Introduction
I flercelliga organismer, är cellmigration viktigt både för utvecklingen av embryot där det garanterar att organisera celler i vävnader och organ, och för vuxenlivet, där det tar del vävnadshomeostas (sårläkning) och immunitet. Förutom dessa fysiologiska funktioner, är cellmigration också involverad i olika patologiska situationer, inklusive i synnerhet cancermetastaser.
Cellmigration har analyserats in vitro i årtionden, vilket ger en övergripande förståelse för de molekylära mekanismer som säkerställer cellrörelser på plana ytor. In vivo dock celler inför en mer komplex miljö. Det framgick tydligt under de senaste åren att migration inom en organism kan påverkas av yttre signaler såsom den extracellulära matrisen, angränsande celler eller utsöndrade kemokiner vägledande migration, och att de mekanismer som driver cellmigration kan variera från vad som har beskrivits <em> In vitro 1,2. Mekanismerna som säkerställer in vivo cell migration har fått mindre uppmärksamhet hittills, främst på grund av den ökade tekniska svårigheter, jämfört med in vitro-studier. In vivo analys av cellmigration i synnerhet kräver direkt optisk access till migrerande celler, tekniker för att märka unika celler i för att se deras dynamik och morfologi samt vinst eller förlust av funktion metoder för att testa rollen av kandidatgener. Hittills har endast ett fåtal modellsystem som härbärgerar dessa egenskaper använts för att dissekera in vivo cell migration 3.
Vi använde nyligen migreringen av den blivande prechordal plattan i början av zebrafisk embryon som en ny bekväm modell för att bedöma funktionen av kandidatgener för att kontrollera in vivo cell migration 4,5. Prospektiv prechordal platta (även känd som främre mesendoderm) är en grupp av celler som bildar vid uppkomsten av gastrulation på den dorsala sidan av embryot. Under gastrulation denna grupp migrerar kollektivt mot djuret pol av embryot 6-8, för att bilda den prechordal platta, en mesendodermal förtjockning, anterior till notokorden, och ligger till grund för neurala plattan. Den främre delen av prechordal plattan kommer att ge upphov till kläckning körtel, medan dess bakre del bidrar sannolikt att leda mesoderm 9. Tack vare den externa utvecklingen och optisk klarhet av fisken embryot, kan cellmigration direkt och lätt observeras i denna struktur.
Celltransplantation är en mycket potent teknik som gör det möjligt att snabbt och enkelt skapa mosaik embryon 10. Att uttrycka fluorescerande cytoskelettala markörer i transplanterade celler resulterar i märkning av isolerade celler, morfologi och dynamik som lätt kan observeras. Kombinera detta till förlust eller vinst av funktion närmar tillåter analys av cellautonoma funktioner i en burkkandidaten genen.
De presenterade protokoll beskriver hur vi bedömt funktion TORC2 komponent Sin1 i att kontrollera cellmigration och aktin dynamik in vivo 5. Men, som nämnts i resultaten och ytterligare diskuteras, det skulle kunna användas för att analysera de möjliga konsekvenserna av varje kandidatgen i att kontrollera cellmigration in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Figur 1 visar konturerna av protokollet.
1. Framställning av nålar för injektion och transplantation
Notera: Nålar kan framställas när som helst och lagras. Förvara dem i en petriskål, på ett band av modellera. Täta skålen med parafilm för att skydda mot damm.
- För injektionsnålar, dra en glaskapillär (ytterdiameter 1,0 mm, innerdiameter 0,58 mm, utan filament (se lista över Materials)) med en mikropipett avdragare (se listan över material). Föredrar korta och tunna nålar (avsmalnande del om ca 5 mm) eftersom de är mer effektiva för genomträngning av chorion.
Obs! Injektionsnålar är för engångsbruk. - Nål för celltransplantation
- Dra en glaskapillär (ytterdiameter 1,0 mm, innerdiameter 0,78 mm, utan filament (se listan över material)) med en mikropipett avdragare.
- Usjunga en microforge (se lista över material), skär nålspetsen vid den punkt där innerdiametern är 35 pm (något mer än diametern av celler som skall transplanteras).
- Avfasning den skurna änden av kapillären med en microgrinder (se lista över material) med en vinkel av 45 °.
