Abstract
Het kweken van primaire hippocampus neuronen in vitro vergemakkelijkt mechanistische ondervraging van de vele aspecten van neuronale ontwikkeling. Gedissocieerde embryonale hippocampale neuronen groeien vaak succesvol op dekglaasjes met hoge dichtheid onder serumvrije omstandigheden, maar lage dichtheid kweken vereisen typisch een toevoer van trofische factoren door co-kweken ze met een glia voedsterlaag, bereiding kan tijdrovend zijn en moeizaam. Bovendien kan de aanwezigheid van glia interpretatie van de resultaten en te vermijden studies op neuron-specifieke mechanismen verwarren. Hier wordt een vereenvoudigde werkwijze voorgesteld voor ultralage dichtheid (~ 2000 neuronen / cm 2), lange termijn (> 3 maanden) primaire hippocampale neuron cultuur die onder serumvrije omstandigheden en zonder glia Celdrager. Lage dichtheid neuronen gekweekt op poly-D-lysine beklede dekglaasjes en knipte hoge dichtheid neuronen gekweekt in een 24-wells plaat. In plaats van paraffine punten om een ruimte te creëren between de twee neuronale lagen, kunnen de onderzoekers eenvoudig etsen plastic bodem van de put, waarop de hoge dichtheid neuronen bevinden, een microspace tot een lage dichtheid neuron groei. De co-kweek kan gemakkelijk worden gehandhaafd gedurende> 3 maanden zonder aanzienlijk verlies van lage dichtheid neuronen, waardoor de morfologische en fysiologische studie van deze neuronen vergemakkelijken. Om deze succesvolle cultuur aandoening te illustreren, worden de gegevens verstrekt aan overvloedig synapsvorming in lage dichtheid cellen na langdurige cultuur te laten zien. Deze co-cultuur systeem vergemakkelijkt ook het voortbestaan van schaarse individuele neuronen gekweekt in eilanden van poly-D-lysine substraten en dus de vorming van autaptic verbindingen.
Introduction
Groeiende hippocampale neuronen onder in vitro omstandigheden maakt waarneming en experimentele manipulatie van deze neuronen die in vivo anders mogelijk niet. Deze experimentele benadering wordt veel gebruikt om neuronale mechanismen van groei, polariteit, neuriet specificatie, handel en subcellulaire lokalisatie van eiwitten, synapsvorming en functionele rijping 1 onthullen. Deze in vitro gekweekte hippocampale neuronen, wanneer geoogst late embryonale fase, relatief zuiver (> 90%) glutamaterge cellen piramidale morfologie 2. Omdat neuronen in een 2-D oppervlak werden gekweekt onder in vitro omstandigheden, maakt deze werkwijze het observeren, zoals live imaging of immunocytochemie (ICC) kleuring via één brandvlak 3; of manipulaties, zoals de behandeling met geneesmiddelen en transfecties 3-6. Wanneer ze groeien bij hoge dichtheid, neuronen hebben de neiging om hoge tarieven van de overleving als gevolg van hogere co hebbenncentrations uitgescheiden groeifactoren naast voedings steun van de groeimedia, en vanwege neuriet contact-afhankelijke mechanismen 7. Echter, een lage dichtheid hippocampus neuronen zijn wenselijk voor morfologische studies, waarbij een individueel neuron in zijn geheel kan worden afgebeeld of gekleurd voor ICC-analyse. Lage dichtheid neuronen zijn moeilijk te handhaven in kweek door gebrek aan ondersteuning paracriene en dus vereisen vaak trofische ondersteuning van een gliale (typisch corticale astrocyten) voedsterlaag, die moet worden opgemaakt voor neuron cultuur 2. Als co-gekweekt met een gliale cel voedsterlaag worden lage dichtheid neuronen gekweekt op dekglaasjes en vervolgens omgedraaid bovenop de glia laag, zodat het lage dichtheid neuronen en glia tegenover elkaar. Een kleine afgesloten ruimte tussen glia en neuronen wordt gecreëerd door het plaatsen van paraffine stippen op de hoeken van de dekglaasjes derhalve tot een 'sandwich' layout 2,8,9. De lage dichtheid neuronen zal groeien wedurende de beperkte ruimte tussen glia en het dekglaasje, die een tolerante micro-omgeving met geconcentreerde factoren uitgescheiden door neuronen en glia creëert. Deze aanpak levert een lage dichtheid, volledig ontwikkeld neuronen die redelijk uit elkaar geplaatst zijn, dus het vergemakkelijken van etikettering ICC of live-imaging studies.
