Introduction
I flercellede organismer, celle migration er afgørende både for udviklingen af embryo, hvor det sikrer organisering af celler i væv og organer, og til voksenlivet, hvor det tager en del til vævshomeostase (sårheling) og immunitet. Foruden disse fysiologiske funktioner, cellemigrering er også involveret i forskellige patologiske situationer, herunder især, cancermetastase.
Cell migration er blevet analyseret in vitro i årtier, giver en overordnet forståelse for de molekylære mekanismer, der sikrer celle bevægelser på flade overflader. In vivo dog celler konfronteret med et mere komplekst miljø. Det tydeligt viste sig i de seneste år, at migration inden en organisme kan påvirkes af eksterne signaler såsom den ekstracellulære matrix, tilstødende celler eller udskilles kemokiner vejledende migration, og at de mekanismer, der driver celle migration kan variere fra hvad der er blevet beskrevet <em> in vitro 1,2. De mekanismer, der sikrer in vivo celle migration har fået mindre opmærksomhed hidtil, primært på grund af den øgede tekniske vanskeligheder i forhold til in vitro-undersøgelser. In vivo analyse af cellemigration især kræver direkte optisk adgang til migrerende celler, teknikker at mærke unikke celler i for at kunne se deres dynamik og morfologi samt gevinst eller tab af funktion tilgange til at teste rollen som kandidatgener. Hidtil har kun få modelsystemer huser disse karakteristika blevet anvendt til at dissekere in vivo cellemigrering 3.
Vi har for nylig brugt migrationen af de fremadrettede prechordal plade i tidlige zebrafisk embryoner som en ny praktisk model system til at vurdere funktionen af kandidatgener i at kontrollere in vivo celle migration 4,5. Prospektiv prechordal plade (også kendt som anterior mesendoderm) er en gruppe af celler danner i starten af gastrulation på dorsale side af fosteret. Under gastrulation denne gruppe migrerer kollektivt mod dyret pol af embryonet 6-8, til dannelse af den prechordal plade, en mesendodermal fortykkelse, anterior til rygstrengen og underliggende neurale plade. Den forreste del af prechordal plade vil give anledning til udrugning kirtel, mens dens bageste del sandsynligvis bidrager til hovedet mesoderm 9. Takket være den eksterne udvikling og optisk klarhed af fisken embryo, kan cellemigrering let og direkte observeret i denne struktur.
Cell transplantation er en meget potent teknik, der giver mulighed for hurtig og nem oprettelse af mosaik embryoner 10. Udtrykker fluorescerende cytoskelet-markører i transplanterede celler resulterer i mærkning af isolerede celler, morfologi og dynamik som let kan observeres. Kombinere dette til tab eller gevinst på funktion nærmer tillader analyse af celle-autonome funktioner i en dåsedidat gen.
Den præsenterede protokol beskriver, hvordan vi vurderede funktionen af TORC2 komponent Sin1 i at kontrollere celle migration og actin dynamik in vivo fem. Men som nævnt i resultaterne, diskuteres yderligere, det kunne anvendes til at analysere den potentielle konsekvenser af ethvert kandidat-gen i at kontrollere cellemigrering in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Figur 1 viser omridset af protokollen.
1. Forberedelse af Needles til injektion og transplantation
Bemærk: Nåle kan fremstilles på ethvert tidspunkt og lagres. Opbevar dem i en petriskål, på et bånd af modellervoks. Seal fadet med parafilm at beskytte mod støv.
- For injektionsnåle, trække et glas kapillarrør (udvendig diameter 1,0 mm, indvendig diameter 0,58 mm, uden endeløse (se listen over Materials)) med en mikropipette aftrækker (se listen over Materials). Foretrækker korte og tynde nåle (tilspidset del på ca. 5 mm), da de er mere effektive til at gennembore chorion.
Bemærk: De injektionsnåle er engangsbrug. - Nål til Cell Transplantation
- Træk et glas kapillarrør (udvendig diameter 1,0 mm, indvendig diameter 0,78 mm, uden endeløse (se listen over Materials)) med en mikropipette aftrækker.
- Usynge en microforge (se listen over materialer), skære spidsen af nålen i det punkt, hvor den indvendige diameter er 35 um (lidt mere end diameteren af celler, der skal transplanteres).
- Bevel snittet ende af kapillar med en microgrinder (se listen over materialer) med en vinkel på 45 °.
