Introduction
In multicellulaire organismen, celmigratie van essentieel belang is voor de ontwikkeling van het embryo, waar het zorgt voor het complex van cellen in weefsels en organen, en volwassen leven, waar het deelneemt aan weefsel homeostase (bloedstolling) en immuniteit. Naast deze fysiologische functies, celmigratie is ook betrokken in verschillende pathologische situaties, waaronder met name kanker metastase.
Cel migratie is geanalyseerd in vitro voor tientallen jaren, het verstrekken van een globaal inzicht in de moleculaire mechanismen die zorgen cel bewegingen op een vlakke ondergrond. In vivo echter cellen worden geconfronteerd met een meer complexe omgeving. Er wordt duidelijk verscheen in de afgelopen jaren dat migratie in een organisme kan worden beïnvloed door externe stimuli zoals de extracellulaire matrix, buurcellen of uitgescheiden chemokinen geleiden migratie, en dat de mechanismen achter celmigratie kunnen per hetgeen beschreven <em> In vitro 1,2. De mechanismen die zorgen voor in vivo celmigratie hebben minder aandacht gekregen tot nu toe, vooral als gevolg van de toegenomen technische moeilijkheid, vergeleken met in vitro studies. In vivo analyse van celmigratie in het bijzonder directe optische toegang tot migrerende cellen vereist, technieken om unieke cellen in labelen teneinde de dynamiek en morfologie, alsmede winst of verlies van functie te zien zal de rol van kandidaatgenen testen. Tot dusver zijn slechts enkele modelsystemen harboring deze code gebruikt te ontleden in vivo celmigratie 3.
Onlangs hebben we gebruikten de migratie van de potentiële prechordale plaat vroege zebravisembryo's als een nieuw geschikt modelsysteem om de functie van kandidaatgenen beoordelen regelen in vivo celmigratie 4,5. Prospectieve prechordale plaat (ook bekend als anterior mesendoderm) is een groep cellen vormen bij het begin van Gastrulation aan de rugzijde van het embryo. Tijdens gastrulatie deze groep migreert gezamenlijk de richting van het dier pool van de embryo 6-8, aan de prechordale plaat, een mesendodermal verdikking, juist voor de notochord te vormen, en die ten grondslag liggen aan de neurale plaat. Het voorste deel van de plaat prechordale geven aanleiding tot de broedeieren klier geven, terwijl de achterste delen die bijdraagt aan mesoderm 9 head. Dankzij de buitenlandse ontwikkeling en optische helderheid van het vis embryo, kunnen celmigratie direct en gemakkelijk worden waargenomen in deze structuur.
Celtransplantatie is een zeer krachtige techniek die zorgt voor de snelle en gemakkelijke creatie mozaïek embryo 10. Het uiten van fluorescerende cytoskelet markers in getransplanteerde cellen resulteert in de etikettering van geïsoleerde cellen, de morfologie en de dynamiek van die gemakkelijk kan worden waargenomen. De combinatie van dit verlies of winst van de functie benadert toelaat de analyse van cel-autonome functies van een blikjedaat-gen.
De gepresenteerde protocol beschrijft hoe wij de functie van de component TORC2 sin1 geëvalueerd beheersen celmigratie actine dynamiek in vivo 5. Maar, zoals vermeld in de resultaten en verder besproken, kan worden gebruikt om de mogelijke betrokkenheid van elke kandidaatgen analyseren beheersen celmigratie in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Figuur 1 toont de omtrek van het protocol.
1. Voorbereiding van de naalden voor injectie en transplantatie
Opmerking: Naalden kunnen worden bereid op elk gewenst moment en opgeslagen. Houd ze in een petrischaal, op een band van boetseerklei. Sluit de schotel met parafilm om te beschermen tegen stof.
- Voor injectienaalden, trek een glazen capillaire (buitendiameter 1,0 mm, inwendige diameter 0,58 mm, zonder draad (zie lijst van Materials)) met een micropipet trekker (zie de lijst van materialen). Liever korte en dunne naalden (taps deel van ongeveer 5 mm) en zij efficiënter voor het doorboren van het chorion.
Opmerking: De injectienaalden voor eenmalig gebruik. - Naald voor Cell Transplantation
- Trek een glazen capillaire (buitendiameter 1,0 mm, inwendige diameter 0,78 mm, zonder draad (zie lijst van Materials)) met een micropipet trekker.
- Uzing een microforge (zie lijst van materialen), snijd de punt van de naald op het punt waar de binnendiameter is 35 urn (iets meer dan de diameter van de cellen te transplanteren).
- Bevel de cut uiteinde van de capillair met een microgrinder (zie de lijst van materialen) met een hoek van 45 °.
