Abstract
Die Kultivierung primäre Neuronen im Hippocampus in vitro erleichtert mechanistischen Abfrage von vielen Aspekten der neuronalen Entwicklung. Dissoziierten embryonalen hippocampalen Neuronen können oft erfolgreich auf Glasdeckgläschen in hoher Dichte unter serumfreien Bedingungen wachsen, aber niedriger Dichte Kulturen erfordern typischerweise eine Zufuhr von trophischen Faktoren durch Co-Kultivieren mit einer Glia feeder layer, deren Herstellung zeitaufwendig sein kann und mühsam. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von Glia Interpretation der Ergebnisse und preclude Studien über neuronenspezifische Mechanismen vermengen. Hier wird ein vereinfachtes Verfahren für ultraniedriger Dichte (~ 2.000 Neuronen / cm 2), langfristige (> 3 Monate) primären Hippocampus Kultur präsentiert , die unter serumfreien Bedingungen und ohne Gliazellen Unterstützung. Niedrige Dichte Neuronen sind auf Poly-D-Lysin beschichtete Deckgläser aufgewachsen, und blätterte auf hoher Dichte Neuronen in einer 24-Well-Platte gewachsen. Anstelle von Paraffin Punkte mit einem Raum zu schaffen between die beiden neuronalen Schichten können die Experimentatoren einfach ätzen die Kunststoff-Boden des Brunnens, an dem die mit hoher Dichte Neuronen befinden, einen Mikroraum förderlich für die geringe Dichte Neuron Wachstum zu schaffen. Die Co-Kultur kann leicht für> 3 Monate ohne signifikanten Verlust der niedriger Dichte Neuronen aufrecht erhalten werden, wodurch die morphologischen und physiologischen Untersuchung dieser Neuronen zu erleichtern. Um diese erfolgreiche Kulturbedingungen zu erläutern, werden Daten zur Verfügung gestellt in Zellen mit niedriger Dichte nach längerer Kultur reichlich Synapsenbildung zu zeigen. Diese Co-Kultursystem erleichtert auch das Überleben von Neuronen in sparse einzelnen Inseln aus Poly-D-Lysin-Substrate und damit die Bildung von autaptic Verbindungen gezüchtet.
Introduction
Hippokampus - Neuronen Anbau unter in vitro Bedingungen ermöglicht Beobachtungen und experimentelle Manipulation dieser Neuronen , die sonst nicht möglich sind , in vivo. Dieser experimentelle Ansatz ist weit verbreitet 1 zu offenbaren neuronalen Mechanismen des Wachstums, der Polarität, Neuriten - Spezifikation, des Handels und der subzellulären Lokalisation von Proteinen, die Synapsenbildung und funktionelle Reifung verwendet. Diese in vitro kultivierten Hippocampus - Neuronen, wenn sie von späten embryonalen Stadien geerntet, sind relativ rein (> 90%) glutamatergen Zellen der Pyramiden Morphologie 2. Da Neuronen in einer 2-D - Oberfläche unter in vitro Bedingungen gezüchtet wurden, ermöglicht diese Methode eine einfache Beobachtung, wie die Live - Darstellung oder Immunzytochemie (ICC) über eine einzige Brennebene Färbung 3; oder Manipulationen, wie medikamentöse Behandlung und Transfektionen 3-6. Wenn bei hoher Dichte gezüchtet, neigen Neuronen hohe Überlebensraten haben wegen der höheren Concentrations von sezernierten Wachstumsfaktoren zusätzlich zu Verdauungs Unterstützung der Wachstumsmedien und auch wegen der Neuriten kontaktabhängige Mechanismen 7. Allerdings sind niedriger Dichte Neuronen im Hippocampus wünschenswert für morphologische Studien, in denen ein einzelnes Neuron kann in seiner Gesamtheit oder gebeizt für ICC-Analyse abgebildet werden. Geringer Dichte Neuronen sind schwer in Kultur zu halten aufgrund des Fehlens von parakrine Unterstützung und erfordern daher oft trophische Unterstützung von einer glialen (typischerweise kortikalen Astrozyten) feeder layer, die vor dem Neuron Kultur 2 vorbereitet werden muss. Wenn co-kultiviert mit einer Gliazellen Feeder-Schicht, sind niedriger Dichte Neuronen auf Deckgläsern gezüchtet, und blätterte dann auf der Oberseite der Schicht Glia, so dass die geringe Dichte Neuronen und Gliazellen sind einander zugewandt sind. Ein kleiner begrenzten Raum zwischen Glia und Neuronen ist , indem Paraffinwachs Punkte an den Ecken der Deck erstellt, also eine "Sandwich" Layout 2,8,9 erzeugen. Die geringe Dichte Neuronen wachsen wnnerhalb den engen Raum zwischen Gliazellen und dem Deckglas, das von Neuronen und Glia sezerniert eine permissive Mikro mit konzentrierter Faktoren erstellt. Dieser Ansatz führt zu geringer Dichte, voll entwickelten Neuronen, die einigermaßen voneinander entfernt sind, also ICC Kennzeichnung oder Live-Imaging-Studien erleichtern.
