozaik embriyolar oluşturarak, hücre özerk etkileri test etmek için izin verir. Bunun aksine, transplantasyonlar da modifiye edilmiş embriyolar, doğal tipte hücrelerin nakli çevrenin otonom-olmayan rolünü değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu test için özel ilgi konusu olabilirÖrneğin, hücre göçü analizi için özellikle uygun olan hücre dışı matris bileşenlerinin işlevi.
Hücre transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol daha önce 10 tarif edilmiştir. Bu protokol ile karşılaştırıldığında, bizim prosedürü iki temel farklılıkları tartışmak istiyorum.
İlk fark donör embriyolar enjeksiyon evresine bağlıdır. Deneyimlerimize göre, embriyolar nedeniyle hücrede RNA'ların bir eksik difüzyon homojen tüm hücrelerde floresan proteini, ifade yoktur floresan protein RNA'lar 1-hücreli aşamada enjekte. dört hücre birinde 4-hücre aşamasında embriyoların donör enjeksiyonu floresan protein RNA'ların birlikte enjekte izlenebilir olmayan diğer RNA'lar ile olduğunda özel ilgi konusu olan hücre homojen bir klon, almasını sağlar.
İkinci temel fark, transplant yerine yağ hava kullanımıiyon şırınga. bir hava-dolu sistemin temel dezavantajı hava elastikiyet kaynaklanan atalet. Yağ tersine, sıkıştırılamaz olmak, emme ve basınç iyi kontrol sunar. Ancak, küçük bir eğitim ve iğne, ince, konik bölümü hava ve embriyo orta arasındaki arayüzü sürdürerek, bir hava-dolu sistemi ile emme ve basınç kontrol kalkan aşamasında hücre nakli için yeterlidir. Hücreler daha küçük ve daha uyumlu hale geldikçe, daha sonra aşamaları için, emiş hava dolu ayarı ile elde edilemez, çok hassas bir şekilde kontrol edilmesi gereken bir yüksek basınç gerektirir. Kurulum herhangi bir hava kabarcığı olmadan yağ dolum sistemi, yağ yerine havayı artmasına katkıda kullanarak zor. Ayrıca, bu yağ ile nakli iğne doldurmak önler. Bu nakil iğneleri yeniden kullanılmak üzere ve bu nedenle dikkatli bir şekilde hazırlanabilir sağlar. Biz keskin kenarları olmayan ve doğru çaplı bir iğne succe için önemli olduğunu hissediyorumssful nakli. Bu nakli adım açıkça kolaylıkla yapılmaktadır önce pratik gerektirir protokolde, kritik adımlardan biridir.
Ayrıca nakli iğne benzersiz bir hücre çekmek için, transplantasyon öncesinde hücrelerin ayrışan oluşur tek hücreler, nakli için belirli bir prosedür önerilmiştir. Bu geçici hücre ayrışma kimliklerini ve / veya davranışını değiştirmek olmaz anlamına gelir. prechordal plaka progenitör hücreler için, genetik hücre kimliğini empoze ve dikkatle bu hücreler olmayan ayrışmış olanlar gibi davrandığını kontrol ettirin. Ancak, biz resmen bu ayrışma gözardı edilemez ve / veya genetik indüksiyon hücrelerinde farkedilmeden değişiklikler neden olur. Onları dissociating olmadan tek hücre nakli mümkündür. Hücreler nakli iğne dikkatlice hazırlanmalıdır. Ancak, bizim elimizde en azından başarı oranı birden fazla hücre nee içine alır ya, çünkü oldukça düşüktürdle, ya da hazırlanan ve iğne ölür ya da bir kez nakledilen hücre makas çünkü.
Hızlı konfokal görüntüleme karşı Epifloresans
mozaik embriyo oluşturmak için hücre naklinin kullanılması diğer etiketli hücreleri ayrılmış izole hücrelerin etiketlenmesi için izin verir. protokol önerildiği gibi, bu bağlamda, hücre morfolojisi ve dinamikleri iyi bir görüntüleme standart epifloresans mikroskobu ile elde edilebilir. Bu nispeten yaygın ekipman ve düşük maliyetli bir alternatif daha pahalı konfokal görüntüleme sistemleri olmanın bariz bir avantaja sahiptir.