- Eventuellt dra en hulling i änden av nålen med hjälp av en microforge. För detta trycker den varma glödtråden med spetsen på den koniska drev och snabbt dra bort det, vilket skapar en hulling som kan hjälpa att tränga in i embryot.
- Montera nålen på en nålhållare ansluten till en spruta. Med hjälp av sprutan, skölj insidan av nålen tre gånger med 2% fluorvätesyra för att eliminera glasrester, och skölj sedan tre gånger med aceton.
Varning: fluorvätesyra är giftig, manipulera under huven, med handskar.
Notera: De celltransplantations nålar kan användas flera gånger.
2. Beredning avRätter för injektion och celltransplantation
- Heat 50 ml embryo medel 11 innehållande 0,5 g av agaros i en mikrovågsugn under 1 minut vid full effekt för att få 1% agaros i embryo medium. Kyla agarosgelen till ca 60 ° C och häll 50 ml i en 90 mm petriskål. Placera vid ytan av gelén en speciellt utformad gjutform (se lista av material), antingen med linjer för insprutningsskålen eller med brunnar för celltransplantation skålen.
- Observera formen flyter på agaros, om agarosen inte är för varmt. Efter agarosgelen är inställd, ta bort mögel med pincett (Figur 2A - B).
Obs: rätter kan förvaras vid 4 ° C, upp till ett par veckor. Förvara dem i en sluten våt låda, för att undvika uttorkning.
- Observera formen flyter på agaros, om agarosen inte är för varmt. Efter agarosgelen är inställd, ta bort mögel med pincett (Figur 2A - B).
- Placera skålen i en 28 ° C inkubator 30 minuter före användning.
3. Insamling av embryon och Injection
- Injektion Lösning Beredning
Notera: Actin bindande domänenav jäst aktin-bindande protein 140 (ABP-140), såsom Lifeact bundet till mCherry (kallad ABP140-mCherry) används för att visualisera polymeriserad aktin i cellen, för att analysera UTSTÅENDE aktivitet. Lägg en annan förening att testa funktionen av en kandidatgen (t.ex. mRNA dominerande negativa eller konstitutivt aktiv konstruktion, eller morfolino oligonukleotider). För att bedöma funktioner Sin1 som beskrivs i resultaten (Figur 3), som används vi morfolino oligonukleotider. Som kontroll använde vi en morfolino- identisk med sin1 morfolino men för 5 nukleotider fördelade utmed sekvensen så att denna kontroll morfolino inte matchar mål-RNA.- Tina sin1 och 5-mismatch styr morpholinos (2 mM stamlösningar), och ABP140-mCherry mRNA på is. Lägg 375 ng mRNA (75 ng / l slutlig) och 0,75 pl antingen sin1 eller 5-mismatch kontroll morpholino (0,3 mM slutlig) i Danieau buffert (58 mM NaCl, 0,7 mMKCI, 0,4 mM MgSO 4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5,0 mM HEPES pH 7,6), för att nå en total volym av 5 pl.
- embryosamlings
Obs: för detta experimentella inrättat både givar- och värd embryon är transgena, uttrycker GFP under kontroll av gsc (GSC) promotor för att visualisera den blivande prechordal plattan 11.- Samla Tg (GSC: gfp) ägg. Placera ca 80 ägg i en 90 mm petriskål fylld med embryo medium och inkubera vid 28 ° C.
- Injicera givare embryon
- Under en stereomikroskop, försiktigt pressa insamlade embryon med pincett i linje med en injektion skål fylld med embryo medium. Använd pincett, orientera embryon med cellerna mot toppen. Placera injektions skålen i inkubator vid 28 ° C tills embryona har nått 4-cellstadiet (1 h efter befruktning).
- Fyll en injektionsnål med 2 plinjektionslösning. Stick in nålen i en nålhållare (se lista över material) som är placerad i en mikro manipulator (se lista över material) och i samband med polytetrafluoretylen (PTFE) slang (se lista över material) till en luft transjector (se lista över material ).
- Öppna kapillären genom att försiktigt röra spetsen med fin pincett. Om det behövs, skär den kapillära öppet genom att nypa sin ände.