Ein scheinbarer Nachteil Neuron-Glia-Co-Kultur, abgesehen davon, dass zeitraubend und arbeitsaufwendig ist, dass es Studium der neuronenspezifische, oder zellautonomen, Mechanismen verhindert. Obwohl dieses System ist weit weniger komplex als in vivo Nervengewebe, Glia Auswirkungen auf neuron Entwicklung durch sezerniert noch-nicht-vollständig definierte Faktoren können die Experimente 10 vermengen. Daher wird in Experimenten, die die Untersuchung von Neuron spezifische Mechanismen erfordern, definierten Kulturbedingungen, die Serum und Glia-Trägerschicht erforderlich sind, zu entfernen. In einer früheren Studie wurde in Züchten niedrigen Konzentrationen von Neuronen (~ 9.000 Zellen / cm 2) unter Verwendung eines th gelungenree dimensionale Hydrogelmatrix 11. Da eine relativ reine kann neuronalen Population mit hoher Dichte unter serumfreien Bedingungen ohne glial Unterstützung kultiviert werden, hypothesize wir, dass ultra-niedrige Dichte von hippocampalen Neuronen in serumfreien definierten Kulturmedium durch Co-Kultivieren mit hoher Dichte Neuronen gezüchtet werden, in eine Möglichkeit, die der konventionell angenommen Neuron-Glia-Kokultur analog ist. Tatsächlich wurden hohe Dichte hippocampalen Neuronenkulturen in einer "Sandwich" -Konfiguration vor kurzem eine kleine Anzahl von spezialisierten magnozellulären endokrinen Neuronen 12 zur Unterstützung verwendet wird .
Daher Co-Kultur mit hoher Dichte Neuronen erlauben kann niedriger Dichte Neuronen trophischen Faktoren Unterstützung zu erhalten, die langfristige Überleben zu ermöglichen, ausreichend ist. Dieses Protokoll der Kultivierung mit ultraniedriger Dichte Neuronen wurde so formuliert und validiert. Das Protokoll kann in einem einzigen Experiment durchgeführt, mit hoher Dichte Herstellung von (~ 250.000 Zellen / ml) disvergesellschafteten Neuronen im Hippocampus zuerst, und macht dann eine Verdünnung mit einer Dichte ~ 10.000 Neuronen zu erhalten / mL (~ 3.000 Neuronen / Deckglas oder ~ 2.000 Neuronen / cm 2), die viel niedriger ist als in den meisten Kulturen mit geringer Dichte berichtet 2,3,9 , 11,13. Diese Kultur Zustand lose bezeichnet als "ultra-niedriger Dichte" Kultur und verwendet mit "niedriger Dichte" inter-changeably. Die hohe Dichte Neuronen werden auf der Poly-D-Lysin beschichtete Platten mit 24 Vertiefungen plattiert; während die geringe Dichte Neuronen auf Poly-D-Lysin-beschichtete 12-mm Glasplättchen ausgesät werden, die in einem anderen 24-Well-Platte angeordnet sind. Die Deckgläser mit geringer Dichte Neuronen haften auf der Oberseite der hohen Dichte Neuronen 2 Stunden später gekippt, nachdem die Neuronen abstammen und auf die Deckgläser angebracht. Zusätzlich anstelle Paraffin Punkte der Verwendung zu erhöhen, wurde die Deckgläser über der hohen Dichte Neuronenschicht, eine 18 G Injektionsnadel verwendet, um den Boden der 24-Well-Platten mit zwei parallelen Streifen zu ätzen. Die resultierende displaced, angrenzende Kunststoffe bieten eine erhöhte Unterstützung für die Glasplättchen. Dieser Raum wird konstant auf 150 bis 200 & mgr; m gemessen, die ausreichend Sauerstoff und Kulturmedium Austausch ermöglicht, während eine Mikroumgebung mit konzentrierter Nahrungsfaktoren bereitstellt. Unter dieser Bedingung wachsen die niedriger Dichte Neuronen extensiv und über drei Monate in Kultur überleben können. Wenn diese Neuronen mit GFP-Plasmid nach drei Wochen in Kultur transfiziert sind, werden die Dendriten überschwänglich mit dendritischen Dornen besetzt. Als Beweis für das Prinzip werden die Daten zu zeigen, präsentiert, dass diese Co-Kultursystem mit ultraniedriger Dichte Kulturen von Neuronen im Hippocampus auf Poly-D-Lysine "Mikro-Inseln", wo Neuronen bilden autaptic Verbindungen ausgesät unterstützt die Untersuchung von Zell erleichtern -autonomous, netzunabhängige Mechanismen.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren Mäuse beteiligt sind, wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Arizona genehmigt, und NIH-Richtlinien angepasst.
1. Gewebequelle für Hippocampus Kultur
- Pränatale Maus Welpen für Hippocampus Kultur zu erzeugen, verwenden zeit trächtige Mäuse (C57Bl6 / J), die im Haus 17 gezüchtet werden. Der Tag mit Vaginalpfropfens Erkennung wird als E0.5 bezeichnet. Die geplante Erntezeit für die Kultur ist E16.5-E17.5.
Hinweis: Dieses Protokoll Kulturen von zwei Platten mit 24 Vertiefungen von zwei hochdichten Neuronen beschreibt Kokultivierung mit niedriger Dichte Neuronen (48 Deck insgesamt). Für weitere Platten, Materialien und Reagenzien können entsprechend skaliert werden.
2. 24-Well-Platten Vorbereitung für High-Density-Neuron Kulturen
Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte (2-3) am Tag vor der geplanten Ernte von Embryonen.
- Bringen Sie zwei 24-LochPlatten in die Zellkultur Kapuze, öffnen Sie die Einzelverpackung.
- Schließen Sie eine 18 G Spritzennadel in einen 1-ml-Plastikeinwegspritze.
