Introduction
Negli organismi multicellulari, migrazione cellulare è essenziale sia per lo sviluppo dell'embrione in cui assicura l'organizzazione delle cellule in tessuti e organi, e per la vita adulta, dove partecipa alla omeostasi tissutale (cicatrizzazione) e l'immunità. Oltre a queste funzioni fisiologiche, la migrazione delle cellule è anche coinvolto in diverse situazioni patologiche, tra cui, in particolare, le metastasi del cancro.
La migrazione cellulare è stato analizzato in vitro per decenni, fornendo una comprensione generale dei meccanismi molecolari che assicurano movimenti delle cellule sulle superfici piane. In vivo Tuttavia, le cellule sono di fronte a un ambiente più complesso. È chiaramente apparso negli ultimi anni che la migrazione all'interno di un organismo può essere influenzata da stimoli esterni come la matrice extracellulare, cellule o chemochine secrete guida migrazione vicina, e che i meccanismi di guida migrazione cellulare può variare da quanto descritto <em> in vitro 1,2. I meccanismi che garantiscano nella migrazione cellulare vivo hanno ricevuto meno attenzione finora, principalmente a causa della maggiore difficoltà tecnica, rispetto a studi in vitro. Analisi in vivo della migrazione cellulare in particolare richiede l'accesso ottico diretto alle cellule migrano, tecniche per marcare le cellule uniche a per vedere la dinamica e la morfologia, così come guadagno o perdita di funzione approcci per testare il ruolo dei geni candidati. Finora, solo pochi sistemi modello che ospitano queste caratteristiche sono stati utilizzati per sezionare nella migrazione delle cellule in vivo 3.
Recentemente abbiamo usato la migrazione del piatto precordale prospettico nei primi embrioni di zebrafish come un nuovo sistema pratico modello per valutare la funzione dei geni candidati nel controllo nella migrazione delle cellule in vivo 4,5. Piastra precordale prospettico (noto anche come anteriore mesendoderm) è un gruppo di cellule che formano al momento della comparsa di Gastrulation sul lato dorsale dell'embrione. Durante la gastrulazione questo gruppo migra collettivamente verso il polo animale dell'embrione 6-8, per formare la lastra precordale, un ispessimento mesendodermal, anteriore alla notocorda, e alla base della piastra neurale. La parte anteriore della piastra precordale darà luogo alla ghiandola cova, mentre la sua parte posteriore probabilmente contribuisce a testa mesoderma 9. Grazie allo sviluppo esterna e chiarezza ottica dell'embrione pesci, migrazione cellulare può essere direttamente e facilmente osservata in questa struttura.
Il trapianto cellulare è una tecnica molto potente che consente la creazione rapida e semplice di embrioni mosaico 10. Esprimendo marcatori del citoscheletro fluorescenti in cellule trapiantate risultati nell'etichettatura delle cellule isolate, la morfologia e la dinamica delle quali possono essere facilmente osservati. Combinando questo per perdita o guadagno di funzione avvicina permette l'analisi delle funzioni cellulari autonomi di una lattinagene didati.
Il protocollo presentato descrive come abbiamo valutato la funzione della componente TORC2 sin1 nel controllo della dinamica di migrazione cellulare e di actina in vivo 5. Ma, come detto nei risultati e ulteriormente discussa, potrebbe essere utilizzata per analizzare il potenziale implicazione di un gene candidato nel controllare la migrazione delle cellule in vivo.
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Protocol
Nota: La Figura 1 presenta la sagoma del protocollo.
1. Preparazione degli aghi per l'iniezione e Trapianti
Nota: aghi può essere preparato in qualsiasi momento e memorizzati. Tenerli in una capsula di Petri, su una banda di plastilina. Sigillare il piatto con parafilm per proteggere dalla polvere.
- Per aghi da iniezione, tirare un capillare di vetro (diametro esterno 1,0 millimetri, diametro interno 0,58 millimetri, senza filamento (vedi elenco dei materiali)) con un estrattore micropipetta (vedi elenco dei materiali). Preferisco aghi corti e sottili (parte conica di circa 5 mm) in quanto sono più efficienti per piercing corion.
Nota: Gli aghi di iniezione sono monouso. - Ago per trapianto di cellule
- Tirare un capillare di vetro (diametro esterno 1,0 millimetri, diametro interno 0,78 millimetri, senza filamento (vedi elenco dei materiali)) con un estrattore micropipetta.
- Ucantare una microforge (vedi elenco dei materiali), tagliare la punta dell'ago nel punto in cui il diametro interno è di 35 micron (leggermente superiore al diametro delle cellule da trapiantare).
