Introduction
I flercellede organismer, er cellemigrasjon avgjørende både for utviklingen av embryoet, hvor den sørger for organisering av celler i vev og organer, og for voksne liv, hvor den tar del i vev homeostase (sårheling) og immunitet. I tillegg til disse fysiologiske funksjoner, er cellemigrering også involvert i forskjellige patologiske tilstander, inkludert, spesielt, kreft metastase.
Cellemigrering er blitt analysert in vitro i flere tiår, noe som gir en generell forståelse av molekylære mekanismer som sikrer celle bevegelser på overflatene. In vivo er imidlertid celler konfrontert med et mer komplekst miljø. Det tydelig vist i de siste årene at migrering innenfor en organisme kan bli påvirket av ytre signaler, slik som den ekstracellulære matriks, naboceller eller utskilte chemokiner førings migrering, og at mekanismene som driver cellemigrering kan variere fra det som er blitt beskrevet <em> in vitro 1,2. Mekanismene som sikrer in vivo cellemigrasjon har fått mindre oppmerksomhet så langt, hovedsakelig på grunn av den økte tekniske problemer, sammenlignet med in vitro studier. In vivo-analyse av cellemigrering i bestemte krever direkte optisk adgang til migrerende celler, teknikker for å merke unike celler i for å se deres dynamikk og morfologi, samt gevinst eller tap av funksjon tilnærminger for å teste rolle kandidat gener. Så langt har bare noen få modellsystemer som bærer disse egenskapene blitt brukt til å dissekere in vivo celle migrasjon tre.
Vi har nylig brukte migrering av den potensielle prechordal platen i tidlige embryoer sebrafisk som en ny praktisk modellsystemet for å vurdere funksjon av kandidatgener i å kontrollere in vivo celle migrasjon 4,5. Prospective prechordal plate (også kjent som fremre mesendoderm) er en gruppe av celler som danner ved utbruddet av gastrulation på den dorsale side av embryoet. Under gastrulation denne gruppen vandrer sammen langs dyret pol av embryoet 6-8, for å danne prechordal plate, en mesendodermal fortykning, anterior til ryggstreng, og underliggende nevrale plate. Den fremre delen av prechordal platen vil gi opphav til klekking kjertel, mens dens bakre del bidrar sannsynligvis til hodet mesoderm 9. Takket være den ytre utvikling og optisk klarhet av fisken embryo, kan cellemigrering bli direkte og lett observeres i denne strukturen.
Celletransplantasjon er en meget potent teknikk som gjør det mulig for rask og enkel etablering av mosaikk embryoer 10. Uttrykkende fluorescerende markører cytoskeletal i transplanterte celler resulterer i merking av isolerte celler, morfologi og dynamikk som lett kan observeres. Ved å kombinere dette til tap eller vinning av funksjon nærmer tillater analyse av celle-autonome funksjoner av en bokscetylen genet.
Den presenterte protokollen beskriver hvordan vi vurderte funksjon av TORC2 komponent SIN1 i å kontrollere cellemigrasjon og aktin dynamikk in vivo 5. Men, som nevnt i resultatene, og nærmere beskrevet, kan det brukes til å analysere den potensielle innblanding av en kandidat-gen i å kontrollere cellemigrering in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Figur 1 viser omrisset av protokollen.
1. Utarbeidelse av nåler for injeksjon og transplantasjon
Merk: Nåler kan være forberedt når som helst og lagret. Oppbevar dem i en petriskål, på et band av modelleire. Tett fatet med Parafilm for å beskytte mot støv.
- For kanyler, trekker et glass kapillær (utvendig diameter 1,0 mm, innvendig diameter 0,58 mm, uten filament (se liste over Materials)) med en mikropipette avtrekker (se liste over Materials). Foretrekker korte og tynne nåler (konisk del på ca 5 mm) som de er mer effektive for piercing chorion.
Merk: kanyler er til engangsbruk. - Nål for Cell Transplantation
- Trekk et glass kapillær (utvendig diameter 1,0 mm, innvendig diameter 0,78 mm, uten filament (se liste over Materials)) med en mikropipette avtrekker.
- Usynge en microforge (se liste over materialer), kutte spissen av nålen på det punkt hvor den indre diameter er 35 um (litt mer enn diameteren av celler som skal bli transplantert).
- Bevel kuttet enden av kapillær med en microgrinder (se liste over Materials) med en vinkel på 45 °.
