Introduction
Dans les organismes multicellulaires, la migration cellulaire est essentielle à la fois pour le développement de l'embryon où elle assure l'organisation des cellules dans les tissus et organes, et la vie adulte, où elle participe à l'homéostasie tissulaire (cicatrisation des plaies) et l'immunité. En plus de ces fonctions physiologiques, la migration des cellules est également impliqué dans diverses situations pathologiques, y compris, en particulier, les métastases du cancer.
La migration cellulaire a été analysée in vitro pendant des décennies, fournissant une compréhension globale des mécanismes moléculaires assurant les mouvements cellulaires sur des surfaces planes. In vivo cependant, les cellules sont confrontés à un environnement plus complexe. Il est apparu clairement au cours des dernières années que la migration au sein d'un organisme peut être influencé par des signaux externes tels que la matrice extracellulaire, des cellules ou des chimiokines sécrétées guidage migration voisine, et que les mécanismes d'entraînement la migration cellulaire peut varier de ce qui a été décrit <em> in vitro 1,2. Les mécanismes assurant la migration cellulaire in vivo ont reçu moins d' attention jusqu'à présent, principalement en raison de la difficulté technique accrue, par rapport à des études in vitro. In vivo analyse de la migration cellulaire , en particulier nécessite un accès optique directe aux cellules migrantes, techniques pour marquer les cellules uniques afin de voir leur dynamique et leur morphologie, ainsi que le gain ou la perte de fonction des approches pour tester le rôle des gènes candidats. Jusqu'à présent, seuls quelques systèmes modèles hébergeant ces caractéristiques ont été utilisées pour disséquer vivo la migration cellulaire 3.
Nous avons récemment utilisé la migration de la plaque préchordale prospective dans les embryons de poisson zèbre début comme un nouveau système de modèle pratique pour évaluer la fonction des gènes candidats dans le contrôle de la migration cellulaire in vivo 4,5 dans. Plaque préchordale prospective (également connu sous mesendoderm antérieur) est un groupe de cellules formant au début de Gastrulation sur la face dorsale de l'embryon. Au cours de la gastrulation ce groupe migre collectivement vers le pôle animal de l'embryon 6-8, pour former la plaque préchordale, un épaississement de mesendodermal, antérieure à la notochorde, et qui sous - tend la plaque neurale. La partie antérieure de la plaque préchordale donnera lieu à l' éclosion de la glande, tandis que sa partie postérieure contribue probablement à la tête mésoderme 9. Merci au développement externe et de la clarté optique de l'embryon de poisson, la migration cellulaire peut être directement et facilement observée dans cette structure.
La transplantation de cellules est une technique très puissante qui permet la création rapide et facile des embryons en mosaïque 10. Exprimer des marqueurs fluorescents cytosquelette dans les résultats des cellules transplantées dans l'étiquetage des cellules isolées, la morphologie et la dynamique qui peuvent être facilement observés. La combinaison de cette perte ou gain de fonction des approches permet l'analyse des fonctions des cellules autonomes d'une boîtegène didat.
Le protocole présenté décrit comment nous avons évalué la fonction de la composante sin1 de TORC2 dans le contrôle de la migration cellulaire et l' actine dynamique in vivo 5. Mais, comme mentionné dans les résultats et discuté plus loin, il pourrait être utilisé pour analyser l'implication potentielle d'un gène candidat pour contrôler la migration des cellules in vivo.
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Protocol
Remarque: La figure 1 présente les grandes lignes du protocole.
1. Préparation des aiguilles pour injection et la transplantation
Remarque: Les aiguilles peuvent être préparés à tout moment et stocké. Gardez-les dans une boîte de Pétri, sur une bande de pâte à modeler. Sceller le plat avec du parafilm pour protéger de la poussière.
- Pour aiguilles d'injection, tirez un capillaire en verre (diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur de 0,58 mm, sans filament (voir la liste des matériaux)) avec un extracteur micropipette (voir la liste des matériaux). Préférez aiguilles courtes et minces (partie conique d'environ 5 mm), car ils sont plus efficaces pour percer le chorion.
Remarque: Les aiguilles d'injection sont à usage unique. - Aiguille pour la transplantation de cellules
- Tirez un capillaire en verre (diamètre extérieur 1,0 mm, diamètre intérieur de 0,78 mm, sans filament (voir la liste des matériaux)) avec un extracteur micropipette.
- Uchanter une microforge (voir la liste des matériaux), couper la pointe de l'aiguille au point où le diamètre intérieur est de 35 um (un peu plus que le diamètre des cellules à transplanter).
- Bevel le bout du capillaire avec un micromoteur (voir la liste des matériaux) avec un angle de 45 ° de coupe.
