Abstract
Dyrkning primære hippocampus neuroner in vitro letter mekanistisk forhør af mange aspekter af neuronal udvikling. Dissocierede embryoniske hippocampale neuroner kan ofte vokse med held på dækglas ved høj tæthed under serumfrie betingelser, men kulturer med lav densitet typisk kræve en levering af trofiske faktorer ved co-dyrkning af dem med en glia fødelag, fremstilling der kan være tidskrævende og arbejdskrævende. Desuden kan tilstedeværelsen af glia forvirre fortolkning af resultaterne og undgå undersøgelser af neuron-specifikke mekanismer. Her er en forenklet metode præsenteret for ultra-low density (~ 2.000 neuroner / cm2), langsigtet (> 3 måneder) primær hippocampus neuron kultur, der er under serumfri betingelser og uden glia celle støtte. neuroner lav densitet er dyrket på poly-D-lysin overtrukne dækglas, og vendt på høje neuroner massefylde dyrket i en plade med 24 brønde. Stedet for at bruge paraffin prikker til at skabe et rum between de to neuronale lag, kan eksperimentatorer simpelthen ætse plast bunden af brønden, hvor de høje neuroner densitet bor, for at skabe en microspace befordrende for lav densitet neuron vækst. Co-kultur kan let opretholdes i> 3 måneder uden signifikant tab af neuroner lav densitet, hvilket vil lette den morfologiske og fysiologiske studier af disse neuroner. For at illustrere dette vellykkede kultur tilstand, er data leveres for at vise kraftig synapse dannelse i celler med lav massefylde efter længere tids kultur. Denne co-kultur-system letter også overlevelsen af sparsomme individuelle neuroner dyrket i øer af poly-D-lysin substrater og dermed dannelsen af autaptic forbindelser.
Introduction
Voksende hippocampale neuroner under in vitro betingelser muliggør observation og eksperimentel manipulation af disse neuroner, som ellers ikke er muligt in vivo. Denne eksperimentelle fremgangsmåde er almindeligt anvendt til at afsløre neuronale mekanismer vækst, polaritet, neurit specifikation, menneskehandel og subcellulære lokalisering af proteiner, synapse dannelse og funktionelle modning 1. Disse in vitro dyrkede hippocampale neuroner, når de er høstet fra sent embryonale stadier, er relativt rent (> 90%) glutamaterge celler af pyramideformede morfologi 2. Fordi neuroner blev dyrket i en 2-D overflade under in vitro betingelser, denne metode giver let observation, såsom levende billeddannelse eller immuncytokemi (ICC) farvning gennem en enkelt brændplan 3; eller manipulationer, såsom narkotika behandling og transfektioner 3-6. Når der dyrkes ved høj tæthed, neuroner tendens til at have høje overlevelse på grund af højere concentrations af udskilt vækstfaktorer foruden ernæringsmæssig støtte fra vækstmedierne, og også på grund af neurit kontakt-afhængige mekanismer 7. Men lav densitet hippocampusneuroner er ønskelige for morfologiske studier, hvor en person neuron kan afbildes i sin helhed eller farvet for ICC analyse. Neuroner lav tæthed er svære at opretholde i kultur på grund af manglende parakrine støtte og derfor ofte kræver trofisk støtte fra en glial (typisk cortical astrocyt) fødelag, som skal fremstilles før neuron kultur 2. Når co-dyrket med en glial celle fødelag, er neuroner lav massefylde dyrket på dækglas, og derefter spejlvendt på toppen af glia lag, således at de lave neuroner massefylde og glia er rettet mod hinanden. En lille lukket rum mellem glia og neuroner er skabt ved at placere paraffin voks prikker på hjørnerne af dækglas, derfor skabe en »sandwich« layout 2,8,9. Neuronerne lav densitet vil vokse wnden for begrænset plads mellem glia og dækglasset, hvilket skaber en permissiv mikromiljø med koncentrerede faktorer der udskilles af neuroner og glia. Denne tilgang giver lav densitet, fuldt udviklede neuroner, der er fordelt rimeligt fra hinanden, derfor lette ICC mærkning eller levende billeddiagnostiske undersøgelser.