- Halten der Spritze, und das Ziel der Nadelspitze bei ~ 1 mm an der Mitte des Bodens der Vertiefung belassen. Mit mäßigem Kraft (~ 250 g), um den Boden des Bohrlochs (~ 1 mm lang) zu ätzen. Eine Nut wird gebildet werden und die Kunststoffmaterialien verdrängt wird über dem flachen Boden gut Oberfläche eine erhöhte Unterstützung bilden. Ätzen andere ~ 1 mm langen parallelen Nut bei ~ 1 mm nach rechts von der Mitte des Bodens in ähnlicher Weise.
- Wiederhole diesen Schritt für alle Vertiefungen der beiden Platten mit 24 Vertiefungen. Die beiden 24-Well-Platten für High-Density-Kultur verwendet werden, sind nun bereit für die Beschichtung mit Poly-D-Lysin (siehe Schritt 3.8 unten).
3. Deckgläser Vorbereitung für Low Density Neuron Kulturen
- Verwenden Sie 12-mm-Durchmesser # 1 Runde Glas.
- Legen Sie 50 Deckgläser in einem Durchmesser von 100 mm sterile Petrischale aus Kunststoff, und versenken Deckin 20 ml 70% ige Ethanollösung. Dieses Petrischale auf einer rotierenden Plattform mit mäßiger (70 rpm) Geschwindigkeitsdrehung für eine Stunde. Entfernen 70% Ethanol und dann mit einer frischen Charge von 70% Ethanol zu ersetzen. Drehen, und für eine weitere Stunde waschen.
- Entsorgen Sie 70% Ethanol Reinigungslösung. In sterilem Wasser (gefiltert durch 0,2 & mgr; m-Filtereinheit). Spülen Sie die Deckgläser rigoros durch die Petrischale mit der Hand drehen. Spülen Sie drei Mal, jedes Mal mit frischem sterilem Wasser zu ersetzen.
- Legen Sie die Petrischale mit Deckgläsern in einer sterilen Zellkultur Kapuze mit Laminar-Flow. Saugen Sie das Spülwasser durch die Vakuumleitung und 10 ml sterilem Wasser filtriert, um die Deckgläser tauchen. Die Deckgläser sollten steril sein und sollte die Oberfläche für Poly-D-Lysin-Beschichtung sauber genug sein.
- Öffnen Sie zwei 24-Well-Platten aus ihrer individuellen Verpackung, und legen Sie sie in der Haube.
- Schalten Sie die Unterdruckleitung in der Motorhaube. Schließen Sie eine 200 ul Pipettenspitze mit der Vakuumleitung, und verwenden Sie einen scissor die Spitze schneiden, um eine größere Öffnung zu schaffen.
- Verwenden Sie eine Fein Spitze # 5 tweezer Deckgläser aus der Petrischale zu holen, ein zu einer Zeit, und verwenden Sie die Unterdruckleitung, um das Deckglas vollständig trocknen. Dann legen Sie ein Deckglas in jede der Vertiefungen der 24-Well-Platte. Die 50 gereinigt Deckgläser sollte ausreichen jeder der Vertiefungen der beiden Platten mit 24 Vertiefungen zu füllen.
- Verdünne die poly-D-Lysin-Stammlösung (1 mg / ml) in die Arbeitslösung (0,1 mg / ml) mit Boratpuffer (pH 8,5). Für die vier 24-Well-Platten (darunter zwei mit hoher Dichte Platten mit geätzten unten), Herstellung von 30 ml der Gesamtarbeitslösung.
- In 300 ul 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin-Arbeitslösung in jede Vertiefung mit Glasplättchen. Stellen Sie sicher, die Deckgläser werden in Lösung vollständig eingetaucht. Wenn nicht, die Spitze # 5 Pinzette verwenden, um nach unten drücken Deckgläser gegen den Boden des Bohrlochs, und verwenden Sie die Spitze Poly-D-Lysin-Lösung zu führen alle die Oberfläche der Deck zu decken. Sichtprüfung alle Deck su zu machenre keine Luft zwischen der Platte und Deck gefangen.
- In 300 ul 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin-Arbeitslösung in jede Vertiefung der hohen Dichte Kulturplatte mit geätzten Boden. Drehen Sie von Hand, um die Lösung zu verbreiten den gesamten Boden des Bohrlochs zu decken.
- Rück alle vier Platten mit Poly-D-Lysin zu der Kultur -Inkubator inkubieren O / N.
4. Waschen und Pre-Anlage Platten für Kultur
Anmerkung: In den folgenden Schritten (4-9) werden am Tag der Gewebeernte durchgeführt.
- Nach der Inkubation / Beschichtung von Deckgläsern und 24-Well-Platten O / N, bringen alle vier Platten (zwei mit Spenderdeck, zwei Akzeptor hoher Dichte Platten mit geätzten Kunststoffboden) in die Kultur Kapuze. Verwenden, um die Unterdruckleitung den Poly-D-lysin-Lösung zu entfernen.
- Unmittelbar nach der Entfernung des Poly-D-Lysin-Lösung, fügen ~ 1 ml steriles Wasser zu jeder Vertiefung eine Plastiktransferpipette. Schließlich werden die Vertiefungen ausgefülltmit Wasser, lassen Sie für 10 Minuten stehen. Entfernen Sie das Wasser durch Vakuum, dann fügen Sie 300 ul Waschmedium in jede Vertiefung der Boden des Bohrlochs zu bedecken (mit oder ohne Glasplättchen). Nicht die Poly-D-Lysin-Beschichtung trocknen lassen.
- Gibt alle vier Platten in die Zelle Inkubator. Die Platten sind bereit zu benutzen, wenn die dispergierten Neuronen im Hippocampus vorbereitet sind.