- Optioneel, trek een weerhaak aan het uiteinde van de naald met behulp van een microforge. Voor dit, raakt u de hete filament met de punt van de schuine en snel weg te trekken, het creëren van een weerhaak die kan helpen bij het penetreren van de embryo.
- Monteer de naald op een naaldhouder bevestigd aan een spuit. Gebruik van de spuit, spoel de binnenkant van de naald driemaal met 2% fluorwaterstofzuur aan glas residuen weg en spoel drie keer met aceton.
Let op: fluorwaterstofzuur is giftig, manipuleren onder de motorkap, met handschoenen.
Opmerking: De celtransplantatie naalden kan meerdere malen worden gebruikt.
2. Bereiding van deGerechten voor injectie en Cell Transplantation
- Verhit 50 ml embryo medium 11 bevattende 0,5 g agarose in een magnetron gedurende 1 min bij vol vermogen tot 1% agarose krijgen in embryo medium. Koel de agarosegel tot ongeveer 60 ° C en giet 50 ml in een 90 mm petrischaal. Plaats op het oppervlak van de gel een speciaal ontworpen matrijs (zie lijst materiaal), ofwel met lijnen voor de injectie schaal of putjes voor celtransplantatie schotel.
- Houd rekening met de schimmel drijven op de agarose, als de agarose niet te warm is. Nadat de agarosegel wordt ingesteld, verwijder de mal met een pincet (Figuur 2A - B).
Opmerking: schotels kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C, tot een paar weken. Houd ze in een gesloten natte doos, om te voorkomen dat ze uitdrogen.
- Houd rekening met de schimmel drijven op de agarose, als de agarose niet te warm is. Nadat de agarosegel wordt ingesteld, verwijder de mal met een pincet (Figuur 2A - B).
- Plaats de schotel in een 28 ° C incubator 30 min vóór gebruik.
3. Het verzamelen van embryo's en Injection
- Injection Solution Voorbereiding
Opmerking: actine-bindend domeinvan de gist actine bindend eiwit 140 (ABP-140), zoals Lifeact gebonden aan mCherry (hierna ABP140-mCherry) wordt gebruikt om gepolymeriseerd actine te visualiseren in de cel, zodat de stuwende werking te analyseren. Voeg een verbinding om de functie van een kandidaat-gen (bijvoorbeeld mRNA van dominant negatieve of constitutief actieve construct of morfolino oligonucleotiden) testen. De functies van sin1 beoordeelt beschreven in de resultaten (figuur 3), gebruikten we morfolino oligonucleotiden. Als controle gebruikten we een morfolino identiek aan de sin1 morfolino maar 5 nucleotiden verdeeld over de sequentie zodat dit besturingselement morfolino niet overeenkomt met het doel-RNA.- Dooi sin1 en 5-mismatch controle morpholinos (2 mM stock oplossingen), en ABP140-mCherry mRNA op ijs. Voeg 375 ng mRNA (75 ng / ul eind) en 0,75 gl ofwel sin1 of 5-mismatch control morfolino (0,3 mM eind) in Danieau buffer (58 mM NaCl, 0,7 mMKCl, 0,4 mM MgSO4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5,0 mM HEPES pH 7,6) tot een totaal volume van 5 pl te bereiken.
- embryo Collection
Let op: voor deze experimentele opstelling zowel donor en gastheer embryo's transgeen, de uiting van de GFP onder de controle van de Goosecoid (SGR) promotor om de aspirant-prechordale plaat 11 te visualiseren.- Verzamel Tg (GSC: GFP) eieren. Plaats ongeveer 80 eieren in een 90 mm petrischaal gevuld met embryo medium en incubeer bij 28 ° C.
- Injecteren Donor Embryo's
- Onder een stereomicroscoop, knijp verzamelde embryo met een pincet in de lijnen van een injectie schotel gevuld met embryo medium. Behulp van een tang, oriënteren de embryo met de cellen naar boven. Plaats de injectie schaal in de incubator bij 28 ° C totdat het embryo de 4-cellig stadium (1 uur na de bevruchting) bereikt.
- Plaats een injectienaald met 2 plinjectieoplossing. Steek de naald in een naaldhouder (zie de lijst van materialen), dat is geplaatst in een micro-manipulator (zie lijst van materialen) en verbonden met polytetrafluorethyleen (PTFE) buis (zie lijst van Materialen) naar een lucht Transjector (zie lijst van materialen ).
- Open het capillair door voorzichtig de tip met fijne tang aan te raken. Indien nodig, knip de capillaire geopend door knijpen zijn uiteinde.
- Voer een van de vier cellen met de naald en spuit de oplossing in de cel om 70% van het celvolume (2 nl) vullen. Injecteer 30 embryo.