En tilsyneladende ulempe ved neuron-glia co-kultur, bortset fra at være tidskrævende og arbejdskrævende, er, at den forhindrer undersøgelse af neuron-specifik eller celle-autonom, mekanismer. Selv om dette system er langt mindre kompleks end in vivo neuralt væv, glia indvirkning på neuron udvikling gennem secernerede, endnu-ikke-fuldt definerede faktorer kan forvirre eksperimenterne 10. Derfor, i eksperimenter, der kræver undersøgelse af neuron specifikke mekanismer, definerede dyrkningsbetingelser der fjerner serum og glial støttelag er nødvendige. En tidligere undersøgelse er lykkedes dyrkning lave koncentrationer af neuroner (~ 9.000 celler / cm2) ved anvendelse af en three dimensionelle hydrogel matrix 11. Da en relativt ren neuronal population kan dyrkes ved høj densitet under serumfri betingelser uden glial støtte, vi hypotesen, at ultralav densitet af hippocampale neuroner kan dyrkes i serumfrit defineret dyrkningsmedium ved co-dyrkning deraf med højt neuroner densitet, i en måde, der er analog med konventionelt vedtaget neuron-glia co-kultur. Faktisk høj densitet hippocampale neuron kulturer i en "sandwich" konfiguration er blevet for nylig anvendt til at støtte et lille antal specialiserede magnocellulære endokrine neuroner 12.
Derfor kan co-kultur med høje neuroner densitet tillader neuroner lav densitet til at modtage trofisk faktorer støtte, der er tilstrækkelig til, at langtidsoverlevelse. Denne protokol af dyrkning af ultra-low density neuroner blev således formuleret og valideret. Protokollen kan implementeres inden for et enkelt forsøg, ved at forberede høj densitet (~ 250.000 celler / ml) disknyttede hippocampale neuroner først, og derefter gør en fortynding til opnåelse af en tæthed ~ 10.000 neuroner / ml (~ 3.000 neuroner / dækglas, eller ~ 2.000 neuroner / cm2), som er meget lavere end de fleste rapporterede kulturer med lav massefylde 2,3,9 , 11,13. Denne kultur betingelse er løst benævnt "ultra-low density 'kultur og bruges med' low-density" inter-changeably. De høje neuroner densitet udplades på poly-D-lysin-coatede 24-brønds plader; mens neuronerne lav densitet podes på poly-D-lysin overtrukne 12-mm dækglas, der er placeret inden i en anden 24-brønds plade. Dækglassene med vedhængende neuroner lav massefylde er vendt på toppen af de høje neuroner densitet 2 timer senere efter neuronerne nedstammer og fastgjort til dækglassene. Desuden, i stedet for at bruge paraffin voks prikker til at løfte dækglassene over høj densitet neuron lag blev en 18 G kanyle bruges til at ætse bunden af pladerne med 24 brønde med to parallelle striber. Den resulterende DISPLAced, tilstødende plast giver en forhøjet støtte til dækglas. Dette rum er konsekvent måles ved 150-200 um, der tillader tilstrækkelig ilt og dyrkningsmedium udveksling samtidig sikre et mikromiljø med koncentrerede trofiske faktorer. Under denne betingelse, de lave neuroner densitet vokse ekstensivt, og kan overleve over tre måneder i kultur. Når disse neuroner transficeres med GFP plasmid efter tre uger i kultur, er dendritter rigt besat med dendritiske spidser. Som et bevis på princippet, er data præsenteret for at vise, at dette samarbejde kultur system understøtter kulturer ultra-lav densitet af hippocampus neuroner podet på poly-D-lysin 'mikro-øer ", hvor neuroner danner autaptic forbindelser, der kan lette undersøgelse af celle Den selvstændige, netværk-uafhængige mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer, der involverer mus blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Arizona, og var i overensstemmelse med NIH retningslinjer.
1. vævskilde for Hippocampal Neuron Kultur
- For at generere prænatal mus hvalpe til hippocampus neuron kultur, bruge tid-gravide mus (C57BL6 / J), der er opdrættet i hus 17. Dagen med vaginal prop detektion er udpeget som E0.5. Den planlagte høsttidspunkt for kultur er E16.5-E17.5.
Bemærk: Denne protokol beskriver kulturer af to plader med 24 brønde af to høj densitet neuroner samdyrkning med lav densitet neuroner (48 dækglas i alt). For flere plader, materialer og reagenser kan skaleres tilsvarende.
2. 24-brønds plader Forberedelse til High Density Neuron kulturer
Bemærk: Udfør følgende trin (2-3) dagen før den planlagte høst af embryoner.
- Bring to 24 brøndplader ind i cellekultur hætte, åbner den enkelte emballage.
- Tilslut en 18 G kanyle til en 1 ml plastik engangssprøjte.