- Eventuelt kan trekke en brodd på den enden av nålen ved hjelp av en microforge. For dette, ta på varme filament med tuppen av skråkant og raskt trekke den bort, og skaper en brodd som kan hjelpe trengende embryo.
- Montere nålen på en nåleholder festet til en sprøyte. Ved hjelp av sprøyte, skyll innsiden av nålen tre ganger med 2% fluorsyre for å fjerne glassrester, og deretter skylles tre ganger med aceton.
Forsiktig: flussyre er giftig, manipulere under panseret, med hansker.
Merk: celle transplantasjon nåler kan brukes flere ganger.
2. Fremstilling avRetter for injeksjon og celletransplantasjon
- Varme 50 ml embryo medium 11 inneholdende 0,5 g agarose i en mikrobølgeovn i 1 min ved full effekt for å få 1% agarose i embryo medium. Avkjøl agarosegel til ca. 60 ° C og hell 50 ml i en 90 mm petriskål. Plasser på overflaten av gelen en spesielt utformet form (se liste over materiale), enten med linjer for injeksjon tallerken eller med brønner for celletransplantasjon fatet.
- Observer mold flyte på agarose, hvis agarose er ikke for varmt. Etter agarosegel er satt, fjerne mugg med pinsett (Figur 2A - B).
Merk: retter kan lagres ved 4 ° C, opp til et par uker. Oppbevar dem i en lukket våt boks, for å unngå uttørking.
- Observer mold flyte på agarose, hvis agarose er ikke for varmt. Etter agarosegel er satt, fjerne mugg med pinsett (Figur 2A - B).
- Plassere formen i en 28 ° C inkubator 30 min før bruk.
3. Innsamling av embryoer og Injection
- Injeksjon Løsning Forberedelse
Merk: Actin bindende domeneav gjær actin-bindende protein 140 (ABP-140), så som Lifeact bundet til mCherry (referert til som ABP140-mCherry) blir brukt til å visualisere polymerisert aktin i cellen, for å analysere den protrusive aktivitet. Legg til en annen forbindelse for å teste funksjonen av en kandidat-gen (f.eks mRNA av dominant negativ eller konstitutivt aktiv konstruksjon, eller morfolino oligonukleotider). For å vurdere funksjonene til SIN1 som beskrevet i resultatene (figur 3), som benyttes vi morfolino oligonukleotider. Som en kontroll ble det benyttet en morfolino- identisk med SIN1 morfolino men til 5 nukleotider fordelt langs sekvensen slik at denne kontrollen morfolino ikke stemmer overens med mål-RNA.- Tine SIN1 og 5-mismatch kontroll morpholinos (2 mm lager løsninger), og ABP140-mCherry mRNA på is. Legg 375 ng av mRNA (75 ng / mL endelig) og 0,75 mL av enten SIN1 eller 5-mismatch kontroll morpholino (0,3 mM endelig) i Danieau buffer (58 mM NaCl, 0,7 mMKCl, 0,4 mM MgSO4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5.0 mM HEPES pH 7,6), for å oppnå et totalt volum på 5 ul.
- embryo Collection
Merk: for denne eksperimentelle satt opp både giver- og verts embryoer er transgene, uttrykker GFP under kontroll av goosecoid (GSC) promoter for å visualisere den potensielle prechordal plate 11.- Samle Tg (GSC: GFP) egg. Plassere rundt 80 egg i en 90 mm petriskål fylt med embryo medium og inkuber ved 28 ° C.
- Sprøyt Donor embryo
- Under en stereomikroskop, forsiktig klem innsamlede embryoer med tang i linjene av en injeksjon rett fylt med embryo medium. Bruk pinsett, orientere embryoene med cellene mot toppen. Sett injeksjon fatet i inkubatoren ved 28 ° C inntil embryoene har nådd 4-cellers trinn (1 timer etter befruktning).
- Legge en kanyle med to ulinjeksjon løsning. Sett nålen i en nåleholder (se liste over materialer) som er plassert i en mikromanipulator (se liste over materialer) og forbundet med polytetrafluoretylen (PTFE) slange (se liste over Materials) til en luft transjector (se liste over material ).
- Åpne kapillær ved forsiktig å berøre tuppen med fine tang. Om nødvendig, kutt kapillær åpen ved å knipe sin ekstremitet.
