Introduction
בשנת יצורים רב-תאיים, נדידת תאים היא חיונית הן לפיתוח העובר שבו היא מבטיחה הארגון של תאים לתוך רקמות ואיברים, ובמשך חייו הבוגרים, בו היא לוקחת חלק הומאוסטזיס רקמות (ריפוי פצעים) וחסינות. בנוסף לפונקציות פיזיולוגיות אלה, נדידת תאים הוא מעורב גם במצבים פתולוגיים מגוונים, כולל, ובמיוחד, גרורות סרטניות.
נדידת תאים כבר נתחה במבחנה במשך עשרות שנים, מתן הבנה כוללת של המנגנונים המולקולריים הבטיחו תנועות תא על משטחים שטוחים. בשנת vivo עם זאת, תאים עומדים בפני סביבה מורכבת יותר. זה בבירור הופיע בשנים האחרונות כי הגירה בתוך אורגניזם עשויה להיות מושפעת רמזים חיצוניים כגון תאי מטריקס, תאי שכנים או כמוקינים מופרשים מנחת הגירה, וכי מנגנוני נהיגת נדידת תאים עשויים להשתנות ממה תוארה <em> במבחנה 1,2. המנגנונים הבטיחו נדידת תאי vivo קבלו פחות תשומת לב עד כה, בעיקר בשל הקושי הטכני גדל, לעומת במבחנה. בשנת vivo ניתוח נדידת תאים בפרט דורש גישה אופטית ישירה תאים נודדים, טכניקות לתייג תאים ייחודיים כדי לראות דינמיקה המורפולוגיה שלהם, כמו גם רווח או הפסד של הפונקציה מתקרב לבחון את התפקיד של גנים מועמדים. עד כה, רק כמה מערכות מודל מחסה מאפיינים אלה שימשו לנתח בתא vivo הגירה 3.
אנחנו לאחרונה השתמשנו ההגירה של צלחת prechordal הפוטנציאלית עוברות דג זברה מוקדם כמערכת מודל הנוח חדשה להעריך את הפונקציה של גני מועמדים בשליטת נדידת תאי vivo 4,5. צלחת prechordal פרוספקטיבי (הידוע גם בשם mesendoderm הקדמי) היא קבוצה של תאים ויוצרים בתחילת Gastrulation בצד הגבי של העובר. במהלך gastrulation בקבוצה זו נודד קולקטיבי כלפי קוטב החיה של העובר 6-8, כדי ליצור את צלחת prechordal, עיבוי mesendodermal, קדמית notochord: ומתחת הצלחת העצבית. החלק הקדמי של צלחת prechordal יהיה להצמיח בלוטת הבקיעה, בעוד החלק האחורי שלה תורם סביר לעמוד בראש mesoderm 9. הודות לפיתוח החיצוני בהירות אופטית של עובר הדג, נדידת תאים ניתן ישירות ובקלות שנצפתה המבנה הזה.
השתלת תאים היא טכניקה חזקה מאוד המאפשרת יצירה המהירה וקלה של עוברת פסיפס 10. הבעת סמני cytoskeletal פלורסנט בתוצאות תאים המושתלים בתוך התיוג של תאים בודדים, המורפולוגיה והדינמיקה של אשר ניתן להבחין בקלות. שילוב זה רווח או הפסד של הפונקציה מתקרב היתרי ניתוח של פונקציות אוטונומיות התא של פחיתגן didate.
הפרוטוקול המובא מתאר כיצד אנו הערכנו את הפונקציה של Sin1 רכיב TORC2 בשליטת דינמיקת גירה תקטין תא in vivo 5. אבל, כאמור בתוצאות ודנו עוד יותר, זה יכול לשמש כדי לנתח את המשמעות הפוטנציאל של כל גן מועמד בשליטת נדידת תאי in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: איור 1 מציג את קווי המתאר של הפרוטוקול.
1. הכנה של מחטי הזרקה והשתלות
הערה: מחטים ניתן להכין בכל עת ומאוחסנים. שמור אותם בצלחת פטרי, על להקה של פלסטלינה. חותם את המנה עם parafilm כדי להגן מפני אבק.
- עבור מחטי הזרקה, משוך נימי זכוכית (מחוץ מ"מ קוטר 1.0, בתוך מ"מ קוטר 0.58, ללא נימה (ראה רשימת חומרים)) עם חולץ micropipette (ראה רשימת חומרים). העדף מחטים קצרות ודקות (חלק מחודד של כ -5 מ"מימ) כפי שהם יעילים יותר על מנת שתוכל לחדור סיסיים.
הערה: מחטי ההזרקה הן לשימוש יחיד. - מחטי השתלת תאים
- משוך נימי זכוכית (מחוץ מ"מ קוטר 1.0, בתוך מ"מ קוטר 0.78, ללא נימה (ראה רשימת חומרים)) עם חולץ micropipette.
- Uלשיר microforge (ראה רשימת חומרים), לחתוך את קצה המחט בנקודה שבה הקוטר הפנימי הוא 35 מיקרומטר (מעט יותר מאשר הקוטר של תאים להיות מושתל).