- Ange en av de fyra cellerna med nålen och injicera lösningen i cellen för att fylla 70% av cellvolymen (2 nl). Injicera 30 embryon.
Notera: Att få nålen i cellen kan vara svårt, eftersom plasmamembranet är mjuk. Syftar till att förbindelsen mellan cellen och äggulan underlättar nålpenetration. - Placera embryona i 28 ° C inkubator tills de har nått sfären steget (4 timmar efter befruktning).
4. Beredning av embryon för Cell TransplantatJon
- Bered 20 ml av embryo medium med 200 pl penicillin / streptomycin (se lista över material) (Pen / Strep EM).
- Dechorionation av embryona på sfären steget (4 h efter befruktning)
Obs: Dechorionated embryon är mycket bräckliga och kommer att explodera vid kontakt med luft eller plast. De behöver därför att placeras i agaros belagda rätter, och överfördes med brand-polerat glas Pasteur pipetter.- Med hjälp av en plast Pasteur pipett värd embryon som samlats i steg 3,2 och givar embryon injiceras i steg 3,3 i två 35 mm petriskålar belagda med 1% agaros i embryo medium och fylld med Pen / Strep EM. Håll värd embryon och givar embryon i två separata rätter.
- extrahera manuellt embryon från sina chorions med fina pincett (se lista över material).
- Placera embryona i 28 ° C inkubator tills de har nått skölden stadiet (6 h efter befruktning).
5. Cell Transplantation
- Ordna embryon för celltransplantation.
- Enligt en fluorescerande stereo väljer givare embryon uttrycker ABP140-mCherry (röd) i skärmen (grön).
- Med hjälp av en brand-polerad pasteurpipett, överföra embryon i brunnarna i celltransplantation skål fylld med Pen / Strep EM. Placera värd embryon i en rad och de givare embryon i den närliggande raden.
- Med hjälp av en ögonfrans, noggrant orientera embryon med upp skölden.
Obs: kan bedömas positionen av skärmen genom GFP uttryck eller anatomiskt.
- Transplantation System Set-up.
Obs! Transplantationssystem består av en nålhållare (se lista över material) som är ansluten med PTFE slang (se listan över material) och ett rör kontakt (se lista över material) till en Hamilton spruta utrustad med en mikro-enhet (se lista Materials). Nålhållarenär monterad på en 3-vägs mikromanipulator (se listan över material).- Med hjälp av en nålhållare ansluten till en spruta, skölj nålen för celltransplantation med 70% etanol. Torr genom att suga upp luft in nålen. Torka inte genom att blåsa, eftersom det kan leda till damm fastnar i den avsmalnande delen av nålen.
- För in nålen i nålhållaren är ansluten till Hamilton sprutan med avfasning uppåt.
- Sköld-till-sköld Cell Transplantation
- Ange sköld en donator embryo med transplantation nålen och drag upp cirka 10-20 celler märkta med ABP140-mCherry. Noggrant undvika att dra äggula.
- Transplantera celler i sköld värden embryot. Upprepa tills alla värd embryon har transplanterats.
- Ta bort eventuella skadade embryon med en brand-polerad pasteurpipett. Placera de transplanterade embryon i inkubator vid 28 ° C och låt dem återhämta sig under ca 30 min.
- Med användning av en nålhållare monterad på en spruta, skölj celltransplantation nål med vatten och placera den tillbaka i en petriskål på ett band av modellera. Täta skålen med parafilm.
6. (Valfritt) Single celltransplantation
Obs: I embryot, cellerna häfta vid varandra, så att det är svårt att dra endast en cell i transplantations nålen. Vi utvecklade ett modifierat protokoll för att enkelt transplantera enskilda prechordal platta progenitorceller. Tanken är att dissociera cellerna före transplantation. Eftersom isolerade prechordal platta progenitorceller tenderar att förlora sin identitet, vi genetiskt införa dem en blivande prechordal platta identitet, genom att aktivera Nodal signalväg, i frånvaro av Sox32 transkriptionsfaktor. Vi har kontrollerat att dessa inducerade celler beter sig som endogena prechordal platta progenitorceller 8. Nedan är de specifika åtgärder för att utföra en enda cell transplantationer. cell dissocianingen uppnås genom att placera embryon i Calcium fritt Ringer 11, dissekera ett explantat och mekaniskt omrörning.