- Inn i en av de fire celler med nålen og injisere oppløsningen i cellen for å fylle 70% av cellevolumet (2 nl). Injiser 30 embryoer.
Merk: Å få nålen i cellen kan være vanskelig, da plasmamembranen er myk. Sikte ved overgangen mellom cellen og den eggeplomme letter nålepenetrering. - Plasser embryoene i 28 ° C inkubator før de har nådd sfæren scenen (4 timer etter befruktning).
4. Forberedelse av embryoene for Cell Transplantation
- Forbered 20 ml embryo medium med 200 mL penicillin / streptomycin (se liste over materialer) (Pen / Strep EM).
- Dechorionation av embryoene på kula scenen (4 timer etter befruktning)
Merk: Dechorionated embryoer er svært skjør og vil eksplodere i tilfelle kontakt med luft eller plast. De trenger derfor å bli plassert i agarose-overtrukket retter, og overføres med flamme-polert glass Pasteur pipetter.- Ved hjelp av en plast Pasteur pipette overføre verts embryoer samlet på trinn 3,2 og donor embryoer injisert i trinn 3,3 i to 35 mm petriskåler belagt med 1% agarose i embryo medium og fylt med Pen / Strep EM. Hold verts embryoer og donor embryoer i to separate retter.
- trekke ut manuelt embryoene fra sine chorions med fin pinsett (se liste over materialer).
- Plasser embryo i 28 ° C inkubator før de har nådd skjoldet scenen (6 timer etter befruktning).
5. Cell Transplantation
- Ordne embryoene for cellen transplantasjon.
- Under en fluorescerende stereomikroskop, velger donor embryoer uttrykker ABP140-mCherry (rød) i skjoldet (grønn).
- Ved hjelp av en flammebehandlet Pasteur pipette, overføres embryoene i brønnene på celletransplantasjon fatet fylt med Pen / Strep EM. Plasser verts embryoene i en rad og donor embryoer i nabo rad.
- Ved hjelp av en øyenvippe, nøye orientere embryoene med skjoldet opp.
Merk: stilling av skjoldet kan vurderes ved GFP uttrykk eller anatomisk.
- Transplantasjon System Set-up.
Merk: transplantasjon systemet består av en nål holder (se liste over materialer) som er forbundet med PTFE slange (se liste over Materials) og en tube-kontakt (se liste over Materials) til en Hamilton sprøyte utstyrt med en mikro-stasjonen (se liste of Materials). Nåleholderener montert på en tre-veis mikromanipulator (se liste over Materials).- Ved hjelp av en nål holder festet til en sprøyte, skyll nålen for celletransplantasjon med 70% etanol. Tørr ved å suge opp luft inn i nålen. Ikke tørk ved å blåse, da dette kan føre til støv å bli sittende fast i den koniske delen av nålen.
- Sett nålen i nåleholderen koblet til Hamilton-sprøyte, med den skråkant oppover.
- Shield-til-skjerm Cell Transplantation
- Skriv inn skjold en donor embryo med transplantasjon nål og trekke opp ca 10-20 celler merket med ABP140-mCherry. Nøye unngå å trekke plomme.
- Transplantere cellene inn i skjoldet av verten embryo. Gjenta til alle verts embryoer har blitt transplantert.
- Fjern eventuelle skadede fostre med en flammebehandlet Pasteur pipette. Plasser transplanterte embryoene i inkubator ved 28 ° C og la dem komme i ca 30 min.
- Ved hjelp av en nålholder festet til en sprøyte, skyll cellen transplantasjon nål med vann og sett den tilbake i en petriskål på et band av modelleire. Tett fatet med Parafilm.
6. (Valgfritt) Enkeltrom Cell Transplantation
Merk: I embryo celler holder seg til hverandre, slik at det er vanskelig å trekke bare en celle i transplantasjon nålen. Vi utviklet en modifisert protokoll for enkelt å transplantere enkelt prechordal plate stamceller. Ideen er å dissosiere celler før transplantasjon. Fordi isolerte prechordal plate stamceller har en tendens til å miste sin identitet, vi genetisk pålegge dem en potensiell prechordal plate identitet, ved å aktivere Nodal signalveien, i fravær av Sox32 transkripsjonsfaktor. Vi har bekreftet at disse induserte celler oppfører seg som endogene prechordal plate stamceller 8. Nedenfor er de konkrete skritt for å utføre enkelt celle transplantasjoner. Cell dissociasjon oppnås ved å plassere embryoer i kalsium-fri Ringer 11, dissekere en explant og mekanisk omrøring.