Opmerking: Aan de naald in de cel kan moeilijk zijn, omdat de plasmamembraan zacht. Gericht op de kruising tussen de cel en de dooier vergemakkelijkt naald penetratie. - Plaats de embryo's in de 28 ° C incubator totdat ze de sfeer fase (4 uur na de bevruchting) hebben bereikt.
4. Voorbereiding van de embryo's voor de Cell Transplantation
- Bereid 20 ml van embryo medium met 200 ul penicilline / streptomycine (zie de lijst van materialen) (Pen / Strep EM).
- Dechorionation van de embryo's in de sfeer fase (4 uur na de bevruchting)
Opmerking: Dechorionated embryo's zijn erg kwetsbaar en zal exploderen in geval van contact met lucht of plastic. Ze moeten dus in-agarose gecoate gerechten te worden geplaatst, en overgebracht met vuur gepolijst glas Pasteur pipetten.- Met behulp van een plastic Pasteur pipet gastheer embryo's bij stap 3.2 en donor embryo geïnjecteerd bij stap 3.3 in twee 35 mm Petrischalen bekleed met 1% agarose in embryo medium en gevuld met Pen / Strep EM. Houd gastheer embryo's en donor embryo's in twee afzonderlijke schotels.
- Handmatig uit te pakken de embryo's uit hun chorions met fijne pincet (zie de lijst van materialen).
- Plaats de embryo's in de 28 ° C incubator totdat ze het schild podium (6 uur na de bevruchting) hebben bereikt.
5. Cell Transplantation
- Schik de embryo's voor de celtransplantatie.
- Onder een tl-stereomicroscoop, selecteert donor embryo's uitdrukken ABP140-mCherry (rood) binnen het schild (groen).
- Met behulp van een brand-gepolijste Pasteur pipet, overdracht van de embryo's in de putjes van de celtransplantatie schotel gevuld met Pen / Strep EM. Plaats de ontvangende embryo's in een rij en de donor embryo in de naburige rij.
- Met een wimpers voorzichtig oriënteren de embryo's met de afscherming omhoog.
Opmerking: de positie van de afscherming kan worden bepaald door GFP expressie of anatomisch.
- Transplantatie System Set-up.
Opmerking: De transplantatie systeem bestaat uit een naaldhouder (zie de lijst van materialen) die verband houden met PTFE-buis (zie de lijst van materialen) en een tube connector (zie de lijst van Materialen) om een Hamilton spuit uitgerust met een micro-drive (zie lijst of Materials). De naaldhouderis gemonteerd op een 3-way micromanipulator (zie lijst van Materials).- Met behulp van een naaldhouder bevestigd aan een spuit, spoel de naald voor celtransplantatie met 70% ethanol. Drogen door zuigen lucht in de naald. Droog geen door te blazen, omdat dit kan resulteren in stof vast komen te zitten in het taps toelopende deel van de naald.
- Steek de naald in de naaldhouder verbonden met de Hamilton spuit met de schuine naar boven.
- Shield-to-shield Cell Transplantation
- Voer het schild van een donor embryo met de transplantatie naald en stelt ongeveer 10-20 cellen gelabeld met ABP140-mCherry. vermijd zorgvuldig tekenen dooier.
- Transplant de cellen in het schild van de ontvangende embryo. Herhaal dit totdat alle gastheer embryo's zijn getransplanteerd.
- Verwijder eventuele beschadigde embryo's met een brand-gepolijste Pasteur pipet. Plaats de getransplanteerde embryo's in de incubator bij 28 ° C en laat ze herstellen gedurende ongeveer 30 minuten.
- Met behulp van een naaldhouder bevestigd aan een spuit, spoel de celtransplantatie naald met water en plaats het terug in een petrischaal op een band van boetseerklei. Sluit de schotel met parafilm.
6. (Optioneel) Single Cell Transplantation
Opmerking: In het embryo cellen hechten aan elkaar, zodat het moeilijk is om slechts één cel transplantatie naald trekken. We ontwikkelden een aangepaste protocol om gemakkelijk te transplanteren enkele prechordale plaat voorlopercellen. Het idee is om cellen te scheiden voorafgaand aan de transplantatie. Omdat geïsoleerde prechordale plaat stamcellen hebben de neiging om hun identiteit te verliezen, we genetisch opleggen daarvan een prospectieve prechordale plaat identiteit, door het activeren van de Nodal signaleringsroute, in afwezigheid van de Sox32 transcriptiefactor. We hebben vastgesteld dat deze geïnduceerde cellen zich gedragen als endogeen prechordale plaat voorlopercellen 8. Hieronder vindt u de specifieke stappen om enkele cel transplantaties uit te voeren. cel dissociatietie wordt bereikt door embryo in calcium-free Ringer 11, ontleden een explantaat en mechanisch roeren.
