Introduction
다세포 생물에서, 세포 이동은, 조직 및 기관에 대한 세포의 조직을 보장 배아의 발달과 그 조직의 항상성 (상처 치유) 및 내성에 참여한다 성인기에 대해 모두 필요하다. 이러한 생리 기능에 더하여, 세포 이동은 암 전이를 포함한 특정의 다양한 병리학 적 상황에 참여하고있다.
세포 이동은 평평한 표면에 세포의 움직임을 보장하는 분자 메커니즘의 전반적인 이해를 제공, 수십 년 동안 시험관에서 분석하고있다. 생체 내에서 그러나, 세포는 더 복잡한 환경에 직면하고 있습니다. 명확하게 마이그레이션을 안내 세포 분비 케모카인 이웃, 같은 세포 외 매트릭스 유기체 내에서 마이그레이션이 외부 단서에 의해 영향을받을 수 있다는 것을 지난 몇 년에 등장하고, 그 설명 된 내용과 다를 수 있습니다 세포 이동을 구동 메커니즘 <EM> 체외 1,2. 생체 내 세포의 이동에 보장 메커니즘은 체외 연구에 비해, 주로 인해 증가 된 기술적 인 어려움 때문에 훨씬 적은 관심을 받았다. 생체 특히 세포 이동의 분석 이주 세포에 직접 광 액세스를 필요로 독특한 셀 라벨을 기술 그 동역학 및 형태뿐만 아니라, 이득 또는 기능의 상실을보고하기 위해 후보 유전자의 역할을 테스트하기 위해 접근한다. 지금까지, 이러한 특성을 보유하는 몇 모델 시스템은 생체 내 세포 이동 (3)에 절개하는데 사용되어왔다.
최근 생체 세포의 이동의 제어에 4,5- 후보 유전자의 기능을 평가하기 편리한 새로운 모델 시스템으로 초기 제브라 피쉬 배아 예상 prechordal 플레이트의 이동을 사용 하였다. (또한 전방 mesendoderm라고도 함) 유망 prechordal 플레이트 가스트의 발병에 형성하는 셀 그룹배아의 등쪽면에 rulation. 낭배 동안이 그룹은 공동으로 척색에 prechordal 판, mesendodermal 비후, 전방을 형성하고, 신경 판을 기본에, 배아 6-8의 동물 극으로 이동한다. 그 후방 부분은 가능성이 중배엽 (9) 머리에 기여하면서 prechordal 판의 앞쪽 부분은 부화 선을 야기 할 것이다. 외부 개발 및 어류 배아의 광학 투명도 덕분에, 세포의 이동이 직접적으로 쉽게 구조에서 관찰 될 수있다.
세포 이식은 모자이크 배아 (10)의 신속하고 쉽게 만들 수 있습니다 매우 강력한 기술이다. 분리 된 세포의 라벨에 이식 된 세포 결과에 형광 세포 골격 마커를 표현, 형태 및 역학있는 쉽게 관찰 할 수있다. 손실 함수의 게인이 결합은 허용에게 전지 캔의 자율 기능의 분석 접근didate 유전자.
제시된 프로토콜은 우리가 생체 5 세포 이동 및 굴지 역학을 제어에 TORC2 구성 요소 Sin1의 기능을 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 결과를 상기에 언급 된 바와 같이하지만, 이는 생체 내에서 세포의 이동을 제어하는 후보 유전자의 잠재적 의미를 분석하기 위해 사용될 수있다.
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Protocol
참고도 1은이 프로토콜의 개요를 제시한다.
사출 및 이식의 바늘 1. 준비
주 : 바늘 언제든지 준비되고 저장 될 수있다. 모델링 점토의 밴드에, 페트리 접시에 보관하십시오. 먼지로부터 보호하기 위해 파라 필름으로 접시를 밀봉합니다.
- 주사 바늘의 경우, 마이크로 피펫 풀러와 (재료의 목록 참조) (필라멘트 (재료의 목록 참조)하지 않고, 직경 0.58 mm 내부 직경 1.0 mm 외부) 유리 모세관을 당기십시오. 그들은 융모막을 관통 더 효율적으로 짧고가는 바늘 (약 5mm의 테이퍼 부분)을 선호한다.
주 : 주사 바늘은 일회용이다. - 세포 이식을위한 바늘
- 마이크로 피펫 풀러와 (필라멘트 (재료의 목록 참조)하지 않고, 직경 0.78 mm 내부 직경 1.0 mm 외부) 유리 모세관을 당겨.
- 유내부 직경 (셀 직경보다 약간 더 이식 함)이 35㎛이고 시점에서 바늘의 선단을 절단하는 microforge (재료의 목록 참조) 노래.
- 경사 45 °의 각도와 microgrinder (재료의 목록 참조)와 모세관의 절단 사지.