- Smusso il taglio estremità del capillare con un Micromacinatore (vedi elenco dei materiali) con un angolo di 45 °.
- Opzionalmente, tirare una sbavatura alla fine dell'ago utilizzando un microforge. Per questo, toccare il filamento caldo con la punta del bisello e rapidamente allontanarlo, creando una sbavatura che può aiutare penetrare l'embrione.
- Montare l'ago su un supporto ago collegato ad una siringa. Usando la siringa, lavare l'interno dell'ago tre volte con acido fluoridrico 2% per eliminare i residui di vetro, e poi sciacquare tre volte con acetone.
Attenzione: L'acido fluoridrico è tossico, manipolare sotto il cofano, con i guanti.
Nota: Gli aghi di trapianto di cellule può essere utilizzato più volte.
2. Preparazione delPiatti per iniezione e trapianto di cellule
- Calore 50 ml di embrioni medie 11 contenenti 0,5 g di agarosio in un forno per 1 min a piena potenza per ottenere 1% agarosio in mezzo embrione. Raffreddare il gel di agarosio a circa 60 ° C e versare i 50 ml in un piatto 90 millimetri Petri. Posizionare sulla superficie del gel uno stampo appositamente progettato (vedi elenco di materiale), sia con le linee per il piatto iniezione o con pozzetti per il piatto trapianto di cellule.
- Osservare il galleggiante muffa sul agarosio, se l'agarosio non è troppo caldo. Dopo il gel di agarosio è impostato, rimuovere lo stampo con una pinza (Figura 2A - B).
Nota: piatti possono essere conservati a 4 ° C, fino a poche settimane. Tenerli in una scatola chiusa bagnato, per evitare l'essiccamento.
- Osservare il galleggiante muffa sul agarosio, se l'agarosio non è troppo caldo. Dopo il gel di agarosio è impostato, rimuovere lo stampo con una pinza (Figura 2A - B).
- Posizionare il piatto in un 28 ° C incubatore 30 minuti prima dell'uso.
3. Raccolta di embrioni e di iniezione
- Iniezione Soluzione Preparazione
Nota: actina dominio di legamedi proteine 140 (ABP-140) come Lifeact vincolato al mCherry vincolante actina lievito (denominato ABP140-mCherry) è usato per visualizzare actina polimerizzata all'interno della cellula, per analizzare l'attività protrusiva. Aggiungere un altro composto per testare la funzione di un gene candidato (ad esempio mRNA di dominante costrutto negativo o costitutivamente attivo, o oligonucleotidi Morpholino). Per valutare le funzioni di sin1 come descritto nelle risultati (figura 3), abbiamo utilizzato oligonucleotidi Morpholino. Come controllo, abbiamo usato un morfolino identico al morfolino sin1 ma per 5 nucleotidi distribuite lungo la sequenza in modo che questo morfolino controllo non corrisponde al RNA bersaglio.- Sin1 Scongelare e Morpholinos controllo 5 disadattamento (2 stock soluzioni mm), e ABP140-mCherry mRNA sul ghiaccio. Aggiungere 375 ng di mRNA (75 ng / mL finale) e 0,75 ml di uno sin1 o 5 disadattamento morfolino controllo (0,3 mm finale) in Danieau tampone (58 mM NaCl, 0.7 mmKCl, 0,4 mM MgSO 4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5,0 mM HEPES pH 7,6), per raggiungere un volume totale di 5 ml.
- embrione Collection
Nota: per questo sperimentale istituito due embrioni donatori e di accoglienza sono transgenici, che esprime la GFP sotto il controllo del goosecoid (GSC) promotore al fine di visualizzare la piastra di precordale prospettico 11.- Raccogliere Tg (GSC: GFP) le uova. Mettere circa 80 uova in un piatto 90 millimetri Petri riempite con terreno di embrione e incubare a 28 ° C.
- Iniettare embrioni donatori
- Sotto uno stereomicroscopio, premere delicatamente embrioni raccolti con una pinza nelle linee di un piatto pieno di iniezione di media embrione. Utilizzando pinze, orientare gli embrioni con le celle verso la parte superiore. Posizionare il piatto di iniezione in incubatore a 28 ° C fino a quando gli embrioni hanno raggiunto la fase 4 celle (1 ora dopo la fecondazione).
- Caricare un ago per iniezione con 2 ml disoluzione iniettabile. Inserire l'ago in un supporto ago (vedere l'elenco dei materiali) che viene inserito in un micro-manipolatore (vedi elenco dei materiali) e collegato con politetrafluoroetilene (PTFE) tubazione (vedere l'elenco dei materiali) ad un transjector dell'aria (vedi elenco dei materiali ).