- Vid steg 2,1, förbereda transplantation skålen med 1% agaros i kalcium-fri Ringer stället för Embryo Medium.
- Vid steg 3,1, utöver ABP140-mCherry RNA och sin1 morfolino, tillsätt 3 ng av RNA som kodar för den aktiva formen av den Nodal receptorn Taram-A (0,6 ng / | j, l slutlig) och 1,25 pl av morfolino mot sox32 (stamlösning vid 2 mM, därav 0,5 mM slutlig).
- Efter steg 4, överföring tre utvalda givare embryon i skålen för celltransplantation fylld med Pen / Strep Kalcium-fri Ringer med hjälp av en brand-polerad pasteurpipett. Med fin pincett, dissekera ett explantat innehållande de injicerade cellerna (ABP140-mCherry märkta celler). Snabbt kassera resten av embryona.
- Med en ögonfrans, försiktigt rör Explantation tills cellerna avstånd.
- Upprätta en gemensam isolerad cell inom transplantations nåloch transplantera in den sköld en värd embryo.
- Med hjälp av en brand-polerad pasteurpipett, överföra embryon i en agaros-belagd skål fylld med Pen / Strep EM. Placera embryona i inkubator vid 28 ° C under 30 min.
7. Embryo Montering
- Imaging avdelningen
- Metod 1: Använd en avbildning kammare består av en plastglid (75 * 25 * 0,5 mm) genomborrade med 4 hål (5,5 mm diameter), med 3 mm höga kanter på ena sidan (Figur 2C - D). Limma ett täckglas på baksidan, med cyanoakrylatlim (superlim).
Obs: I slutet av experimentet, placera kammaren i vatten under en natt för avlägsnande av täckglas och bli av limrester med sandpapper. - Metod 2: Använd 35 mm MatTek glas botten rätter (se lista över material) med en 10 mm hål.
- Metod 1: Använd en avbildning kammare består av en plastglid (75 * 25 * 0,5 mm) genomborrade med 4 hål (5,5 mm diameter), med 3 mm höga kanter på ena sidan (Figur 2C - D). Limma ett täckglas på baksidan, med cyanoakrylatlim (superlim).
- embryo Montering
- Fyll upp en glasflaska med 1 ml varm 0,2% agaros i embryo medium.Håll det vid 42 ° C i ett värmeblock.
- Under den fluorescerande stereo väljer ett embryo där röda transplanterade celler är en del av den blivande prechordal plattan märkt i grönt (dvs röda transplanterade celler är inom det gröna blivande prechordal platta, och har börjat migrera mot djuret pol).
- Överför en vald embryo i agaroslösningen med en brand-polerad pasteurpipett. Kassera överskottet av embryo medium från pipetten. Rita embryot i pipetten med agaros, och överföra embryot i avbildning kammaren, deponerar en droppe agaros. Innan agaros är inställd orientera embryot med en ögonfrans. Placera den blivande prechordal plattan uppåt för avbildning med en upprätt mikroskop, eller på glaset botten för avbildning med ett inverterat mikroskop. Vänta tills agarosen är satt (ca 1 min, beroende på rumstemperaturen) innan montering annan embryo i nästa brunn i kammaren.
Obs: en avbildning chamber innehållande 4 brunnar tillåter montering upp till 4 embryon. - När agarosen är inställd, fylla kammaren med Pen / Strep EM för att undvika uttorkning.
8. Live Imaging
- Använd en 40X vatten nedsänkning långväga lins. Använd lämpliga filteruppsättningar till bilden GFP och mCherry (för GFP: excitation BP 470/40, stråldelare FT 510, och emissions BP 540/50, för mCherry: excitation BP 578/21, stråldelare FT 596, och emissions LP 641 / 75). Justera exponeringstid för att optimera bilddynamik.
- Till bilden alla celler i plattan, förvärva z-stackar, börjar några um ovanför den blivande prechordal plattan (i ektoderm) och slutar några pm under den blivande prechordal plattan (i gulan). Använder en z-steg på 2 | im. För att optimera förvärv hastighet, byta färger mellan z-stackar snarare än mellan ramar.