- Eventuelt trække en modhage på enden af nålen ved hjælp af en microforge. Til dette, trykke den varme filament med spidsen af affasningen og træk det hurtigt væk, hvilket skaber en modhage, der kan hjælpe gennemtrængende embryoet.
- Montere kanylen på en nåleholder fastgjort til en sprøjte. Brug af sprøjten, skylles indersiden af nålen tre gange med 2% flussyre at fjerne rester glas, og derefter skylles tre gange med acetone.
Forsigtig: flussyre er giftigt, manipulere under kølerhjelmen, med handsker.
Bemærk: De celletransplantationstjenester nåle kan bruges flere gange.
2. Fremstilling afRetter til injektion og Cell Transplantation
- Heat 50 ml embryo medium 11 indeholdende 0,5 g agarose i en mikrobølgeovn i 1 min ved fuld effekt for at få 1% agarose i embryo medium. Afkøl agarosegel til ca. 60 ° C, og hæld 50 ml i en 90 mm petriskål. Placere på overfladen af gelen en specialdesignet støbeform (se listen over materiale), enten med linjer for injektionen parabol eller med brønde til celletransplantation skålen.
- Observere formen flyde på agarose, hvis agarose ikke er for varmt. Efter agarosegelen er indstillet, fjerne formen med pincet (figur 2A - B).
Bemærk: retter kan opbevares ved 4 ° C, op til et par uger. Opbevar dem i en lukket våd boks, for at undgå udtørring.
- Observere formen flyde på agarose, hvis agarose ikke er for varmt. Efter agarosegelen er indstillet, fjerne formen med pincet (figur 2A - B).
- Sæt fadet i en 28 ° C inkubator 30 minutter før brug.
3. Indsamling af embryoer og Injektion
- Injektionsopløsning Fremstilling
Bemærk: Actin-bindende domæneaf gær actinbindende protein 140 (ABP-140), såsom Lifeact bundet til mCherry (benævnt ABP140-mCherry) anvendes til at visualisere polymeriseret actin i cellen, for at analysere protrusive aktivitet. Tilføj en anden forbindelse for at teste funktionen af en kandidat-gen (f.eks mRNA af dominant negativ eller konstitutivt aktiv konstrukt, eller morpholino oligonukleotider). For at vurdere funktioner Sin1 som beskrevet i resultaterne (figur 3), vi brugte morpholino oligonukleotider. Som kontrol anvendte vi en morpholino identisk med sin1 morpholino men i 5 nukleotider fordelt langs sekvensen, således at denne kontrol morpholino ikke svarer til mål-RNA'et.- Thaw sin1 og 5-mismatch kontrol morpholinoer (2 mM stamopløsninger), og ABP140-mCherry mRNA på is. Tilføj 375 ng mRNA'er (75 ng / pl final) og 0,75 pi af enten sin1 eller 5-mismatch kontrol morpholino (0,3 mM endelig) i Danieau puffer (58 mM NaCl, 0,7 mMKCI, 0,4 mM MgSO4, 0,6 mM Ca (NO3) 2, 5,0 mM HEPES pH 7,6), for at nå et samlet volumen på 5 pi.
- Embryo Collection
Bemærk: for denne eksperimentelle oprettet både donor og vært embryoner er transgene, udtrykker GFP under kontrol af goosecoid (GSC) promotor for at visualisere den potentielle prechordal plade 11.- Saml Tg (GSC: GFP) æg. Placere omkring 80 æg i en 90 mm petriskål fyldt med embryo-medium og inkuberes ved 28 ° C.
- Sprøjt Donor Embryoner
- Under et stereomikroskop, forsigtigt klemme indsamlede fostre med pincet i linjerne i en injektion fad fyldt med embryo medium. Med pincet, orientere embryonerne med cellerne mod toppen. Placer injektion skål i inkubatoren ved 28 ° C, indtil embryonerne har nået 4-celle stadiet (1 timer efter befrugtning).
- Læg et kanyle med 2 piinjektionsopløsning. Stik nålen i en nåleholder (se listen over materialer), der er placeret i en mikro-manipulator (se listen over materialer) og forbundet med polytetrafluorethylen (PTFE) slange (se listen over Materials) til en luft Transjector (se listen over materialer ).