- 선택적으로, microforge를 사용하여 바늘 끝에 미늘을 당긴다. 이를 위해, 베벨의 팁 뜨거운 필라멘트을 터치하고 빠르게 배아를 관통 도움을 줄 수있는 미늘을 만들어, 그것을 멀리 당기십시오.
- 주사기에 부착 된 바늘 홀더에 바늘을 탑재합니다. 주사기를 사용하여, 유리 잔류 물을 제거하고, 아세톤으로 3 회 씻어 2 % 불산 바늘 세번의 내부를 헹군다.
주의 : 불산은 독성이, 장갑, 후드 조작 할 수 있습니다.
주 : 세포 이식 바늘을 여러 번 사용될 수있다.
의 2. 준비사출 및 세포 이식 용 식기
- 열 전체 전력에서 1 분 동안 전자 레인지에 아가로 오스 0.5 g을 포함 11 매체 배아의 50 ml의 배아 매체에 1 % 아가로 오스를 얻을 수 있습니다. 약 60 ° C의 아가 로스 겔 쿨하고 90mm 페트리 접시에서 50 ㎖를 붓는다. 특별히 고안된 금형 (물질의 목록 참조), 중 사출 요리 라인 또는 세포 이식의 요리 우물과 겔의 표면에 놓습니다.
- 아가로 오스가 너무 뜨겁지 않은 경우, 아가로 오스의 금형 플로트를 관찰한다. 아가로 오스 겔을 설정 한 후, 집게와 금형 (- B 그림 2A)를 제거합니다.
참고 : 요리는 몇 주까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 건조를 방지하기 위해 밀폐 된 습식 상자에 보관하십시오.
- 아가로 오스가 너무 뜨겁지 않은 경우, 아가로 오스의 금형 플로트를 관찰한다. 아가로 오스 겔을 설정 한 후, 집게와 금형 (- B 그림 2A)를 제거합니다.
- 사용하기 전에 28 ° C 배양기 30 분에서 접시를 놓습니다.
태아 및 사출 3. 컬렉션
- 사출 솔루션 준비
참고 : 액틴 결합 도메인mCherry 결합 등 Lifeact 같은 단백질 140 (ABP-140)를 결합 효모 액틴의 돌출 활성을 분석하기 위하여, 세포 내에서 중합 액틴을 시각화하기 위해 사용된다 (ABP140-mCherry을 함). 후보 유전자 (지배 부정 또는 구조적으로 활성 구조의 예를 들어 mRNA의, 또는 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드)의 기능을 테스트하기 위해 다른 화합물을 추가합니다. (도 3), 우리는 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드를 사용한 결과에 기재된 Sin1의 기능을 평가한다. 대조군으로서, 우리는 sin1의 모르 폴리 노에 있지만 제어 모르 대상 RNA 일치하지 않도록 순서를 따라 분포 5 뉴클레오티드 동일 모르 폴리 노를 사용 하였다.- 해동 sin1 및 5 불일치 제어 morpholinos (2 MM의 재고 솔루션), 얼음에 ABP140-mCherry의 mRNA. 의 mRNA의 375 NG (75 NG / 최종 μL) 및 sin1 또는 5 불일치 제어 모르 폴리 노 중 하나의 0.75 μL (0.3 mM의 최종) Danieau 버퍼 (58 mM의 염화나트륨, 0.7 밀리미터에 추가의 KCl, 0.4 mm의 (NO 3) 2, 5.0 mM의 HEPES pH를 7.6), 5 ㎕의 총 부피에 도달하는, 0.6 mM의 칼슘을 황산 4.
- 배아 컬렉션
참고 :이 실험은 설정 모두 기증자와 호스트 배아는 유전자 변형이며, 장래 prechordal 플레이트 (11)를 시각화하기 위해 상기 goosecoid (GSC)의 제어 발기인에서 GFP를 표현.- (: GFP GSC) 계란의 Tg를 수집합니다. 배아 매체 가득 90mm 페트리 접시에 약 80 알을 놓고 28 ° C에서 품어.
- 기증자의 배아를 주입
- 실체 현미경에서 부드럽게 배아 매체 가득 사출 접시의 라인에 집게로 수집 된 배아를 짠다. 집게를 사용하여, 상부를 향해 세포 배아를 배향. 배아는 4 셀 단계 (1 시간 게시물 수정)에 도달 할 때까지 28 ° C에서 인큐베이터에 주입 접시를 놓습니다.
- 2 μL와 주사 바늘을로드주입 솔루션입니다. 공기 transjector에 (물질의 목록 참조) 마이크로 매니퓰레이터에 넣고 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 튜브 (재료의 목록 참조)에 연결된 바늘 홀더 (물질의 목록 참조)에 바늘을 삽입 (재료의 목록을 보려면 ).
- 부드럽게 미세 집게로 끝을 터치하여 모세 혈관을 엽니 다. 필요한 경우, 그 말단을 곤란에 의해 열린 모세관을 잘라.