- Eventuellement, tirer un ardillon sur l'extrémité de l'aiguille en utilisant un microforge. Pour cela, appuyez sur le filament chaud avec la pointe du biseau et tirez rapidement loin, créant une barbe qui peut aider à pénétrer l'embryon.
- Monter l'aiguille sur un porte-aiguille fixée à une seringue. À l'aide de la seringue, rincer l'intérieur de l'aiguille à trois reprises avec de l'acide fluorhydrique à 2% pour éliminer les résidus de verre, puis rincer trois fois avec de l'acétone.
Attention: l'acide fluorhydrique est toxique, manipuler sous le capot, avec des gants.
Remarque: Les aiguilles de transplantation de cellules peuvent être utilisés plusieurs fois.
2. Préparation de laVaisselle pour injection et Cell Transplantation
- Chauffer 50 ml d'embryon moyenne 11 contenant 0,5 g d'agarose dans un micro - ondes pendant 1 min à pleine puissance pour obtenir 1% d' agarose dans un milieu d'embryon. Refroidir le gel d'agarose à environ 60 ° C et verser 50 ml dans une boîte de Pétri 90 mm. Placer à la surface du gel un moule spécialement conçu (voir la liste de matériel), soit avec des lignes pour le plat d'injection ou de puits pour le plat de la transplantation de cellules.
- Observez le flotteur de moule sur l'agarose, si l'agarose est pas trop chaud. Après le gel d' agarose est réglé, retirer le moule avec une pince (Figure 2A - B).
Remarque: Les plats peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'à quelques semaines. Gardez-les dans une boîte humide fermée, pour éviter le séchage.
- Observez le flotteur de moule sur l'agarose, si l'agarose est pas trop chaud. Après le gel d' agarose est réglé, retirer le moule avec une pince (Figure 2A - B).
- Placer le plat dans un 28 ° C incubateur 30 min avant utilisation.
3. Collecte des embryons et injection
- Injection Solution Préparation
Remarque: domaine de liaison à l'actinede la levure de protéines 140 (ABP-140), tels que Lifeact lié à mCherry actine (dénommé ABP140-mCherry) est utilisée pour visualiser l'actine polymérisée dans la cellule, afin d'analyser l'activité protrusion. Ajouter un composé à tester la fonction d'un gène candidat (par exemple , l' ARNm de construction négative ou constitutivement active dominante, ou des oligonucléotides morpholino). Pour évaluer les fonctions de sin1 comme décrit dans les résultats (Figure 3), nous avons utilisé des oligonucléotides morpholino. Comme témoin, on a utilisé un groupe morpholino identique à celui sin1 morpholino , mais pour 5 nucléotides répartis le long de la séquence de telle sorte que ce contrôle morpholino ne correspond pas à l'ARN cible.- Sin1 Décongeler et morpholinos de contrôle 5-mismatch (solutions mères 2 mM), et ABP140-mCherry ARNm sur la glace. Ajouter 375 ng d'ARNm (75 ng / ul final) et 0,75 ul de sin1 ou 5-mismatch morpholino de contrôle (0,3 mM final) dans un tampon Danieau (58 mM de NaCl, 0,7 mMKCl, 0,4 mM MgSO4, 0,6 mM de Ca (NO 3) 2, 5,0 mM de HEPES , pH 7,6) pour atteindre un volume total de 5 ul.
- Embryo Collection
Remarque: pour cette expérimentation a mis en place les deux embryons donateurs et d' accueil sont transgéniques, exprimant la GFP sous le contrôle de l'goosecoid (SGC) promoteur afin de visualiser la plaque préchordale prospective 11.- Recueillir Tg (SGC: gfp) œufs. Placez environ 80 oeufs dans un plat de 90 mm de Pétri remplie avec le milieu de l'embryon et incuber à 28 ° C.
- Injecter Embryons donateurs
- En vertu d'un stéréomicroscope, presser doucement embryons collectés avec une pince dans les lignes d'un plat d'injection rempli avec le milieu de l'embryon. En utilisant des pinces, orienter les embryons avec les cellules vers le haut. Placer le plat d'injection dans l'incubateur à 28 ° C jusqu'à ce que les embryons ont atteint le stade 4 cellules (1 h après la fécondation).
- Charger une aiguille d'injection avec 2 pi deSolution d'injection. Insérez l'aiguille dans un porte-aiguille (voir la liste des matériaux) qui est placé dans un micro-manipulateur (voir la liste des matériaux) et de raccords en polytétrafluoroéthylène (PTFE) tube (voir la liste des matériaux) à un transjecteur d'air (voir la liste des matériaux ).
- Ouvrez le capillaire en touchant doucement la pointe avec une pince fine. Si nécessaire, couper le capillaire ouvert en pinçant son extrémité.