- Bij stap 2.1, de voorbereiding van de transplantatie schotel met 1% agarose in Calcium-vrij Ringer plaats van Embryo Medium.
- In stap 3,1, naast ABP140-mCherry RNA en sin1 morfolino, voeg 3 ng RNA dat codeert voor de actieve vorm van de Nodal receptor Taram-A (0,6 ng / pl def) en 1,25 gl morfolino tegen sox32 (voorraadoplossing bij 2 mM, vandaar 0,5 mM definitief).
- Na stap 4, de overdracht drie geselecteerde donor embryo's in de schotel voor celtransplantatie gevuld met Pen / Strep Calcium-vrije Ringer met behulp van een brand-gepolijste Pasteur pipet. Met fijne pincet, ontleden een explantaat met de geïnjecteerde cellen (ABP140-mCherry gelabelde cellen). Snel gooi de rest van de embryo's.
- Met een wimper, roer voorzichtig de explantatie tot cellen distantiëren.
- Het opstellen van een enkele geïsoleerde cel in de transplantatie naalden transplantatie het in het schild van een gastheer embryo.
- Met behulp van een brand-gepolijste Pasteur pipet de embryo's in een met agarose gecoate schaal gevuld met Pen / Strep EM. Plaats de embryo's in de incubator bij 28 ° C gedurende 30 minuten.
7. Embryo Montage
- Imaging Chamber
- Methode 1: gebruik een imaging kamer bestaat uit een plastic dia (75 * 25 * 0,5 mm) doorboord met 4 gaten (5,5 mm diameter), met 3 mm hoge randen aan de ene kant (figuur 2C - D). Lijm een glazen dekglaasje aan de achterzijde, met cyanoacrylaatlijm (superlijm).
Let op: Aan het einde van het experiment, zet de kamer in het water voor een nacht aan het dekglaasje te verwijderen en zich te ontdoen van de lijmresten met schuurpapier. - Methode 2: Gebruik 35 mm MatTek glazen bodem gerechten (zie de lijst van materialen) met een 10 mm gat.
- Methode 1: gebruik een imaging kamer bestaat uit een plastic dia (75 * 25 * 0,5 mm) doorboord met 4 gaten (5,5 mm diameter), met 3 mm hoge randen aan de ene kant (figuur 2C - D). Lijm een glazen dekglaasje aan de achterzijde, met cyanoacrylaatlijm (superlijm).
- embryo Montage
- Vul een glazen flacon met 1 ml warm 0,2% agarose in embryo medium.Bewaren bij 42 ° C in een warmte-blok.
- Onder de fluorescerende stereomicroscoop, selecteer een embryo waarin rood getransplanteerde cellen maken deel uit van de aspirant-prechordale plaat gelabeld in groen (dwz rode getransplanteerde cellen zijn binnen de groene prospectieve prechordale plaat, en zijn begonnen met het migreren naar het dier pool).
- Transfer een geselecteerde embryo in de agarose-oplossing met een brand-gepolijste Pasteur pipet. Gooi het overtollige embryo medium uit de pipet. Teken de embryo in de pipet met agarose, en overdracht van de embryo in de beeldvorming kamer, het aanbrengen van een druppel agarose. Voordat agarose is ingesteld, oriënteren het embryo met een wimper. Plaats de potentiële prechordale plaat omhoog voor beeldvorming met een rechtopstaande microscoop of op de glazen bodem voor beeldvorming met een omgekeerde microscoop. Wacht tot de agarose is ingesteld (ongeveer 1 min, afhankelijk van de kamertemperatuur) Voor montage een embryo in het volgende putje van de kamer.
Let op: een beeldvormende chamber met 4 putten laat montage tot 4 embryo's. - Wanneer de agar is ingesteld, vult de kamer met Pen / Strep EM om uitdroging te voorkomen.
8. Live-Imaging
- Gebruik een 40X water-immersie lange afstand lens. Gebruik de juiste filter sets op de foto om GFP en mCherry (voor GFP: excitatie BP 470/40, beam splitter FT 510, en emissie BP 540/50, want mCherry: excitatie BP 578/21, beam splitter FT 596, en emissie LP 641 / 75). Pas de blootstellingsduur om afbeeldingen dynamiek te optimaliseren.
- Om beeld alle cellen in de plaat verwerven z-stacks vanaf enkele urn boven de potentiële prechordale plaat (in het ectoderm) en eindigend enkele urn onder de toekomstige prechordale plaat (in de dooier). Gebruik een z-stap van 2 urn. Om overname snelheid te optimaliseren, schakelen kleuren tussen de z-stacks in plaats van tussen frames.