- שפוע גפי החתך של הנימים עם microgrinder (ראה רשימת חומרים) עם זווית של 45 מעלות.
- לחלופין, למשוך עקיצה על קצה המחט באמצעות microforge. לשם כך, גע הנימה החמה עם הקצה שפוע במהירות ולמשוך אותו משם, יצירת עקיצה שיכול לעזור חודר העובר.
- הר מחט על בעל מחט מצורף מזרק. באמצעות מזרק, לשטוף את החלק הפנימי של שלוש פעמים מחט עם 2% חומצה הידרופלואורית לחסל שאריות זכוכית, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם אצטון.
זהירות: חומצה הידרופלואורית הוא רעיל, לתפעל מתחת למכסה המנוע, עם כפפות.
הערה: מחטי ההשתלה ניתן להשתמש מספר פעמים.
2. הכנהכלים עבור הזרקת השתלת תאים
- מחממים 50 מ"ל של העובר בינוני 11 המכיל 0.5 גרם של agarose במיקרוגל דקות 1 במלוא העוצמה כדי לקבל agarose 1% בטווח הבינוני העובר. מצננים את הג'ל agarose לכ -60 מעלות צלזיוס ויוצקים את 50 מ"ל בצלחת 90 מ"מ פטרי. מניח על פני השטח של הג'ל תבנית ומעוצבת (ראה רשימה של חומר), או עם קווים עבור מנת הזריקה או עם בארות עבור מנת השתלת תאים.
- שים מצוף העובש על agarose, אם agarose לא חם מדי. לאחר ג'ל agarose מוגדר, להסיר את התבנית עם מלקחיים (איור 2 א - ב).
הערה: ניתן לאחסן מנות ב 4 ° C, עד כמה שבועות. שמור אותם בתוך קופסא סגורה רטובה, כדי למנוע התייבשות.
- שים מצוף העובש על agarose, אם agarose לא חם מדי. לאחר ג'ל agarose מוגדר, להסיר את התבנית עם מלקחיים (איור 2 א - ב).
- מניח את הצלחת בתוך 30 דקות C חממת 28 מעלות לפני השימוש.
אוסף 3. עבר הזרקה
- הכנת פתרון הזרקה
הערה: תחום מחייב תקטיןשל אקטין שמרים חלבון מחייב 140 (ABP-140) כגון Lifeact כבול mCherry (המכונה ABP140-mCherry) משמש לדמיין אקטין polymerized בתוך התא, על מנת לנתח את פעילות ובולטות. הוסף עוד מתחם לבחון את תפקידו של גן מסוים המועמד (למשל mRNA של מבנה שלילי דומיננטי או constitutively פעיל, או oligonucleotides Morpholino). כדי להעריך את תפקידי Sin1 כמתואר התוצאות (איור 3), השתמשנו oligonucleotides Morpholino. כביקורת, השתמשנו morpholino זהה morpholino sin1 אבל במשך 5 נוקלאוטידים מופצים לאורך הרצף כך morpholino שליטה זו אינה תואמת את היעד RNA.- Sin1 ההפשרה morpholinos מלאה 5-התאמה (2 פתרונות מניות מ"מ), ו ABP140-mCherry mRNAs על הקרח. להוסיף 375 ננוגרם של mRNAs (75 ng / μl סופי) ו -0.75 μl של כל אחד sin1 או morpholino מלא 5-התאמה (0.3 מ"מ סופי) במאגר Danieau (58 mM NaCl, 0.7 מ"מKCl, 0.4 מ"מ MgSO 4, 0.6 מ"מ Ca (NO 3) 2, 5.0 מ"מ HEPES pH 7.6), כדי להגיע בנפח כולל של 5 μl.
- אוסף העובר
הערה: עבור הניסוי הזה להגדיר שני עוברי תורם מארח הם מהונדסים, המבטא את ה- GFP תחת השליטה של goosecoid (GSC) האמרגן כדי להמחיש את הצלחת הפוטנציאלית prechordal 11.- אסוף Tg (GSC: GFP) ביצים. מניח כ -80 ביצים בצלחת 90 מ"מ פטרי מלא בינוני העובר לדגור על 28 מעלות צלזיוס.
- להזריק עוברי תורם
- תחת סטראו, לסחוט עוברים שנאספו בעדינות עם מלקחיים לתוך השורות של צלחת הזרקה מלאה בינוני עובר. בעזרת מלקחיים, כוון את העוברים עם התאים כלפי מעלה. מניחים את צלחת הזרקת בחממה על 28 מעלות צלזיוס עד העוברים הגיעו לשלב 4 תאים (שלאחר ההפריה 1 hr).
- טען מחט הזריקה עם 2 μl שלפתרון ההזרקה. הכנס את מחט בעל מחט (ראה רשימת חומרים) אשר ממוקם בשכונת א-מניפולטור מיקרו (ראה רשימת חומרים) ומחוברת עם polytetrafluoroethylene (PTFE) צינורות (ראה רשימת חומרים) אל transjector אוויר (ראה רשימת חומרים ).