- 바늘로 4 개의 셀 중 하나를 입력하고, 셀 체적 (2 NL)의 70 %를 채우기 위해 셀 내의 용액을 주입. 30 배아를 주입한다.
주 : 원형질막 소프트와 같이 셀의 바늘을 얻기 어려울 수있다. 셀과 노른자 사이의 접합을 목표로하는 것은 바늘 침투를 용이하게한다. - 그들은 구 단계 (4 시간 후 수정)에 도달 할 때까지 28 ° C 배양기에서 배아를 놓습니다.
셀 Transplantat의 배아 4. 준비이온
- 200 μL 페니실린 / 스트렙토 마이신 (물질의 목록 참조) (펜 / 연쇄상 구균 EM)와 배아 매체의 20 ㎖를 준비합니다.
- 구 단계에서 배아의 Dechorionation (4 시간 후 수정)
참고 : Dechorionated 배아 매우 깨지기하고 공기 또는 플라스틱과 접촉시 폭발 할 것입니다. 따라서 그들은 아가 코팅 접시에 넣고, 화재 연마 유리 파스퇴르 피펫으로 전달 될 필요가있다.- 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아 매체에 1 % 아가 로스 코팅과 펜 / 연쇄상 구균 EM 가득이 35mm 배양 접시에 단계 3.3에서 주입 단계 3.2에서 수집 호스트 배아 기증자의 배아를 전송합니다. 두 개의 요리 호스트 배아 기증자의 배아를 유지합니다.
- 수동으로 미세 핀셋 (물질의 목록 참조)과의 chorions에서 배아를 추출합니다.
- 그들은 방패 단계 (6 시간 게시물 수정)에 도달 할 때까지 28 ° C를 인큐베이터에서 배아를 놓습니다.
5. 세포 이식
- 세포 이식을위한 배아를 정렬합니다.
- 형광 실체 현미경에서 선택 기증자의 배아는 실드 (녹색) 내에서 ABP140-mCherry (적색)을 표현.
- 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 펜 / 연쇄상 구균 EM 가득 세포 이식 접시의 우물에서 배아를 전송합니다. 이웃 행 한 행의 호스트 배아 및 기증자의 배아를 놓습니다.
- 속눈썹을 사용하여 조심스럽게 방패 위로 배아의 방향.
주 : 실드의 위치는 GFP 발현에 의해 평가 또는 해부학 적으로 될 수있다.
- 이식 시스템 설정입니다.
참고 : 이식 시스템은 마이크로 드라이브가 장착 된 해밀턴 주사기 (물질의 목록 참조) PTFE 튜브 (재료의 목록 참조) 및 튜브 커넥터 (재료의 목록 참조)에 연결된 바늘 홀더로 구성되어있다 (목록 참조 재료). 바늘 홀더3 방향 미세 조작기에 장착된다 (재료의 목록 참조).- 주사기에 부착 된 바늘 홀더를 사용하여, 70 % 에탄올로 세포 이식 바늘을 헹군다. 바늘로 공기를 흡입하여 건조. 이 먼지는 바늘의 테이퍼 부분에 갇히지 될 수 있으므로, 불어 건조하지 마십시오.
- 위쪽으로 베벨과, 해밀턴 주사기에 연결된 바늘 홀더에 바늘을 삽입합니다.
- 방패에 방패 세포 이식
- 이식 바늘로 기증자 배아의 방패를 입력하고 ABP140-mCherry 표지에 대한 10 ~ 20 세포를 그립니다. 조심스럽게 노른자 그리기 마십시오.
- 호스트 배아 실드에 세포를 이식. 모든 호스트 배아가 이식 될 때까지 반복합니다.
- 화재 연마 파스퇴르 피펫으로 손상된 배아를 제거합니다. 28 ° C에서 인큐베이터에 이식 된 배아를 배치하고 약 30 분 동안 복구 할 수 있습니다.
- 바늘을 사용하여주사기에 부착 된 홀더, 물을 세포 이식 바늘을 씻어 모델링 점토의 밴드에 페트리 접시에 다시 배치합니다. 파라 필름으로 접시를 밀봉합니다.
6. (선택 사항) 단일 세포 이식
참고 : 이식 바늘 하나의 셀을 그리기 어려워되도록 배아 세포는 서로 부착. 우리는 쉽게 하나의 prechordal 판 전구 세포를 이식하는 수정 된 프로토콜을 개발했다. 아이디어는 이전에 이식에 세포를 떼어 놓다하는 것입니다. 격리 판 prechordal 전구 세포들의 신원을 잃는 경향이 있기 때문에, 우리는 유전 Sox32 전사 인자의 부재하에, 절점 신호 전달 경로를 활성화하여, 장래 prechordal 판 신원을 부과. 우리는이 유도 된 세포가 내인성 prechordal 판 전구 세포 (8)처럼 행동 것을 확인했습니다. 아래는 하나의 세포 이식을 수행 할 수있는 특정 단계가있다. 셀 dissocia기 칼슘 프리 링거 11 배아 배치 체외 이식편 해부 기계적으로 교반함으로써 달성된다.