- Aprire il capillare toccando delicatamente la punta con una pinza sottile. Se necessario, tagliare il capillare aperto da pizzicare sua estremità.
- Inserire una delle quattro cellule con l'ago e iniettare la soluzione all'interno della cellula in modo da riempire il 70% del volume cellulare (2 nl). Iniettare 30 embrioni.
Nota: raggiungere l'ago nella cella può essere difficile, in quanto la membrana plasmatica è morbido. Mirare alla giunzione tra la cella e il tuorlo facilita la penetrazione dell'ago. - Mettere gli embrioni in C incubatore 28 ° fino a quando non hanno raggiunto la fase sfera (4 ore dopo la fecondazione).
4. Preparazione degli embrioni per la cella Transplantatione
- Preparare 20 ml di terreno embrione con 200 ml di penicillina / streptomicina (vedi elenco dei materiali) (Pen / Strep EM).
- Dechorionation degli embrioni allo stadio sfera (4 ore dopo la fecondazione)
Nota: embrioni dechorionated sono molto fragili e esploderanno in caso di contatto con l'aria o plastica. Hanno bisogno quindi ad essere messi in piatti agarosio rivestite, e trasferiti con pipette Pasteur di vetro fuoco lucido.- Usando una pipetta Pasteur di plastica, trasferire gli embrioni di accoglienza raccolti al punto 3.2 e gli embrioni donatori iniettati al punto 3.3 in due 35 millimetri piastre Petri rivestiti con 1% di agarosio nel medio embrione e riempite con la penna / Strep EM. Mantenere gli embrioni di accoglienza ed embrioni di donatori in due piatti separati.
- estrarre manualmente gli embrioni dai loro chorions con le pinzette sottili (vedi elenco dei materiali).
- Mettere gli embrioni in C incubatore 28 ° fino a quando non hanno raggiunto la fase scudo (6 ore dopo la fecondazione).
5. trapianto di cellule
- Disporre il embrioni per il trapianto di cellule.
- Sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza, selezionare gli embrioni donatori esprimono ABP140-mCherry (rosso) all'interno dello scudo (verde).
- Usando una pipetta Pasteur incendio lucidato, di trasferire gli embrioni nei pozzetti del piatto trapianto di cellule riempito con la penna / Strep EM. Mettere gli embrioni ospitanti in una fila e gli embrioni donatori nella fila vicina.
- Utilizzando un ciglio, orientare con attenzione gli embrioni con lo scudo.
Nota: la posizione dello schermo può essere valutata mediante espressione GFP o anatomicamente.
- Trapianti System Set-up.
Nota: Il sistema di trapianto è composto da un porta-aghi (vedi elenco dei materiali) collegato con tubi in PTFE (vedi elenco dei materiali) e un connettore tubo (vedi elenco dei materiali) ad una siringa Hamilton dotato di un micro-drive (vedi elenco di materiali). Il porta-aghiè montato su un micromanipolatore 3 vie (vedi elenco dei materiali).- Usando un supporto ago collegato ad una siringa, lavare l'ago per il trapianto di cellule con il 70% di etanolo. Secco risucchiando aria nel ago. Non asciugare soffiando, in quanto ciò potrebbe causare la polvere conficcato nella parte rastremata dell'ago.
- Inserire l'ago nel supporto ago collegato alla siringa Hamilton, con lo smusso verso l'alto.
- Shield-to-shield trapianto di cellule
- Inserire lo scudo di un embrione donatore con l'ago trapianto e elaborare circa 10-20 cellule marcate con ABP140-mCherry. evitare accuratamente disegno tuorlo.
- Trapianto di cellule nel scudo dell'embrione host. Ripetere l'operazione fino a quando tutti gli embrioni di accoglienza sono state trapiantate.
- Rimuovere eventuali embrioni danneggiati con un incendio lucidato pipetta Pasteur. Mettere gli embrioni trapiantati in incubatore a 28 ° C e lasciarli recuperare per circa 30 min.
- Utilizzando un agotitolare attaccato ad una siringa, lavare l'ago trapianto di cellule con acqua e metterlo di nuovo in una capsula di Petri su una banda di plastilina. Sigillare il piatto con parafilm.