- Hold sprøjten, og sigter kanylespidsen i ~ 1 mm til venstre for midten af bunden af brønden. Påfør moderat kraft (~ 250 g) at ætse bunden af brønden (~ 1 mm lang). En rille vil blive dannet, og plastmaterialer forskydes vil danne en forhøjet støtte over den flade bund brøndens overflade. Etch anden ~ 1 mm lange parallelle rille på ~ 1 mm til højre for midten af bunden på en lignende måde.
- Gentag dette trin for alle brøndene i de to plader med 24 brønde. De to plader med 24 brønde anvendes til høj tæthed kultur er nu klar til belægning med poly-D-lysin (se trin 3.8 nedenfor).
3. Dækglas Forberedelse til Low Density Neuron kulturer
- Brug 12-mm # 1 runde glas.
- Placer 50 dækglas i en diameter på 100 mm steril plastik petriskål, og nedsænkes dækglasi 20 ml 70% ethanol-opløsning. Placer denne petriskål på en roterende platform med moderat (70 rpm) rotationshastighed i en time. Fjern 70% ethanol og derefter erstatte med en frisk batch af 70% ethanol. Rotere og vask i en anden time.
- Kassér 70% ethanol rengøringsmiddel. Tilføj sterilt vand (filtreret gennem 0,2 um filterenhed). Skyl dækglassene strengt ved at dreje petriskål med hånden. Skyl tre gange, hver gang udskiftning med frisk sterilt vand.
- Anbring petriskålen med dækglas inde i en steril cellekultur hætte med laminar strømning. Aspirer skyllevandet gennem vakuum linje, og der tilsættes 10 ml filtreret sterilt vand til at fordybe dækglas. Dækglassene skal være sterile og overfladen skal være ren nok til poly-D-lysin belægning.
- Åbne to plader med 24 brønde fra deres individuelle emballage, og placere dem i hætten.
- Tænd vakuum linje i hætten. Tilslut en 200 pi pipettespids til vakuum linje, og bruge en LAFsor at skære spidsen for at skabe en større åbning.
- Brug en fin-tip # 5 pincet til at afhente dækglas fra petriskålen, en ad gangen, og bruge vakuum linje til helt tørre dækglasset. Derefter placere et dækglas til hver af brøndene i 24-brønds plade. De 50 rengjorte dækglas bør være nok til at fylde hver af brøndene i de to plader med 24 brønde.
- Fortynd poly-D-lysin-stamopløsning (1 mg / ml) i arbejdsposition opløsning (0,1 mg / ml) med boratpuffer (pH 8,5). For de fire 24-brønds plader (herunder to high density plader med ætset bund), forberede 30 ml total arbejdsopløsning.
- Tilsæt 300 pi 0,1 mg / ml poly-D-lysin arbejde opløsning til hver brønd med dækglas. Sørg for, at dækglas er helt nedsænket i opløsning. Hvis ikke, skal du bruge # 5 pincet tip til at presse ned dækglas mod bunden af brønden, og bruge spidsen til at guide poly-D-lysin løsning til at dække hele overfladen af dækglas. Efterse alle dækglas at gøre sure ingen luft var fanget mellem pladen og dækglas.
- Tilsæt 300 pi 0,1 mg / ml poly-D-lysin arbejde opløsning til hver brønd af høj densitet kultur plade med ætset bund. Rotere med hånden for at sprede opløsningen til at dække hele bunden af brønden.
- Returnere alle de fire plader med poly-D-lysin til kulturen inkubator, og inkuber O / N.
4. Vask og Pre-conditioning Plader til Kultur
Bemærk: Følgende trin (4-9) udføres på dagen for væv høst.
- Efter inkubation / coating af dækglas og 24-brønds plader O / N, bringe alle fire plader (to med donor dækglas, to acceptor-høj densitet plader med ætset plast bund) i kulturen hætte. Brug vakuumledningen at fjerne poly-D-lysin-opløsning.
- Umiddelbart efter fjernelse af poly-D-lysin-opløsning tilsættes ~ 1 ml sterilt vand til hver brønd med en plastik overførsel pipette. Når alle brønde er fyldtmed vand, lad stå i 10 min. Fjerne vand ved hjælp af vakuum, hvorefter der tilsættes 300 pi Wash mediet i hver brønd for at dække bunden af brønden (med eller uden dækglas). Lad ikke poly-D-lysin belægning tørre ud.
- Returnere alle fire plader til cellen inkubator. Pladerne er klar til brug, når de dispergerede hippocampale neuroner fremstilles.