- פתח את הנימים ידי נגיעת הקצה בעדינות עם מלקחיים בסדר. במידת צורך, לחתוך את הנימים פתוחות ידי צובט הגפיים שלה.
- זן אחד מארבעה התאים עם המחט ולהזריק הפתרון בתוך התא כדי למלא 70% מנפח התא (2 nl). להזריק 30 עובר.
שים לב: המחט בתא עלול להיות קשה, כמו קרום התא הוא רך. מכוון בצומת בין התא ואת חלמון מקלת חדירת מחט. - מניחים את העוברים בחממה C 28 ° עד שהם הגיעו לשלב כדור (לאחר ההפריה 4 שעות).
4. הכנת העוברים עבור Cell Transplantatיוֹן
- הכן 20 מ"ל של מדיום העובר עם 200 פניצילין / סטרפטומיצין μl (ראה רשימת חומרים) (פן / סטרפטוקוקוס EM).
- Dechorionation של העוברים בשלב כדור (4 שעות לאחר ההפריה)
הערה: עוברים Dechorionated הם שבירים מאוד תתפוצץ במקרה של מגע עם אוויר או פלסטיק. הם ובכך צריכים להציב מנות מצופות agarose, והועברו עם טפטפות פסטר זכוכית אש מלוטשת.- בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק, להעביר לארח עוברי שנאספו בשלב 3.2 ו עוברים התורם מוזרק בשלב 3.3 לשתי מנות פטרי 35 מ"מ מצופה agarose 1% בטווח הבינוני העובר ומלא פן / סטרפטוקוקוס EM. שמור עובר מארח עובר תורם בשתי מנות נפרדות.
- ידני לחלץ את העוברים מן chorions שלהם עם פינצטה בסדר (ראה רשימת חומרים).
- מניחים את העוברים בחממה C 28 ° עד שהם הגיעו לשלב מגן (שלאחר ההפריה 6 שעות).
5. השתלת תאים
- מסדרים את העוברים על השתלת תאים.
- תחת סטראו פלורסנט, עובר תורם בחר להביע ABP140-mCherry (אדום) בתוך המגן (הירוק).
- בעזרת פיפטה פסטר אש מלוטשת, להעביר את עוברי הבארות של מנת ההשתלה מלאה פן / סטרפטוקוקוס EM. מניח את עוברי המארח בשורה אחת ואת עוברי התורם בשורה השכנה.
- באמצעות עפעף, כוונו את העוברים בזהירות עם את המגן.
הערה: המיקום של המגן ניתן להעריך על ידי ביטוי של GFP או אנטומית.
- קמת השתלת מערכת.
הערה: מערכת השתלת מורכב בעל מחט (ראה רשימת חומרים) מחובר עם צינורות PTFE (ראה רשימת חומרים) וגם מחבר צינור (ראה רשימת חומרים) כדי מזרק המילטון מצויד בכונן מיקרו (ראה רשימה של חומרים). בעל המחטהוא רכוב על micromanipulator 3 כיוונים (ראה רשימת חומרים).- באמצעות בעל מחט מצורף מזרק, יש לשטוף את המחט על השתלה תאית עם אתנול 70%. ניקוי על ידי מתחנף אוויר לתוך המחט. האם לא יבש על ידי נושבת, מכיוון שהדבר עלול לגרום אבק להיתקע בחלק החד של המחט.
- הכנס את מחט בעל מחט מחוברת המזרק המילטון, עם שיפוע כלפי מעלה.
- מגן-ל-מגן השתלת תאים
- הזן את המגן של עובר תורם עם מחט ההשתלה ותנסח על 10-20 תאים שכותרתו עם ABP140-mCherry. בזהירות להימנע מהדפסת חלמון.
- להשתיל את התאים לתוך המגן של העובר המארח. חזור על הפעולה עד כל העוברים המארח הושתלו.
- הסר את כל עוברים פגומים עם פיפטה פסטר אש מלוטשת. מניחים את העוברים המושתלים בחממה ב 28 ° C ולתת להם להתאושש במשך כ -30 דקות.
- באמצעות מחטבעל מצורף מזרק, יש לשטוף את מחט השתלת תאים במים ומניח אותו בחזרה בצלחת פטרי על להקה של פלסטלינה. חותם את המנה עם parafilm.
6. (אופציונלית) השתלת תאים יחידה
הערה: העובר, תאים לדבוק זה בזה, כך שזה קשה לצייר רק תא אחד מחט ההשתלה. פתחנו פרוטוקול שונה להשתיל ובתאי צלחת prechordal יחידים בקלות. הרעיון הוא לנתק תאים לפני ההשתלה. בגלל ובתאי צלחת prechordal מבודדים נוטים לאבד את זהותם, אנו גנטיים להטיל להם זהות צלחת פוטנציאלית prechordal, על ידי הפעלת מסלול איתות הקטרים, בהעדרו של גורם שעתוק Sox32. אימתנו כי תאי המושרה האלה מתנהגים כמו ובתאי צלחת prechordal אנדוגני 8. להלן הצעדים הספציפיים לבצע השתלות תא בודדות. Cell dissociation מושגת על ידי הצבת עוברים רינגר סידן חופשי 11, לנתח explant מכנית לבחוש בו.