- I trinn 2.1, forberede transplantasjon fatet med 1% agarose i Calcium-fri Ringer i stedet for Embryo Medium.
- Ved trinn 3.1, i tillegg til ABP140-mCherry RNA og SIN1 morfolino, tilsett 3 ng av RNA som koder for den aktive formen av knutepunkt-reseptor Taram-A (0,6 ng / mL sluttkonsentrasjon) og 1,25 ul morfolino mot sox32 (stamløsning på 2 mM, derav 0,5 mM final).
- Etter trinn 4, overføring tre utvalgte donor embryo i fatet for celletransplantasjon fylt med Pen / Strep Kalsium-fri Ringer du bruker en brann-polert Pasteur pipette. Med fine pinsett, dissekere en eksplantering inneholder de injiserte celler (ABP140-mCherry merket celler). Raskt forkaste resten av embryoer.
- Med en øyenvippe, rør forsiktig eksplantering til cellene distansere.
- Tegn opp en enkelt isolert celle i transplantasjon nålog transplantere det inn i skjoldet av en vert embryo.
- Ved hjelp av en flammebehandlet Pasteur pipette overføre embryoene i en agarose-belagt tallerken fylt med Pen / Strep EM. Plasser embryoene i inkubator ved 28 ° C i 30 minutter.
7. Embryo Monterings
- Imaging Chamber
- Metode 1: bruke en avbildning skammer som består av en plastglide (75 * 25 * 0,5 mm) gjennomhullet med 4 hull (5,5 mm diameter), med 3 mm høye kanter på en side (figur 2C - D). Lim et glass dekkglass på baksiden, med cyanoakrylatlim (super lim).
Merk: Ved slutten av forsøket, plasserer kammer i vann i en natt for å fjerne dekkglass og kvitte seg limrester med sandpapir. - Metode 2: Bruk 35 mm Mattek glassbunn retter (se liste over Materials) med en 10 mm hull.
- Metode 1: bruke en avbildning skammer som består av en plastglide (75 * 25 * 0,5 mm) gjennomhullet med 4 hull (5,5 mm diameter), med 3 mm høye kanter på en side (figur 2C - D). Lim et glass dekkglass på baksiden, med cyanoakrylatlim (super lim).
- embryo Montering
- Fylle opp et hetteglass med 1 ml varm 0,2% agarose i embryo medium.Hold det ved 42 ° C i en varmeblokk.
- Under det fluorescerende stereomikroskopet ved å velge et embryo i hvilken red transplanterte celler er en del av den potensielle prechordal plate merket med grønt (dvs. røde transplanterte celler er innenfor det grønne potensielle prechordal plate, og har begynt å migrere inn i dyret pol).
- Overfør en valgt embryo inn i agarose løsning med en flammebehandlet Pasteur pipette. Kast overskudd av embryoet medium fra pipetten. Tegn embryo i pipette med agarose, og overføre embryoet i bildekammeret, innløsing av en dråpe agarose. Før agarose er satt, orientere embryo med en øyenvippe. Plasser den potensielle prechordal platen oppover for avbildning med en oppreist mikroskop, eller på glassbunn for avbildning med en invertert mikroskop. Vent til agarose er satt (ca. 1 min, avhengig av romtemperaturen) før montering av en annen embryo i den neste brønn av kammeret.
Merk: en avbildning chamber inneholder 4 brønner tillater montering opp til 4 embryoer. - Når agarose er satt, fylle kammeret med penn / Strep EM for å unngå uttørking.
8. Levende Imaging
- Bruk en 40X vann-nedsenking langtrekkende linse. Bruk egnet filtersett til bilde GFP og mCherry (for GFP: eksitasjon BP 470/40, stråledeler FT 510, og utslipp BP 540/50, for mCherry: eksitasjon BP 578/21, stråledeler FT 596, og utslipp LP 641 / 75). Juster eksponering varighet for å optimalisere bildedynamikk.
- Til bilde alle cellene i platen, erverve z-stabler, som starter noen mikrometer over den potensielle prechordal plate (i ektoderm) og slutter noen få mikrometer under den potensielle prechordal plate (i eggeplomme). Bruke et Z-trinn med 2 um. For å optimalisere oppkjøpet hastighet, bytte farger mellom z-stabler snarere enn mellom rammer.