5. Udarbejdelse af komplet Culture Medium, og trypsin løsning til enzymatisk fordøjelse
- Forbered 60 ml Complete dyrkningsmediet ved blanding af bestanddelene (se Materialer). Anvend en 50 ml sprøjte forbundet med en 0,2 um-porestørrelse sprøjtefilter, foretage Complete Culture medium i to 50 ml koniske rør. Hvert rør indeholder 30 ml Komplet dyrkningsmedium.
- I en separat 50 ml konisk rør, tilsættes ~ 30 ml vaskemedium (se Materialer) og varme det op til 37 ° C. Den bruges til at vaske vævet efter enzymatisk fordøjelse.
- Forbered enzymfordøjelse medium. I en 15 ml konisk rør, tilsæt 4,5 ml vaskemedium og 0,5 ml 2,5% trypsin-opløsning, og 50 pi 100X DNase I.
- Placer Complete Dyrkningsmedium, vaskemedium, og enzym fordøjelsen medium i et 37 ° C vandbad.
6. Fremstilling af kirurgiske redskaber
- Sterilisere alle de kirurgiske værktøjer i en sterilisering portion: to små saks, en pincet og to # 5 pincet.
7. Fjernelse af Brains fra E16.5-E17.5 Mouse embryoner og Dissektion af Hippocampi
- Forbered to 10-cm petriskåle fyldt med iskoldt, sterilt Hanks balancerede saltopløsning (HBSS).
- Aflive musen dæmning med en intraperitoneal injektion af natrium phenobarbital (100 mg / kg i et volumen på ~ 0,5 ml). Efter injektion, når dæmningen mister respons på tå knivspids, ofre med cervikal dislokation.
- Spray dæmningen abdomen område med 70% ethanol, og gøre en 2-cm langt indsnit langs midterlinjen af maven for at blotlæggelivmoderen.
- Fjern embryoner og placere individuelle dem i 10 cm i diameter petriskål med koldt dissekere HBSS buffer.
- Hold fosteret ved halsen ved hjælp af en pincet, og bruge en lille saks til at gøre den første cut højre i midterlinjen under lillehjernen niveau og § tværs af hjernevæv. Må ikke halshugge embryoet.
- Sæt højre spids af den lille saks fra caudale region, der er skåret åben, hele vejen igennem rostralt del af den embryoniske hjernen (ikke krydser midterlinjen), og lave et snit i venstre side på niveau med kraniet base.
- Sæt den venstre side saks tip igen for at lave et snit i højre side. Efterlad et smalt bånd af uskåret kraniet og hudvæv ved rostralt ende, således at hele hjernen kan vendes til side for nem ekstraktion.
- Brug spidsen af saks til at øse ud af embryonale hjernen i HBSS løsning. Undersøg hjernen under et dissektionsmikroskop. Hjernen bør være intakt uden brutto cut-off regioner.
- Gentag disse trin for at indsamle alle embryo hjerner.
- Saml alle de intakte hjerner i en ny petriskål indeholdende 20 ml kold HBSS buffer. Anbring petriskålen under et dissektionsmikroskop.
- Se hjernen fra ventrale side. Mens du holder hjernen med pincet ved caudale ende, indsætte en skarp # 5 pincet diagonalt for at lave et snit mellem den midterste rostralt punkt og caudale-temporale region. Gentag dette for den anden halvkugle. Efter skæring, separate to halvkugler med intakt hippocampus fra resten af hjernen stamceller væv.
- Gentag dette for hver af hjerner.
- Pool alle dissekerede halvkugler, og fjern meninges bruger to par # 5 pincet.
- Identificer udvikle hippocampus som en buet struktur, der er foldet ind i tindingelappen. Skifte mellem to par pincet til at adskille hippocampus fra tilstødende corticale væv. Indsamle og samle alle de hippocampi væv (se figur 1).
8. enzymatisk nedbrydning, separat i Single Neuroner
- Ved hjælp af en plastik overførsel pipette alle de dissekerede hippocampi i enzymatisk fordøjelse opløsning indeholdende 5 ml vaskemedium med 0,25% trypsin + 1X DNase I i en 15 ml konisk rør.
- Glasset anbringes inde i en vandbad og inkuberes ved 37 ° C i 25 minutter, med intermitterende blid inverterende af røret én gang i hver 5 min.
- Efter 25 min, forsigtigt fjerne enzymet løsning med en håndholdt plast pipette ved aspiration. Tilføj varm vask medium til 10 ml og forsigtigt vaske vævet ved langsomt at vende røret 5 gange. Fjern vaskemediet, og der tilsættes 10 ml vaskemedium igen i yderligere vask.