Opmerking: Dit kan leiden tot kleine verschillen tussen de groene en rode afbeeldingen, maar is geen probleem want geen precieze co-localization tussen de groene en rode signalen vereist. Verder beeldvormingstijd en blootstelling aan licht, groen worden slechts eens 5 tijdstippen, die voldoende is om prechordale plaat voorlopercellen identificeren verkregen. - Het gebruik van dergelijke instellingen, stock maximaal 4 embryo binnen twee minuten tijdsinterval dat nodig is om uitsteeksel frequentie en oriëntatie analyseren. Voor de analyse van uitsteeksel leven, te verminderen tijdsinterval tot 30 sec om hogere tijdsresolutie te krijgen. Afbeelding van 60% tot 80% epiboly epiboly.
9. Cell Dynamics Analyse
- Laad 4D afbeeldingen in ImageJ
Opmerking: Afhankelijk van de gebruikte software voor de verwerving, worden de beelden opgeslagen in verschillende formaten (één bestand per beeld, een bestand per z-stack, een bestand voor het hele experiment). Sommige ImageJ Plugins zijn online beschikbaar voor 4D stapels te openen. Onze gegevens worden opgeslagen als een bestand per z-stack. Omdat de dataset groot kan zijn, kan het geschikt zijn om slechts een deel ervan (sommige tim openene punten, of een subdeel van de z-stack, of 8-bit omgezet beelden ...). We maken gebruik van een op maat gemaakte ImageJ plugin om dit te doen, die we graag verspreiden op aanvraag zou zijn. - Analyse van de oriëntatie en de frequentie van de Cel Uitsteeksels
- Gebruik GFP beelden naar de belangrijkste richting van de potentiële prechordale plaat migratie te bepalen. Neem dit als referentie voor de cel uitsteeksels hoek metingen. Draai de stapel, zodat deze referentierichting parallel aan een zijde van het beeld.
- Volg een cel. Kies een hoek tool. Voor elk frame en elk uitsteeksel, gebruikt de hoek hulpmiddel om de hoek tussen het uitsteeksel en de referentierichting (figuur 3A) te meten. Gebruik de Analyseer / Meet commando om de waarde (of druk op M op het toetsenbord) op te slaan. Sla de resultaten als een txt-bestand. Herhaal dit met de volgende cel.
- Importeer de gegevens in R en plot hoek zoals histogrammen. Gebruik de Kolmogorov-Smirnov-test (ks.test in R) aan verschillende omstandigheden te vergelijken.
Opmerking: De hoek hulpmiddel biedt waarden tussen 0 ° en 180 °, waardoor het gebruik van klassieke statistische tests en niet cirkelvormig testen. - Met deze dataset berekenen zendfrequentie als het aantal uitsteeksels per cel per minuut. Gebruik Student T-toets (t.test in R) aan verschillende omstandigheden te vergelijken.
- Analyse van de Cel Uitsteeksels Lifetime
- Voor elke cel en elk uitsteeksel, te meten uitsteeksel duur (aantal frames waarin het uitsteeksel aanwezig x tijd-interval tussen de frames).
- Importeer de gegevens in R. Met Student T-toets (t.test in R) aan verschillende omstandigheden te vergelijken.
Opmerking: Other migratiefuncties kan interessant zijn om te analyseren om de celmigratie te karakteriseren. Deze omvatten cel tracks, voor snelheid, richting en volharding metingen of celmorfologie. Sommige commerciële software-applicaties beschikbaar zijn om deze functies te meten, maar een groot aantal open-source software toepaskationen en ImageJ plugins zijn ook beschikbaar, zoals bijvoorbeeld aanpassen aan morfodynamica 12 te analyseren, Diper te kijken naar mobiele trajecten en directionele doorzettingsvermogen 13, CellTrack naar cel grenzen te volgen tijdens de migratie 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gepresenteerde techniek werd gebruikt om de rol van sin1, een van de belangrijkste onderdelen van het complex Tor 2 (TORC2) analyse, het beheersen in vivo celmigratie. Het gebruik van celtransplantatie maakt labeling van geïsoleerde cellen en analyse van cel-autonome effecten. Movie S1 toont de migratie van getransplanteerde prechordale plaat voorlopercellen. Actine labeling met ABP140 maakt het gemakkelijk visualisatie van actine-rijke cytoplasmatische uitsteeksels. We meten de frequentie en oriëntatie. Wildtype cellen frequent grote cytoplasmatische uitsteeksels georiënteerd in richting van de animale pool, dat wil zeggen in de trekrichting (figuur 3B). Functieverlies van sin1 leidt tot een drastische vermindering van het aantal uitsteeksels en randomisatie van de overblijvende, waaruit blijkt hoe belangrijk sin1 het beheersen actine-rijke kratervorming. Interessant is dat dit fenotype worden gered door eXpression van een constitutief actieve vorm van Rac1 15, sterk suggereert dat TORC2 controleert actine dynamiek en de vorming cel uitsteeksel door middel van Rac1 (Figuur 3B).