6. (Facoltativo) trapianto di cellule singolo
Nota: In dell'embrione, le cellule aderiscono l'uno all'altro, in modo che sia difficile disegnare una sola cella l'ago trapianto. Abbiamo sviluppato un protocollo modificato di trapiantare facilmente singole cellule progenitrici piatto precordale. L'idea è quella di dissociarsi cellule prima del trapianto. Perché isolate cellule progenitrici piastra precordale tendono a perdere la loro identità, abbiamo geneticamente imponiamo loro una prospettiva precordale timbro identità, attivando la via di segnalazione nodale, in assenza del fattore di trascrizione Sox32. Abbiamo verificato che queste cellule indotte comportano come endogeni precordale cellule progenitrici piatto 8. Di seguito sono riportati i passaggi specifici per eseguire trapianti di cellule singole. cellulare dissociazionezione si ottiene mettendo embrioni in Ringer senza calcio 11, sezionare un espianto e meccanicamente mescolando.
- Al passo 2.1, preparare il piatto trapianto con 1% agarosio in Ringer senza calcio, invece di embrioni Media.
- Al passo 3.1, oltre a ABP140-mCherry RNA e morfolino sin1, aggiungere 3 ng di RNA che codifica per la forma attiva del recettore nodale Taram-A (0,6 ng / ml finale) e 1,25 ml di morfolino contro sox32 (soluzione a 2 mM, quindi 0,5 mM finale).
- Dopo il punto 4, il trasferimento di tre embrioni di donatori selezionati nel piatto per il trapianto di cellule riempite con la penna / Strep Ringer priva di calcio utilizzando un incendio lucidato pipetta Pasteur. Con una pinzetta sottile, sezionare un espianto contenente le cellule iniettate (ABP140-mCherry cellule marcate). Rapidamente scartare il resto degli embrioni.
- Con un ciglio, mescolare delicatamente l'espianto fino cellule si dissociano.
- Elaborare una singola cella isolata nel ago trapiantie trapiantare in scudo di un embrione ospite.
- Usando una pipetta Pasteur incendio lucidato, di trasferire gli embrioni in un piatto agarosio rivestite pieno di Pen / Strep EM. Mettere gli embrioni in incubatore a 28 ° C per 30 min.
7. Embrione di montaggio
- Imaging Camera
- Metodo 1: utilizzare una camera di imaging composto da una slitta di plastica (75 * 25 * 0.5 mm) penetrante con 4 fori (diametro 5,5 mm), con 3 mm bordi alti su un lato (Figura 2C - D). Incollare un vetrino di vetro sul lato posteriore, con la colla cianoacrilato (super colla).
Nota: Al termine dell'esperimento, mettere la camera in acqua per una notte per rimuovere il vetrino e sbarazzarsi di residui di colla con carta vetrata. - Metodo 2: utilizzare 35 mm Mattek vetro piatti inferiori (vedi elenco dei materiali) con un foro di 10 mm.
- Metodo 1: utilizzare una camera di imaging composto da una slitta di plastica (75 * 25 * 0.5 mm) penetrante con 4 fori (diametro 5,5 mm), con 3 mm bordi alti su un lato (Figura 2C - D). Incollare un vetrino di vetro sul lato posteriore, con la colla cianoacrilato (super colla).
- embrione di montaggio
- Riempire una fiala di vetro con 1 ml di caldo 0,2% agarosio a medio embrione.Tenerlo a 42 ° C in un calore-blocco.
- Sotto lo stereomicroscopio a fluorescenza, selezionare un embrione in cui le cellule trapiantate rossi sono parte della piastra precordale prospettico etichettati in verde (cioè le cellule trapiantate rossi sono all'interno della piastra precordale prospettiva verde, e hanno iniziato la migrazione verso il polo animale).
- Trasferire un embrione selezionato nella soluzione di agarosio con un incendio lucidato pipetta Pasteur. Eliminare l'eccesso di medio dell'embrione dalla pipetta. Disegnare l'embrione nella pipetta con agarosio, e trasferire l'embrione in camera di imaging, depositando una goccia di agarosio. Prima di agarosio è impostato, orientare l'embrione con un ciglio. Posizionare la piastra precordale prospettica verso l'alto per l'imaging con un microscopio verticale, o sul fondo di vetro per l'imaging con un microscopio invertito. Attendere l'agarosio è impostato (circa 1 min, a seconda della temperatura ambiente) prima di montare un embrione nel pozzo successivo della camera.
Nota: un cha immaginimber contenente 4 pozzi consente il montaggio fino a 4 embrioni. - Quando l'agarosio è impostato, riempire la camera con la penna / Strep EM per evitare l'essiccamento.
8. immagini dal vivo
- Utilizzare un obiettivo a lungo raggio 40X acqua-immersion. Utilizzare appositi set di filtri di immagine GFP e mCherry (per GFP: eccitazione BP 470/40, divisore di fascio FT 510, e l'emissione BP 540/50; per mCherry: eccitazione BP 578/21, divisore di fascio FT 596, e LP emissione di 641 / 75). Regolare la durata dell'esposizione al fine di ottimizzare la dinamica di immagini.