- Fjern vaskemediet, og der tilsættes 3 ml frisk varm vask medium igen. Ryst røret med hånden strengt for 15 gange for at fjerne de spaltede neuroner fra vævet. Mediet bør blive uklar, når celler enre adskilt fra vævet i vaskemediet. Opsaml cellesuspensionen i en ny 15 ml konisk rør mens det resterende væv i røret.
- Tilføje endnu 2 ml vaskemedium til vævet, og forsigtigt adskille resterende væv ved triturering gennem en plastik pipette til ~ 15 gange. Lad det sidde i 5 min. Pool cellesuspensionen i den nye 15 ml konisk rør, der indeholder indsamlet "ryste-off 'celler.
- Tæl tætheden af neuroner med et hæmocytometer. Typisk kan der opnås 3.000-5.000 celler pr mikroliter afhængigt af antallet af embryoner dissekeret. Et gennemsnitligt antal på 2,5 x 10 7 neuroner skønnes hvis antage seks embryoer dissekeres.
- Beregn rumfanget nødvendig af denne cellesuspension, hvilket gav en tæthed på 250.000 neuroner / ml efter tilsætning til 30 ml Komplet dyrkningsmedium. Tilføje denne mængde til et af de to koniske rør indeholdende 30 ml komplet Dyrkningsmedium til opnåelse af høj densitet neuron plating medium. <li> Overfør 1,2 ml af denne høje massefylde neuron løsning på en anden 30 ml Complete Culture medium til opnåelse af en koncentration på ~ 10.000 neuroner / ml. Brug denne fortynding til frø dækglassene low-density.
9. Plating af neuroner og Long Term Co-kultur
- Bringe de to 24-brønds plader med ætsede bunde til høje massefylde neuroner i cellekultur hætte. Fjern 300 pi forudsætning medium ved vakuum. Plate 0,6 ml høj tæthed cellesuspensioner på 250.000 neuroner / ml.
- Bringe de andre to 24-brønds plader med dækglas i kulturmediet hætte, og fjern 300 pi forudsætning medium ved vakuum. Plade 0,6 ml med lav massefylde cellesuspensioner ved 10.000 neuroner / ml på dækglassene inde i to 24-brønds plader.
- Returnere alle fire plader med 24 brønde til inkubatoren. Lad det sidde i 2 timer.
- Flip dækglas med lav densitet med vedhængende neuroner til høj densitet kultur. Sørg for, at neuronerne vender mod hinanden (dvs. not adskilt af dækglas). Derefter returnere de to plader med co-kultur til inkubatoren.
10. Co-kultur Opretholdelse
- Feed co-kulturer ved tilsætning 300 pi frisk Feed medium (se Materialer) på dag in vitro (DIV) 5. Det er ikke nødvendigt at fjerne 50% af det oprindelige Komplet Dyrkningsmedium, som rapporteret af mange andre undersøgelser. Den fodring medium indeholder også 15 pM cytosinarabinosid (Ara-C, hvilket gav en slutkoncentration på 5 uM) for at minimere risikoen for glia kontaminering og proliferation.
- Efter denne indledende fodring, tilsættes 300 pi frisk Feed medium uden Ara-C til brønden hver uge. Bør kulturen opbevares i mere end en måned, erstatte halvdelen af mediet med frisk Feed medium hver uge ud over et måneders punkt (med det første medium halve udskiftning med DIV33). Morfologisk, både høj tæthed og neuroner lav massefylde ser sund op til tre måneder (den længste tid observeret af experimenters).
11. Illustration af en eksperimentel Manipulation-lav Density Neuron transfektion
Bemærk: Når der ønskes transfektion i neuroner lav massefylde, kan en simpel calciumphosphat protokol vedtages. Vi har fundet, at kulturer med lav densitet har bedre transfektionseffektivitet med calciumphosphat protokol, inden DIV12, men de kan transficeres med meget lavere effektivitet ved DIV21 eller ældre, i hvilket tidsrum dendritiske spidser er fremtrædende. Gennemførligheden af transfektion af den dyrkede lav densitet neuron illustreres ved transfektion neuroner med en pEGFP-C3-plasmidet (se nedenfor).
- Ved DIV21, fjerne 600 pi konditioneret medium fra hver brønd i co-kultur, og overføre det til en ny 24-brønds plade. Derefter tilsættes 600 pi frisk Feed medium til co-kultur til at bringe det tilbage til den oprindelige volumen.