Obs: Detta kan leda till små skillnader mellan de gröna och röda bilder, men är inte ett problem eftersom ingen exakt co-localization mellan de gröna och röda signalerna krävs. För att minska ytterligare imaging tid och exponering för ljus, kan grönt förvärvas endast en gång var 5 tidpunkter, vilket är tillräckligt för att identifiera prechordal platta progenitorceller. - Med hjälp av sådana inställningar, bild upp till 4 embryon inom två minuters tidsintervall som är nödvändigt för att analysera utsprång frekvens och orientering. För analys av utsprång livstid, minska tidsintervallet till 30 sekunder för att få högre tidsupplösning. Bild från 60% epiboly till 80% epiboly.
9. Cell Dynamics Analys
- Ladda 4D bilder i ImageJ
Obs! Beroende på den programvara som används för förvärv, lagras bilderna i olika format (en fil per bild, en fil per z-stack, en fil för hela experimentet). Vissa ImageJ Plugins är tillgängliga online för att öppna 4D staplar. Våra data lagras som en fil per z-stack. Eftersom dataset kan vara stor, kan det vara lämpligt att öppna endast en del av den (några time punkter, eller en underavdelning av det z-stack, eller 8-bitars konverterade bilder ...). Vi använder en skräddarsydd ImageJ plugin för att göra det, som vi skulle vara glada att dela på begäran. - Analys av Orientering och frekvens av cellutskott
- Använd GFP bilder för att bestämma den huvudsakliga inriktningen av blivande prechordal platta migration. Ta detta som en referens för cellutskott vinkelmätningar. Rotera stapeln, så att denna referensriktning är parallell med en sida av bilden.
- Följ en cell. Välj vinkel verktyg. För varje ram och varje utsprång, använd vinkel verktyg för att mäta vinkeln mellan den utskjutande delen och referensriktningen (figur 3A). Använd kommandot Analysera / Mät att lagra värdet (eller tryck på M på tangentbordet). Spara resultatet som en txt-fil. Upprepa med nästa cell.
- Importera data till R och tomt vinkelfördelning som histogram. Använd Kolmogorov-Smirnov-test (ks.test i R) för att jämföra olika förhållanden.
Observera: Vinkel Verktyget ger värden som ligger mellan 0 ° och 180 °, som medger användning av klassiska statistiska tester och inte cirkulära tester. - Med denna uppsättning data, beräkna frekvens utsläppen enligt antalet utsprång per cell per minut. Använd Student T-test (t.test i R) för att jämföra olika förhållanden.
- Analys av cellutskott Lifetime
- För varje cell och varje utsprång, mäta utsprång varaktighet (antal ramar under vilka utsprång är närvarande x tidsintervallet mellan bildrutorna).
- Importera data till R. Använd Student T-test (t.test i R) för att jämföra olika förhållanden.
Obs: Andra migrationsfunktioner kan vara intressant att analysera för att karakterisera cellvandring. Dessa inkluderar cell spår, för hastighet, riktning och mätningar persistens eller cellmorfologin. Vissa kommersiella program finns tillgängliga för att mäta dessa egenskaper, men ett stort antal öppen källkod tillämpkatjoner och ImageJ plugins finns också, som till exempel Adapt att analysera morfodynamiska 12, till DiPer titta på cellbanor och riktnings uthållighet 13 CellTrack att spåra cellgränser under migreringen 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De presenterade teknik användes för att analysera vilken roll Sin1, en av de centrala delarna av Tor komplex 2 (TORC2), för att kontrollera in vivo cell migration. Användningen av celltransplantation tillåter märkning av isolerade celler och analys av cell autonoma effekter. Film S1 visar migreringen av transplanterade prechordal platt progenitorceller. Aktin märkning med ABP140 tillåter enkel visualisering av aktin-rika cytoplasmiska utsprång. Vi mätte deras frekvens och orientering. Vildtyp celler producerar ofta stora cytoplasmiska utsprång orienterade i riktning mot djuret pol, dvs i riktning mot migration (Figur 3B). Förlust av funktion av Sin1 leder till en drastisk minskning av antalet utsprång, och randomisering av de återstående, vilket visar betydelsen av sin1 i att kontrollera aktin-rika utsprånget bildning. Intressant nog kan denna fenotyp räddas av eXpression av en konstitutivt aktiv form av RAC1 15, vilket starkt antyder att TorC2 styr aktin dynamik och cell utsprånget bildning genom RAC1 (figur 3B).