- Entrer dans l'un des quatre cellules avec l'aiguille et injecter la solution dans la cellule afin de remplir 70% du volume de la cellule (2 nl). Injecter 30 embryons.
Remarque: Obtenir l'aiguille dans la cellule peut être difficile, car la membrane plasmique est douce. Visant à la jonction entre la cellule et le jaune facilite la pénétration de l'aiguille. - Placer les embryons dans le 28 ° C incubateur jusqu'à ce qu'ils aient atteint le stade de la sphère (4 heures après la fécondation).
4. Préparation de la Embryons pour la Cellule Transplantation
- Préparer 20 ml de milieu d'embryon avec 200 ul de pénicilline / streptomycine (voir la liste des matériaux) (Pen / Strep EM).
- Dechorionation des embryons au stade de la sphère (4 heures après la fécondation)
Remarque: les embryons dechorionated sont très fragiles et vont exploser en cas de contact avec de l'air ou de plastique. Ils doivent donc être placés dans des boîtes d'agarose revêtues, et transférés avec des pipettes Pasteur en verre poli au feu.- En utilisant une pipette Pasteur en plastique, transférer les embryons hôtes recueillies à l'étape 3.2 et les embryons donneurs injectés à l'étape 3.3 en deux 35 mm des boîtes de Petri revêtues d'agarose à 1% dans le milieu de l'embryon et remplis de Pen / Strep EM. Gardez embryons hôtes et des embryons donateurs dans deux plats séparés.
- extraire manuellement les embryons de leurs chorions avec des pinces fines (voir la liste des matériaux).
- Placer les embryons dans le 28 ° C incubateur jusqu'à ce qu'ils aient atteint le stade de blindage (6 heures après la fécondation).
5. Cell Transplantation
- Disposer les embryons pour la transplantation de cellules.
- Sous un stéréomicroscope fluorescent, sélectionner des embryons donateurs exprimant ABP140-mCherry (rouge) dans le bouclier (vert).
- En utilisant une pipette Pasteur polie au feu, transférer les embryons dans les puits de la boîte de transplantation de cellules remplie de Pen / Strep EM. Placer les embryons hôtes dans une rangée et les embryons donateurs dans la rangée voisine.
- L'utilisation d'un cil, orienter soigneusement les embryons avec le bouclier vers le haut.
Remarque: la position de l'écran peut être évaluée par l'expression de la GFP ou anatomiquement.
- Transplantation System Set-up.
Remarque: Le système de transplantation est composé d'un porte-aiguille (voir la liste des matériaux) relié à un tube de PTFE (voir la liste des matériaux) et un connecteur de tube (voir la liste des matériaux) à une seringue Hamilton équipée d'un micro-drive (voir la liste des matériaux). Le porte-aiguilleest montée sur un micromanipulateur 3 voies (voir la liste des matériaux).- Au moyen d'un porte-aiguille fixée à une seringue, rincer l'aiguille pour la transplantation de cellules avec 70% d'éthanol. Sec en aspirant l'air dans l'aiguille. Ne pas sécher en soufflant, car cela peut entraîner dans la poussière se coincer dans la partie conique de l'aiguille.
- Insérer l'aiguille dans le porte-aiguille reliée à la seringue Hamilton, avec le biseau vers le haut.
- Bouclier à bouclier Cell Transplantation
- Entrez le bouclier d'un embryon donneur avec l'aiguille de transplantation et établit environ 10-20 cellules marquées avec ABP140-mCherry. Eviter soigneusement dessin jaune.
- Transplanter les cellules dans le bouclier de l'embryon hôte. Répétez jusqu'à ce que tous les embryons hôtes ont été transplantés.
- Retirez tous les embryons endommagés avec une pipette Pasteur polie au feu. Placer les embryons transplantés dans l'incubateur à 28 ° C et laissez-les récupérer pendant environ 30 min.
- En utilisant une aiguillesupport fixé à une seringue, rincer l'aiguille de transplantation de cellules avec de l'eau et placez-le dans une boîte de Pétri sur une bande de pâte à modeler. Sceller le plat avec du parafilm.
6. (EN OPTION) Single Cell Transplantation
Remarque: Dans l'embryon, les cellules adhèrent les unes aux autres, de sorte qu'il est difficile d'en tirer une seule cellule dans l'aiguille de transplantation. Nous avons développé un protocole modifié pour transplanter facilement les cellules progénitrices plaque préchordale simples. L'idée consiste à dissocier les cellules avant transplantation. Parce que les cellules progénitrices plaque préchordale isolées ont tendance à perdre leur identité, nous les imposons génétiquement une identité de plaque préchordale prospective, en activant la voie de signalisation Nodal, en l'absence du facteur de transcription Sox32. Nous avons vérifié que les cellules induites se comportent comme des cellules progénitrices plaque préchordale endogènes 8. Voici les étapes spécifiques pour effectuer des transplantations de cellules isolées. cellule dissociation est obtenue en plaçant des embryons dans Ringer sans calcium-11, la dissection d' un explant et mécaniquement en remuant.