- Overfør dækglassene i den nye plade med 24 brønde med 600 pi konditioneret medium. Sørg for, atneuroner lav densitet vender opad. Placer høje plader densitet og de nye plader med dækglas tilbage i inkubatoren.
- Forbered to 1,5 ml sterile rør. I det ene rør, tilsæt 600 ul 2X HEPES pufret saltopløsning (HBS) opløsning. Beregn rumfanget af 12 ug pEGFP-C3 DNA baseret på plasmid koncentration. I det andet rør, tilsættes 74 pi CaCI2 (2 M stamopløsning) og mængden af vand, der efter tilsætning plasmid vil gøre 600 pi. Bland godt ved pipettering og derefter tilføje plasmid-DNA. bland langsomt godt. Lad begge rør sidde i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Mens hånd-holder 2X HBS rør og moderat omrøring løsningen på en mixer, tilsæt alle de 600 pi DNA-CaCl2-opløsning dråbevis til 600 pi 2X HBS rør. Det er afgørende, at det dannede bundfald er i form af 'fine sand' granuler. Blanding for stærk og for hurtigt er ikke ønskeligt, da det vil mere sandsynligt producere store 'snow flake'-lignende bundfald, which har dramatisk lavere transfektionseffektivitet baseret på vores observationer.
- Lad bundfaldet fortsat dannes i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Tilsæt 100 pi bundfald til hver brønd, der indeholder lav massefylde neuron på dækglas, dråbe for dråbe og jævnt. Returnere pladen til inkubatoren og inkuberes i 2 timer. Antages det meste af CaCl2 er i fri form, resulterer dette i en koncentration på ~ 17,6 mM Ca2 +, som kan være toksisk for neuroner efter langvarig inkubation.
- Forbered en 50 ml konisk rør med ~ 50 ml Wash medium, varme det op til 37 ° C.
- Ved udgangen af 2 timer, bringe den lave massefylde neuron med DNA-calciumphosphatudfældninger ind i hætten. Pick up hver enkelt dækglas med en skarp # 5 pincet, og dyp det tre gange i 50 ml Wash medium til at vaske det kort. Så returnere det til de høje neuroner tæthed i dens oprindelige co-kultur plader, med neuroner lav massefylde vender nedad.
- Fortsæt kulturen indtilde low density kultur neuroner på dækglas høstes til undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet her muliggør vellykket ultralav densitet, langtidsdyrkning af rene glutamaterge neuroner uden behov for gliaceller, der tjener som et fødelag. Protokollen er et diagram i figur 1, som involverer fremstilling af høj densitet (på poly-D-lysin overtrukne 24 brønde) og low-density neuroner (på poly-D-lysin-overtrukne dækglas) separat, og efterfølgende co-kultur, der kan opretholdes op til tre måneder.
Figur 2A og 2B er illustrationer af høj densitet og lav densitet neuroner på 5 dage efter udpladning. Low density kultur er ca. 30 gange mindre i densitet. Begge neuroner gennemgår typiske udviklingsstadier som skitseret af KAECH og Banker (2006). På dag 14, både høj densitet og neuroner lav densitet viser kunstfærdige dendritiske strukturer, som afsløret ved DIC-billeder (figur 2C,D, bemærk begge paneler er fra samme mark med forskellige fokale planer, som vist ved placeringen af etch). Når disse neuroner er plettet med MAP2 antistof at afsløre dendritter, ingen signifikante forskelle i antallet af dendritter (t 13 = 1,27, p> 0,05; målt ved dendritiske spids nummer) og total dendritiske længde (t 16 = 1,41, p> 0,05 ) pr neuron mellem den høje densitet og neuroner lav massefylde findes (figur 2E, F).
Immuncytokemi mærkning bruges til at afsløre funktionelle glutamaterge synapser. Vi bruger dobbelt farvning at mærke NMDA-receptoren underenheden NR1 og AMPA-receptoren underenheden GluR1 (figur 3A), og funktionelle synapser (co-lokaliserede puncta i gult) kan let identificeres og kvantificeres ved hjælp ImageJ. Low Density neuroner er også mærket med antistof mod dendritiske protein markør MAP2,i kombination med axonal protein markør p-Tau. Denne dobbelte-mærkning giver klar sondring af dendritter og axoner (figur 3B). Kulturer med lav densitet kan også udmærket transficeret med DNA-plasmider under anvendelse calciumphosphatmetoder, selvom transfektion sats er typisk meget lav på senere stadier (<0,2% neuroner når transficeret ved DIV21). Figur 3C illustrerer, at EGFP transfektion kan afsløre neuronal morfologi, og gengive fine dendritiske rygsøjlen strukturer synlige. Endelig, som det proof of concept, neuroner ultra-lav densitet kan dyrkes under betingelser, som fremmer autapse dannelse (figur 3D). Disse ultra-low density autaptic neuroner dyrket på poly-D-lysin coatede 'mikro-øer "kan opretholdes ved høj tæthed feeder neuron til over 2 måneder med denne co-kultur-protokol.