Den presenterade tekniken användes också för att karakterisera den roll Arpin, en nyligen identifierad inhibitor av Arp2 / 3-komplexet, på celldynamik 4. Förlust av Arpin funktionen leder till en ökning av utsprång frekvens (genomsnittlig hastighet av celler som härbärgerar ett utsprång vid en given tidpunkt). Detta kan antingen bero på tätare utskjutande formation eller en ökning av utsprång stabilitet. Mätning utsprång livstid visade att i frånvaro av Arpin är utsprånget tids uthållighet fördubblats (Figur 3C). Detta ligger i linje med den roll Arpin som Arp2 / 3-hämmare, vilket skulle underlätta utsprång indragning, och föreslår att Arpin påverkar utsprånget frekvens genom att modulera utsprång stabilitet, snarare änutsprång inledande.
Figur 1:. Sammanfattning av ordningen Tg (GSC: gfp) embryon injiceras vid 4-cellstadiet (1 h efter befruktning). Efter 5 h vid 28 ° C, embryon som visar ABP140-mCherry positiva celler inom avskärmningen (GFP +) väljs som donator embryon. Sköld celler upprättas inom transplantations nålen och överföras till sköld en värd embryo. Efter 0,5 timmar av återhämtning, är embryon värd monteras och avbildas med en epifluorescent mikroskop (40X objektiv). HPF. timmar efter befruktningen Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Transplantatipå skålen och Imaging kammare. (A) Transplantation skålen med enskilda brunnar. (B) Mögel för celltransplantation skålen. (C) Hemgjorda avbildning kammare. (D) Schematisk bild av hemgjorda avbildning kammare. Skala bar = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Resultat från Cell Dynamics Analysis (A) Scheme of utskjutande vinkelmätning. (B) Analys av cell utskjutande orientering och frekvens. I avsaknad av Sin1 (Mo-Sin1), celler släpper ut mindre utsprång och de återstående utsprången är slumpmässigt orienterade. Denna fenotyp kan räddas genom uttryck av en konstitutivt aktiv form av GTPas RAC1 (Mo-Sin1 + CA-RAC1). Modifierad från Dumortier och David, 2015 5. (C) Analys av utsprånget livstid. I avsaknad av Arpin (Mo-Arpin), är utsprånget frekvensen ökar. Detta beror på en ökning av utsprång livstid. Återinföra en ARPIN RNA okänslig för morpholino åter detta hyper UTSTÅENDE fenotyp. Modifierad från Dang et al., 2013 4. Scale bar = 10 | im. A: Anterior; P: Bakre, L: Vänster R:. Höger Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: Sin1 kontroller bildandet av cellutskott, genom RAC1 (Högerklicka för att ladda ner). Transplanterade prechordal platta progenitorceller, injicerade medABP140-mCherrry RNA och en kontroll morfolino, eller sin1 morfolino, eller sin1 morfolino och RNA för den konstitutiva formen av RAC1. Utsprång frekvens och orientering mättes på dessa bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll utgör ett enkelt sätt att studera rollen av en kandidatgen i cell migration in vivo, genom att kombinera att skapa chimära embryon med hjälp av celltransplantation med levande avbildning.
Skapande av mosaik embryon
Studera dynamiken i en cell kräver visualisering av dess kontur att analysera cytoplasmiska förlängningar. Detta kan uppnås genom att märka isolerade celler i en annars omärkt - eller olika märkta - miljö, vilket ger god visuell kontrast.