5. Herstellung von komplettem Kulturmedium und Trypsinlösung für enzymatische Verdauung
- Bereiten Sie 60 ml komplettem Kulturmedium durch Mischen der Bestandteile (siehe Materialien). Verwenden Sie eine 50-ml-Spritze mit einer 0,2 & mgr; m Porengröße Spritzenfilter verbunden, filtern das komplette Kulturmedium in zwei 50 ml konischen Röhrchen. Jedes Röhrchen enthält 30 ml komplettem Kulturmedium.
- In einem separaten 50 ml konischen Röhrchen, fügen ~ 30 ml Waschmedium (siehe Materialien) und erwärmen auf 37 ° C. Dies wird verwendet, um das Gewebe nach enzymatischer Verdauung zu waschen.
- Bereiten Sie das Enzym Digestionsmedium. In einem 15 ml konische Röhrchen, fügen Sie 4,5 ml Waschmedium und 0,5 ml 2,5% Trypsin-Lösung und 50 & mgr; l 100X DNase I.
- Legen Sie das komplette Kulturmedium, Waschmedium und Enzymdigestionsmedium in einem 37 ° C Wasserbad.
6. Herstellung von Chirurgische Werkzeuge
- Sterilisieren alle chirurgischen Werkzeugen in einem Sterilisationstasche: zwei kleine Schere, eine Pinzette und zwei # 5 Pinzette.
7. Entfernen von Brains von E16.5-E17.5 Maus Embryonen und Dissection von Hippocampi
- Bereiten Sie zwei 10-cm-Petri gefüllten Schalen mit eiskaltem, sterilen Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS).
- Euthanize die Maus dam mit einer intraperitonealen Injektion von Natriumpentobarbital Phenobarbital (100 mg / kg in einem Volumen von ~ 0,5 ml). Nach der Injektion, wenn der Damm Reaktion auf Zehe Prise verliert, opfern mit Genickbruch.
- Sprühen Sie den Bauchbereich des Damms mit 70% Ethanol, und machen eine 2-cm langen Schnitt entlang der Mittellinie des Bauches zu belichtendie Gebärmutter.
- Entfernen Sie die Embryonen und stellen einzelne in einem Durchmesser von 10 cm Petrischale mit kaltem Sezieren HBSS-Puffer.
- Halten Sie den Embryo durch den Hals eine Zange verwenden, und verwenden Sie einen kleinen Schere den ersten Schnitt direkt in der Mittellinie unterhalb des Kleinhirns Ebene und Schnitt durch das Hirngewebe zu machen. Sie nicht den Embryo enthaupten.
- auf der Ebene der Schädelbasis Legen Sie die rechte Seite Spitze des kleinen Schere aus Schwanzregion, die aufgeschnitten wird, den ganzen Weg durch den rostralen Teil des embryonalen Gehirn (nicht überqueren Mittellinie) und einen Schnitt an der linken Seite zu machen.
- Legen Sie die Seite Scheren links Spitze wieder um einen Schnitt auf der rechten Seite zu machen. Lassen Sie ein schmales Band von ungeschnittenen Schädelknochen und Hautgewebe am rostralen Ende, so dass das ganze Gehirn beiseite für die einfache Extraktion gekippt werden kann.
- Verwenden Sie die Spitze der Schere die embryonale Gehirn in die HBSS-Lösung heraus zu schaufeln. Untersuchen Sie das Gehirn unter einem Binokular. Das Gehirn sollte ohne grobe Schnitt-o intakt seinff Regionen.
- Wiederholen Sie diese Schritte alle Embryo Gehirne zu sammeln.
- Sammeln Sie alle intakten Gehirn in eine neue Petrischale mit 20 ml kaltem HBSS-Puffer. Legen Sie die Petrischale unter einem Präpariermikroskop.
- Sehen Sie das Gehirn von Bauchseite. Halten Sie das Gehirn mit einer Pinzette am kaudalen Ende nach unten, legen Sie eine scharfe # 5 Pinzette diagonal einen Schnitt zwischen der Mitte rostral Punkt und dem Schwanz-Schläfenregion zu machen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die andere Hemisphäre. Nach dem, trennen zwei Hemisphären mit intakten Hippocampus vom Rest der Hirnstamm Gewebe zu schneiden.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede der Gehirne.
- Pool alle seziert Hemisphären, und entfernen Sie die Meningen mit zwei Paaren von # 5 Pinzette.
- Identifizieren Sie die Entwicklung Hippocampus als eine gekrümmte Struktur, die im Inneren des Schläfenlappens gefaltet wird. Abwechselnd die beiden Paare von Pinzetten aus angrenzenden kortikalen Gewebe des Hippokampus zu trennen. Sammeln und bündeln alle hippocampi Gewebe (siehe Abbildung 1).
8. enzymatische Verdauung, Trennen in Einzel Neurons
- Verwendung eines Kunststoff-Transferpipette, übertragen alle seziert Hippocampi in die enzymatische Aufschlußlösung, enthaltend 5 ml Waschmedium mit 0,25% Trypsin + 1X DNase I in einem 15 ml konischen Röhrchen.
- Das Röhrchen wird in ein Wasserbad und Inkubation bei 37 ° C für 25 min, mit intermittierender sanften Invertierung des Rohres einmal in jedem 5 min.
- Nach 25 min, entfernen Sie vorsichtig die Enzymlösung mit einer Hand gehalten Plastikpipette durch Absaugen verwendet wird. In warmen Waschmedium auf 10 ml und sanft in das Gewebe zu waschen, indem Sie langsam das Rohr 5-mal umgekehrt wird. Entfernen Sie das Waschmedium, und dann werden 10 ml Waschmedium erneut für eine zusätzliche Wäsche.