- Åbn kapillarrøret ved forsigtigt at røre spidsen med fine tænger. Hvis det er nødvendigt, skære kapillær åbne ved at klemme sin ekstremitet.
- Angiv en af de fire celler med nålen og injicere opløsningen i cellen for at fylde 70% af cellens volumen (2 nl). Injicer 30 embryoner.
Bemærk: At få nålen i cellen kan være svært, da plasmamembranen er blød. Sigter mod krydset mellem cellen og blommen letter nål penetration. - Placer embryoner i 28 ° C inkubator, indtil de har nået den sfære etape (4 timer efter befrugtning).
4. Forberedelse af embryoner til Cell Transplantation
- Forbered 20 ml embryo medium med 200 pi penicillin / streptomycin (se listen over materialer) (Pen / Strep EM).
- Dechorionation af embryonerne på kuglen etape (4 timer efter befrugtning)
Bemærk: Dechorionated embryoner er meget skrøbelige og vil eksplodere i tilfælde af kontakt med luft eller plast. De skal derfor placeres i agarose-coatede retter, og overføres med brand-poleret glas Pasteur-pipetter.- Ved hjælp af en plastik Pasteur pipette vært embryoner indsamlet på trin 3.2 og donor embryoner injiceret i trin 3.3 i to 35 mm petriskåle overtrukket med 1% agarose i embryo medium og fyldt med Pen / Strep EM. Hold vært embryoner og donor embryoner i to separate skåle.
- Manuelt udpakke embryoner fra deres chorions med fine pincet (se liste over materialer).
- Placer embryonerne i 28 ° C inkubator, indtil de har nået skjoldet etape (6 timer efter befrugtning).
5. Cell Transplantation
- Arranger Embryoner for cellen Transplantation.
- Under en fluorescerende stereomikroskop vælge donor embryoner udtrykker ABP140-mCherry (rød) i skjoldet (grøn).
- Ved hjælp af en flammepoleret Pasteur pipette embryonerne i brøndene af celletransplantation skålen fyldt med Pen / Strep EM. Placer værten embryoner i en række og donor embryoner i den nærliggende række.
- Ved hjælp af en øjenvippe, omhyggeligt orientere embryoner med skjoldet op.
Bemærk: placeringen af skjoldet kan vurderes ved GFP-ekspression eller anatomisk.
- Transplantation System Set-up.
Bemærk: transplantation system består af en nåleholder (se listen over materialer) forbundet med PTFE slange (se listen over Materials) og et rør stik (se listen over Materials) til en Hamilton-sprøjte med en mikro-drev (se listen of Materials). nåleholderener monteret på en 3-vejs mikromanipulator (se listen over Materials).- Ved hjælp af en nåleholder fastgjort til en sprøjte, skylles nålen for celle transplantation med 70% ethanol. Tør ved at suge op luft ind i nålen. Må ikke tørre ved at blæse, da dette kan resultere i støv at sidde fast i den koniske del af nålen.
- Stik nålen i nåleholderen forbundet til Hamilton-sprøjte, med den skrå kant opad.
- Shield-til-skjold Cell Transplantation
- Indtast skjold en donor embryo med transplantation nål og udarbejde omkring 10-20 celler mærket med ABP140-mCherry. undgå omhyggeligt tegning æggeblomme.
- Transplantation af cellerne ind i skjoldet af værtsembryo. Gentag indtil alle værten embryonerne er blevet transplanteret.
- Fjern eventuelle beskadigede embryoner med en brand-poleret Pasteur pipette. Placer transplanterede embryoner i inkubatoren ved 28 ° C og lade dem komme sig i ca. 30 minutter.
- Anvendelse af en nålholder fastgjort til en sprøjte, skylles celletransplantation nålen med vand og sæt den tilbage i en petriskål på et bånd af modellervoks. Seal fadet med parafilm.
6. (Valgfrit) Single Cell Transplantation
Bemærk: I embryonet, celler klæber til hinanden, således at det er vanskeligt at drage kun en celle i transplantation nål. Vi udviklede en modificeret protokol for nemt transplantation enkelt prechordal plade stamceller. Ideen er at dissociere celler inden transplantation. Fordi isolerede prechordal plade progenitorceller tendens til at miste deres identitet, vi genetisk pålægge dem en prospektiv prechordal plade identitet, ved at aktivere Nodal signalvej, i fravær af Sox32 transkriptionsfaktoren. Vi har kontrolleret, at disse inducerede celler opfører sig som endogene prechordal plade stamceller 8. Nedenfor er de specifikke trin for at udføre enkelt celle transplantationer. Cell dissociation opnås ved at placere embryoner i calciumfri Ringer 11, dissekere en eksplantat og mekanisk omrøring.