- 2.1 단계에서 대신 배아 중간의 칼슘 무료 벨소리 1 % 아가로 오스와 이식 요리를 준비합니다.
- 3.1 단계에서, ABP140-mCherry RNA와 sin1 모르 폴리 노 이외에, 2에서 3 (최종 0.6 NG / μL) 마디 수용체 Taram-A의 활성 형태를 코딩하는 RNA를의 NG 및 sox32에 대한 모르 폴리 노의 1.25 μL (원액을 추가 밀리미터, 따라서 0.5 mM의 최종).
- 4 단계, 전송 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여 펜 / 패 혈성 칼슘 무료 벨소리로 가득 세포 이식에 대한 접시에 세 가지 선택 기증자의 배아 후. 미세 핀셋, 주입 된 세포 (ABP140-mCherry 표지화 된 세포)를 함유하는 이식편 해부. 빠르게 배아의 나머지 부분을 폐기합니다.
- 세포가 해리까지 속눈썹으로 부드럽게 이식편을 저어.
- 이식 바늘에 하나의 고립 된 셀을 그립니다및 호스트 배아 실드로 이식.
- 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 펜 / 연쇄상 구균 EM 가득 아가로 오스 - 코팅 접시에 배아를 전송합니다. 30 분 동안 28 ° C에서 인큐베이터에서 배아를 놓습니다.
설치 7. 배아
- 영상 상공 회의소
- 방법 1 : 한쪽 3mm 높은 가장자리 4 홀 (5.5 mm 직경), (그림 2C - D)을 관통 플라스틱 슬라이드 (75 * 25 * 0.5 mm)로 구성된 영상 실을 사용합니다. 시아 노 아크릴 레이트 접착제 (슈퍼 접착제)과 뒷면 유리 커버 슬립을 붙인다.
참고 실험의 마지막에, 커버 슬립을 제거하고 모래 종이 접착제 잔기 없애 하룻밤 동안 물에 챔버를 배치했다. - 방법 2 : 10mm 구멍 35mm 매텍 유리 바닥 요리 (재료의 목록을 참조)를 사용합니다.
- 방법 1 : 한쪽 3mm 높은 가장자리 4 홀 (5.5 mm 직경), (그림 2C - D)을 관통 플라스틱 슬라이드 (75 * 25 * 0.5 mm)로 구성된 영상 실을 사용합니다. 시아 노 아크릴 레이트 접착제 (슈퍼 접착제)과 뒷면 유리 커버 슬립을 붙인다.
- 배아 실장
- 배아 매체의 뜨거운 0.2 % 아가로 오스 1 ml의 유리 병을 채 웁니다.열 블록에 42 ° C에서 보관하십시오.
- 형광 실체 현미경에서 빨간색 이식 된 세포가 녹색으로 표시된 예상 prechordal 판 (즉, 빨간색 이식 된 세포가 녹색 미래의 prechordal 판에서, 그리고 동물 극으로 이주 시작)의 일부있는 배아를 선택합니다.
- 화재 연마 파스퇴르 피펫 아가로 오스 솔루션으로 선택된 배아를 전송합니다. 피펫으로부터 배아 매체의 과잉 버린다. 아가로 피펫 배아을 그리고 아가 방울을 증착 촬상 챔버 배아 옮긴다. 아가로 오스가 설정되기 전에, 속눈썹과 배아의 방향. 직립 현미경으로 이미징 위쪽으로 예상 prechordal 플레이트를 배치, 또는 거꾸로 현미경 이미징의 유리 바닥에. 아가로 오스는 챔버의 다음 물론 다른 배아를 설치하기 전에 (실내 온도에 따라 약 1 분) 설정 될 때까지 기다립니다.
참고 : 영상의 차를mber 4 우물을 포함하는 4 배아까지 장착 할 수 있습니다. - 아가로 설정하면 건조를 피하기 위해 펜 / 스트렙토 EM과 상기 챔버를 채운다.
8. 라이브 영상
- 40 배의 물에 침수 장거리 렌즈를 사용합니다. GFP에 대한 이미지 GFP 및 mCherry (적절한 필터 세트를 사용하여, 여기 BP 40분의 470, 빔 스플리터 FT (510), 및 배출 BP의 50분의 540 mCherry에 대한 : 여기 BP 21분의 578, 빔 스플리터 FT (596), 및 배출 LP 641 / 75). 상 동성을 최적화하기 위해, 노광 시간을 조정한다.
- 접시에 모든 셀 이미지 (외배엽)에서 예상 prechordal 판 위의 몇 μm의 시작 (노른자)에서 예상 prechordal 판 아래에 몇 μm의 끝, Z-스택을 취득. 2 ㎛의 Z-단계를 사용합니다. 수집 속도를 최적화하기 위해, Z-스택 사이가 아닌 프레임 사이에 색상을 전환 할 수 있습니다.