- A l'étape 2.1, préparer le plat de transplantation avec 1% d'agarose dans Ringer sans calcium au lieu de Embryo Medium.
- A l' étape 3.1, en plus de ABP140-mCherry ARN et morpholino sin1, ajouter 3 ng d'ARN codant pour la forme active du récepteur Nodal Taram-A (0,6 ng / ul final) et 1,25 ul de morpholino contre sox32 (solution mère à 2 mM, d'où 0,5 mM final).
- Après l'étape 4, le transfert de trois embryons donneurs sélectionnés dans le plat pour la transplantation de cellules remplie de Pen / Strep Ringer sans calcium à l'aide d'une pipette Pasteur polie au feu. Avec des pinces fines, disséquer un explant contenant les cellules injectées (cellules marquées ABP140-mCherry). Rapidement jeter le reste des embryons.
- Avec un cil, remuer doucement jusqu'à ce que l'expiant cellules se dissocient.
- Dressez une seule cellule isolée dans l'aiguille de transplantationet le transplanter dans le bouclier d'un embryon hôte.
- En utilisant une pipette Pasteur polie au feu, transférer les embryons dans un plat d'agarose revêtu rempli de Pen / Strep EM. Placer les embryons dans l'incubateur à 28 ° C pendant 30 min.
7. Embryon de montage
- Imaging Chambre
- Méthode 1: utiliser une chambre d'imagerie composée d'une lame en plastique (75 * 25 * 0,5 mm) percé de 4 trous (diamètre 5,5 mm), avec 3 mm des bords élevés sur un côté (figure 2C - D). Collez une lamelle de verre sur la face arrière, avec la colle cyanoacrylate (super glue).
Remarque: A la fin de l'expérience, placer la chambre dans l'eau pendant une nuit pour enlever la lamelle et de se débarrasser des résidus de colle avec du papier de verre. - Méthode 2: utiliser 35 mm MatTek plats à fond de verre (voir la liste des matériaux) avec un trou de 10 mm.
- Méthode 1: utiliser une chambre d'imagerie composée d'une lame en plastique (75 * 25 * 0,5 mm) percé de 4 trous (diamètre 5,5 mm), avec 3 mm des bords élevés sur un côté (figure 2C - D). Collez une lamelle de verre sur la face arrière, avec la colle cyanoacrylate (super glue).
- embryon de montage
- Remplir un flacon en verre avec 1 ml de chaud 0,2% d'agarose dans un milieu d'embryon.Gardez-le à 42 ° C dans un bloc thermique.
- Sous le stéréomicroscope fluorescent, sélectionnez un embryon dans lequel les globules rouges transplantés font partie de la plaque préchordale prospective marquée en vert ( à savoir les cellules transplantées rouges sont dans la plaque préchordale prospective verte, et ont commencé à migrer vers le pôle animal).
- Transfert d'un embryon sélectionné dans la solution d'agarose avec une pipette Pasteur polie au feu. Jeter l'excès de milieu d'embryon de la pipette. Dessiner l'embryon dans la pipette avec de l'agarose et transfert de l'embryon dans la chambre d'imagerie, le dépôt d'une goutte d'agarose. Avant agarose est défini, orienter l'embryon avec un cil. Placer la plaque préchordale potentiel vers le haut pour l'imagerie avec un microscope droit ou sur le fond en verre pour une imagerie avec un microscope inversé. Attendez jusqu'à ce que l'agarose est fixé (environ 1 min, en fonction de la température ambiante) avant de monter un autre embryon dans le prochain puits de la chambre.
Remarque: un cha d'imageriembre contenant 4 puits permet de monter jusqu'à 4 embryons. - Lorsque l'agarose est réglé, remplir la chambre avec Pen / Strep EM pour éviter le séchage.
8. Imagerie en direct
- Utilisez un objectif à long terme 40X immersion dans l'eau. Utilisez des filtres appropriés à l'image GFP et mCherry (pour la GFP: excitation BP 470/40, diviseur de faisceau FT 510, et l'émission BP 540/50; pour mCherry: excitation BP 578/21, diviseur de faisceau FT 596, et l'émission LP 641 / 75). Régler la durée d'exposition afin d'optimiser la dynamique de l'image.