- Ved trin 2.1, forberede transplantation fad med 1% agarose i Calcium-fri Ringer stedet for Embryo Medium.
- Ved trin 3.1, foruden ABP140-mCherry RNA og sin1 morpholino, tilsættes 3 ng af RNA'er, der koder den aktive form af nodal receptor Taram-A (0,6 ng / pl final) og 1,25 pi morpholino mod sox32 (stamopløsning på 2 mM, dermed 0,5 mM endelig).
- Efter trin 4, overførsel tre udvalgte donor embryoner i fadet for celle transplantation fyldt med Pen / Strep Calcium-fri Ringer ved hjælp af en brand-poleret Pasteur pipette. Med fine pincet, dissekere en eksplantat indeholder de injicerede celler (ABP140-mCherry mærkede celler). Hurtigt kassere resten af embryonerne.
- Med en øjenvippe, blidt røre eksplantatet indtil cellerne dissociere.
- Udarbejd en enkelt isoleret celle i transplantation nålog transplantation det ind i skjoldet af en vært embryo.
- Ved hjælp af en brand-poleret Pasteur pipette overføre embryoner i en agarose-coatet fad fyldt med Pen / Strep EM. Placer embryoner i inkubatoren ved 28 ° C i 30 minutter.
7. Embryo Montering
- Imaging Chamber
- Metode 1: Brug et billeddannende kammer sammensat af en plast glider (75 * 25 * 0,5 mm) gennemboret med 4 huller (5,5 mm diameter), med 3 mm høje kanter på den ene side (fig 2C - D). Lim et dækglas på bagsiden, med cyanoacrylat lim (superlim).
Bemærk: Ved afslutningen af forsøget, placere kammeret i vand i en nat for at fjerne dækglasset og slippe af lim rester med sandpapir. - Metode 2: Brug 35 mm Mattek glasbund retter (se liste over Materials) med en 10 mm hul.
- Metode 1: Brug et billeddannende kammer sammensat af en plast glider (75 * 25 * 0,5 mm) gennemboret med 4 huller (5,5 mm diameter), med 3 mm høje kanter på den ene side (fig 2C - D). Lim et dækglas på bagsiden, med cyanoacrylat lim (superlim).
- Embryo Montering
- Fylde en glasbeholder med 1 ml varm 0,2% agarose i embryo-medium.Hold det ved 42 ° C i en varme-blok.
- Under fluorescerende stereomikroskop, skal du vælge et foster, hvor rode transplanterede celler er en del af den kommende prechordal plade mærket i grøn (dvs. røde transplanterede celler er inden for det grønne prospektive prechordal plade, og er begyndt at migrere mod dyret pol).
- Overfør en udvalgt embryo ind i agarose løsning med en brand-poleret Pasteur pipette. Kassér overskud af embryo medium fra pipetten. Tegn embryo i pipetten med agarose, og overføre fosteret i imaging kammer, deponering af en dråbe af agarose. Før agarose er indstillet, orientere foster med en øjenvippe. Placer den potentielle prechordal plade opad til billeddannelse med en opretstående mikroskop, eller på glasbund til billeddannelse med en omvendt mikroskop. Vent indtil agarosen er indstillet (ca. 1 min, afhængig af stuetemperatur) før montering anden embryo i den næste brønd i kammeret.
Bemærk: en billeddannende chamber indeholder 4 brønde giver mulighed for montering op til 4 embryoner. - Når agarose er indstillet, fylde kammeret med Pen / Strep EM for at undgå udtørring.
8. Levende Imaging
- Brug en 40X vand-nedsænkning langtrækkende linse. Brug passende filtersæt til billedet GFP og mCherry (for GFP: excitation BP 470/40, beam splitter FT 510, og emission BP 540/50, for mCherry: excitation BP 578/21, beam splitter FT 596, og emission LP 641 / 75). Juster eksponering varighed for at optimere billedet dynamik.