- Per immagine tutte le cellule nella piastra, acquisire z-stack, partendo pochi micron sopra la piastra precordale prospettica (in ectoderma) e termina pochi micron sotto la piastra precordale prospettica (nel tuorlo). Utilizzare un z-passo di 2 micron. Per ottimizzare la velocità di acquisizione, cambiare i colori tra Z-stack piuttosto che tra i fotogrammi.
Nota: Ciò può portare a delle differenze fra le immagini verde e rosso, ma non è un problema poiché non precisa coÈ necessario -localization tra i segnali verde e rosso. Per ridurre ulteriormente i tempi di imaging e l'esposizione alla luce, verde può essere acquisita solo una volta ogni 5 punti di tempo, il che è sufficiente per identificare le cellule progenitrici piatto precordale. - Utilizzando tali impostazioni, immagine fino a 4 embrioni nell'intervallo due minuti di tempo che è necessario analizzare la frequenza protrusione e orientamento. Per l'analisi del ciclo di vita protrusione, ridurre l'intervallo di tempo di 30 sec per ottenere la risoluzione temporale superiore. Immagine dal 60% al 80% epiboly epiboly.
9. Dynamics cella di analisi
- Caricare le immagini 4D in ImageJ
Nota: A seconda del software utilizzato per l'acquisizione, le immagini vengono memorizzate in diversi formati (un file per immagine, un file per z-stack, un file per l'intero esperimento). Alcuni plugin di ImageJ sono disponibili online per aprire pile 4D. I nostri dati vengono memorizzati come un file per z-stack. Poiché il set di dati può essere grande, può essere conveniente aprire solo una parte di essa (alcuni time punti, o una sottoparte di z-stack, o 8 bit convertiti immagini ...). Usiamo un plugin ImageJ su misura per farlo, che saremo lieti di distribuire su richiesta. - Analisi della Orientamento e frequenza di sporgenze cellulari
- Usare le immagini GFP per determinare la direzione principale della migrazione potenziale piatto precordale. Prendere come riferimento per misure di angolo di protrusioni cellulari. Ruotare la pila, in modo che tale direzione di riferimento è parallela ad un lato dell'immagine.
- Seguire una cella. Seleziona strumento angolazione. Per ogni fotogramma e ciascuna protrusione, utilizzare lo strumento angolazione per misurare l'angolo tra la sporgenza e la direzione di riferimento (Figura 3A). Utilizzare il comando Analizza / Misura per memorizzare il valore (o premere M sulla tastiera). Salvare i risultati come file txt. Ripetere con la cella successiva.
- Importare i dati in distribuzione R e l'angolo di trama come istogrammi. Utilizzare il test di Kolmogorov-Smirnov (ks.test in R) per confrontare diverse condizioni.
Nota: lo strumento angolazione fornisce valori compresi tra 0 ° e 180 °, consentendo l'uso di test statistici classici e test non circolari. - Con questo insieme di dati, il calcolo della frequenza di emissione come il numero di sporgenze per cella per minuto. Utilizzare Student t-test (t.test in R) per confrontare diverse condizioni.
- Analisi della cella sporgenze a vita
- Per ogni cellula e ogni sporgenza, misura la durata protrusione (numero di fotogrammi in cui la sporgenza è presente x intervallo di tempo tra i fotogrammi).
- Importare i dati in R. Usa Student t-test (t.test in R) per confrontare diverse condizioni.
Nota: Altre caratteristiche di migrazione può essere interessante analizzare al fine di caratterizzare la migrazione delle cellule. Questi includono tracce di cellule, per la velocità, la direzione e le misure di persistenza, o morfologia cellulare. Alcune applicazioni software commerciali sono a disposizione per misurare queste caratteristiche, ma un gran numero di software appli open-sourcecationi e plugin di ImageJ sono inoltre disponibili, come per esempio ADAPT per analizzare morfodinamica 12, Diper a guardare traiettorie delle cellule e la persistenza direzionale 13, CellTrack per tracciare i bordi delle celle durante la migrazione 14.