- בשלב 2.1, להכין את המנה השתיל עם agarose 1% ב רינגר סידן חופשי במקום עובר הבינוני.
- בשלב 3.1, בנוסף ABP140-mCherry רנ"א morpholino sin1, להוסיף 3 ng של RNAs המקודד את הצורה הפעילה של Taram-A רצפטור קטרי (0.6 ng / μl הסופי) ו -1.25 μl של morpholino נגד sox32 (פתרון המניה ב 2 מ"מ, ומכאן סופי 0.5 מ"מ).
- לאחר שלב 4, העביר שלושה עוברי תורם שנבחרו בצלחת עבור השתלת תאי מלאת הפן / סטרפטוקוקוס רינגר סידן החופשי בעזרת פיפטה פסטר אש מלוטשת. עם פינצטה בסדר, לנתח explant המכיל את התאים המוזרקים (תאי שכותרתו ABP140-mCherry). במהירות וזורק את שאר העוברים.
- עם עפעף, בעדינות מערבבים את explant עד תאים לנתק.
- צייר את תא מבודד יחיד מחט ההשתלהו להשתיל אותו לתוך המגן של עובר מארח.
- בעזרת פיפטה פסטר אש מלוטש, להעביר את העוברים בצלחת agarose מצופה מלא פן / סטרפטוקוקוס EM. מניחים את העוברים בחממה ב 28 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
7. עובר שמה
- לשכת הדמיה
- שיטה 1: השתמש תא הדמיה מורכב שקופית פלסטיק (75 * 25 * 0.5 מ"מ) מנוקבת 4 חורים (בקוטר 5.5 מ"מ), עם 3 מ"מ שוליים גבוהים בצד אחד (איור 2 ג - ד). מדביקים coverslip זכוכית על הצד האחורי, עם דבק cyanoacrylate (דבק סופר).
הערה: בסוף הניסוי, מניח את החדר במים למשך לילה אחד כדי להסיר את coverslip להיפטר שאריות דבקות עם נייר חול. - שיטה 2: השתמש 35 מ"מ מנות תחתית זכוכית MatTek (ראה רשימת חומרים) עם חור 10 מ"מ.
- שיטה 1: השתמש תא הדמיה מורכב שקופית פלסטיק (75 * 25 * 0.5 מ"מ) מנוקבת 4 חורים (בקוטר 5.5 מ"מ), עם 3 מ"מ שוליים גבוהים בצד אחד (איור 2 ג - ד). מדביקים coverslip זכוכית על הצד האחורי, עם דבק cyanoacrylate (דבק סופר).
- שמה עובר
- מלאו את בקבוקון זכוכית עם 1 מ"ל של agarose 0.2% חם במדיום העובר.שמור את זה על 42 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום.
- תחת סטראו פלורסנט, בחר עובר שבה אדום תאים מושתלים הם חלק הצלחת prechordal הפוטנציאלי המסומנת בירוק (תאים מושתלים אדומים כלומר הם בתוך הצלחת prechordal הפוטנציאלית הירוקה, החלו נודד לעבר הקוטב בעלי החיים).
- העברת עובר שנבחר לתוך תמיסת agarose עם פיפטה פסטר אש מלוטשת. מחק את העודף בינוני עובר מן פיפטה. צייר את העובר פיפטה עם agarose, ולהעביר את העובר בחדר הדמיה, הפקדת טיפת agarose. לפני agarose מוגדר, כוון את העובר עם עפעף. מניח את הצלחת הפוטנציאלית prechordal כלפי מעלה הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף, או על תחתית זכוכית הדמיה עם מיקרוסקופ הפוכה. המתן עד agarose מוגדר (כ 1 דקות, תלוי בטמפרטורת החדר) לפני הרכבה העובר אחר בבאר הבא של החדר.
הערה: צ'ה הדמיהmber המכיל 4 בארות מאפשר הרכבה עד 4 עוברים. - כאשר agarose מוגדר, למלא את התא עם פן / סטרפטוקוקוס EM כדי למנוע התייבשות.
8. הדמיה חיה
- השתמש עדשת 40X מי טבילה ארוך טווח. השתמש בקבוצות מסנן מתאים לתדמית GFP ו mCherry (עבור GFP: עירור BP 470/40, קרן splitter FT 510, ופליטה BP 540/50; עבור mCherry: עירור BP 578/21, קרן splitter FT 596, ו LP פליטה 641 / 75). התאם משך חשיפה על מנת לייעל דינמיקת תמונה.
- חזרה לתמונה כל התאים בצלחת, לרכוש Z- ערימות, החל כמה מיקרומטר מעל צלחת prechordal הפוטנציאלית (ב האאקטודרם) וכלה כמה מיקרומטר מתחת צלחת prechordal הפוטנציאלית (בחלמון). השתמש z-צעד של 2 מיקרומטר. כדי לייעל את מהירות רכישה, להחליף צבעים בין Z- ערימות ולא בין מסגרות.