<strong> Figur 1. Skematisk illustration af den høje densitet og lav protokol densitet co-kultur. (A) E16.5-E17.5 mus embryonale hjerner opsamles, hippocampus dissekeres ud og fordøjet med trypsin. (B) skåret hippocampus vasket, adskilt i enkelte neuroner, og udpladet ved høj densitet (250.000 celler / ml) på plader med 24 brønde; i mellemtiden er lav densitet (10.000 celler / ml) neuroner udpladet på dækglas. Brøndene for høj densitet kultur ætses med en 18 G kanyle at tilvejebringe en forhøjet støtte til dækglassene. (C) Illustration af co-kultur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Både høj densitet og neuroner lav densitet har comparable morfologiske udvikling ved sam-dyrkning. (A, B) Mikrofotografier viser udpladningsdensitet af både høj densitet og lav lag densitet. (C, D) DIC billeder, der viser omfattende neurit vækst i både høj (C) og lav massefylde (d) neuroner. De neuroner lav densitet på dækglas hviler lige over de høje neuroner tæthed. Bemærk placeringen af det forelagte plastunderlag. (E) Immuncytokemi mærkning af dendritisk protein MAP2. (F) Kvantificering (gennemsnit ± SEM) af total dendritiske længde og dendritiske spids antal pr neuron. Ingen signifikant forskel (NS) blev set mellem høj densitet og neuroner lav massefylde dyrket i co-kultur. Scale bar i (B, D), 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
FO: keep-together.within-side = "1"> 
Figur 3. Eksperimentelle manipulationer af lav neuroner densitet dyrket i co-kultur. (A) Immuncytokemi mærkning i lav densitet kultur identifikation af funktionelle synapse defineret ved co-mærkning af GluR1 (grøn) og NR1 (rød). (B) Co-mærkning af neuronal dendritiske protein MAP2 (magenta) og axonal protein p-Tau (grøn). (C) En lav-densitet hippocampale neuron transficeret med pEGFP-C3-plasmid, der viser kraftig dendritiske spidser. (D) En lav neuron tæthed udarbejdet på poly-D-lysin "mikro-ø", og dyrkes på toppen af de høje neuroner tæthed. En optagelse patch-elektrode fylder neuron med Alexa-555 hydrazid at afsløre morfologi neuron. Scale bar i AD, 20 pm.7fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer en detaljeret protokol for langsigtet kultur af ultra-low density hippocampus glutamaterge neuroner under serumfri betingelser. På ~ 2000 neuroner / cm2, tætheden er mindst to gange lavere end de fleste "lav tæthed 'kultur præparater med eller uden glia støtte rapporteret af den eksisterende litteratur 2,3,11,13,14. Ud over at være ultra-lav densitet, denne protokol er hidtil ukendt og vigtig i yderligere to måder. Først er ingen glia fødelag nødvendig som de lave neuroner densitet opnå trofisk faktor støtte fra den store tæthed neuroner, der er i umiddelbar fysisk nærhed, selv om der ikke er nogen synaptiske forbindelser eller direkte kontakt mellem neuronerne dyrket ved forskellige tætheder. Denne protokol eliminerer behovet for fremstilling af glia monolag før de planlagte dyrkningseksperimenter, og tillader både høj densitet og kulturer med lav densitet til at vokse på samme tid. Forberedelse af glia monolag kan være tidskrævende og laborious, og de fleste litteratur bruger neonatal rotte hvalp cortex 2. Derfor, for laboratorier, der arbejder med kun mus, dette kræver betydelige yderligere bestræbelser. Endnu vigtigere, i eksperimenter, hvor neuronale specifikke mekanismer der undersøges, kan tilstedeværelsen af glia i co-kultur være uønsket, fordi det forhindrer tilskrive observerede virkninger specifikt til neuroner, glia eller samspillet mellem de to celletyper 10. Hertil kommer, for glia kultur, serum supplement er obligatorisk 2,15, og dette kan forurene glia-neuron co-kultur og indføre yderligere forstyrrende faktorer. Et vigtigt træk ved vores protokol er, at co-kultur er under definerede medium betingelser. Vi anvender strengt Complete dyrkningsmedium uden serum supplement, og opdage, at hvis dyrkningsmediet udveksling tidsplan strengt følges, kan co-kultur kan opretholdes over tre måneder, som burde tilfredsstille de fleste eksperimenter. Fordi der er næsten ingenglia tilstedeværelse, en begrænsning af denne teknik er, at forsigtighed bør udvises, når man sammenligner med resultaterne af litteratur, der bruger glia-neuron co-kulturer.