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Representative Results
La tecnica presentata è stata utilizzata per analizzare il ruolo di sin1, uno dei componenti principali del Tor complesso 2 (TORC2), nel controllo nella migrazione delle cellule in vivo. L'uso di trapianto di cellule permette l'etichettatura di cellule isolate e l'analisi degli effetti delle cellule-autonomo. Film S1 mostra la migrazione delle cellule progenitrici piastra precordale trapiantati. etichettatura actina con ABP140 permette la facile visualizzazione di sporgenze citoplasmatici ricchi di actina. Abbiamo misurato la loro frequenza e l'orientamento. Cellule wild-type producono frequenti grandi sporgenze citoplasmatici orientati in direzione del polo animale, ossia nella direzione di migrazione (Figura 3B). La perdita della funzione di sin1 porta ad una drastica riduzione del numero di sporgenze e randomizzazione dei rimanenti, dimostrando l'importanza di sin1 nel controllare formazione protrusione ricco-actina. È interessante notare che questo fenotipo può essere salvato tramite eXpression di una forma costitutivamente attiva di Rac1 15, suggerendo fortemente che TORC2 controlla la dinamica di actina e la formazione protrusione cellulare attraverso Rac1 (Figura 3B).
La tecnica presentata stato anche usato per caratterizzare il ruolo di Arpin, un inibitore recentemente identificato del complesso Arp2 / 3, sulla dinamica cellulare 4. La perdita della funzione Arpin porta ad un aumento della frequenza protrusione (tasso medio di cellule che ospitano una sporgenza in un dato momento). Questo potrebbe essere dovuto sia alla formazione protrusione più frequenti o un aumento della stabilità protrusione. Misurare vita protrusione rivelato che, in assenza di Arpin, protrusione persistenza temporale è raddoppiato (Figura 3C). Questo è coerente con il ruolo di Arpin come Arp2 / 3 inibitore, che faciliterebbe protrusione retrazione, e suggerisce che Arpin colpisce frequenza protrusione modulando stabilità protrusione, piuttosto cheprotrusione iniziazione.
Figura 1:. Schema della Procedura Tg (GSC: GFP) gli embrioni vengono iniettati nella fase 4 celle (1 ora dopo la fecondazione). Dopo 5 ore a 28 ° C, gli embrioni che mostra ABP140-mCherry cellule positive all'interno dello scudo (GFP +) sono selezionate come embrioni di donatori. cellule Shield sono redatti entro l'ago trapianto e trasferiti nel scudo di un embrione ospite. Dopo 0,5 ore di recupero, embrioni di accoglienza sono montati e ripreso con un microscopio epifluorescente (obiettivo 40X). HPF:. ore dopo la fecondazione prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Transplantatiil Piatto e Imaging Camera. (A) Piatto trapianto con singoli pozzi. (B) Stampo per piatto trapianto di cellule. Camera di imaging (C) fatti in casa. (D) Schema di camera di imaging fatta in casa. Scala grafica = 1 cm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. I risultati di cellulare Dynamics Analysis (A) Schema di misurazione dell'angolo di protrusione. (B) Analisi dell'orientamento protrusione cellule e frequenza. In assenza di sin1 (Mo-sin1), cellule emettono meno sporgenze e le sporgenze rimanenti sono orientate in modo casuale. Questo fenotipo può essere salvato da espressione di una forma costitutivamente attiva della GTPasi Rac1 (Mo-Sin1 + CA-Rac1). Modificato da Dumortier e David 2015 5. (C) Analisi del ciclo di vita protrusione. In assenza di Arpin (Mo-Arpin), la frequenza protrusione è aumentata. Ciò è dovuto ad un aumento della vita protrusione. Reintrodurre un RNA Arpin insensibile al morfolino ripristina questo fenotipo iper protrusiva. Modificato da Dang et al., 2013 4. Barra di scala = 10 micron. A: anteriore; P: posteriore, L: Sinistra, R: Sì. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Film 1: controlli sin1 formazione di protrusioni cellulari, attraverso Rac1 (Tasto destro del mouse per scaricare). Cellule progenitrici piastra precordale trapiantati, iniettati conABP140-mCherrry RNA e un morfolino controllo o il morfolino sin1, o il morfolino sin1 e RNA per la forma costitutiva di Rac1. frequenza e orientamento protrusione sono stati misurati su tali immagini.
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Discussion
Questo protocollo presenta un modo semplice per studiare il ruolo di un gene candidato nella migrazione delle cellule in vivo, unendo la creazione di embrioni chimerici con il trapianto di cellule con l'imaging dal vivo.
Creazione di embrioni a mosaico
Studiando le dinamiche di una cellula richiede la visualizzazione del suo contorno di analizzare estensioni citoplasmatiche. Ciò può essere ottenuto marcando le cellule isolate in un altrimenti non marcato - o diverso etichettato - ambiente, offrendo così un buon contrasto visivo.