이 녹색과 빨간색 이미지 사이에 약간의 차이가 발생할 수 있지만 정확한 공동 이후 문제가되지 않습니다 참고 :녹색과 빨간색 신호 사이의 -localization가 필요합니다. 광에 상기 촬상 시간의 노출을 줄이기 위해, 녹색 번만 prechordal 플레이트 전구 세포를 식별하기에 충분한 시간마다 5 포인트를 획득 할 수있다. - 돌기 주파수와 방향을 분석 할 필요가있는 2 분의 시간 간격 내에서 4 배아, 화상 등의 설정을 사용. 돌기 수명의 분석을 위해, 더 높은 시간 해상도를 얻기 위해 30 초까지의 시간 간격을 감소시킨다. 80 % epiboly에 60 % epiboly에서 이미지.
9. 세포 역학 분석
- ImageJ에있는 4D 이미지를로드
참고 : 인수에 사용되는 소프트웨어에 따라, 이미지가 다른 형식으로 저장됩니다 (이미지 당 하나의 파일, Z-스택 당 하나의 파일, 전체 실험에 대한 하나의 파일). 일부 ImageJ에의 플러그인 4D 스택을 열 온라인으로 사용할 수 있습니다. 우리의 데이터는 Z-스택 당 하나의 파일로 저장됩니다. 데이터 셋이 커질 수 있기 때문에, 그것의 일부 (일부 팀을 열 편리 할 수있다E 지점 또는 Z - 스택, 또는 8 비트의 서브 파트는) ... 이미지 변환된다. 우리는 우리가 요청에 배포 행복 할 것이다, 그렇게하기 위해 주문 제작 ImageJ에 플러그인을 사용합니다. - 오리엔테이션의 분석 및 세포 돌기의 주파수
- 미래의 prechordal 판 이주의 주요 방향을 결정하기 위해 GFP 이미지를 사용합니다. 세포 돌기 각도 측정을위한 기준으로서 이것을 가지고. 이 기준 방향은 화상의 한쪽면에 평행하도록 스택을 돌린다.
- 하나의 셀을 따르십시오. 선택 각 도구입니다. 각 프레임의 각 돌출부를 들어, 돌출부와 기준 방향 (도 3a) 사이의 각도를 측정하는 각도 도구를 사용한다. (키보드를 누르거나 M) 값을 저장하기 위해 측정 / 분석 명령을 사용하십시오. TXT 파일로 결과를 저장합니다. 다음 셀 반복합니다.
- 히스토그램과 같은 R과 플롯의 각도 분포로 데이터를 가져옵니다. 다른 조건을 비교하기 위해 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트 (R에 ks.test)를 사용합니다.
주 : 각 도구 고전 통계적 테스트 원형없는 테스트의 사용을 허용, 0 °와 180 ° 사이에 포함 된 값을 제공한다. - 이 데이터 세트 분당 셀당 돌기의 수가 발광 주파수를 계산한다. 사용 학생 T-테스트 (R에 t.test는) 다른 조건을 비교합니다.
- 셀 돌출부 수명의 분석
- 각 셀에 각각 돌출, 측정 돌기 기간 (돌출부 프레임 사이에 X 시간 간격 동안 프레임 수)를 참조하십시오.
- 다른 조건을 비교 R. 사용 학생 T-테스트 (R에 t.test)에 데이터를 가져옵니다.
참고 : 다른 마이그레이션 기능은 세포 이동을 특성화하기 위해 분석하는 흥미로운 일이 될 수 있습니다. 이 속도, 방향과 지속성 측정, 또는 세포 형태에 대한 세포 트랙을 포함한다. 일부 상용 소프트웨어 응용 프로그램은 이러한 기능을 측정 할 수 있지만, 오픈 소스 소프트웨어 어플리 많은 수의예를 들어 morphodynamics (12)를 분석에 적응으로 양이온과 ImageJ에의 플러그인도 사용할 수 있습니다 DiPer 마이그레이션 14시 셀 경계를 추적하는 세포 궤적과 방향 지속성 (13), CellTrack 볼 수 있습니다.