Et andet nyt aspekt ved denne protokol er, at vi bruger en enkel metode til at skabe en effektiv mikro-rum mellem de høje neuroner massefylde dyrket på bunden af 24-brønds plade, og den lave neuron densitet klæbet til dækglas sidder ret ovenfor. Tidligere undersøgelser anvender paraffin prikker påført den overtrukne dækglas at hæve dækglassene ved ~ 500 um over glia fødelag 2,8,9. Udarbejdelse af paraffin prikker kræver den rigtige størrelse og rigtige temperatur, som kræver en rimelig mængde indsats og praksis. Til sammenligning en simpel ætsning på brøndbunden plast med en 18 G nål understøtter dækglassene samt god adskillelse mellem de to lag af neuroner. Vi har anvendt en patch clamp optagelse rig med digital Z meter for at bestemme linøre rum mellem to lag af neuroner ved at fokusere på den høje densitet og derefter på de lave lag densitet ved anvendelse af en 60X nedsænkning i vand objektiv, og fandt, at rummet er typisk 150-200 um (179,4 +/- 25,3 um, n = 5 ). Dette smallere plads (sammenlignet med genereret af voks prikker) sandsynligvis til at oversætte til en hurtigere stigning, og højere koncentration af neurotrofiske faktorer, derfor giver tilstrækkelig støtte for den lave massefylde neuron til at vokse. Selvom dette snævrere plads kan rejse spørgsmål om hastigheden af dyrkningsmediet udveksling og hvorvidt den mindre plads vanskeliggør neuroner fra at få ilt og ernæringsmæssig støtte, vores resultater viser, at dette ikke er sandsynligt en bekymring. Tværtimod konstaterede vi, at høj tæthed neuroner under dækglassene også vokse bedre (højere overlevelsesrate, mere omfattende dendritiske træ og mere synaptisk puncta ved NR1-farvning, data ikke vist) i forhold til den store tæthed neuroner fra det samme præparat, men uden den overliggende coverslips. Derfor er denne enkle protokol er ikke kun hurtig, enkel, men også meget effektivt til at opretholde både høj densitet og neuroner med lav massefylde.
Dyrkning hippocampale neuroner in vitro kræver belægning af vækstfremmende substrater, såsom poly-D-lysin og / eller laminin / collagen 5,16. Selv omhyggelig udvælgelse og fremstilling af dækglas er kritiske for effektiv neuronal overlevelse, har vi fundet, at med dækglasset udvalgte vi, en grundig rensning med 70% ethanol er tilstrækkelig, hvilket ophæver behovet for hårdere behandling (fx kogning i syre) af dækglassene. Efter dækglassene rengøres i ethanol og tørret ved vakuum, glasset synes at være hydrofobt på grund af den oprindelige coating. Imidlertid vellykket belægning på 0,1 mg / ml poly-D-lysin i boratpuffer bør gøre glasoverfladen hydrofil, således at når dækglassene samles op fra vaskevandet, et ensartet lag af vand, der er jævntspreder sig ud over hele glasoverflade kan observeres. Vi fandt, at dette er kritisk vigtigt. Ellers vil neuronerne mest sandsynligt dø efter udpladning på grund af utilstrækkelig belægning. Selv om kun lav densitet hippocampus neuroner testes i denne protokol, forventes det, at andre neuronale typer (f.eks, kortikale neuroner, cerebellare granula neuroner, eller specialiserede neurale populationer) også kan opretholdes ved lav tæthed i tilstedeværelse af en høj tæthed neuron feeder lag. Endelig, når denne enkle protokol følges, kan man forvente at høste raske neuroner ultra-lav densitet. Brede applikationer såsom immunocytokemi mærkning, levende billedbehandling, morfologiske undersøgelser og elektrofysiologi optagelse kan alle udføres på disse neuroner efter standardprocedurer 16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. Cultureing Nerve Cells. , 2nd edition, 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