Merk: Dette kan føre til små forskjeller mellom de grønne og røde bilde, men er ikke et problem siden ingen nøyaktig co-localization mellom de grønne og røde signaler kreves. For å redusere ytterligere bildebehandling tid og eksponering for lys, kan grønn erverves kun en gang hvert 5. tidspunkter, som er tilstrekkelig til å identifisere prechordal plate stamceller. - Ved hjelp av slike innstillinger, bilde inntil 4 embryoer innenfor to minutters tidsintervall som er nødvendig for å analysere protrusion frekvens og orientering. For analyse av utstikket levetid, redusere tidsintervallet til 30 sek for å få høyere tidsoppløsning. Bilde fra 60% epiboly til 80% epiboly.
9. Cell Dynamics Analysis
- Last 4D bilder i ImageJ
Merk: Avhengig av programvaren som brukes for oppkjøpet, er bilder som er lagret i forskjellige formater (én fil per bilde, en fil per z-stack, en fil for hele forsøket). Noen ImageJ Plugins er tilgjengelig på nettet for å åpne 4D stabler. Våre data er lagret som én fil per z-stack. På grunn av at datasettet kan være store, kan det være hensiktsmessig å åpne bare en del av det (noen time poeng, eller en subpart av z-stack, eller 8-bit konverterte bildene ...). Vi bruker en skreddersydd ImageJ plugin for å gjøre det, som vi ville være glad for å distribuere på forespørsel. - Analyse av Orientering og frekvens av Cell fremstående delene
- Bruk GFP bilder å bestemme viktigste retning av prospektive prechordal plate migrasjon. Ta dette som en referanse for celle utstikk vinkelmålinger. Rotere stabelen, slik at denne referanseretning er parallell med en side av bildet.
- Følg en celle. Velg vinkel verktøyet. For hver ramme, og hvert fremspring, bruker vinkel verktøy for å måle vinkelen mellom fremspringet og den referanseretning (figur 3A). Bruk Analyser / Mål kommando for å lagre verdien (eller trykk M på tastaturet). Lagre resultatene som en txt-fil. Gjenta med den neste cellen.
- Importere dataene inn i R og plottet vinkel distribusjon som histogrammer. Bruk Kolmogorov-Smirnov test (ks.test i R) for å sammenligne ulike forhold.
Merk: Den vinkel verktøyet gir verdier mellom 0 ° og 180 °, som tillater bruk av klassiske statistiske tester og ikke sirkulære tester. - Med dette datasettet, å beregne utslipp frekvens som antall utstikkende deler per celle per minutt. Bruk Student T-test (t.test i R) for å sammenligne ulike forhold.
- Analyse av Cell fremstående levetid
- For hver celle, og hvert fremspring, måle fremspring varighet (antall av rammer under hvilken fremspringet er til stede x tidsintervallet mellom rammer).
- Importere data inn R. Bruk Student T-test (t.test i R) for å sammenligne ulike forhold.
Merk: Andre migrasjons funksjoner kan være interessant å analysere for å karakterisere celle migrasjon. Disse inkluderer celle spor, for fart, retning og utholdenhet målinger, eller celle morfologi. Noen kommersielle programmer er tilgjengelig for å måle disse funksjonene, men et stort antall av åpen kildekode apparakasjoner og ImageJ plugins er også tilgjengelig, som for eksempel ADAPT å analysere morphodynamics 12, diper å se på celle baner og retnings utholdenhet 13, CellTrack å spore cellegrensene under migreringen 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den presenterte teknikken ble brukt til å analysere rollen SIN1, en av de viktigste komponentene i Tor-komplekset 2 (TORC2), i å kontrollere in vivo celle migrasjon. Bruken av celletransplantasjon tillater merking av isolerte celler og analyse av celle-autonome effekter. Movie S1 viser migrering av transplanterte prechordal plate stamceller. Actin merking med ABP140 tillater enkel visualisering av aktin-rik cytoplasmatiske fremspring. Vi målte frekvensen og orientering. Vill-type-celler produserer hyppige store cytoplasmiske fremspring orientert i retning av det animalske pol, dvs. i retning av migrasjon (figur 3B). Tap av funksjon av SIN1 fører til en drastisk reduksjon av antall fremspring, og randomisering av de gjenværende, noe som viser viktigheten av å kontrollere SIN1 i aktin-rik fremspring formasjonen. Interessant, kan dette fenotype bli reddet av eXpression av en konstitutivt aktiv form for Rac1 15, sterkt tyder på at TorC2 styrer aktin dynamikk og celle utvekst formasjon gjennom Rac1 (figur 3B).