הערה: זה עשוי להוביל הבדלים קלים בין התמונות הירוקות ואדום, אבל הוא לא בעיה מאז שום דו מדויק-localization בין האותות הירוקים ואדום נדרש. כדי לקצר את זמן הדמיה נוסף וחשיפה לאור, ירוק עשויים להירכש רק אחת ל -5 נקודות זמן, וזה מספיק כדי לזהות ובתאי צלחת prechordal. - שימוש בהגדרות כאלה, תמונה עד 4 עובר בתוך פרק הזמן של שתי דקות שבו יש צורך לנתח תדירות וכיוון בליטה. באשר לניתוח חי בליטה, להפחית מרווח הזמן עד 30 שניות כדי לקבל החלטת זמן גבוהה. תמונה מתוך epiboly 60% עד 80% epiboly.
ניתוח 9. Dynamics הנייד
- טען תמונות 4D ב ImageJ
הערה: בהתאם לתוכנה המשמש רכישה, תמונות מאוחסנות בפורמטים שונים (קובץ אחד לכל תמונה, קובץ אחד לכל Z- מחסנית, קובץ אחד עבור הניסוי כולו). תוספי ImageJ חלקם זמינים באינטרנט לפתוח ערימות 4D. הנתונים שלנו מאוחסנים כקובץ אחד לכל Z- מחסנית. מכיוון בסיס הנתונים יכול להיות גדול, זה עשוי להיות נוח לפתוח רק חלק ממנה (כמה timנקודות e, או subpart של Z- מחסנית, או 8 סיביות להמיר תמונות ...). אנו משתמשים תוסף מחוייט ImageJ לעשות זאת, אשר נשמח להפיץ על פי בקשה. - ניתוח של כיווניות ותדירויות של בליטות ניידות
- השתמש בתמונות GFP כדי לקבוע את הכיוון העיקרי של הגירת צלחת prechordal הפוטנציאלית. קח את זה כנקודת התייחסות למדידות זווית בליטות תא. סובב את המחסנית, כך כיוון הפניה זו מקבילה צד אחד של התמונה.
- עקוב תא אחד. כלי זווית בחרו. עבור כל מסגרת וכל בליטה, השתמש בכלי הזווית כדי למדוד את הזווית בין הבליטה ואת כיוון ההפניה (איור 3 א). השתמש בפקודה לנתח / מדוד כדי לאחסן את הערך (או הקש M במקלדת). שמור את התוצאות כקובץ txt. חזור עם התא הבא.
- לייבא את הנתונים לתוך הפצת זווית R ו- עלילה כמו היסטוגרמות. השתמש בבדיקת קולמוגורוב-סמירנוב (ks.test ב R) כדי להשוות תנאים שונים.
הערה: כלי הזווית מספק ערכים המורכבים בין 0 ° ו -180 °, המאפשר השימוש של מבחנים סטטיסטיים קלסיים ולא בדיקות מעגליות. - עם מערך נתונים זה, לחשב תדירות פליטה כמספר בליטות לכל תא לדקה. השתמש סטודנטים T-test (t.test ב R) כדי להשוות תנאים שונים.
- ניתוח של Lifetime Cell בליטות
- עבור כל תא וכל בליטה, משך בליטת מדד (מספר המסגרות שבמהלכו הבליטה היא מרווח זמן x הנוכחי בין מסגרות).
- לייבא את הנתונים לתוך ר השתמש Student T-test (t.test ב R) כדי להשוות תנאים שונים.
הערה: תכונות הגירה אחרות יכולות להיות מעניינות לנתח על מנת לאפיין את נדידת התאים. אלה כוללים מסלולי תא, עבור מהירות, כיוון ומדידות התמדה, או מורפולוגיה תא. יישומי תוכנה מסוימים מסחריים זמינים למדוד תכונות אלו, אך מספר רב של appli תוכנות קוד פתוחהקטיונים תוספים ImageJ זמינים אף הם, כמו למשל להסתגל לנתח morphodynamics 12, DiPer להסתכל מסלולי התא והתמדה כיוונית 13, CellTrack לעקוב אחר גבולות התא במהלך ההעברה 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הטכניקה הציגה שמשה לנתח את התפקיד של Sin1, אחד מרכיבי הליבה של הטור 2 המורכב (TORC2), בשליטת נדידת תאי vivo. שימוש השתלת תאים מתיר תיוג של תאים מבודדים וניתוח של תופעות תאים אוטונומיים. סרט S1 מציג את ההגירה של ובתאים צלחת prechordal המושתלים. תיוג יקטין עם ABP140 מאפשר הדמיה הקלה של בליטות ציטופלסמית עשיר תקטנה. מדדנו תדירות והכיוון שלהם. Wild-type תאים לייצר בליטות ציטופלסמית גדולים תכופים אוריינטציה בכיוון של הקוטב בעלי חיים, כלומר בכיוון של הגירה (איור 3B). אובדן התפקוד של Sin1 מוביל לירידה דרסטית של מספר בליטות, אקראי של הנותרים, הממחיש את חשיבות sin1 בשליטת היווצרות בליטה עשירה תקטין. מעניין לציין, כי פנוטיפ זה יכול להינצל על ידי דוארxpression של צורה constitutively פעילה של Rac1 15, דבר המצביע בחום TorC2 שולט דינמיקה יקטין היווצרות בליטת תא דרך Rac1 (איור 3 ב).