Un modo semplice per etichettare stocasticamente una porzione di cellule nell'embrione è quello di iniettare DNA plasmidico nella fase 1-cella 16. I plasmidi iniettato formano aggregati che vengono casualmente e disuguale segregati in cellule durante la divisione cellulare. Ciò conduce all'espressione del plasmide in un sottoinsieme casuale di cellule, e rappresenta quindi un metodo molto veloce, facile e non invasivo per la generazione moembrioni SAIC. Tuttavia, le cellule che esprimono il plasmide iniettati tendono a formare gruppi, e la probabilità di trovare embrioni contenenti poche cellule isolate che esprimono nella piastra precordale prospettiva è piuttosto basso. Inoltre, l'uso di DNA plasmidico offre un controllo molto limitato del livello di espressione del costrutto iniettato. La creazione di embrioni chimerici di trapianto di cellule, anche se tecnicamente più difficile che l'iniezione del DNA plasmidico, offre una serie di vantaggi: controllo del numero di cellule trapiantate, il controllo del livello di espressione dei costrutti (iniezione RNA), e non ultimo , trapianti cellulari permettono di verificare gli effetti delle cellule-autonoma, con la creazione di embrioni a mosaico in cui trapiantate cellule contengono la perdita o il guadagno di costrutti di funzione. Al contrario, trapianti possono anche essere utilizzati per valutare il ruolo non autonomo dell'ambiente trapiantando cellule wild-type in embrioni che sono stati modificati. Questo può essere di particolare interesse per le proveper esempio, la funzione dei componenti della matrice extracellulare che sono particolarmente rilevanti per l'analisi migrazione cellulare.
Un protocollo dettagliato per il trapianto di cellule è già stata descritta 10. Rispetto a questo protocollo, vorremmo discutere due differenze principali nel nostro procedimento.
La prima differenza è relativa alla fase di iniezione embrioni donatori. Secondo la nostra esperienza, embrioni iniettati nella fase 1-cella con RNA di una proteina fluorescente non esprimono omogeneamente la proteina fluorescente in tutte le cellule, a causa di una diffusione incompleta degli RNA nella cellula. Iniezione di embrioni donatori nella fase 4 celle in una delle quattro celle permette di ottenere un clone omogenea di cellule, che è di particolare interesse quando RNAs della proteina fluorescente sono co-iniettata con altri RNA che non sono rintracciabili.
La seconda differenza principale è l'uso dell'aria posto dell'olio nel transplantatione siringa. L'inconveniente principale di un sistema di aria piena è l'inerzia risultante dalla elasticità dell'aria. Olio al contrario, essendo incomprimibile, offre un buon controllo della aspirazione e pressione. Tuttavia, con un po 'di formazione, e mantenendo l'interfaccia tra aria e medio embrione in, parte sottile rastremata dell'ago, il controllo della pressione di aspirazione e di un sistema di aria inserita è sufficiente per il trapianto di cellule nella fase scudo. Per fasi successive, come cellule diventano più piccole e più coesa, l'aspirazione richiede una alta pressione che deve essere controllata in modo molto preciso, che non può essere ottenuto con una configurazione piena d'aria. Utilizzando aria invece di olio facilita l'installazione, come riempire l'impianto con l'olio senza alcuna bolla d'aria è difficile. Inoltre, evita riempire l'ago trapianto con olio. In questo modo gli aghi di trapianto per essere riutilizzati, e quindi di essere preparati con cura. Riteniamo che un ago senza spigoli vivi e del diametro corretto è la chiave per succeIl trapianto ssful. Questo passaggio trapianto è chiaramente una delle fasi critiche nel protocollo, che richiede la pratica prima di essere facilmente eseguito.
Abbiamo anche proposto una procedura specifica per il trapianto di cellule singole, che consiste nel dissociare le cellule prima del trapianto, al fine di disegnare una cella unica nel ago trapianto. Ciò implica che la dissociazione delle cellule transitoria non modificherà la propria identità e / o del comportamento. Per le cellule progenitrici piatto precordale, siamo geneticamente imponiamo l'identità delle cellule, e sono state accuratamente controllate che queste cellule si comportano come quelli non dissociati. Tuttavia, non possiamo escludere formalmente che la dissociazione e / o induzione genetica indurre modificazioni inosservati nelle cellule. Trapianto di cellule singole senza dissociare è fattibile. Le cellule devono essere redatti con attenzione l'ago trapianto. Tuttavia, almeno nelle nostre mani, percentuale di successo è piuttosto basso, sia perché più di una cella riceve in needle, o perché le cesoie cellulari quando redatto e muore nel ago o una volta trapiantate.