De gepresenteerde techniek werd ook gebruikt om de rol van Arpin, een recent geïdentificeerde inhibitor van de Arp2 / 3 complex karakteriseren op celdynamiek 4. Verlies van Arpin functie leidt tot een toename van de frequentie uitsteeksel (gemiddelde percentage van cellen die een uitsteeksel op een gegeven tijd). Dit kan te wijten ofwel vaker kratervorming of een toename uitsteeksel stabiliteit. Het meten uitsteeksel leven is gebleken dat, in afwezigheid van Arpin, uitsteeksel temporele persistentie wordt verdubbeld (figuur 3C). Dit is consistent met de rol van Arpin als Arp2 / 3-remmer, waarbij uitsteeksel retractie vergemakkelijkt, en stelt Arpin beïnvloedt uitsteeksel frequentie moduleren uitsteeksel stabiliteit, in plaats vanuitsteeksel initiatie.
Figuur 1:. Overzicht van de procedure Tg (GSC: GFP) embryo's worden geïnjecteerd in het 4-cell fase (1 uur na de bevruchting). Na 5 uur bij 28 ° C, embryo tonen ABP140 mCherry-positieve cellen in de afscherming (GFP +) gekozen als donor embryo. Shield cellen zijn binnen de transplantatie naald getrokken en overgebracht naar het schild van een gastheer embryo. Na 0,5 uur van herstel, zijn gastheer embryo's gemonteerd en afgebeeld met een epifluorescerende microscoop (40X objectief). HPF:. uren na de bevruchting Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Transplantatieover de schotel en Imaging Kamer. (A) Transplantation gerecht met afzonderlijke putjes. (B) Mold voor celtransplantatie gerecht. (C) Huisgemaakte beeldvorming kamer. (D) Schematische tekening van de zelfgemaakte beeldvorming kamer. Schaal bar = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Resultaten uit Cell Dynamics Analyse (A) Regeling van uitsteeksel hoekmeting. (B) Analyse van cellen uitsteeksel oriëntatie en frequentie. Bij afwezigheid van sin1 (Mo-sin1), cellen uitstoten minder uitsteeksels en de resterende uitsteeksels worden willekeurig georiënteerd. Dit fenotype kan worden gered door expressie van een constitutief actieve vorm van de GTPase Rac1 (Mo-Sin1 + CA-Rac1). Gewijzigd ten opzichte van Dumortier en David, 2015 5. (C) Analyse van uitsteeksel leven. Indien de Arpin (Mo-Arpin), wordt de frequentie verhoogd uitsteeksel. Dit komt door een toename uitsteeksel leven. Herinvoering van een Arpin RNA ongevoelig voor de morfolino herstelt deze hyper stuwend fenotype. Gewijzigd ten opzichte van Dang et al., 2013 4. Schaal bar = 10 micrometer. A: Anterior; P: Posterior, L: links, R:. Right Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1: sin1 controles vorming van cel uitsteeksels, door middel van Rac1 (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Getransplanteerde prechordale plaat voorlopercellen, geïnjecteerd metABP140-mCherrry RNA's en een controle morfolino, of de sin1 morfolino, of de sin1 morfolino en RNA's voor de constitutieve vorm van Rac1. Uitsteeksel frequentie en oriëntatie werden gemeten op de afbeeldingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol geeft een eenvoudige manier om de rol van een kandidaatgen in celmigratie in vivo te bestuderen, door het combineren van het creëren van chimere embryo gebruik celtransplantatie live imaging.
Oprichting van mozaïek embryo
Het bestuderen van de dynamica van een cel moet het visualiseren van de contour cytoplasmische extensies analyseren. Dit kan worden bereikt door het merken van geïsoleerde cellen in een anders ongemerkt - of verschillend gelabelde - milieu en dus een goed visueel contrast.