הטכניקה הציגה גם שמשה כדי לאפיין את התפקיד של Arpin, מעכב זיהה באחרונה של מתחם Arp2 / 3, על דינמיקת תא 4. אובדן תפקוד Arpin מוביל לעלייה בתדירות בליטה (שיעור ממוצע של תאי מחסה בליטה בזמן נתון). זה יכול להיות אם בשל היווצרות בליטה תכופה יותר או לעליית יציבות בליטה. מדידה בחי בליטה גילתה כי, בהעדר Arpin, התמדת הבליטה זמנית מוכפלת (איור 3 ג). זה עולה בקנה אחד עם תפקידה של Arpin כמעכב Arp2 / 3, אשר יקל הכחשת בליטה, ומציע Arpin משפיע תדר בליטה על ידי ויסות יציבות בליטה, ולאייזום בליטה.
איור 1:. תאור של הליך Tg (GSC: GFP) עוברים מוזרקים בשלב 4 תאים (שלאחר ההפריה 1 hr). אחרי 5 שעות ב 28 ° C, עובר מראה ABP140-mCherry תאים חיוביים בתוך המגן (+ GFP) נבחר כמו עוברי תורם. תאי מגן שנכרתו בתוך מחט ההשתלה ומועברים לתוך המגן של עובר מארח. לאחר 0.5 שעות של התאוששות, לארח עוברים מאובטחים היטב צלמו עם מיקרוסקופ epifluorescent (אובייקטיבי 40X). hpf:. שעות לאחר ההפריה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Transplantatiעל צלחת והדמיה קאמרית. (א) צלחת השתלה עם בארות בודדות. (ב) עובש למנת השתלה. (C) תא הדמיה תוצרת בית. (ד) סכמטי ציור של חדר הדמיה תוצרת בית. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. תוצאות מתא Dynamics ניתוח (א) תוכנית של מדידת זווית בליטה. (ב) ניתוח של נטיית בליטת תא ותדירות. בהיעדרו של Sin1 (Mo-Sin1), התאים פולטים בליטות פחות בליטות הנותרים מכוונים באופן אקראי. פנוטיפ זה יכול להינצל על ידי ביטוי של צורה פעילה constitutively של GTPase Rac1 (Mo-Sin1 + CA-Rac1). שונה מן Dumortier ודוד 2015 5. (C) ניתוח של פעם בחיים בליטה. בהיעדרו של Arpin (Mo-Arpin), תדירות בליטה הוא גדל. זאת בשל עלייה בחי בליטה. Reintroducing בדמות רנ"א arpin הרגיש morpholino משחזר Hyper זה פנוטיפ ובולט. שונה מן דאנג et al., 2013 4. בר סולם = 10 מיקרומטר. ת: Anterior; P: אחורי, L: שמאל, R:. Right אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1: שולט Sin1 היווצרות בליטות תא, דרך Rac1 (קליק ימני להוריד). ובתאי צלחת prechordal מושתלים, הזריקוABP140-mCherrry RNAs ו morpholino שליטה, או morpholino sin1, או morpholino sin1 ו RNAs עבור הטופס המכונן של Rac1. תדירות וכיוון בליטה נמדדו על התמונות האלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מציג דרך קלה ללמוד את התפקיד של גן מועמד נדידת תאי in vivo, על ידי שילוב של היצירה עוברת chimeric באמצעות השתלה תאית עם הדמיה לחיות.
יצירה עוברת פסיפס
לימוד הדינמיקה של תא דורש הדמיה של קווי המתאר שלה לנתח סיומות cytoplasmic. זו יכולה להיות מושגת על ידי תיוג תאים מבודדים בתוך תווית אחרת - שכותרתו או אחר - סביבה, ובכך להציע בניגוד חזותי טוב.