- Af billedet alle celler i pladen, erhverve z-stakke startede en par um over den potentielle prechordal plade (i ektoderm) og slutter et par um under den potentielle prechordal plade (i blommen). Brug en z-trin på 2 gm. For at optimere erhvervelse hastighed, skifte farver mellem z-stakke snarere end mellem rammer.
Bemærk: Dette kan føre til små forskelle mellem de grønne og røde billeder, men er ikke et problem da nogen præcis co-localization mellem den grønne og røde signaler er påkrævet. For at reducere yderligere billedbehandling tid og udsættelse for lys, kan grøn erhverves én gang hver 5 tidspunkter, hvilket er tilstrækkeligt til at identificere prechordal plade stamceller. - Ved hjælp af sådanne indstillinger, billede op til 4 embryoner inden for to-minutters tidsinterval, som er nødvendigt at analysere fremspring frekvens og retning. Til analyse af fremspring levetid, reducere tidsintervallet til 30 sek for at få højere tidsopløsning. Billede fra 60% epiboly til 80% epiboly.
9. Cell Dynamics Analyse
- Indlæs 4D billeder i ImageJ
Bemærk: Afhængigt af den software, der anvendes til erhvervelse, er billederne gemmes i forskellige formater (en fil pr billede, en fil pr z-stack, en fil for hele eksperimentet). Nogle ImageJ plugins er tilgængelige online for at åbne 4D stakke. Vores data gemmes som en fil pr z-stak. Fordi datasæt kan være store, kan det være hensigtsmæssigt at åbne kun en del heraf (nogle time point, eller et subpart af Z-stakken, eller 8-bit konverterede billeder ...). Vi bruger en skræddersyet ImageJ plugin til at gøre det, som vi ville være glade for at distribuere på anmodning. - Analyse af Orientering og Hyppighed af Cell Fremspring
- Brug GFP-billeder til at bestemme den vigtigste retning af fremadrettede prechordal plade migration. Tag dette som en reference for celle fremspring vinkelmålinger. Rotere stakken, således at denne reference retning er parallel med den ene side af billedet.
- Følge en celle. Vælg vinkel værktøj. For hver ramme og hvert fremspring, bruge vinklen værktøj til at måle vinklen mellem fremspringet og henvisningen retning (figur 3A). Brug Analyser / Mål kommando for at gemme værdien (eller tryk på M på tastaturet). Gem resultaterne som en txt-fil. Gentag med den næste celle.
- Importer data i R og plot vinkel fordeling som histogrammer. Brug Kolmogorov-Smirnov test (ks.test i R) til at sammenligne forskellige betingelser.
Bemærk: Vinklen værktøj giver værdier på mellem 0 ° og 180 °, tillader anvendelse af klassiske statistiske tests og ikke cirkulære tests. - Med dette datasæt, beregne emission frekvens som antal fremspring per celle per minut. Brug Student T-test (t.test i R) til at sammenligne forskellige betingelser.
- Analyse af Cell Fremspring Lifetime
- For hver celle og hvert fremspring, foranstaltning fremspring varighed (antallet af billeder, i hvilke fremspringet er til stede x tidsintervallet mellem rammer).
- Importer data i R. Brug Student T-test (t.test i R) til at sammenligne forskellige betingelser.
Bemærk: Andre migration funktioner kan være interessant at analysere for at karakterisere cellen migration. Disse omfatter celle spor, for hastighed, retning og vedholdenhed målinger, eller celle morfologi. Nogle kommercielle software applikationer er tilgængelige til at måle disse funktioner, men et stort antal af open source-software ansøgkationer og ImageJ plugins er også tilgængelige, som f.eks ADAPT at analysere morfologiske dynamik 12, DiPer at se på celle baner og retningsbestemt vedholdenhed 13, CellTrack at spore celle grænser under migration 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den præsenterede teknik blev anvendt til at analysere den rolle, Sin1, en af de centrale komponenter i Tor komplekse 2 (TORC2), i at kontrollere in vivo celle migration. Anvendelsen af celletransplantation tillader mærkning af isolerede celler og analyse af celle--autonome virkninger. Movie S1 viser migration af transplanterede prechordal plade stamceller. Actin mærkning med ABP140 tillader nem visualisering af actin-rige cytoplasmiske fremspring. Vi målte deres hyppighed og orientering. Wild-type celler producerer hyppige store cytoplasmatiske fremspring orienteret i retning af dyret pole, dvs. i retning af migration (figur 3B). Tab af funktion af Sin1 fører til en drastisk reduktion af antallet af fremspring, og randomisering af de resterende, hvilket viser betydningen af sin1 ved styring actin-rige fremspring formation. Interessant, kan denne fænotype reddes af eXPRESSION af en konstitutivt aktiv form af Rac1 15, hvilket kraftigt antyder, at TorC2 styrer actin dynamik og celle fremspring dannelse gennem Rac1 (figur 3B).