Een gemakkelijke manier om een deel van de cellen in het embryo stochastisch label wordt plasmide DNA te injecteren in de 1-cellig stadium 16. De geïnjecteerde plasmiden vormen aggregaten die willekeurig en ongelijk in cellen worden gescheiden tijdens de celdeling. Dit leidt tot de expressie van het plasmide in een willekeurige subset van cellen en vormt dus een zeer snelle, gemakkelijke en niet-invasieve werkwijze voor het moSAIC embryo's. Echter, cellen die het plasmide geïnjecteerd neiging om clusters te vormen, en de waarschijnlijkheid om embryo's met enkele geïsoleerde expressie brengen in de toekomstige prechordale plaat behoorlijk laag. Verder gebruik van plasmide DNA slechts zeer beperkte controle van het expressieniveau van het construct geïnjecteerd. De oprichting van chimere embryo's door celtransplantatie, hoewel technisch moeilijker dan plasmide DNA injectie, biedt een aantal voordelen: controle van het aantal getransplanteerde cellen, de controle van de expressie van de constructen (RNA injectie), en last but not least , cel transplantaties laten testen op cel-autonome effecten, door het creëren van mozaïek embryo's waarin getransplanteerde cellen bevatten verlies of winst van de functie constructen. Omgekeerd kan transplantaties ook worden gebruikt om de niet-autonome rol van het milieu door het transplanteren van wild-type cellen in embryo's die zijn gewijzigd beoordelen. Dit kan van bijzonder belang zijn voor het testenbijvoorbeeld de werking van extracellulaire matrixcomponenten die relevant zijn voor celmigratie analyse.
Een gedetailleerd protocol voor celtransplantatie is reeds beschreven 10. In vergelijking met dit protocol, willen we twee belangrijke verschillen in onze procedure te bespreken.
Het eerste verschil is gerelateerd aan de fase van donor embryo injectie. Volgens onze ervaring, embryo geïnjecteerd op de 1-cellig stadium met RNA van een fluorescerend eiwit niet tot expressie homogeen het fluorescente eiwit in alle cellen, als gevolg van een onvolledige diffusie van het RNA in de cel. Injectie van donor embryo's in het 4-cellig stadium in een van de vier cellen toelaat een homogene kloon van cellen, die van bijzonder belang wanneer RNA van het fluorescente eiwit co-geïnjecteerd met andere RNA's die niet traceerbaar krijgen.
Het tweede verschil is het gebruik van lucht in plaats van olie in de transplantation spuit. Het belangrijkste nadeel van een met lucht gevulde systeem is de inertie gevolg van de elasticiteit van de lucht. Olie daarentegen zijn onsamendrukbare, biedt een goede beheersing van zuig- en druk. Echter, met een beetje training en het behoud van het grensvlak tussen lucht en embryo medium in de dunne, taps toelopende gedeelte van de naald, de controle van zuig- en druk met luchtgevulde systeem is voldoende voor het transplanteren van cellen in de afscherming stadium. Voor latere fasen cellen kleiner en meer samenhangend wordt de zuiging vereist een hoge druk die moet zeer nauwkeurig worden geregeld, die niet kunnen worden bereikt met een luchtgevulde setup. Met behulp van lucht in plaats van olie vergemakkelijkt het setup, zoals het vullen van het systeem met olie zonder luchtbel is lastig. Bovendien vermijdt het vullen van de transplantatie naald met olie. Hiermee transplantatie naalden worden hergebruikt, en dus goed worden voorbereid. We hebben het gevoel dat er een naald, zonder scherpe randen en van de juiste diameter is de sleutel tot successful transplantatie. Deze transplantatie stap is duidelijk een van de kritische stappen in het protocol, dat praktijk vereist voordat ze eenvoudig uit te voeren.
We hebben voorgesteld een specifieke procedure voor het transplanteren van enkele cellen, die bestaat uit het dissociëren cellen voorafgaand aan transplantatie teneinde een unieke cel transplantatie naald trekken. Dit impliceert dat tijdelijke celdissociatie hun identiteit en / of het gedrag niet wijzigen. Voor prechordale plaat stamcellen, we genetisch opleggen cel identiteit en hebben zorgvuldig gecontroleerd dat deze cellen zich gedragen als niet-gesplitste degenen. We kunnen echter niet formeel uitsluiten dat dissociatie en / of genetische inductie induceren ongemerkt wijzigingen in de cellen. Transplanteren enkele cellen zonder ze dissociëren haalbaar. De cellen moeten voorzichtig op in de transplantatie naald worden getrokken. Echter, althans in onze handen, slagingspercentage is vrij laag, hetzij omdat meer dan één cel krijgt in de neeDLE, of omdat de cel scharen wanneer deze wordt opgesteld en sterft in de naald of een keer getransplanteerd.
Epifluorescentie versus fast confocale imaging
Het gebruik van de celtransplantatie te mozaïek embryo's zorgt voor de etikettering van geïsoleerde cellen, gescheiden van andere gelabelde cellen. In deze context kan een goede beeldvorming van celmorfologie en dynamiek worden verkregen met standaard epifluorescentie microscopie, zoals voorgesteld in het protocol. Dit heeft het duidelijke voordeel dat een relatief wijdverbreide apparatuur en een goedkoop alternatief voor duurdere confocale beeldvorming.