דרך קלה stochastically לתייג חלק תאים בעובר היא להזריק DNA plasmidic בשלב 1 תאים 16. פלסמידים מוזרק ליצור אגרגטים כי הם באופן אקראי הפרדה בחוסר שוויון תאים בעת חלוקת התא. זה מוביל לביטוי של פלסמיד בקבוצת משנה אקראי של תאים, ובכך מייצג שיטה מהירה מאוד, קלה ולא פולשנית להפקה מועובר SAIC. עם זאת, תאים המבטאים את פלסמיד המוזרק נוטים ליצור אשכולות, ואת ההסתברות למציאת עוברים המכילים כמה מבודדים לבטא בתאים בצלחת הפוטנציאלית prechordal היא נמוכה למדי. יתר על כן, שימוש DNA plasmidic מציע שליטה מוגבלת מאוד של רמת הביטוי של המבנה המוזרק. יצירה מכוונת של עוברים chimeric על ידי השתלת תאי, אף שטכנית קשה יותר מאשר הזרקת DNA plasmidic, מציעה מספר יתרונות: שליטה על מספר התאים המושתלים, בקרה על רמת הביטוי של המבנים (הזרקת RNA), ו ואחרון אחרון חביב השתלות תאיות, מאפשרות לבחון השפעות תאים אוטונומיים, על ידי יצירה עוברת פסיפס שבו מושתלי תאים מכילים הפסד או רווח של בונת פונקציה. לעומת זאת, השתלות יכולות לשמש גם כדי להעריך את התפקיד הלא אוטונומי של הסביבה על ידי השתלת תאי wild-type לעוברים ששונו. זה יכול להיות עניין מיוחד לבדיקהלמשל, הפונקציה של רכיבים תאים מטריקס שרלוונטיות במיוחד עבור ניתוח נדידת תאים.
פרוטוקול מפורט להשתלת תא כבר תואר 10. בהשוואה לפרוטוקול זה, ברצוננו לדון שני הבדלים עיקריים בהליך שלנו.
ההבדל הראשון קשור לשלב הזרקת עוברי תורם. על פי הניסיון שלנו, עובר מוזרק בשלב 1 התאים עם RNAs של חלבון פלואורסצנטי אינו מבטא את חלבון פלואורסצנטי הומוגנית בכל התאים, עקב דיפוזיה שלמה של RNAs בתא. הזרקה של עוברי תורם בשלב 4 תאים באחד ארבעה התאים מאפשרת לקבל שיבוט הומוגנית של תאים, אשר הוא בעלת עניין מיוחד כאשר RNAs של חלבון פלואורסצנטי הם מוזרקים שיתוף עם RNAs אחרים שאינם עקיבים.
ההבדל העיקרי השני הוא השימוש אוויר במקום הנפט transplantatמזרק יון. החסרון העיקרי של מערכת מלאת אוויר הוא האינרציה נובעי האלסטיות של האוויר. שמן להפך, להיות דחיס, מציע שליטה טובה של יניקה בלחץ. עם זאת, עם קצת אימון, ועל ידי שמירה על הממשק בין האוויר בינוני העובר בחלק הדק, המחודד של המחט, את השליטה של יניקה בלחץ עם מערכת מלאת אוויר מספיקה עבור השתלת תאים בשלב המגן. עבור בשלבים מאוחר יותר, כמו התאים הופכים קטנים יותר מלוכדים, היניקה דורשת לחץ גבוה כי צריך להיות מבוקרות מאוד במדויק, לא יכול להיות מושג באמצעות התקנה מלאת אוויר. שימוש באוויר במקום שמן מקל על ההתקנה, כמילוי המערכת עם שמן ללא כל בועת אוויר הוא מסובך. יתר על כן, זה ימנע מילוי מחט ההשתלה בשמן. זה מאפשר מחטי השתלה כדי לעשות בה שימוש חוזר, ולכן יש להכין בקפדנות. אנו חשים כי מחט ללא קצוות חדים של בקוטר הנכון הוא המפתח succeהשתלת ssful. צעד השתלה זהו ללא ספק אחד השלבים הקריטיים בפרוטוקול, אשר דורש תרגול לפני מתבצע בקלות.
גם הצענו הליך ספציפי עבור השתלת תאים בודדים, אשר מורכב מתנער תאים לפני ההשתלה, כדי לצייר תא ייחודי מחט ההשתלה. משמעות הדבר היא כי ניתוק התא חולף לא לשנות זהות ו / או ההתנהגות שלהם. עבור ובתאים צלחת prechordal, אנו גנטיים להטיל תא זהות ולסמן בזהירות כי התאים האלה מתנהגים כמו אלה שאינם ניתקים. עם זאת, אנחנו לא יכולים באופן רשמי לשלול כי דיסוציאציה ו / או אינדוקציה גנטית לגרום שינויי מעיניהם בתאים. השתלת תאים בודדים ללא מתנער מהם אינה ריאלית. תאים צריכים להיות שהועלו בזהירות את מחט ההשתלה. עם זאת, לפחות בידינו, שיעור ההצלחה הוא נמוך למדי, אם משום יותר מתא אחד נכנס לביתDLE, או כי את מספרי התא כאשר משוכים ומת המחט או פעם המושתלת.
Epifluorescence לעומת הדמיה confocal מהר
שימוש השתלת תאי כדי ליצור עובר פסיפס מאפשר התיוג של תאים בודדים, להפריד אותו מתאים שכותרתו אחרת. בהקשר זה, הדמיה טובה של מורפולוגיה תאי דינמיקה יכולה להיות מושגת באמצעות מיקרוסקופיה epifluorescence הרגילה, כפי שהוצעה בפרוטוקול. זה כולל את היתרון הברור של להיות ציוד יחסית רחב התפשט ו חלופה בעלות נמוכה יקרות יותר מערכות הדמית confocal.