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Representative Results
제시된 기법은 생체 내 세포 이동의 제어에 Sin1 상기 토 착체 2 (TORC2)의 핵심 구성 요소 중 하나의 역할을 분석 하였다. 세포 이식의 사용은 분리 된 세포 및 세포 자율 효과 분석 라벨을 허용한다. 영화 S1은 이식 prechordal 판 전구 세포의 이동을 보여줍니다. ABP140와 굴지의 표시는 굴지 풍부한 세포질 돌기 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 우리는 그들의 주파수와 방향을 측정 하였다. 야생형 세포 이동의 방향 (도 3B)에서, 즉 동물 극 방향으로 배향 빈번한 큰 세포질 돌기를 생성한다. Sin1의 기능의 상실은 액틴 - 풍부 돌기 형성을 제어 sin1의 중요성을 입증 나머지 것들의 급격한 돌기의 수가 감소하고, 무작위로 이끈다. 흥미롭게도,이 표현형은 전자에 의해 구출 될 수있다RAC1 (15)의 구성 적 활성 형태의 xpression 강하게 TORC2는 RAC1 (그림 3B)를 통해 굴지 역학 및 세포 돌기의 형성을 제어하는 것을 제안.
제시된 기법은 셀 다이나믹스 사에서 Arpin 상기 Arp2 / 3 복합체의 최근 식별 억제제의 역할을 특성화하기 위해 사용되었다. Arpin 기능 상실 돌기 주파수 (특정 시간에 돌출부를 보유하는 세포의 평균 속도)의 증가를 이끈다. 이 중 하나를 더 자주 돌출 형성 또는 돌출 안정성의 증가로 인해 수 있습니다. 돌출 수명을 측정하는 것은 Arpin의 부재에서, 돌출 시간 지속 (그림 3C) 배가된다 것으로 나타났습니다. 이 돌기 수축을 촉진 것 인 Arp2 / 3 억제제로서 Arpin의 역할과 일치하며, Arpin보다는, 돌기 안정성을 변조함으로써 돌출부 주파수에 영향을 미치는 것을 제안돌기 시작.
그림 1 :. 프로 시저의 개요 Tg는 (GSC : GFP)을 배아는 4 셀 단계 (1 시간 게시물 수정)에 주입된다. 28 ° C에서 5 시간 후, 배아는 ABP140-mCherry에게 실드 (GFP의 +) 내에서 양성 세포를 보여주는 기증자의 배아로 선택된다. 쉴드 세포 이식 바늘 내에 그려진 호스트 배아 실드로 전송된다. 회복 0.5 시간 후에, 호스트 배아 탑재하고 epifluorescent 현미경 (40X 대물 렌즈) 이미지화. HPF :. 시간 게시물 수정은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : Transplantati접시 및 개인 우물와 이미징 회의소. (A) 이식 접시에. 세포 이식 요리 (B) 금형. (C) 집에서 만든 영상 실. (D)에 집에서 만든 영상 챔버의 개략도. 스케일 바 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 셀의 결과 역학 분석 돌출 각도 측정의 (A) 계획. 셀 돌출 방향 및 주파수의 (B) 분석. Sin1 (MO-Sin1)의 부재에서, 세포는 적은 돌출부를 방출하고 나머지 돌출부는 무작위로 배향된다. 이 표현형이는 GTPase RAC1 (모 - 죄의 구성 적 활성 형태의 식에 의해 구출 될 수있다1 + CA-RAC1). Dumortier 다윗 2015 년 5 돌기 수명. (C) 분석에서 수정. Arpin (MO-Arpin)의 부재에 볼록 주파수가 증가된다. 이 돌기 수명의 증가에 기인한다. 모르 폴리 노에 영향을받지 arpin RNA를 재 도입하는 것은이 하이퍼 돌출 표현형을 복원합니다. 에서 젠장 등. 수정 된 2013 년 4. 스케일 바 = 10 μm의. A : 전방; P : 후방, L : 왼쪽, R :. 오른쪽 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1 : 세포 돌기의 Sin1 컨트롤 형성, RAC1을 통해 (오른쪽 다운로드 클릭). 주사 이식 prechordal 판 전구 세포를,ABP140-mCherrry RNA를하고 RAC1의 구성 적 형태의 제어 모르 폴리 노, 또는 sin1의 모르 폴리 노, 또는 sin1의 모르 폴리 노 및 RNA를. 돌기 주파수 및 배향은 이러한 이미지상에서 측정 하였다.
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Discussion
이 프로토콜은 생체 내에서 라이브 영상으로 세포 이식을 사용하여 키메라 배아의 생성을 결합하여 세포 이동의 후보 유전자의 역할을 연구하는 쉬운 방법을 제공합니다.
모자이크 배아의 생성
셀의 역학을 공부하는 것은 세포질 확장을 분석하기 위해 형상의 시각화가 필요합니다. 따라서 좋은 시각적 대비를 제공하고, 환경 - 또는 다르게 표시 - 이것은 그렇지 않으면 레이블이없는에 고립 된 세포를 라벨에 의해 달성 될 수있다.