- Entfernen Sie das Waschmedium, und 3 ml frisches, warmes Waschmedium wieder. Das Röhrchen mit der Hand rigoros auf das 15-fache der verdauten Neuronen aus dem Gewebe zu entfernen. Das Medium sollte, sobald die Zellen eine trübe gewordenwieder aus dem Gewebe in das Waschmedium abgetrennt. Sammeln der Zellsuspension in ein neues 15 ml konischen Röhrchen, während das verbleibende Gewebe in die Röhre zu verlassen.
- Fügen Sie eine weitere 2 ml Waschmedium auf das Gewebe und sanft das verbleibende Gewebe getrennt durch Verreiben durch eine Plastikpipette für ~ 15-mal. Lassen Sie für 5 Minuten sitzen. Pool der Zellsuspension in die neue 15 ml konischen Röhrchen, die "shake-off 'Zellen gesammelt enthält.
- Zählen Sie die Dichte von Neuronen mit einem Hämozytometer. Typischerweise kann 3.000-5.000 Zellen pro Mikroliter erhalten werden seziert, abhängig von der Anzahl der Embryonen. Eine durchschnittliche Anzahl von 2,5 x 10 7 Neuronen werden geschätzt , wenn unter der Annahme , sechs Embryonen werden zerlegt.
- Berechne das Volumen dieser Zellsuspension benötigt, um eine Dichte von 250.000 Neuronen / ml zu ergeben, wenn sie auf die 30 ml komplettem Kulturmedium zugegeben. Dieses Volumen einer der beiden konischen Rohren 30 ml komplettem Kulturmedium, das die hohe Dichte neuron Plattierungsmedium zu ergeben. <li> Transfer 1,2 ml dieser hohen Dichte Neuron Lösung weitere 30 ml komplettem Kulturmedium mit einer Konzentration von ~ 10.000 Neuronen / ml zu ergeben. Verwenden Sie diese Verdünnung die niedriger Dichte Deck Saatgut.
9. Auflage des Neurons und langfristige Co-Kultur
- Bringen Sie die beiden 24-Well-Platten mit geätzten Böden für hohe Dichte Neuronen in der Zellkultur Kapuze. Entfernen Sie die 300 & mgr; l Voraussetzung Medium durch Vakuum. Platte 0,6 ml hoher Dichte Zellsuspensionen bei 250.000 Neuronen / ml.
- Bringen Sie die beiden anderen 24-Well-Platten mit Deckgläsern in die Kulturhaube, und entfernen Sie die 300 ul Voraussetzung Medium durch Vakuum. Platte 0,6 ml niedriger Dichte Zellsuspensionen bei 10.000 Neuronen / ml auf die Deckgläser in den zwei 24-Well-Platten.
- Gibt alle vier 24-Well-Platten in den Inkubator. Lassen Sie für 2 Stunden sitzen.
- Drehen Sie die niedriger Dichte Deck mit Neuronen der hohen Dichte Kultur haften. Stellen Sie sicher , dass die Neuronen einander zugewandt sind (dh not durch das Deckglas getrennt). Dann kehren die beiden Platten mit Co-Kultur in den Inkubator.
10. Co-Kultur Sustaining
- Feed - Co-Kulturen durch Zugabe von 300 & mgr; l frisches Futter mittel (siehe Materialien) am Tag in vitro (DIV) 5. Es ist nicht notwendig 50% der ursprünglichen komplettem Kulturmedium zu entfernen, wie von vielen anderen Studien berichtet. Nährmediums enthält auch 15 uM Cytosinarabinosid (Ara-C, um eine Endkonzentration von 5 uM zu ergeben), um die Wahrscheinlichkeit von Kontamination Glia und Proliferation zu minimieren.
- Nach dieser ersten Fütterung, fügen Sie 300 ul frisches Futter Medium ohne Ara-C in die gut jede Woche. Sollte die Kultur für mehr als einen Monat gehalten werden, die Hälfte des Mediums mit frischem Feed-Medium ersetzen jede Woche über einen Monat hinaus Zeitpunkt (mit dem ersten Medium Halb Ersatz bei DIV33). Morphologisch, sowohl eine hohe Dichte und niedriger Dichte Neuronen gesund aussehen bis zu drei Monaten (die längste Zeit von der exper beobachtetimenters).
11. Abbildung eines experimentellen Manipulation niedriger Dichte Neuron Transfection
Hinweis: Bei der Transfektion in geringer Dichte Neuronen gewünscht ist, kann ein einfaches Calciumphosphat-Protokoll verabschiedet werden. Wir haben festgestellt, dass niedrige Dichte Kulturen bessere Transfektionseffizienz mit Calciumphosphat-Protokoll vor DIV12 haben, aber sie können bei DIV21 oder älter sind, prominente dendritischen Dornen sind während dieser Zeit mit viel geringerer Effizienz transfiziert werden. Die Durchführbarkeit der Transfektion der kultivierten niedriger Dichte Neuron durch Transfektion von Neuronen mit einem pEGFP-C3-Plasmid dargestellt ist (siehe unten).
- Bei DIV21 Entfernen 600 & mgr; l konditioniertes Medium aus jeder Vertiefung der Co-Kultur, und übertragen sie auf eine neue 24-Well-Platte. Dann fügen Sie 600 ul frisches Futter Medium auf die Co-Kultur, um es wieder auf das ursprüngliche Volumen.