Ett enkelt sätt att stokastiskt märka en del av celler i embryot är att injicera plasmid DNA vid ett-cellstadiet 16. De injicerade plasmider bilda aggregat som slumpmässigt och ojämnt avskiljs i celler under celldelningen. Detta leder till expression av plasmiden i en slumpmässig undergrupp av celler, och representerar således en mycket snabb, enkel och icke-invasiv metod för att generera moSAIC embryon. Celler som uttrycker de injicerade plasmiden tenderar att bilda kluster och sannolikheten att hitta embryon som innehåller enstaka uttryckande celler i den blivande prechordal plattan är ganska låg. Vidare användning av plasmid-DNA erbjuder mycket begränsad kontroll av expressionsnivån av den injicerade konstruktet. Skapandet av chimära embryon genom celltransplantation, även om tekniskt svårare än plasmid DNA-injektion, erbjuder flera fördelar: kontroll av antalet transplanterade celler, kontroll av expressionsnivån av konstruktionerna (RNA injektion), och sist men inte minst celltransplantationer låt testet för cellautonoma effekter genom att skapa mosaik embryon där transplanterade celler innehåller förlust eller vinst på funktions konstruktioner. Omvänt kan transplantationer också användas för att bedöma icke-självständiga roll för miljön genom att transplantera celler av vild typ i embryon som har ändrats. Detta kan vara av särskilt intresse för testningtill exempel funktionen av extracellulära matriskomponenter som är särskilt relevanta för cellmigration analys.
En detaljerat protokoll för celltransplantation har redan beskrivits 10. Jämfört med detta protokoll, vill vi diskutera två viktigaste skillnaderna i vårt förfarande.
Den första skillnaden är relaterad till det stadium av givare embryon injektion. Enligt vår erfarenhet, embryon injicerades vid 1-cellstadiet med RNA av ett fluorescerande protein uttrycker inte homogent det fluorescerande proteinet i alla celler, på grund av en ofullständig diffusion av RNA i cellen. Injektion av givare embryon vid 4-cellstadiet i en av de fyra cellerna gör det möjligt att få en homogen klon av celler, som är av särskilt intresse när RNA av det fluorescerande proteinet är sam-injicerades med andra RNA som inte är spårbara.
Den andra huvudsakliga skillnaden är användningen av luft i stället för olja i transplantation spruta. Den största nackdelen med en luftfylld systemet är den tröghet som följer av elasticiteten i luften. Olja tvärtom, är inkompressibelt, erbjuder god kontroll över sug och tryck. Men med lite träning, och genom att bibehålla gränssnittet mellan luft och embryo medium i den tunna, avsmalnande delen av nålen, är tillräcklig för att transplantera celler i sköldstadiet kontroll av sug- och tryck med en luftfylld systemet. För senare stadier, eftersom cellerna blir mindre och mer sammanhängande, kräver sugs ett högt tryck som måste mycket exakt kontrolleras, vilket inte kan uppnås med en luftfylld setup. Användning av luft i stället för olja underlättar installationen, som att fylla systemet med olja utan någon luftbubbla är knepigt. Vidare undviker det fyllning av transplantation nålen med olja. Detta gör det möjligt för transplantations nålar för att återanvändas, och därmed förberedas noga. Vi anser att en nål utan vassa kanter och rätt diameter är nyckeln till Succéssful transplantation. Denna transplantation steg är helt klart en av de kritiska stegen i protokollet, som kräver övning innan det lätt utföras.
Vi har också föreslagit ett särskilt förfarande för att transplantera enskilda celler, som består i att dissociera cellerna före transplantation, för att dra en unik cell inom transplantations nålen. Detta innebär att övergående cell dissociation inte kommer att ändra sin identitet och / eller beteende. För prechordal platta progenitorceller, vi genetiskt införa cellidentiteten, och har noga kontrollerat att dessa celler beter sig som icke-differentierade och kära. Vi kan dock inte formellt utesluta att dissociation och / eller genetisk induktion inducera obemärkt förändringar i cellerna. Transplantation enskilda celler utan att dissociera dem är möjlig. Celler bör utarbetas noggrant transplantation nålen. Emellertid, åtminstone i våra händer, är framgång ganska låg, antingen därför att mer än en cell kommer in i needle, eller på grund av cell sax när upprättats och dör i nålen eller en gång transplanterade.
Epifluorescence kontra snabb konfokal avbildning
Användningen av celltransplantation för att skapa mosaik embryon gör det möjligt för märkning av isolerade celler, skild från andra märkta celler. I detta sammanhang kan god avbildning av cellmorfologin och dynamik uppnås med standard epifluorescensmikroskopi, som föreslås i protokollet. Detta har den uppenbara fördelen av att vara en relativt utbredd utrustning och en låg kostnad alternativ till dyrare konfokalt avbildningssystem.