Den præsenterede teknik blev også anvendt til at karakterisere rollen som Arpin, en nylig identificeret hæmmer af ARP2 / 3-kompleks, på celle dynamik 4. Tab af Arpin funktion fører til en stigning i fremspring frekvens (gennemsnit på celler, der huser et fremspring på et givet tidspunkt). Dette kan enten skyldes hyppigere fremspring formationen eller til en stigning i fremspring stabilitet. Måling fremspring levetid afsløret, at fravær af Arpin, er fremspring tidsmæssig vedholdenhed fordoblet (figur 3C). Dette stemmer overens med den rolle, Arpin som ARP2 / 3-inhibitor, der kan fremme fremspringet tilbagetrækning, og foreslår, at Arpin påvirker fremspringet frekvens ved modulering fremspring stabilitet, i stedet forfremspring indvielse.
Figur 1:. Træk proceduren Tg (GSC: GFP) embryoner injiceres ved 4-celle stadiet (1 timer efter befrugtning). Efter 5 timer ved 28 ° C, embryoer viser ABP140-mCherry positive celler i skjoldet (GFP +) vælges som donor embryoner. Shield celler er udarbejdet inden for transplantation nål og overføres til skjoldet af en vært foster. Efter 0,5 time for inddrivelse, er vært embryoner monteret og filmede med et epifluorescensmikroskop (40X objektiv). HPF:. timer efter befrugtning Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Transplantatipå parabol og Imaging salen. (A) Transplantation fad med enkelte brønde. (B) Mold for celle transplantation skålen. (C) Hjemmelavet imaging kammer. (D) Skematisk tegning af den hjemmelavede imaging kammer. Scale bar = 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Resultater fra Cell Dynamics Analyse (A) Ordning af fremspring vinkel måling. (B) Analyse af celle fremspring orientering og frekvens. I fravær af Sin1 (Mo-Sin1), celler udleder færre fremspring og de resterende fremspring er tilfældigt orienteret. Denne fænotype kan reddes af ekspression af et konstitutivt aktiv form af GTPase Rac1 (Mo-Sin1 + CA-Rac1). Modificeret fra Dumortier og David, 2015 5. (C) Analyse af fremspring levetid. I fravær af Arpin (Mo-Arpin), er fremspring frekvens øges. Dette skyldes en stigning i fremspring levetid. Genindfører en arpin RNA ufølsom over for morpholino genskaber denne hyper protrusive fænotype. Modificeret fra Dang et al. 2013 4. Scale bar = 10 um. A: Anterior; P: Posterior, L: Venstre, R:. Lige Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: Sin1 kontrol dannelsen af celle fremspring, gennem Rac1 (Højreklik for at downloade). Transplanterede prechordal plade stamceller, injiceret medABP140-mCherrry RNA og en kontrolgruppe morpholino, eller sin1 morpholino, eller sin1 morpholino og RNA for konstitutive form af Rac1. Fremspring frekvens og orientering blev målt på disse billeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol viser en nem måde at studere rollen af en kandidat-gen i cellemigrering in vivo, ved at kombinere skabelse af kimære embryoner under anvendelse celletransplantation med levende billeddannelse.
Oprettelse af mosaik embryoner
Studere dynamikken i en celle kræver visualisering af sin kontur til at analysere cytoplasmatiske udvidelser. Dette kan opnås ved mærkning isolerede celler i en ellers umærket - eller forskelligt mærket - miljø, hvilket giver en god visuel kontrast.