Den presenterte teknikken ble også benyttet for å karakter rollen til Arpin, en nylig identifisert inhibitor av Arp2 / 3-komplekset, på celle dynamikk 4. Tap av Arpin funksjon fører til en økning i frekvens fremspring (gjennomsnittlig hastighet på celler som inneholder et fremspring på et gitt tidspunkt). Dette kan enten skyldes hyppigere fremspring dannelse eller til en økning i fremspring stabilitet. Måling utvekst levetid avslørte at i fravær av Arpin er utstikket tidsmessig utholdenhet fordoblet (figur 3C). Dette er konsistent med rollen til Arpin som en Arp2 / 3-inhibitor, noe som ville lette fremspring tilbaketrekkingen, og antyder at Arpin påvirker fremspringet frekvens ved modulering av fremspringet stabilitet, i stedet forutstikket innvielse.
Fig. 1: Oversikt over prosedyren Tg (GSC: GFP) embryoer blir injisert i 4-cellen trinn (1 timer etter befruktning). Etter 5 timer ved 28 ° C, embryoer som viser ABP140-mCherry positive celler i skjoldet (GFP +) velges som donor embryoer. Shield celler utarbeides innenfor transplantasjon nål og overført til skjoldet til en vert embryo. Etter 0,5 timer med utvinning, er verts embryoer montert og avbildes med en epifluorescent mikroskop (40X objektiv). HPF. timer etter befruktning Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Transplantatipå tallerken og Imaging Chamber. (A) Transplantasjon tallerken med individuelle brønner. (B) Mold for celletransplantasjon parabolen. (C) Hjemmelaget bildekammeret. (D) Skjematisk tegning av hjemmelagde bildekammeret. Scale bar = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Resultater fra Cell Dynamics Analysis (A) Scheme av utstikket vinkelmåling. (B) Analyse av cellefremspring orientering og frekvens. I fravær av SIN1 (Mo-SIN1), celler som avgir færre fremspring og de resterende fremspring er tilfeldig orientert. Denne fenotype kan bli reddet ved ekspresjon av en konstitutivt aktiv form av GTPase Rac1 (Mo-Sin1 + CA-Rac1). Modifisert fra Dumortier og David, 2015 5. (C) Analyse av utstikket levetid. I fravær av Arpin (Mo-Arpin), blir fremspringet frekvens økes. Dette skyldes en økning i utstikket levetid. Gjeninnføre en Arpin RNA ufølsom for morpholino gjenoppretter denne hyper protrusive fenotype. Modifisert fra Dang et al., 2013 4. Scale bar = 10 mikrometer. A: Anterior; P: Posterior, L: Venstre, R:. Akkurat Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: SIN1 kontroller dannelsen av cellefremspring, gjennom Rac1 (Høyreklikk for å laste ned). Transplanterte prechordal plate stamceller, injisert medABP140-mCherrry RNA og en kontroll morfolino, eller den SIN1 morfolino, eller den SIN1 morfolino og RNA for den konstitutive form av Rac1. Protrusion frekvens og orientering ble målt på disse bildene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir en enkel måte for å studere rollen til en kandidat genet i cellemigrering in vivo, ved å kombinere etableringen av kimære embryoer ved hjelp av celletransplantasjon med levende avbildning.
Opprettelse av mosaikk embryoer
Studerer dynamikken i en celle krever visualiseringen av dens kontur for å analysere cytoplasmiske utvidelser. Dette kan oppnås ved å merke isolerte celler i en ellers umerket - eller på en annen måte merket - miljø, og dermed gir god visuell kontrast.