- Übertragen Sie die Deckgläser in die neue 24-Well-Platte mit 600 & mgr; l konditioniertes Medium. Stellen Sie sicher, dass dieniedriger Dichte Neuronen nach oben zeigen. Legen Sie die hohe Dichte Platten und die neuen Platten mit Deck zurück in den Inkubator.
- Bereiten Sie zwei 1,5 ml sterilen Röhrchen. In einem Röhrchen, fügen Sie 600 ul 2X HEPES Salzlösung (HBS) Lösung gepuffert. Berechne das Volumen von 12 & mgr; g pEGFP-C3 DNA basierend auf Plasmid-Konzentration. In der anderen Röhre, fügen Sie 74 ul CaCl 2 (2 M Lager) und das Volumen des Wassers das Plasmid nach der Zugabe von 600 & mgr; l zu machen. Gut mischen durch Pipettieren und dann Plasmid-DNA hinzufügen. Langsam gut mischen. Lassen Sie beide Rohre für 5 min bei RT sitzen.
- Während des 2X HBS Rohr von Hand halten und mäßig die Lösung auf einem Mischer gerührt, fügen Sie alle der 600 & mgr; l der DNA-CaCl 2 -Lösung tropfen auf das Rohr 600 ul 2X HBS. Es ist entscheidend, dass der Niederschlag in Form von "feinen Sand" Granulat gebildet ist. zu stark und zu schnell mixen ist nicht wünschenswert, da es wahrscheinlicher, große 'Schnee flake' artige Niederschläge produzieren wird, which hat dramatisch geringere Effizienz der Transfektion auf der Grundlage unserer Beobachtungen.
- Lassen der Niederschlag weiter für 30 min im Dunkeln bei RT zu bilden.
- 100 l Niederschlag zu jeder Vertiefung, die durch Tropfen auf den Deckgläsern enthält, fallen und gleichmäßig niedriger Dichte Neuron. Bringen Sie die Platte am Inkubator, und Inkubation für 2 Stunden. Unter der Annahme , der größte Teil des CaCl 2 in freier Form, führt dies zu einer Konzentration von ~ 17,6 mM Ca 2+, die Neuronen nach längerer Inkubation toxisch sein können.
- Bereiten Sie eine 50 ml konischen Röhrchen mit ~ 50 ml Waschmedium, es warm bis 37 ° C.
- Am Ende von 2 h, bringen die niedriger Dichte Neurons mit DNA-Calciumphosphat-Präzipitate in die Haube. Pick-up jeden einzelnen Deckglas mit einem scharfen # 5 Pinzette, und tauchen sie dreimal in 50 ml Waschmedium zu waschen kurz. Dann kehren sie auf die hohe Dichte Neuronen in seiner ursprünglichen Co-Kulturplatten mit niedriger Dichte Neuronen nach unten.
- Weiter die Kultur bisDie geringe Dichte Kultur Neuronen auf Deckgläser werden für Studien geerntet.
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Representative Results
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht erfolgreiche ultra-niedriger Dichte, langfristige Kultur der reinen glutamatergen Neuronen, ohne die Notwendigkeit von Glia-Zellen als Feeder-Schicht dient. Das Protokoll ist in Abbildung 1 graphisch dargestellt, die die Herstellung von hoher Dichte beinhaltet (auf Poly-D-Lysin 24 Vertiefungen beschichtet) und niedriger Dichte Neuronen (auf Poly-D-Lysin beschichteten Glasplättchen) getrennt, und anschließender Co-Kultur , die kann gehalten bis zu drei Monaten werden.
2A und 2B sind Darstellungen der mit hoher Dichte und niedriger Dichte Neuronen an 5 Tage nach dem Ausplattieren. Geringer Dichte Kultur ist ungefähr 30-fach geringer Dichte. Beide Neuronen unterziehen typische Entwicklungsstadien wie Kaech und Banker (2006) beschrieben. Am Tag 14, die beide mit hoher Dichte und niedriger Dichte Neuronen zeigen aufwändige dendritischen Strukturen, wie DIC Bilder (2C ergab,D, beachten Sie beide Platten aus dem gleichen Bereich sind mit unterschiedlichen Fokusebenen, wie sie in der Lage von Etch gezeigt). Wenn diese Neuronen sind mit MAP2 - Antikörper gefärbt , um die Dendriten zu offenbaren, keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der Dendriten (t 13 = 1,27, p> 0,05, gemessen durch dendritische Spitze Nummer) und insgesamt dendritischen Länge (t 16 = 1,41, p> 0,05 ) pro Neuron zwischen der hohen Dichte und niedriger Dichte Neuronen (Abbildung 2E, F) gefunden.
Immunzytochemie Kennzeichnung wird verwendet, funktionelle glutamatergen Synapsen zu offenbaren. Wir verwenden Doppelfärbung der NMDA - Rezeptor - Untereinheit NR1 und die AMPA - Rezeptor - Untereinheit GluR1 (3A) und funktionelle Synapsen (co-lokalisierten puncta in gelb) zu etikettieren leicht identifiziert werden kann und quantifiziert ImageJ verwenden. Niedrige Dichte Neuronen werden auch mit einem Antikörper gegen dendritischen Protein-Marker MAP2 gekennzeichnet,in Kombination mit p-Tau axonalen Protein-Marker. Diese Doppel-Kennzeichnung ermöglicht eine klare Unterscheidung von Dendriten und Axone (3B). Geringer Dichte Kulturen können auch erfolgreich mit DNA - Plasmiden unter Verwendung von Calciumphosphat - Verfahren transfiziert werden, obwohl die Transfektionsrate bei späteren Stadien der Regel sehr gering ist (<0,2% Neuronen , wenn sie bei DIV21 transfiziert). 3C veranschaulicht , dass EGFP Transfektion neuronale Morphologie zeigen kann, und machen feinen dendritischen Dorn Strukturen sichtbar. Schließlich als Proof of Concept, ultra-niedriger Dichte Neuronen unter Bedingungen werden gezüchtet , das autapse Bildung (3D) zu fördern. Diese ultra-niedriger Dichte autaptic Neuronen gewachsen auf Poly-D-Lysin-beschichtete "Mikroinseln" können mit diesem Co-Kultur-Protokoll über 2 Monaten durch die hohe Dichte Feeder-Neuron aufrechterhalten werden.