- Pour l'image toutes les cellules de la plaque, acquérir z-piles, en commençant quelques microns au-dessus de la plaque préchordale prospective (dans l'ectoderme) et se terminant quelques microns en dessous de la plaque préchordale prospective (dans le jaune). Utilisez un z-étape de 2 pm. Pour optimiser la vitesse d'acquisition, changer de couleur entre les z-piles plutôt que entre les images.
Remarque: Cela peut conduire à de légères différences entre les images vertes et rouges, mais pas un problème puisque aucune co précise-localisation entre les signaux verts et rouges est nécessaire. Pour réduire davantage le temps d'imagerie et de l'exposition à la lumière, vert peut être acquis qu'une fois tous les 5 points de temps, ce qui est suffisant pour identifier les cellules progénitrices plaque préchordale. - L'utilisation de ces paramètres, l'image jusqu'à 4 embryons dans l'intervalle de temps de deux minutes qui est nécessaire pour analyser la fréquence et l'orientation saillie. Pour l'analyse de la saillie durée de vie, de réduire l'intervalle de temps de 30 secondes pour obtenir une meilleure résolution temporelle. Image de 60% à 80% épibolie épibolie.
9. Dynamics Cell Analyse
- Charger images 4D en ImageJ
Remarque: Selon le logiciel utilisé pour l'acquisition, les images sont stockées dans des formats différents (un fichier par image, un fichier par z-stack, un fichier pour l'ensemble de l'expérience). Certains Plugins ImageJ sont disponibles en ligne pour ouvrir des piles 4D. Nos données sont stockées sous forme d'un fichier par z-stack. Parce que l'ensemble de données peut être grand, il peut être commode d'ouvrir seulement une partie de celui-ci (certains timles points e, ou une sous-partie de la pile en Z ou 8 bits converties images ...). Nous utilisons un ImageJ plug-in sur-mesure de le faire, que nous serions heureux de distribuer sur demande. - Analyse de l'orientation et de la fréquence des Protrusions cellulaires
- Utiliser des images GFP pour déterminer la direction principale de prospective migration de la plaque préchordale. Prenez cela comme une référence pour les mesures de l'angle des saillies cellulaires. Faire tourner la pile, de sorte que cette direction de référence est parallèle à un côté de l'image.
- Suivez une cellule. Outil de sélection d'angle. Pour chaque cadre et chaque saillie, utilisez l'outil d'angle pour mesurer l'angle entre la saillie et la direction de référence (figure 3A). Utilisez la commande Analyser / Mesurer pour stocker la valeur (ou appuyez sur M sur le clavier). Enregistrer les résultats dans un fichier txt. Répéter l'opération avec la cellule suivante.
- Importez les données dans la distribution de R et l'angle de la parcelle sous forme d'histogrammes. Utilisez le test de Kolmogorov-Smirnov (ks.test en R) pour comparer les différentes conditions.
Remarque: L'outil d'angle fournit des valeurs comprises entre 0 ° et 180 °, ce qui permet l'utilisation de tests statistiques classiques et des tests non circulaires. - Avec cet ensemble de données, calculer la fréquence d'émission que le nombre de saillies par cellule par minute. Utiliser Student T-test (t.test en R) pour comparer des conditions différentes.
- Analyse de la Cellule Protrusions Lifetime
- Pour chaque cellule et chaque saillie, la durée du dépassement de mesure (nombre de trames au cours de laquelle la saillie est présent x intervalle de temps entre les trames).
- Importez les données dans R. Utiliser Student T-test (t.test en R) pour comparer les différentes conditions.
Remarque: Les autres caractéristiques de migration peut être intéressant d'analyser afin de caractériser la migration cellulaire. Ceux-ci comprennent des pistes de cellules, pour la vitesse, la direction et les mesures de la persistance ou la morphologie des cellules. Certaines applications de logiciels commerciaux sont disponibles pour mesurer ces caractéristiques, mais un grand nombre d'appli de logiciels open-sourcecations et plugins ImageJ sont également disponibles, comme par exemple ADAPT pour analyser morphodynamique 12, DIPER à regarder les trajectoires cellulaires et la persistance directionnelle 13, Celltrack pour suivre les limites des cellules lors de la migration 14.