En enkel måte å stokastisk merke en del av cellene i embryoet er å injisere plasmidic DNA i en celle-trinns 16. De injiserte plasmider danner aggregater som er tilfeldig og ujevnt adskilt i cellene under celledeling. Dette fører til ekspresjon av plasmidet i en tilfeldig subsett av celler, og representerer således en meget rask, enkel og ikke-invasiv metode for å generere moSAIC embryoer. Imidlertid, celler som uttrykker de injiserte plasmid som har en tendens til å danne klaser, og sannsynligheten for å finne embryoer som inneholder noen få isolerte uttrykkende celler i den potensielle prechordal platen er ganske lav. Videre er bruk av plasmidic DNA har svært begrenset kontroll av ekspresjonsnivået av den injiserte konstruksjonen. Opprettelsen av kimære embryoer ved celletransplantasjon, men teknisk vanskeligere enn plasmidic DNA-injeksjon, og tilbyr en rekke fordeler: kontroll av antallet av transplanterte celler, kontroll av ekspresjonsnivået av konstruksjonene (RNA-injeksjon), og sist men ikke minst celle transplantasjoner tillate å teste for celle-autonome effekter, ved å lage mosaikk embryoer som transplanterte cellene inneholder tap eller gevinst på funksjons konstruksjoner. Omvendt kan transplantasjoner også brukes til å vurdere den ikke-autonome rolle av miljøet ved å transplantere villtype celler inn i embryoer som har blitt endret. Dette kan være av spesiell interesse for testingfor eksempel, den funksjon av ekstracellulære matriks-komponenter som er spesielt relevante for cellemigrasjon analyse.
En detaljert protokoll for celletransplantasjon er allerede blitt beskrevet 10. Sammenlignet med denne protokollen, vil vi gjerne diskutere to viktigste forskjellene i vår prosedyre.
Den første forskjellen er knyttet til fasen av donor embryoer injeksjon. Ifølge vår erfaring, embryoer injisert ved 1-cellestadiet med RNA av et fluorescent protein uttrykker ikke homogent det fluorescerende protein i alle celler, på grunn av en ufullstendig diffusjon av RNA i cellen. Injeksjon av donor embryoer på 4-cellestadiet i en av de fire celler som gjør det mulig å få en homogen klon av celler, som er av spesiell interesse når RNA av det fluorescerende protein er ko-injisert med andre RNA-er som ikke er sporbare.
Den andre hovedforskjellen er bruk av luft i stedet for olje i transplantation sprøyte. Den største ulempen med en luftfylt system er tregheten som følge av elastisiteten av luften. Olje tvert imot, å være komprimerbart, og gir god styring av sug og trykk. Men med en liten opplæring, og ved å opprettholde grenseflaten mellom luft og embryo medium i den tynne, avsmalnende del av nålen, er tilstrekkelig for å transplantere celler ved skjoldet stadium kontroll av sugetrykket og med en luftfylt system. For senere stadier, som celler blir mindre og mer sammenhengende, krever suge et høyt trykk som må være meget nøyaktig reguleres, og som ikke kan oppnås med et luftfylt oppsett. Ved hjelp av luft i stedet for olje letter oppsett, som å fylle systemet med olje uten luftboble er vanskelig. Dessuten unngår den fyller transplantasjon nål med olje. Dette gjør at transplantasjon nåler til å bli gjenbrukt, og dermed være nøye forberedt. Vi føler at en nål uten skarpe kanter og av riktig diameter er nøkkelen til successful transplantasjon. Dette transplantasjon trinnet er helt klart en av de kritiske trinn i protokollen, som krever trening før de blir lett utført.
Vi har også foreslått en spesiell prosedyre for å transplantere enkeltceller, som består i å dissosiere celler før transplantasjon, for å trekke en unik celle i transplantasjon nålen. Dette innebærer at forbigående celledissosiasjon ikke vil endre sin identitet og / eller oppførsel. For prechordal plate stamceller, vi genetisk pålegge celleidentiteten og har nøye sjekket at disse cellene oppfører seg som ikke-dissosiert seg. Men vi kan ikke formelt utelukke at dissosiasjon og / eller genetisk induksjon indusere ubemerket endringer i cellene. Transplanterer enkeltceller uten dissociating dem er gjennomførbart. Cellene bør utarbeides forsiktig i transplantasjon nål. Imidlertid, i det minste i våre hender, er suksessraten ganske lav, enten fordi mer enn en celle kommer inn i needle, eller fordi celle saks når trukket opp og dør i nålen eller en gang transplantert.
Epifluorescence versus rask confocal bildebehandling
Bruken av celletransplantasjon for å skape mosaikk embryoer gjør det mulig for merking av isolerte celler, separert fra andre merkede celler. I denne sammenheng kan god avbildning av cellemorfologi og dynamikk oppnås med standard epifluorescens mikroskopi, som foreslått i protokollen. Dette har den åpenbare fordel at den er en forholdsvis stor utbredelse utstyr og et rimelig alternativ til mer kostbare konfokalt avbildningssystemer.