<strong> Abbildung 1. Schematische Darstellung der mit hoher Dichte und niedriger Dichte Co-Kultur - Protokoll. (A) E16.5-E17.5 embryonalen Maus - Gehirne werden gesammelt, Hippocampus seziert und mit Trypsin verdaut. (B) , verdaut Hippocampi werden gewaschen, in einzelne Neuronen getrennt und auf 24 - Well - Platten mit hoher Dichte (250.000 Zellen / ml) plattiert; in der Zwischenzeit mit niedriger Dichte (10.000 Zellen / ml) Neuronen werden auf Deckgläsern ausplattiert. Die Vertiefungen für hochdichte Kultur werden mit einer 18 G Injektionsnadel geätzt für die Deckgläser eine erhöhte Unterstützung. (C) Darstellung der Co-Kultur. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Sowohl mit hoher Dichte und niedriger Dichte Neuronen comparable morphologische Entwicklung in Kokultur. (A, B) Mikroskopische Aufnahmen zeigen Plattierungsdichte sowohl hoher Dichte und niedriger Dichte Schicht. (C, D) DIC Bilder zeigen umfangreiche Neuritenwachstum in beide hoch (C) und niedriger Dichte (D) Neuronen. Die geringe Dichte Neuronen auf Deck ruhen direkt über den hohen Dichte Neuronen. Beachten Sie die Position des erhabenen Kunststoffträger. (E) Immunocytochemistry Kennzeichnung von dendritischen Protein MAP2. (F) Quantifizierung (Mittelwert ± SEM) der gesamten dendritischen Länge und dendritischen Spitze Anzahl pro Neuron. Kein signifikanter Unterschied (ns) zwischen hoher und niedriger Dichte gezüchtet Neuronen in Co-Kultur. Maßstabsbalken in (B, D), 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Figure 3. Experimentelle Manipulationen von geringer Dichte Neuronen gewachsen in Co-Kultur. (A) Immunzytochemie Kennzeichnung in geringer Dichte Kultur ermöglicht die Identifizierung von funktionellen Synapsen , die durch Co-Kennzeichnung von GluR1 (grün) und NR1 (rot). (B) Co-Kennzeichnung von neuronalen dendritischen Protein MAP2 (magenta) und axonalen Protein p-Tau (grün). (C) Ein niedriger Dichte Hippocampus transfiziert mit pEGFP-C3 - Plasmid, zeigt reichlich dendritischen Dornen. (D) Eine geringe Dichte Neuron vorbereitet auf Poly-D-Lysin "Mikro-Insel", und auf der Oberseite der hohen Dichte Neuronen gewachsen. Ein Aufzeichnungspatchelektrode füllt das Neuron mit Alexa-555 hydrazid die Morphologie des Neurons zu offenbaren. Maßstabsbalken in AD, 20 & mgr; m.7fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die Langzeitkultur von ultra-niedriger Dichte des Hippocampus glutamatergen Neuronen unter serumfreien Bedingungen. Bei ~ 2000 Neuronen / cm 2 ist die Dichte mindestens zweifach niedriger ist als die meisten "niedriger Dichte" Kultur Zubereitungen mit oder ohne 2,3,11,13,14 durch die bestehende Literatur berichtet Glia - Unterstützung. Zusätzlich zu ultra-niedriger Dichte ist, ist dieses Protokoll neu und signifikant in zwei weitere Möglichkeiten. Zuerst wird keine Glia-Feeder-Schicht erforderlich, da die geringe Dichte Neuronen trophischen Faktor Unterstützung durch die hohe Dichte Neuronen erhalten, die in räumlicher Nähe sind, auch wenn es keine synaptischen Verbindungen oder den direkten Kontakt zwischen den Neuronen in verschiedenen Dichten kultiviert. Dieses Protokoll eliminiert die Notwendigkeit zur Herstellung von Glia einschichtigen vor den Kulturexperimenten geplant und ermöglicht sowohl eine hohe Dichte und geringe Dichte Kulturen gleichzeitig wachsen. Herstellung der Glia einschichtigen kann zeitraubend und l seinaborious und die meisten Literatur verwendet neugeborenen Ratten pup cortices 2. Daher ist für Labors, die nur mit Mäusen arbeiten, erfordert dies erhebliche zusätzliche Anstrengungen. Weitere Experimente in wichtiger ist , in denen neuronale spezifische Mechanismen untersucht werden, kann das Vorhandensein von Glia in der Co-Kultur , unerwünscht sein, weil es zuschreibt beobachteten Wirkungen speziell auf Neuronen, Gliazellen oder die Wechselwirkung zwischen den beiden Zelltypen 10 verhindert. Darüber hinaus ist für Gliazellen Kultur, Serum - Ergänzung ist obligatorisch 2,15, und dies kann die Glia-Neuron - Co-Kultur und die Einführung zusätzlicher Störfaktoren verunreinigen. Ein wichtiges Merkmal unserer Protokoll ist, dass die Co-Kultur unter definierten Medienbedingungen ist. Wir verwenden ausschließlich das komplette Kulturmedium ohne Serum zu ergänzen, und feststellen, dass, wenn das Kulturmedium Austauschplan strikt eingehalten wird, kann die Co-Kultur über drei Monate hinaus aufrechterhalten werden, was die Mehrheit der Experimente erfüllen sollte. Da es praktisch keinenGlia Präsenz, ist eine Beschränkung dieses Verfahrens, daß Vorsicht geboten, wenn sie mit den Ergebnissen der Literatur zu vergleichen, die Glia-Neuron-Kokulturen verwenden.