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Representative Results
La technique présentée a été utilisé pour analyser le rôle des sin1, l' une des composantes essentielles de la Tor complexe 2 (TORC2), dans le contrôle de la migration cellulaire in vivo. L'utilisation de la transplantation de cellules permet de marquage des cellules et l'analyse des effets sur les cellules autonomes isolées. Film S1 montre la migration des cellules progénitrices de la plaque préchordale transplantées. étiquetage actine avec ABP140 permet la visualisation facile des protubérances cytoplasmiques actine riches. Nous avons mesuré leur fréquence et leur orientation. Les cellules de type sauvage produisent fréquemment de grandes protubérances cytoplasmiques orientées en direction du pôle animal, à savoir dans la direction de la migration (figure 3B). La perte de fonction de sin1 conduit à une diminution drastique du nombre de saillies, et la randomisation de celles qui restent, ce qui démontre l'importance de sin1 dans le contrôle de la formation de la saillie actine riche. Fait intéressant, ce phénotype peut être sauvé par eXpression d'une forme constitutivement active de Rac1 15, ce qui suggère fortement que TORC2 contrôle dynamique de l' actine et la formation de saillie de cellule par Rac1 (figure 3B).
La technique présentée a également été utilisée pour caractériser le rôle de Arpin, un inhibiteur récemment identifié du complexe Arp2 / 3, sur la dynamique des cellules 4. La perte de fonction Arpin conduit à une augmentation de la fréquence de saillie (taux moyen de cellules hébergeant une saillie à un moment donné). Cela pourrait être dû à la formation de la saillie plus fréquentes ou une augmentation de la stabilité de la saillie. Mesure de saillie vie a révélé que, en l' absence de Arpin, protrusion la persistance temporelle est doublée (figure 3C). Ceci est cohérent avec le rôle de Arpin comme inhibiteur Arp2 / 3, ce qui faciliterait la saillie de rétraction, et suggère que Arpin affecte la fréquence de modulation de la stabilité en saillie en saillie, plutôt quesaillie initiation.
Figure 1:. Aperçu de la procédure Tg (SGC: gfp) embryons sont injectés au stade 4 cellules (1 h après la fécondation). Après 5 heures à 28 ° C, les embryons montrant ABP140-mCherry cellules positives dans le bouclier (GFP +) sont sélectionnées comme des embryons donateurs. les cellules du Bouclier sont établis dans l'aiguille de transplantation et transférés dans le bouclier d'un embryon hôte. Après 0,5 h de récupération, les embryons hôtes sont montés et imagés avec un microscope à épifluorescence (objectif 40X). HPF:. heures après la fécondation S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Transplantatisur Dish et imagerie Chambre. (A) plat de transplantation avec des puits individuels. (B) Moule pour plat de transplantation de cellules. Chambre d'imagerie (C) fait maison. (D) de dessin schématique de la chambre d'imagerie maison. Barre d' échelle = 1 cm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Les résultats de l' analyse cellulaire Dynamics (A) Schéma de mesure d'angle de saillie. (B) Analyse de l' orientation de la saillie de la cellule et de la fréquence. En l'absence de sin1 (Mo-sin1), les cellules émettent moins de saillies et les saillies restantes sont orientées de manière aléatoire. Ce phénotype peut être sauvé par l'expression d'une forme constitutivement active de la GTPase Rac1 (Mo-Sin1 + CA-Rac1). Modifié à partir de David Dumortier et 2015 5. (C) Analyse de la saillie à vie. En l'absence d'Arpin (Mo-Arpin), la fréquence de dépassement est augmentée. Ceci est dû à une augmentation de la durée de vie saillie. Réintroduire un ARN arpin insensible à la morpholino restaure ce phénotype hyper protrusion. Modifié de Dang et al., 2013 4. Barre d' échelle = 10 pm. A: Anterior; P: Postérieur, L: gauche, R:. Droit S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1: contrôles sin1 formation de saillies cellulaires, par Rac1 (clic pour télécharger). Cellules plaque progénitrices préchordale transplantées, injectés avecABP140-mCherrry ARNs et un morpholino de contrôle, ou morpholino sin1, ou morpholino sin1 et ARNs pour la forme constitutive de Rac1. la fréquence et l'orientation Saillie ont été mesurées sur ces images.
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Discussion
Ce protocole présente un moyen facile d'étudier le rôle d'un gène candidat dans la migration cellulaire in vivo, en combinant la création d'embryons chimères en utilisant une transplantation de cellules avec l' imagerie en direct.
Création d'embryons mosaïques
Étude de la dynamique d'une cellule nécessite la visualisation de son contour pour analyser les extensions cytoplasmiques. Ceci peut être réalisé par marquage des cellules isolées dans une autre sans étiquette - ou différemment marqué - l'environnement, offrant ainsi un bon contraste visuel.