For nøyaktige subcellulære lokaliseringen kan konfokalt avbildnings brukes til å forbedre oppløsning, spesielt aksial oppløsning. For å likevel få tilstrekkelig tidsoppløsning, bør raskt confocal bildebehandling brukes. Fra vår erfaring, spinning-platen mikroskoper tilby et godt kompromiss mellom oppløsning, hastighet og foto-toksisitet. Rask skanning konfokalmikroskoper microscopes (som resonans skanning mikroskop) er gode alternativer også, men sjeldnere og dyrere.
cytoskjelettet merking
God merking av aktin filamenter og deres dynamikk er avgjørende for å studere mekanismene for aktin-baserte cellemigrering. Selv om membranbundne fluorescerende markører er mer effektive for å analysere celle vektorer, gjør det mulig for aktin merking en mye bedre visualisering av cellefremspring. Særlig hvis tre merkede celler komme i kontakt, er det meget vanskelig å identifisere et cytoplasmatisk forlengelse som ligger mellom to naboceller som omrisset av utvidelsen og membranen av nabocellene kan bli blandet sammen. Merking aktin filamenter tillater entydig påvisning av aktin-baserte cellefremspring, som vi fokusert. Hvis cellemorfologi var som skal kvantifiseres, ville en membranmerking være å foretrekke. Et annet alternativ er å bruke både merking, enten ved hjelp av tre-farge imaging (en for transgen line, en for aktin og en for membranen), eller ved GFP merking av membranen. I den transgene linje, er GFP cytoplasmisk, og goosecoid-GFP-positive celler kan således bli identifisert, selv om membranen er GFP-merket.
I løpet av de siste årene har en rekke sonder blitt brukt til å merke aktin i live-prøver. De første var direkte fusjoner til aktin monomerer. Disse presenteres to store ulemper. Først merket de alle aktin og ikke spesielt polymerisert aktin. For det andre var de ofte giftig. Sondene for tiden er i bruk er trådformede aktin bindingsdomener smeltet til fluorescerende reportere. I denne protokollen, brukte vi ABP140 17 (aktin bindende domene av gjær aktinbindende protein 140), som er den mest brukte markør for trådformede aktin og etiketter alle trådformede aktin. Utrophin 18 (calponin homologi domene) etiketter også trådformede aktin, men ser ut til å merke bare stabile filamenter. Denne forskjellen har blitt brukt til Identify dynamisk aktin filamenter, som de som er merket med ABP140 og ikke Utrophin 19.
Nylig er det blitt rapportert i flue som ABP140 og Utrophin kunne ha toksiske virkninger, særlig mer enn 20 lang uttrykk. Selv om vi ikke har merket noen migrasjons defekter i ABP140-merkede celler, kan vi ikke utelukke at ABP140 uttrykk kan forurolige endogene aktin dynamikk. En tredje sonde for trådformede aktin ble nylig rapportert 21. F-tractin (actin-bindende domene fra rotte-inositol-trifosfat 3-kinase) har blitt beskrevet som en trofast reporter av filamentøst aktin, som ikke ville vise toksiske effekter 20,22. Så vidt vi vet, har bruken av F-tractin ikke blitt rapportert i sebrafisk ennå.
I tillegg til aktin, kan mange andre cellebestanddeler merkes for å forbedre vår forståelse av celle migrasjon. Dette inkluderer andre cytoskeletal komponenter som myosin, mikrotubuler, centrosomes, samt knegne regulatorer av cellemigrasjon (aktiverte former av den lille GTPases Rho, Rac og Cdc42, fluorescerende prober for PIP3 ...) eller proteiner som er involvert i celle adhesjon (inte cadherins ...).
Totalt, regroups denne protokollen en rekke tidligere beskrevne verktøy og teknikker for å foreslå en hurtig og enkelt system for å teste involvering av en kandidat-gen i å kontrollere cellemigrering in vivo. Vi brukte potensielle prechordal plate migrasjon som det er en interessant modell av rettet kollektiv migrasjon, og på grunn av den tilgjengelige transgene linjen merking den. Imidlertid kan en lignende protokoll være innrettet til å analysere andre migrerings hendelser som oppstår i løpet av utviklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
- Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), Cambridge, England 921-932 (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
- Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
- Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
- Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
- Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
- Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