Hassas hücre içi lokalizasyonu için konfokal görüntüleme özellikle eksenel çözünürlükte, çözünürlüğü artırmak için kullanılabilir. hala yeterli temporal çözünürlük elde etmek için, hızlı konfokal görüntüleme kullanılmalıdır. Bizim deneyim, eğirme disk mikroskoplar çözünürlük, hız ve foto-toksisite arasında iyi bir denge sunuyor. Hızlı tarama konfokal mikrofon(Rezonans tarama mikroskopları gibi) roscopes daha seyrek ve daha pahalı hem de iyi bir seçenek, ama.
Hücre iskeleti etiketleme
aktin filamentler ve dinamikleri iyi etiketleme aktin bazlı hücre göçü mekanizmaları incelemek için son derece önemlidir. membrana bağlı floresan belirteçler hücre hatlarını analiz etmek daha verimli olmasına rağmen, aktin etiketleme hücre çıkıntılar çok daha iyi bir görselleştirme sağlar. Üç etiketli hücreleri temasa Özellikle, uzantının anahat ve karışık alabilirsiniz komşu hücrelerin zar olarak iki komşu hücreler arasında bulunan bir sitoplazmik uzantı belirlemek çok zordur. aktin filamentleri Etiketleme biz odaklı hangi aktin-tabanlı cep çıkıntıların, kesin ve açık algılanmasını sağlar. Hücre morfolojisi sayısal olarak yapmak ise, bir membran etiketleme tercih olacaktır. Başka bir seçenek ya transgenik li 3-renk görüntüleme (birini kullanarak, hem etiketleme kullanmaktırNE, aktin ve bir zar için) ya da GFP membran etiketlenmesi. Transgenik paralel olarak, GFP membran GFP etiketli olsa bile, sitoplazmik ve goosecoid-GFP pozitif hücrelerin bu şekilde tespit edilebilir.
Son yıllarda, bir prob sayıda canlı örneklerde aktin etiketlemek için kullanılmıştır. ilk olanlar aktin monomerlerin doğrudan füzyonlar vardı. Bu iki ana dezavantajı mevcuttur. Birincisi, hepsi aktin ve özellikle polimerize aktin etiketli. İkincisi, sık sık zehirli idi. Şu anda kullanımda olan sondalar floresan gazetecilere kaynaşmış ipliksi aktin bağlayıcı etki vardır. Bu protokol, şu anda ipliksi aktin için en sık kullanılan belirteç ve tüm ipliksi aktin etiketler, ABP140 17 (maya aktin bağlayıcı protein 140 aktin bağlayıcı etki alanı) kullanılır. 18 (calponin homoloji etki alanı) Utrophin da ipliksi aktin etiketler, ancak kararlı filamentler etiketlemek için görünür. Bu fark iden için kullanılmıştıryaşam tarzlarına sahip, dinamik aktin filamentler, olanları ABP140 etiketli ve Utrophin 19 olarak.
Son zamanlarda ABP140 ve Utrophin uzun ifade üzerinde 20, özellikle toksik etkilere sahip olabilir sinek bildirilmiştir. Biz ABP140 etiketli hücrelerde herhangi bir göç kusurları fark olsa da, biz ABP140 ifade endojen aktin dinamiklerini karıştırmayı olabileceğini göz ardı edemeyiz. Ipliksi aktin üçüncü prob son zamanlarda 21 bildirilmiştir. F-tractin (sıçan inositol trifosfat 3-kinaz ile ilgili aktin-bağlama alanı), toksik etkileri 20,22 gösterilmez filamentli aktin'in sadık raportör olarak tarif edilmiştir. Bildiğimiz kadarıyla, F tractin kullanımı henüz zebrabalıkları bildirilmemiştir.
aktin yanı sıra, diğer birçok hücre bileşenleri hücre göçü anlayışımızı geliştirmek için etiketlenmiş olabilir. Bu, diğer iskelet miyozin gibi bileşenleri, Mikrotübülleri, sentrozom, yanı sıra kn içerirKendi hücresi göçü regülatörleri (küçük GTPazlar Rho, Rac ve Cdc42, PIP3 floresan probları aktif formları ...) ya da hücre yapışması yer alan proteinler (integrinler, kaderinler ...).
Genel olarak, bu protokol, in vivo olarak, hücre göçü kontrol bir aday genin katılımını test etmek için hızlı ve kolay bir sistem önermektir daha önce tarif edilen araçlar ve bir takım teknikler toplanacak. o yönetti kolektif göç ilginç bir modeldir, çünkü mevcut transgenik hat etiketleme bunun gibi muhtemel prechordal plaka göç kullanılır. Bununla birlikte, benzer bir protokol gelişimi sırasında meydana gelen diğer geçiş olayları analiz için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
- Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), Cambridge, England 921-932 (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
- Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
- Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
- Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
- Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
- Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