Ein weiterer neuer Aspekt dieses Protokolls besteht darin, dass wir ein einfaches Verfahren verwenden eine effektive Mikroraum zwischen den mit hoher Dichte Neuronen auf dem Boden der 24-Well-Platte, und die niedrige Dichte Neuron zu den Glasdeckgläser rechts oben eingehalten gewachsen zu schaffen sitzen. Frühere Studien verwendet Punkte Paraffin auf die beschichteten Deckgläser aufgebracht , um die Deck bei ~ 500 & mgr; m über der Schicht Glia Feeder erhöhen 2,8,9. Herstellung von Paraffin Punkte erfordert die richtige Größe und richtige Temperatur, die eine angemessene Menge an Anstrengungen und Praxis verlangt. Im Vergleich dazu liefert ein einfaches Ätzen auf den Vertiefungsboden Kunststoff mit einer 18 G Nadel unterstützt die Deckgläser sowie eine gute Trennung zwischen den beiden Schichten von Neuronen. Wir haben eine Patch-Clamp-Aufzeichnung Anlage mit digitalen Z-Meter verwendet, um die lin, um zu bestimmenOhrraum zwischen den beiden Schicht aus Neuronen, die durch auf der hohen Dichte konzentriert und dann auf die Schichten geringer Dichte unter Verwendung eines 60X Wasserimmersionsobjektiv, gefunden, und dass der Raum ist typischerweise 150-200 um (179,4 +/- 25,3 & mgr; m, n = 5 ). Dieser engeren Raum (im Vergleich mit der von Wachs dots erzeugt) wahrscheinlich zu einem schnelleren Anstieg und eine höhere Konzentration von neurotrophen Faktoren zu übersetzen, damit eine ausreichende Unterstützung für die geringe Dichte neuron Bereitstellung wachsen. Obwohl dieser engeren Raum Fragen über die Geschwindigkeit des Kulturmediums Austausch erhöhen kann und ob der kleinere Raum behindert Neuronen aus Sauerstoff und Ernährungsunterstützung zu erhalten, zeigen unsere Ergebnisse, dass dies wahrscheinlich nicht ein Anliegen ist. Im Gegenteil, fanden wir, dass die hohe Dichte Neuronen unter den Deckgläsern auch besser (höhere Überlebensrate, aufwendigere Dendritenbaum und synaptic puncta durch NR1 Färbung, Daten nicht gezeigt) im Vergleich zu der hohen Dichte Neuronen aus dem gleichen Herstellungs wachsen, aber ohne die Überlagerung coverslips. Daher ist dieses einfache Protokoll nicht nur eine schnelle, einfache, aber auch sehr wirksam bei sowohl hoher Dichte und niedriger Dichte Neuronen aufrecht zu erhalten.
Hippokampus - Neuronen in vitro Kultivierung erfordert Beschichtung von wachstumsfördernden Substrate, wie Poly-D-Lysin und / oder Laminin / Collagen 5,16. Obwohl sorgfältige Auswahl und Vorbereitung der Deckgläser für eine effektive neuronale Überleben kritisch sind, haben wir gefunden , dass wir mit dem Deckglas eine gründliche Reinigung mit 70% Ethanol ausgewählt ist , ausreichend ist, wodurch die Notwendigkeit von härteren Behandlung Negieren (zB in Säuren Sieden) der Deck. Nachdem die Deckgläser in Ethanol und trocknet im Vakuum gereinigt werden, scheint das Glas aufgrund der ursprünglichen Beschichtung hydrophob ist. Jedoch erfolgreiche Beschichtung von 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin in Boratpuffer sollten die Glasoberfläche hydrophil zu machen, so dass, wenn die Deckgläser aus dem Waschwasser, eine gleichförmige Schicht aus Wasser aufgenommen, die gleichmäßig istüber die gesamte Glasoberfläche ausbreitet beobachtet werden. Wir fanden, dass dies von entscheidender Bedeutung ist. Andernfalls werden die Neuronen sterben am ehesten nach einer unzureichenden Beschichtung durch Plattierung. Obwohl nur geringe Dichte Hippokampus - Neuronen in diesem Protokoll getestet werden, wird erwartet , dass andere neuronale Typen (zB kortikalen Neuronen, Kleinhirn - Körnerneuronen oder spezialisierte neuronale Populationen) können auch bei geringer Dichte in Gegenwart einer hohen Dichte neuron feeder aufrechterhalten werden Schicht. Schließlich, wenn dieses einfache Protokoll gefolgt ist, kann ein gesundes ultraniedriger Dichte Neuronen zu ernten erwarten. Broad - Anwendungen wie Immunzytochemie Kennzeichnung, die Live - Darstellung, morphologische Studien und Elektro Aufnahme können alle auf diesen Neuronen nach Standardverfahren 16,17 durchgeführt werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
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