En nem måde at stokastisk mærke en del af celler i embryonet er at injicere plasmid-DNA ved 1-celle stadium 16. De injicerede plasmider danne aggregater, der er tilfældigt og ulige udskilt i celler under celledeling. Dette fører til ekspressionen af plasmidet i en tilfældig undergruppe af celler, og er således en meget hurtig, nem og ikke-invasiv metode til generering moSAIC embryoner. Celler, der udtrykker de injicerede plasmid tendens til at danne klynger, og sandsynligheden for at finde embryoner indeholdende få isolerede udtrykkende celler i den prospektive prechordal plade er ganske lav. Endvidere anvendelse af plasmid DNA tilbyder meget begrænset kontrol af ekspressionen af den injicerede konstrukt. Oprettelsen af kimære embryoner ved celletransplantation, selv om de teknisk vanskeligere end plasmid DNA injektion, tilbyder et antal fordele: kontrol med antallet af transplanterede celler, styring af ekspressionsniveauet af konstruktionerne (RNA injektion), og sidst men ikke mindst , celle transplantationer muligt at teste for celle-autonome effekter, ved at skabe mosaik embryoner, hvor transplanterede celler indeholder tab eller gevinst på funktions-konstruktioner. Omvendt kan transplantationer også anvendes til at vurdere ikke-selvstændige rolle af miljøet ved at transplantere vildtypeceller i embryoner der er blevet ændret. Dette kan være af særlig interesse til testfor eksempel funktionen af ekstracellulære matrixbestanddele, der er særligt relevante for cellemigrering analyse.
En detaljeret protokol for celle transplantation er allerede blevet beskrevet 10. I forhold til denne protokol, vil vi gerne diskutere to vigtigste forskelle i vores procedure.
Den første forskel er relateret til den fase af donorembryoner injektion. Ifølge vores erfaring, embryoner injiceret i 1-celle stadium med RNA'er af et fluorescerende protein udtrykker ikke homogent det fluorescerende protein i alle celler, på grund af en ufuldstændig diffusion af RNA'er i cellen. Injektion af donor embryoner på det 4-celle stadiet i en af de fire celler muligt at få en homogen klon af celler, som er af særlig interesse, når RNA'er af det fluorescerende protein er co-injiceret med andre RNA'er, som ikke kan spores.
Den anden primære forskel er brugen af luft i stedet for olie i transplantation sprøjte. Den største ulempe ved et luftfyldt system er den inerti, der følger af elasticiteten af luften. Olie tværtimod bliver usammentrykkelige, giver god styring af sugning og tryk. Men med lidt træning, og ved at opretholde grænsefladen mellem luft og embryo-medium i den tynde, tilspidsede del af nålen, kontrol med sugning og tryk med et luftfyldt system er tilstrækkeligt til at transplantere celler ved skjoldet stadium. For senere stadier, som celler bliver mindre og mere sammenhængende, sugningen kræver et højt tryk, der skal styres meget præcist, hvilket ikke kan opnås med et luftfyldt setup. Brug luft i stedet for olie letter opsætningen, som systemet fyldes med olie uden nogen luftboble er tricky. Desuden undgår fylde transplantation nål med olie. Dette gør det muligt transplantation nåle skal genbruges, og derfor skal omhyggeligt forberedt. Vi mener, at en nål uden skarpe kanter og korrekt diameter er nøglen til Successful transplantation. Denne transplantation skridt er helt klart en af de kritiske trin i protokollen, som kræver øvelse, før det let udføres.
Vi har også foreslået en særlig procedure for at transplantere enkelte celler, som består i at dissociere celler før transplantation, for at trække en unik celle i transplantation nål. Dette indebærer, at forbigående celle dissociation ikke vil ændre deres identitet og / eller adfærd. For prechordal plade stamceller, vi genetisk pålægge celle identitet, og har nøje kontrolleret, at disse celler opfører sig som ikke-dissocierede dem. Men vi kan ikke formelt udelukke, at dissociation og / eller genetisk induktion fremkalde ubemærket ændringer i cellerne. Transplantere enkelte celler uden at ophæve dem er mulig. Celler bør udarbejdes omhyggeligt i transplantation nål. Men i det mindste i vores hænder, succesrate er ganske lav, enten fordi mere end én celle kommer ind i needle, eller fordi cellen saks, når der er udarbejdet og dør i nål eller en gang transplanteret.
Epifluorescens versus hurtig konfokal billedbehandling
Brugen af celle transplantation for at skabe mosaik embryoner muliggør mærkning af isolerede celler, adskilt fra andre mærkede celler. I denne sammenhæng kan god billeddannelse af cellemorfologi og dynamik opnås med standard epifluorescensmikroskopi, som foreslået i protokollen. Dette har den indlysende fordel at være et relativt udbredt udstyr og et billigt alternativ til dyrere konfokal billeddannelse.