Un moyen facile d'étiqueter stochastiquement une partie des cellules de l'embryon est d'injecter de l' ADN plasmidique au stade 1 cellule 16. Les plasmides injectés forment des agrégats qui sont au hasard et inégalement ségrégation dans les cellules pendant la division cellulaire. Ceci conduit à l'expression du plasmide dans un sous-ensemble aléatoire de cellules, et représente donc un moyen très simple, rapide et non invasive pour générer des moembryons SAIC. Cependant, les cellules exprimant les plasmides injectés ont tendance à former des agrégats, et la probabilité de trouver des embryons contenant quelques cellules isolées exprimant la plaque préchordale potentiel est assez faible. En outre, l'utilisation d'ADN plasmidique permet un contrôle très limité au niveau de la construction d'expression injectée. La création d'embryons chimères par la transplantation de cellules, bien que techniquement plus difficile que l'injection d'ADN plasmidique, offre un certain nombre d'avantages: le contrôle du nombre de cellules transplantées, le contrôle du niveau des constructions (injection d'ARN) d'expression, et last but not least , les greffes de cellules permettent de tester les effets de cellules-autonome, en créant des embryons de mosaïque dans laquelle transplantées cellules contiennent perte ou gain de constructions de fonction. A l'inverse, les transplantations peuvent également être utilisés pour évaluer le rôle non-autonome de l'environnement par la transplantation de cellules de type sauvage dans des embryons qui ont été modifiés. Cela peut être d'un intérêt particulier pour les testsPar exemple, la fonction des composants de la matrice extracellulaire qui sont particulièrement pertinents pour l'analyse de la migration cellulaire.
Un protocole détaillé pour la transplantation cellulaire a déjà été décrite 10. Par rapport à ce protocole, nous aimerions discuter de deux principales différences dans notre procédure.
La première différence est liée à la phase d'injection d'embryons donateurs. D'après notre expérience, les embryons injectés au stade 1 cellule avec des ARN d'une protéine fluorescente ne pas exprimer la protéine fluorescente de manière homogène dans toutes les cellules, en raison d'une diffusion incomplète des ARN dans la cellule. L'injection d'embryons de donneur au stade 4 cellules dans l'un des quatre cellules permet d'obtenir un clone de cellules homogène, ce qui est particulièrement intéressant lorsque les ARN de la protéine fluorescente sont co-injectées avec d'autres ARN qui ne sont pas identifiables.
La deuxième différence principale est l'utilisation de l'air au lieu de l'huile dans le transplantatSeringue ionique. Le principal inconvénient d'un système rempli d'air est l'inertie résultant de l'élasticité de l'air. Huile au contraire, étant incompressible, offre un bon contrôle de l'aspiration et de la pression. Cependant, avec un peu d'entraînement, et en maintenant l'interface entre l'air et le milieu de l'embryon dans la mince partie effilée de l'aiguille, le contrôle de l'aspiration et de la pression avec un système rempli d'air est suffisant pour la transplantation de cellules au stade de bouclier. Pour les étapes ultérieures, que les cellules deviennent de plus en plus cohérente, l'aspiration nécessite une haute pression qui doit être contrôlé de façon très précise, qui ne peut être réalisé avec une configuration remplie d'air. Utilisation de l'air au lieu de l'huile facilite la configuration, comme le remplissage du système avec de l'huile sans aucune bulle d'air est délicate. En outre, il évite de saturer l'aiguille de transplantation d'huile. Cela permet à des aiguilles de transplantation d'être réutilisés, et donc à être soigneusement préparés. Nous estimons qu'une aiguille sans arêtes vives et du diamètre correct est la clé de succetransplantation ssful. Cette étape de la transplantation est clairement l'une des étapes critiques dans le protocole, ce qui exige de la pratique avant d'être facile à réaliser.
Nous avons également proposé une procédure spécifique pour la transplantation de cellules simples, qui consiste à dissocier les cellules avant la transplantation, afin d'en tirer une cellule unique dans l'aiguille de transplantation. Ceci implique que la dissociation cellulaire transitoire ne modifie pas leur identité et / ou de comportement. Pour les cellules progénitrices plaque préchordale, nous imposons génétiquement identité de la cellule, et avons soigneusement vérifié que ces cellules se comportent comme les non dissociés. Cependant, nous ne pouvons pas exclure formellement que la dissociation et / ou par induction génétique induire des modifications passées inaperçues dans les cellules. Transplanter des cellules individuelles sans les dissociant est réalisable. Les cellules doivent être élaborées avec soin dans l'aiguille de transplantation. Cependant, au moins dans nos mains, le taux de réussite est très faible, soit parce que plus d'une cellule pénètre dans le needle, ou parce que les cisailles cellulaires lorsque rédigé et meurt dans l'aiguille ou une fois transplanté.
Épifluorescence contre imagerie confocale rapide
L'utilisation de la transplantation de cellules pour créer des embryons en mosaïque permet l'étiquetage des cellules isolées, séparées des autres cellules marquées. Dans ce contexte, une bonne image de la morphologie cellulaire et de la dynamique peut être obtenue avec la microscopie épifluorescence standard, tel que proposé dans le protocole. Ceci a l'avantage évident d'être un équipement relativement large diffusion et une alternative à faible coût pour les systèmes d'imagerie confocale plus chers.