확률 적 배아에서 세포의 일부를 레이블하는 쉬운 방법은 한 세포 단계 16 plasmidic DNA를 주입하는 것입니다. 주입 된 플라스미드는 무작위 불평등 세포 분열시 세포에서 분리되어 응집체를 형성한다. 이는 세포의 임의의 서브 세트 내의 플라스미드의 발현을 유도하고, 따라서 MO를 생성하는 매우 빠르고 쉽고 비 침습적 방법을 나타낸다SAIC 배아. 그러나, 주입 된 플라스미드를 발현하는 세포가 클러스터를 형성하는 경향이 있고, 장래 prechordal 플레이트에 몇 절연 발현 세포를 포함하는 배아를 찾을 가능성은 매우 낮다. 또한 plasmidic DNA의 사용은 삽입 된 구조체의 발현 수준의 매우 제한된 제어를 제공한다. plasmidic DNA 주입보다 기술적으로 곤란하지만 세포 이식에 의한 키메라 배아의 생성은 다수의 이점을 제공한다 : 이식 된 세포의 수를 제어의 구조 (RNA 주입)의 발현 수준을 제어하고, 마지막으로 세포 이식은 세포가 손실 또는 기능 구조의 이득을 포함 이식하는 모자이크 배아를 생성하여, 셀 자치 효과를 테스트 할 수 있습니다. 반대로 이식은 또한 수정 된 배아에 야생형 세포 이식에 의한 환경의 비 - 자율적 인 역할을 평가하기 위해 사용될 수있다. 이 테스트에 대한 특별한 관심이있을 수있다예를 들어, 세포 이동 분석에 특히 적합하다 세포 외 기질 성분의 기능.
세포 이식에 대한 상세한 프로토콜은 이미 (10)을 설명 하였다. 이 프로토콜에 비해, 우리는 우리의 과정에서 두 가지의 차이를 논의하고 싶습니다.
첫번째 차이는 도너 배아 주입 단계에 관한 것이다. 경험에 의하면, 배아 인해 셀에서의 RNA의 불완전한 확산 균일 모든 셀의 형광 단백질을 발현하지 않는 형광 단백질의 RNA를 가진 한 세포 단계에서 주입. 네 개의 셀 중 하나의 4- 세포 단계에서 도너 배아 주입 형광 단백질의 RNA를 공동 주입 추적되지 않은 다른 RNA를 가진 경우에 특히 중요한 세포 균질 클론을 얻을 수있다.
두번째 주요 차이점은 transplantat 대신에 오일 공기의 사용이다이온 주사기. 공기 충진 시스템의 주요 단점은 공기의 탄성에 의한 관성이다. 오일 반대로, 비압축성되고, 흡입 압력을 잘 제어 할 수 있습니다. 그러나, 약간의 훈련 및 바늘의 얇은 테이퍼 부분에 공기와 배아 매체 간의 인터페이스를 유지함으로써, 공기 충전 시스템과 흡입 압력의 제어는 실드 단계에서 세포를 이식하기에 충분하다. 세포가 더 작고 응집됨에 후반부를 들면, 흡입 공기 충진 설치로 달성 될 수없는 매우 정밀하게 제어해야하는 높은 압력을 필요로한다. 설정이 어떤 기포없이 기름으로 시스템을 충전으로, 기름 대신 공기를 쉽게 사용하기 까다 롭습니다. 또한, 오일 이식 바늘을 채우는 피한다. 이것은 이식 바늘을 재사용하도록하고, 따라서주의 깊게 제조 할 수있다. 우리는 날카로운 모서리없이 올바른 직경의 바늘이 succe의 핵심이라고 생각ssful 이식. 이식이 단계는 분명히 용이하게 수행되기 전에 실제로 필요한 프로토콜의 중요한 단계 중 하나이다.
또한 이식 바늘에 고유 한 셀을 그리기 위해, 이식 이전에 세포 해리로 이루어져 하나의 세포를 이식하기위한 구체적인 방법을 제시하고있다. 이것은 일시적인 세포 해리가 자신의 정체성 및 / 또는 동작을 수정하지 않습니다 것을 의미한다. prechordal 판 전구 세포 위해, 우리는 유 전적으로 세포의 정체성을 부과하고,주의 깊게 세포가 아닌 해리 사람처럼 행동 것을 확인했다. 그러나, 우리는 형식적으로 그 해리를 배제 할 수없는 및 / 또는 유전자의 유도는 세포 내에서 주목 수정을 유도한다. 그들을 해리없이 단일 세포를 이식하는 것은 가능하다. 세포 이식 바늘에 신중하게 작성해야합니다. 그러나, 우리의 손에 적어도 성공률은 하나 이상의 셀이 니 들어간 하나 때문에 매우 낮다DLE, 또는 작성 및 바늘에 사망 또는 한 번 이식 된 세포 가위 때문이다.
빠른 공 초점 영상에 비해 표면 형광
모자이크 배아를 생성하는 세포 이식의 사용은 다른 표지 된 세포로부터 분리 된 분리 된 세포의 표지에 대해 허용한다. 프로토콜에서 제안 된 바와 같이,이 상황에서, 세포 형태와 역학 좋은 촬상이 표준 표면 형광 현미경에 의해 달성 될 수있다. 이것은 비교적 넓은 확산 장비와 저가의 대안 더 비싼 공 촛점 이미징 시스템에 존재의 명백한 이점이있다.