Een duidelijk nadeel van neuron-glia co-cultuur, afgezien van tijdrovend en moeizaam, is dat het voorkomt onderzoek neuron-specifieke of cel-autonome mechanismen. Hoewel dit systeem is veel minder complex dan in vivo zenuwweefsel, glia effect op neuron ontwikkeling door middel van uitgescheiden, nog-niet-helemaal-gedefinieerde factoren kunnen de experimenten 10 beschamen. Daarom is in experimenten die het onderzoek naar neuron specifieke mechanismen, gedefinieerd kweekomstandigheden die te verwijderen serum en gliacellen steunlaag nodig zijn nodig. Een eerdere studie heeft kunnen kweken lage concentraties van neuronen (~ 9000 cellen / cm2) met een eree dimensionale hydrogel matrix 11. Omdat een relatief zuivere neuronale populatie kan worden gekweekt met hoge dichtheid onder serumvrije omstandigheden zonder glial steun Onze hypothese is dat ultra-lage dichtheid van hippocampale neuronen in serumvrij gedefinieerd kweekmedium worden gekweekt door co-kweken ze met hoge dichtheid neuronen, in een manier die analoog is aan de conventioneel aangenomen neuron-glia co-cultuur. Inderdaad, hoge dichtheid hippocampale neuron culturen in een "sandwich" configuratie zijn onlangs gebruikt om een klein aantal gespecialiseerde endocriene magnocellulaire neuronen 12 ondersteunen.
Daarom kan co-kweek met hoge dichtheid neuronen mogelijk lage dichtheid neuronen trofische factoren ondersteuning die voldoende is om de overleving op lange termijn mogelijk ontvangen. Dit protocol van het kweken van ultra-lage dichtheid neuronen werd dus geformuleerd en gevalideerd. Het protocol kan worden uitgevoerd binnen een enkel experiment, door het bereiden van een hoge dichtheid (~ 250.000 cellen / ml) dispelde hippocampale neuronen, en dan het maken van een verdunning tot een dichtheid ~ 10.000 neuronen op / ml (~ 3000 neuronen / dekglaasje of ~ 2000 neuronen / cm 2), die veel lager dan de meeste gerapporteerde lage dichtheid cultures 2,3,9 , 11,13. Dit kweekomstandigheid is losjes aangeduid als "ultra-low density cultuur en worden met" lage dichtheid "onderling verwisselbaar. De hoge dichtheid neuronen uitgeplaat op poly-D-lysine beklede 24-putjesplaten; terwijl de lage dichtheid neuronen gezaaid op poly-D-lysine beklede 12-mm dekglaasjes die in een andere 24-wells plaat geplaatst. De dekglaasjes met hechtende lage dichtheid neuronen worden omgedraaid op de top van de hoge dichtheid neuronen 2 uur later nadat de neuronen zijn afgedaald en aan de dekglaasjes. Bovendien, in plaats van paraffinewas stippen op de dekglaasjes boven de hoge dichtheid laag neuron verhogen, werd een 18 G naald gebruikt om de bodem van de 24 well platen etsen met twee evenwijdige strepen. De resulterende DISPLAced, grenzend aan plastics zorgen voor een verhoogde steun voor de dekglaasjes. Deze ruimte wordt consequent gemeten bij 150-200 urn, die voldoende zuurstof en kweekmedium uitwisseling mogelijk maakt, terwijl een micro-omgeving met geconcentreerd trofische factoren. Onder deze voorwaarde, de lage dichtheid neuronen groeien op grote schaal, en kan overleven dan drie maanden in de cultuur. Wanneer deze neuronen worden getransfecteerd met GFP plasmide na drie weken in cultuur worden de dendrieten rijkelijk bezaaid met dendritische stekels. Als bewijs van principe worden gegevens die aantonen dat deze co-kweeksysteem ondersteunt ultralage dichtheid kweken van hippocampale neuronen gezaaid op poly-D-lysine micro-eilanden, waarbij neuronen vormen autaptic verbindingen die onderzoek cel kan vergemakkelijken -autonomous, netwerk-onafhankelijke mechanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures waarbij muizen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Arizona, en gelijkvormig aan NIH richtlijnen.
1. Tissue Bron voor de hippocampus Neuron Cultuur
- Prenatale muis pups voor hippocampus neuron cultuur te genereren, gebruiken time-zwangere muizen (C57Bl6 / J) die worden gefokt in huis 17. De dag met een vaginale plug detectie wordt aangewezen als E0.5. De geplande oogsttijd voor cultuur is E16.5-E17.5.
Opmerking: Dit protocol beschrijft kweken van twee 24-well platen van twee hoge dichtheid neuronen co-kweken met lage dichtheid neuronen (48 dekglaasjes totaal). Voor meer platen en reagentia kunnen dienovereenkomstig worden geschaald.
2. 24-well platen Voorbereiding voor High Density Neuron culturen
Opmerking: Voer de volgende stappen (2-3) de dag vóór de geplande oogst embryo.
- Breng twee 24 goedplaten in de celkweek kap, opent u de individuele verpakking.
- Sluit een 18 G naald in een 1 ml plastic voor eenmalig gebruik spuit.