For præcise subcellulære lokaliseringer kan konfokal billeddannelse bruges til at forbedre beslutning, især aksial opløsning. At stadig få tilstrækkelig tidsmæssig opløsning, bør anvendes hurtigt konfokal billeddannelse. Fra vores erfaring, spinning-disc mikroskoper tilbyder et godt kompromis mellem opløsning, hastighed og foto-toksicitet. Hurtig konfokalt microscopes (ligesom resonante scanning mikroskoper) er gode muligheder så godt, men mindre hyppig og dyrere.
cytoskeleton mærkning
God mærkning af actinfilamenter og deres dynamik er afgørende for at studere mekanismerne for actin-baserede celle migration. Selvom membranbundne fluorescerende markører er mere effektivt at analysere celle konturer, actin mærkning tillader en meget bedre visualisering af cellen fremspring. Navnlig hvis tre mærkede celler kommer i kontakt, er det meget vanskeligt at identificere en cytoplasmatisk forlængelse placeret mellem to tilstødende celler som omridset af forlængelsen og membranen af de omkringliggende celler kan blive blandet op. Mærkning actinfilamenter muliggør entydig påvisning af actin-baserede celle fremspring, som vi fokuserede. Hvis cellemorfologi skulle kvantificeres, ville en mærkning membran være at foretrække. En anden mulighed er at bruge både mærkningen, enten under anvendelse af 3-farve billedbehandling (én for det transgene line, ét for actin og en for membranen), eller ved GFP mærkning membranen. I transgene linje, GFP er cytoplasmisk, og goosecoid-GFP-positive celler kan således identificeres, også selv om membranen er GFP-mærket.
I de seneste år har en række sonder blevet brugt til at mærke actin i levende prøver. De første var direkte fusioner til actin monomerer. Disse præsenteres to store ulemper. Først, de mærkede alle actin og ikke specifikt polymeriseret actin. For det andet, var de ofte giftige. Proberne anvendes på nuværende tidspunkt er filamentøse actinbindende domæner fusioneret til fluorescerende reportere. I denne protokol, brugte vi ABP140 17 (actin bindende domæne af gær actin bindende protein 140), som i øjeblikket er den mest anvendte markør for trådformede actin, og mærker alle trådformede actin. Utrophin 18 (calponin homologi domæne) etiketter også trådformede actin, men synes at mærke kun stabile filamenter. Denne forskel er blevet anvendt til idencere dynamisk actinfilamenter, som dem mærket ved ABP140 og ikke Utrophin 19.
For nylig er det blevet rapporteret i flue, ABP140 og Utrophin kunne have toksiske virkninger, især mere end lange udtryk 20. Selvom vi ikke har bemærket nogen migration defekter i ABP140-mærkede celler, kan vi ikke udelukke, at ABP140 udtryk kan forstyrre endogene actin dynamik. En tredje probe for filamentøs actin blev for nylig rapporteret 21. F-tractin (actin-bindende domæne fra rotte inositoltriphosphat 3-kinase) er blevet beskrevet som en trofast reporter af filamentøs actin, hvilket ikke ville vise toksiske virkninger 20,22. Så vidt vi ved, har anvendelsen af F-tractin ikke blevet rapporteret i zebrafisk endnu.
Foruden actin, kunne mange andre cellebestanddele mærkes for at forbedre vores forståelse af cellemigrering. Dette omfatter andre cytoskelet komponenter som myosin, mikrotubuli, centrosomer samt knegne regulatorer af celle migration (aktiverede former af den lille GTPaser Rho, Rac og Cdc42, fluorescerende prober til PIP3 ...) eller proteiner involveret i celleadhæsion (integriner cadheriner ...).
Samlet set denne protokol samler en række tidligere beskrevne værktøjer og teknikker til at foreslå en hurtig og nemt system til at teste inddragelse af en kandidat gen i at kontrollere celle migration in vivo. Vi brugte prospektive prechordal plade migration, da det er en interessant model af instrueret kollektiv migration, og på grund af den tilgængelige transgene linje mærkning det. Imidlertid kunne en lignende protokol tilpasses til at analysere andre begivenheder migration opstår under udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
- Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), Cambridge, England 921-932 (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
- Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
- Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
- Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
- Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
- Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