Voor een nauwkeurige subcellulaire lokalisatie, kan confocale beeldvorming worden gebruikt om de resolutie te verbeteren, in het bijzonder de axiale resolutie. Om toch voldoende temporele resolutie, moet snel confocale beeldvorming worden gebruikt. Vanuit onze ervaring, spinning-disc microscopen bieden een goed compromis tussen resolutie, snelheid en foto-toxiciteit. Fast scanning confocale microscopes (zoals resonerende scanning microscopen) zijn goede opties ook, maar minder frequent en duurder.
cytoskelet etikettering
Goede etikettering van actine filamenten en hun dynamiek is van cruciaal belang om de mechanismen van actine gebaseerde celmigratie te bestuderen. Hoewel membraangebonden fluorescerende markers zijn efficiënter om de cel contouren analyseren actine labeling maakt een betere visualisatie van de cel uitsteeksels. In het bijzonder wanneer drie gemerkte cellen in contact te komen, is het zeer moeilijk om een cytoplasmatisch verlenging gelegen tussen twee naburige cellen als de omtrek van de verlenging en het membraan van de naburige cellen gemengd raken identificeren. Het labelen van actine filamenten kan de ondubbelzinnige detectie van actine gebaseerde cel uitsteeksels, waarop we ons gericht. Als celmorfologie zou worden gekwantificeerd, zou membraan labeling voorkeur. Een andere mogelijkheid is om zowel labeling gebruiken, met gebruikmaking van 3-kleuren weergave (een voor de transgene line, een voor actine en voor membraan), of door GFP labelen van de membraan. In de transgene lijn, cytoplasmatische GFP en Goosecoid GFP-positieve cellen kunnen aldus worden geïdentificeerd, zelfs als het membraan GFP gemerkt.
In de afgelopen jaren hebben een aantal sondes gebruikt om actine label in levende monsters. De eersten waren direct fusies aan actine monomeren. Deze presenteerde twee belangrijke nadelen. Ten eerste, het label dat ze allemaal actine en niet specifiek gepolymeriseerd actine. Ten tweede, ze waren vaak giftig. De sondes die momenteel in gebruik zijn filamenteus actine bindende domeinen gefuseerd met tl-verslaggevers. In dit protocol, gebruikten we ABP140 17 (actine-bindende domein van het gist-actine-bindend eiwit 140), die momenteel de meest gebruikte marker voor filamenteus actine, en labels alle filamenteus actine. Utrophin 18 (calponine homologie domein) etiketten ook filamenteus actine, maar blijkt slechts stabiele filamenten labelen. Dit verschil is gebruikt om identify dynamische actine filamenten, op die gelabeld door ABP140 en niet utrophin 19.
Onlangs is gemeld in vlieg die ABP140 en utrophin toxische effecten, met name over lange expressie 20 zou kunnen hebben. Hoewel we geen migratie defecten in ABP140-gelabelde cellen zijn opgevallen, kunnen we niet uitsluiten dat ABP140 expressie endogeen actine dynamiek kan verstoren. Een derde probe voor filamenteus actine werd onlangs gemeld 21. F-tractin (actine-bindende domein van ratten inositol trifosfaat 3-kinase) is beschreven als een getrouwe reporter van filamenteus actine, die geen toxische effecten zou vertonen 20,22. Voor zover wij weten, is het gebruik van F-tractin niet gemeld Nog zebravis.
Naast actine, kunnen vele andere celcomponenten worden gelabeld om ons begrip van de celmigratie verbeteren. Dit omvat andere cytoskelet componenten zoals myosine, microtubuli, centrosomes, alsmede kneigen regulatoren van celmigratie (geactiveerde vormen van de kleine GTPases Rho, Rac en Cdc42, fluorescente probes voor PIP 3 ...) of eiwitten die betrokken zijn bij celhechting (integrines, cadherinen ...).
Kortom, dit protocol hergroepeert een aantal eerder beschreven tools en technieken om een snelle en eenvoudige systeem voor te stellen om de betrokkenheid van een kandidaat-gen te testen bij het beheersen van celmigratie in vivo. We gebruikten potentiële prechordale plaat migratie is een interessant voorbeeld van gerichte collectieve migratie, en vanwege de beschikbare transgene lijn labelen. Echter kan een soortgelijk protocol aangepast analyseren migratie andere gebeurtenissen tijdens ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
- Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), Cambridge, England 921-932 (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
- Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
- Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
- Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
- Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
- Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