Epifluorescenza contro veloce confocale
L'uso di trapianto di cellule per creare embrioni mosaico consente per l'etichettatura di cellule isolate, separate dalle altre cellule marcate. In questo contesto, una buona immagine di morfologia cellulare e dinamiche può essere realizzato con epifluorescenza standard come proposto nel protocollo. Questo ha l'indubbio vantaggio di essere un'apparecchiatura relativamente diffusa e un basso costo alternativa ai più costosi sistemi di imaging confocale.
Per una precisa localizzazione subcellulare, confocale può essere utilizzato per migliorare la risoluzione, in particolare la risoluzione assiale. Per ancora ottenere risoluzione temporale sufficiente, l'imaging veloce confocale dovrebbe essere usato. Dalla nostra esperienza, microscopi filatura a disco offrono un buon compromesso tra la risoluzione, la velocità e la foto-tossicità. Scansione rapida mic confocaleroscopes (come microscopi a scansione di risonanza) sono buone opzioni pure, ma meno frequenti e più costoso.
etichettatura citoscheletro
Buona etichettatura dei filamenti di actina e la loro dinamica è fondamentale per studiare i meccanismi di migrazione delle cellule actina-based. Sebbene marcatori fluorescenti di membrana sono più efficienti per analizzare i contorni cellulari, etichettatura actina permette una migliore visualizzazione delle protrusioni cellulari. In particolare, se tre cellule marcate vengono a contatto, è molto difficile identificare un'estensione citoplasmatica situato tra due celle adiacenti come il profilo di sviluppo e la membrana delle cellule vicine possono mescolarsi. Etichettatura filamenti di actina permette la rilevazione inequivocabile di sporgenze cellulari actina-based, su cui ci siamo concentrati. Se morfologia cellulare doveva essere quantificato, un'etichettatura membrana sarebbe preferibile. Un'altra opzione è quella di utilizzare sia l'etichettatura, sia utilizzando l'imaging a 3 colori (uno per il Li transgenicone, uno per actina e uno per membrane), o GFP etichettatura membrana. In linea transgenica, GFP è citoplasmatica, e cellule positive goosecoid-GFP può quindi essere identificata, anche se la membrana è GFP etichettati.
Negli ultimi anni, una serie di sonde sono stati utilizzati per etichettare actina in campioni vivi. I primi erano fusioni scalo a monomeri di actina. Questi hanno presentato due grossi inconvenienti. In primo luogo, etichettate tutte actina e actina non specificamente polimerizzato. In secondo luogo, erano spesso tossici. Le sonde attualmente in uso sono filamentose di actina domini di legame fuse ai giornalisti fluorescenti. In questo protocollo, abbiamo usato ABP140 17 (actina dominio di legame del legame actina lievito proteina 140), che è attualmente il marcatore più utilizzato per actina filamentosa, ed etichette tutte actina filamentosa. Utrophin 18 (dominio di omologia calponin) Etichette anche actina filamentosa, ma sembra etichettare filamenti solo stabili. Questa differenza è stato utilizzato per idenduare filamenti di actina dinamiche, come quelle etichettate con ABP140 e non Utrophin 19.
Recentemente è stato riportato in mosca che ABP140 e Utrophin potrebbero avere effetti tossici, in particolare più di lunga espressione 20. Anche se non abbiamo notato alcun difetto di migrazione di cellule ABP140-etichettati, non possiamo escludere che l'espressione ABP140 può perturbare dinamiche di actina endogene. Una terza sonda per l'actina filamentosa è stato recentemente riportato 21. F-tractin (dominio actina-vincolante da ratto inositolo trifosfato 3-chinasi) è stato descritto come un giornalista fedele di actina filamentosa, che non avrebbe mostrato effetti tossici 20,22. A nostra conoscenza, l'uso di F-tractin non è stato riportato in zebrafish ancora.
Oltre a actina, molti altri costituenti cellulari potrebbero essere etichettati per migliorare la nostra comprensione della migrazione delle cellule. Questo include altri componenti del citoscheletro come miosina, microtubuli, centrosomes, nonché knpropri regolatori di migrazione cellulare (forme attivate della piccola GTPasi Rho, Rac e Cdc42, sonde fluorescenti per PIP3 ...) o proteine coinvolte nella adesione cellulare (integrine, caderine ...).
Nel complesso, questo protocollo raggruppa una serie di strumenti e tecniche precedentemente descritte di proporre un sistema semplice e rapido per verificare il coinvolgimento di un gene candidato nel controllo della migrazione delle cellule in vivo. Abbiamo usato la migrazione prospettico piatto precordale in quanto è un interessante modello di migrazione collettiva diretto, ed a causa della linea di etichettatura transgenica disponibile esso. Tuttavia, un protocollo simile potrebbe essere adattato per analizzare altri eventi di migrazione che si verificano durante lo sviluppo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
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