För exakta subcellulära lokaliseringar kan konfokal avbildning användas för att förbättra upplösning, i synnerhet axiell upplösning. För att ändå få tillräcklig tidsupplösning, bör snabb konfokal avbildning användas. Från vår erfarenhet, spinning skiv mikroskop ger en bra kompromiss mellan upplösning, hastighet och fototoxicitet. Snabb scanning konfokala microscopes (som resonansscannande mikroskop) är bra alternativ också, men mindre frekventa och dyrare.
cytoskelettet märkning
Bra märkning av aktinfilament och deras dynamik är avgörande för att studera mekanismerna för aktin baserade cellmigration. Även om membranbundna fluorescerande markörer är mer effektivt att analysera cell konturer tillåter aktin märkning en mycket bättre visualisering av cellutskott. I synnerhet om tre märkta celler komma i kontakt, är det mycket svårt att identifiera en cytoplasmisk förlängning ligger mellan två angränsande celler som konturen av förlängningen och membranet av de angränsande cellerna kan blandas ihop. Märkning aktinfilament möjliggör entydig detektion av aktin baserade cellutskott, där vi fokuserade. Om cellmorfologin skulle kvantifieras, skulle en membran märkning vara att föredra. Ett annat alternativ är att använda både märkning, antingen genom att använda 3-färgbilder (en för den transgena line, en för aktin och ett för membran), eller genom GFP märkning membranet. I den transgena linjen, är GFP cytoplasmatisk och gsc-GFP-positiva celler kan sålunda identifieras, även om membranet är GFP märkta.
Under de senaste åren har ett antal sönder använts för att märka aktin i levande prov. De första som var direkta fusioner till aktinmonomerer. Dessa presenteras två stora nackdelar. Först märkt alla aktin och inte specifikt polymeriserat aktin. För det andra, de var ofta toxiska. Sonderna för närvarande används är tråd aktin bindande domäner sammansmälta med fluorescerande reportrar. I detta protokoll använde vi ABP140 17 (aktin bindande domänen av jäst aktin bindande protein 140), som för närvarande är den mest använda markören för fintrådiga aktin och etiketter alla fintrådiga aktin. Utrofin 18 (calponin homologi domän) etiketter också fintrådiga aktin, men verkar märka endast stabila trådar. Denna skillnad har använts för att idenfiera dynamisk aktinfilament, som de märkt av ABP140 och inte utrofin 19.
Nyligen har det rapporterats i fluga som ABP140 och utrofin kan ha toxiska effekter, särskilt över långa uttryck 20. Även om vi inte har märkt några migrations defekter i ABP140-märkta celler, kan vi inte utesluta att ABP140 uttryck kan störa endogena aktin dynamik. En tredje sond för fintrådiga aktin rapporterades nyligen 21. F-tractin (aktin-bindande domän från råtta inositoltrifosfat 3-kinas) har beskrivits som en trogen reporter av fintrådiga aktin, som inte skulle visa toxiska effekter 20,22. Såvitt vi vet, har användningen av F-tractin inte rapporterats i zebrafisk ännu.
Förutom aktin, kan många andra cellbeståndsdelar märkas för att förbättra vår förståelse av cellmigration. Detta inkluderar övriga cytoskelettala komponenter som myosin, mikrotubuli, centrosom samt knegna regulatorer av cellmigration (aktiverade former av små GTPaser Rho, Rac och Cdc42, fluorescerande prober för PIP3 ...) eller proteiner involverade i cellvidhäftnings (integriner, kadheriner ...).
Sammantaget omgrupperar detta protokoll ett antal tidigare beskrivna verktyg och tekniker för att föreslå en snabb och enkelt system för att testa medverkan av en kandidatgen för att kontrollera cellmigration in vivo. Vi använde prospektiv prechordal plattan migration eftersom det är en intressant modell för riktad kollektiv migration, och på grund av det tillgängliga transgena linjen märkning det. Emellertid kan ett liknande protokoll anpassas för att analysera andra migrationshändelser som förekommer under utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
- Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), Cambridge, England 921-932 (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
- Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
- Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
- Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
- Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
- Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