לקבלת localizations subcellular מדויק, הדמיה confocal ניתן להשתמש כדי לשפר את הרזולוציה, ברזולוציה צירית בפרט. כדי עדיין לקבל החלטה זמנית מספיק, הדמית confocal מהר אמורה לשמש. מניסיוננו, מיקרוסקופים-דיסק ספינינג מציעים פשרה טובה בין רזולוציה, מהירות צילום רעיל. סריקה מהירה מיקרופון confocalroscopes (כמו מיקרוסקופי סריקת תהודה) הם אפשרויות טובות גם כן, אבל פחות תכוף ויקרים יותר.
תיוג נוגדנים
תיוג טוב של סיבי יקטין והדינמיקה שלהם הוא חיוני כדי לחקור מנגנונים של נדידת תאים מבוססות תקטין. למרות סמני ניאון קרום נכנס יעילים יותר לנתח את קווי מתאר התא, תיוג יקטין מאפשר ויזואליזציה טובה יותר של בליטות התא. בפרט, אם שלושה תאים שכותרתו ליצור קשר, זה מאוד קשה לזהות סיומת ציטופלסמית ממוקמת בין שני תאים סמוכים כמו למתווה של ההרחבה הממברנה של תאי שכנים יכולים להסתבך. תיוג סיבי אקטין מאפשרת זיהוי חד משמעי של בליטות סלולריים מבוססי אקטין, שעליו התמקדנו. אם מורפולוגיה התא היה לכמת, תיוג קרום יהיה עדיף. אפשרות נוספת היא להשתמש בשני התיוג, בין אם באמצעות הדמית 3-צבע (אחד עבור li מהונדסne, אחד עבור תקטין ואחד קרום), או על ידי ה- GFP תיוג הממברנה. בשורה המהונדסת, GFP הוא cytoplasmic, ותא החיובי goosecoid-GFP יכול ובכך להיות מזוהה, גם אם הקרום הוא GFP שכותרתו.
במהלך השנים האחרונות, מספר בדיקות שמשו לתייג תקטין בדגימות לחיות. הראשונות היו בשילובים ישירים מונומרים יקטין. אלה מוצגים שני חסרונות עיקריים. ראשית, הם שכותרתו כל תקטינו ולא יקטין polymerized במיוחד. שנית, הם היו רעילים לעתים קרובות. הבדיקות כיום בשימוש הם תחומים מחייבים filamentous יקטין התמזגו כתבי ניאון. בפרוטוקול זה, השתמשנו ABP140 17 (תחום מחייב יקטין של אקטין שמרים החלבון מחייב 140), אשר נמצא כעת את הסמן השכיח ביותר עבור תקטין פילמנטיות, ותוויות כל תקטין פילמנטיות. 18 Utrophin (תחום הומולוגית calponin) גם תוויות תקטנה פילמנטיות, אבל נראה תווית חוטים יציבים בלבד. הבדל זה נעשה שימוש כדי IDENחוטים דינמיים יקטינו תצדיק, כמו אלה שכותרתו ידי ABP140 ולא Utrophin 19.
לאחרונה זה דווח זבוב ABP140 ו Utrophin יכולים להיות השפעה רעילה, בפרט על ביטוי ארוך 20. למרות שאנחנו לא שמתנו לב לפגמי הגירה בתאי ABP140 שכותרתו, אנחנו לא יכולים לשלול כי ביטוי ABP140 עלול להפריע תקטין דינמיקה אנדוגני. בדיקה שלישית תקטין פילמנטיות דווחה 21 לאחרונה. F-tractin (תחום מחייב יקטין מן החולדה אינוזיטול אדנוזין 3-kinase) תואר ככתב נאמן של אקטין פילמנטיות, אשר לא ייראה השפעות רעילות 20,22. למיטב ידיעתנו, השימוש F-tractin טרם דווח דג הזברה עדיין.
בנוסף תקטין, מרכיבי תאים רבים אחרים יכולים להיות מתויגים כדי לשפר את ההבנה שלנו של נדידת התאים. זה כולל רכיבים cytoskeletal אחרים כמו שרירן, microtubules, centrosomes, כמו גם knרגולטורים עצמו של נדידת תאים (צורות מופעלות של Rho GTPases הקטן, RAC ו- Cdc42, בדיקות ניאון עבור PIP3 ...) או חלבוני המעורבים הידבקות תא (integrins, cadherins ...).
בסך הכל, פרוטוקול זה regroups מספר כלים שתוארו לעיל וטכניקות להציע מערכת מהירה וקלה כדי לבדוק את מעורבותו של גן מועמד בשליטת נדידת תאי in vivo. השתמשנו הגירת הצלחת prechordal צופה פני עתיד זה הוא מודל מעניין של הגירה קולקטיבית מכוונת, ובגלל תיוג הקו המהונדס הזמין זה. עם זאת, פרוטוקול דומה יכול להיות מותאם לנתח אירועים הגירה והאחרים המתרחשים במהלך ההתפתחות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
- Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), Cambridge, England 921-932 (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
- Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
- Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
- Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
- Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
- Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