Pour les localisations subcellulaires précises, l'imagerie confocale peut être utilisé pour améliorer la résolution, en particulier la résolution axiale. Pour obtenir encore une résolution temporelle suffisante, l'imagerie confocale rapide doit être utilisé. D'après notre expérience, les microscopes de filature à disques offrent un bon compromis entre la résolution, la vitesse et la photo-toxicité. Numérisation rapide micro confocalroscopes (comme les microscopes à balayage de résonance) sont de bonnes options aussi bien, mais moins fréquentes et plus cher.
étiquetage cytosquelette
Bon étiquetage des filaments d'actine et de leur dynamique est cruciale pour étudier les mécanismes de la migration des cellules à base d'actine. Bien que des marqueurs fluorescents liés à la membrane sont plus efficaces pour analyser les contours de la cellule, le marquage de l'actine permet une meilleure visualisation des saillies cellulaires. En particulier, si trois cellules marquées entrent en contact, il est très difficile d'identifier une extension cytoplasmique situé entre deux cellules voisines comme le contour de l'extension et de la membrane des cellules voisines peuvent se mêler. Étiquetage filaments d'actine permet la détection sans ambiguïté des saillies de cellules à base de l'actine, sur laquelle nous nous sommes concentrés. Si la morphologie des cellules devait être quantifié, un marquage de la membrane serait préférable. Une autre option consiste à utiliser à la fois l'étiquetage, soit en utilisant l'imagerie en 3 couleurs (un pour le li transgéniquene, un pour l'actine et une pour la membrane), soit par GFP marquage de la membrane. Dans la lignée transgénique GFP est cytoplasmique et les cellules positives GFP goosecoid peut donc être identifié, même si la membrane est marqué par la GFP.
Au cours des dernières années, un certain nombre de sondes ont été utilisées pour marquer l'actine dans des échantillons vivants. Les premiers étaient des fusions directs à des monomères d'actine. Ces deux inconvénients majeurs présentés. D'abord, ils étiquetés tous actine et actine pas spécifiquement polymérisé. Deuxièmement, ils étaient souvent toxiques. Les sondes actuellement utilisées sont des domaines de liaison d'actine filamenteux fusionnés à des journalistes fluorescents. Dans ce protocole, nous avons utilisé ABP140 (domaine de liaison de l' actine de la levure actine protéine 140) 17, qui est actuellement le marqueur le plus fréquemment utilisé pour l' actine filamenteuse, et les étiquettes toutes actine filamenteuse. Utrophine 18 (domaine d'homologie de calponin) marque également actine filamenteuse, mais semble marquer des filaments seulement stables. Cette différence a été utilisée pour identifier filaments d'actine dynamique, comme ceux marqués par ABP140 et non utrophine 19.
Récemment , il a été rapporté dans la mouche qui ABP140 et utrophine pourraient avoir des effets toxiques, en particulier sur une longue expression 20. Même si nous avons pas remarqué les défauts de migration dans les cellules ABP140 marquées, on ne peut exclure que l'expression ABP140 peut perturber la dynamique de l'actine endogène. Une troisième sonde pour l' actine filamenteuse a été récemment rapporté 21. F-tractin (domaine liant l'actine de inositol de rat triphosphate 3-kinase) a été décrit comme un journaliste fidèle de l' actine filamenteuse, qui ne serait pas montré d' effets toxiques 20,22. À notre connaissance, l'utilisation de F-tractin n'a pas encore été rapporté chez le poisson zèbre.
En plus de l'actine, de nombreux autres constituants cellulaires pourraient être étiquetés afin d'améliorer notre compréhension de la migration cellulaire. Cela comprend les autres composants du cytosquelette telles que la myosine, les microtubules, les centrosomes, ainsi que knpropres régulateurs de la migration des cellules (les formes activées de la petite GTPases Rho, Rac et Cdc42, sondes fluorescentes pour PIP3 ...) ou des protéines impliquées dans l'adhésion cellulaire (intégrines, cadhérines ...).
Dans l' ensemble, ce protocole regroupe un certain nombre d'outils et de techniques décrites précédemment pour proposer un système rapide et facile de tester l'implication d'un gène candidat dans le contrôle de la migration des cellules in vivo. Nous avons utilisé la migration prospective plaque préchordale comme il est un modèle intéressant de la migration collective dirigée, et en raison de l'étiquetage de la lignée transgénique disponible, il. Cependant, un protocole similaire peut être adapté pour analyser d'autres événements de migration qui se produisent au cours du développement.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
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