정확한 세포 내 현지화를 들어, 공 초점 영상이 특정의 축 방향 해상도를, 해상도를 향상시킬 수있다. 아직 충분한 시간 해상도를 얻으려면, 빠른 공 초점 이미징이 사용되어야한다. 우리의 경험에서, 회전 디스크 현미경은 해상도, 속도 및 사진 독성 사이 좋은 타협을 제공합니다. 빠른 스캐닝 공 초점 마이크(공진 주사 현미경 등) roscopes 덜 빈번하고 더 비싼뿐만 아니라 좋은 옵션이지만.
세포 골격 라벨링
액틴 필라멘트 및 역학의 좋은 라벨은 액틴 기반의 세포 이동의 메커니즘을 연구하는 것이 중요하다. 막 - 결합 된 형광 표식은 셀 윤곽을 분석하는 것이 더 효율적이지만, 액틴 라벨링 셀 돌출부 더 나은 시각화를 허용한다. 세 개의 표지화 된 세포 접촉에 들어갈 경우 특히, 상기 연장 부의 윤곽과 혼동 할 수있는 인접 셀들의 막으로 인접한 두 셀 사이에 위치하는 세포질 확장자를 식별하는 것은 매우 어렵다. 액틴 필라멘트에 레이블을 우리가 초점을 맞추고있는 굴지 기반의 세포 돌기의 명확한 검출 할 수있다. 세포 형태를 정량 한 경우 멤브레인 표시가 바람직하다. 또 다른 옵션은 하나의 유전자에 대한 리 3 색 영상 (하나를 이용하여, 모두 라벨을 사용하는네브라스카, 굴지 하나 하나 막) 또는하여 GFP는 막을 라벨. 트랜스 제닉 라인에서, GFP가 막 GFP 표지하더라도 세포질이며 goosecoid-GFP 양성 세포를 따라서 식별 될 수있다.
지난 몇 년 동안, 프로브의 수는 실제 샘플에서 굴지의 레이블을 사용되어왔다. 첫 번째 사람은 액틴 단량체에 직접 융합했다. 이 두 가지 주요 단점을 제시했다. 첫째, 그들은 모든 액틴이 아니라 구체적으로 중합 굴지의 레이블. 둘째, 자주 독성했다. 현재 사용중인 프로브는 형광 기자 융합 사상 굴지 바인딩 도메인입니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 현재 사상 굴지의 가장 자주 사용되는 마커이며, 모든 사상 굴지의 레이블, ABP140 17 (효모 액틴 결합 단백질 (140)의 액틴 결합 도메인)을 사용했다. 18 (calponin의 상동 도메인) Utrophin는 사상 굴지의 레이블,하지만 안정된 필라멘트 레이블을 나타납니다. 이러한 차이는 아이덴하는데 사용 된tify 동적 액틴 필라멘트, 사람은 ABP140에 의해 표시되지 Utrophin 19있다.
최근이 ABP140 및 Utrophin은 긴 식 20 특히 독성 효과를 가질 수 비행에보고되었다. 우리가 ABP140 표지 세포에서 어떤 마이그레이션 결함을 발견하지 않았습니다에도 불구하고, 우리는 ABP140 표현은 내생 굴지 역학을 교란 수 있음을 배제 할 수 없다. 사상 굴지에 대한 세 번째 프로브는 최근 21보고되었다. F-tractin (쥐 이노시톨 인산염-3 키나아제에서 액틴 결합 도메인)의 독성 효과 (20, 22)를 표시하지 않을 사상 굴지의 충실한 기자로 설명되었다. 우리의 지식에, F-tractin의 사용은 아직 제브라 피쉬에보고되지 않았습니다.
액틴 외에도 많은 다른 세포 성분은 세포 이동에 대한 이해를 향상시키기 위해 분류 될 수있다. 이것은 다른 세포 골격의 미오신과 같은 구성 요소, 미세 소관, 중심체뿐만 아니라 KN을 포함자신의 세포 이동의 규제 (작은 GTP 아제의 Rho, rac와 Cdc42, PIP3에 대한 형광 프로브의 활성화 형태 ...) 또는 세포 부착에 관여하는 단백질 (인테그린, cadherins ...).
전반적으로,이 프로토콜은 생체 내에서 세포의 이동을 제어 후보 유전자의 개입을 테스트하는 빠르고 쉬운 시스템을 제안 전술 툴 및 기술들을 재편성. 이 지시 집단 이주의 흥미로운 모델이며, 때문에 가능한 유전자 변형 라인 표시 그것으로 우리는 미래의 prechordal 판 마이그레이션을 사용했다. 그러나, 동일한 프로토콜이 개발 중에 발생하는 다른 이전 이벤트를 분석하도록 구성 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
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