- Houd de spuit en richt de naaldpunt ~ 1 mm links naar het midden van de bodem van de put. Toepassen matige kracht (~ 250 g) aan de bodem van de put (~ 1 mm) te etsen. Een groef wordt gevormd en de kunststoffen verplaatst zal een verhoogde ondersteuning boven de vlakke bodem goed oppervlak te vormen. Etch andere ~ 1 mm lange parallelle groef ~ 1 mm rechts van het midden van de bodem op een gelijkaardige manier.
- Herhaal deze stap voor alle putjes van de twee 24-well platen. De twee 24-well platen voor hoge kweekdichtheid zijn nu klaar voor bekleden met poly-D-lysine (zie stap 3.8 hieronder).
3. Coverslips Voorbereiding voor Low Density Neuron culturen
- Gebruik 12-mm diameter # 1 ronde glazen.
- Plaats 50 dekglaasjes in een diameter van 100 mm steriele plastic petrischaaltje, en dompel dekglaasjesin 20 ml 70% ethanol. Plaats deze petrischaal op een roterend platform met matige (70 rpm) rotatiesnelheid voor een uur. Verwijder 70% ethanol en vervolgens vervangen door een verse partij van 70% ethanol. Roteren en was nog een uur.
- Gooi 70% ethanol reinigingsmiddel. Voeg steriel water (gefilterd door 0,2 um filter eenheid). Spoel de dekglaasjes rigoureus door het draaien van de petrischaal met de hand. Spoel drie keer, telkens vervangen door vers steriel water.
- Plaats de petrischaal met dekglaasjes in een steriele celkweek kap met laminaire stroming. Zuig het spoelwater door het vacuüm lijn, en voeg 10 ml gefilterd steriel water om de dekglaasjes onder te dompelen. De dekglaasjes moet steriel zijn en het oppervlak moet voldoende schoon zijn voor poly-D-lysine coating.
- Open twee 24-wells platen uit hun individuele verpakking en plaats ze in de kap.
- Zet het vacuüm lijn in de kap. Sluit een 200 ul pipet tip om het vacuüm lijn, en gebruik maken van een GCBsor de punt snijden om een grotere opening te creëren.
- Gebruik een fine-tip # 5 pincet te halen dekglaasjes van de petrischaal, een voor een, en gebruik het vacuüm lijn naar de dekglaasje drogen. Plaats dan een dekglaasje in elk van de putjes van de 24-well plaat. Het 50 gereinigde dekglaasjes moet genoeg zijn om elk van de putjes van de twee 24-well platen vullen.
- Verdun het poly-D-lysine stockoplossing (1 mg / ml) in werkoplossing (0,1 mg / ml) met boraatbuffer (pH 8,5). Voor de vier 24-wells platen (waaronder twee high density platen met geëtst onder), bereid 30 ml totaal werkoplossing.
- Voeg 300 pi 0,1 mg / ml poly-D-lysine work oplossing in elk putje met dekglaasjes. Zorg ervoor dat de dekglaasjes worden volledig ondergedompeld in oplossing. Zo niet, gebruik dan de # 5 pincet tip naar beneden te drukken dekglaasjes tegen de bodem van de put, en gebruik de tip om poly-D-lysine oplossing voor al het oppervlak van de dekglaasjes te dekken te begeleiden. Visueel te inspecteren alle dekglaasjes om su te makenre geen lucht gevangen zat tussen de plaat en dekglaasjes.
- Voeg 300 pi 0,1 mg / ml poly-D-lysine work oplossing in elk putje van de hoge dichtheid kweekplaat met geëtste bodem. Hand gedraaid om de oplossing te verspreiden naar de gehele bodem van de put omvatten.
- Het geven van de vier platen met poly-D-lysine om de incubator en incubeer O / N.
4. Wassen en Pre-conditioning Platen voor Cultuur
Opmerking: De volgende stappen (4-9) worden uitgevoerd op de dag van de oogst weefsel uitgevoerd.
- Na incubatie / bekleding van dekglaasjes en 24-well platen O / N, brengen alle vier platen (twee dekglaasjes met donor, acceptor twee high density platen met geëtst kunststof bodem) in de cultuur kap. Gebruik het vacuüm lijn naar de poly-D-lysine oplossing te verwijderen.
- Onmiddellijk na het verwijderen van de poly-D-lysine oplossing, voeg ~ 1 ml steriel water aan elk putje met een plastic pipet overdracht. Nadat alle putjes gevuldmet water, laat staan voor 10 min. Water verwijderen door vacuüm, voeg 300 ul wasmedium in elk putje om de bodem van de put bedekken (met of zonder dekglaasjes). Laat niet de poly-D-lysine coating uitdrogen.
- Geeft alle vier platen om de celincubator. De platen zijn klaar voor gebruik zodra de verspreide hippocampus neuronen worden bereid.
5. Bereiding van compleet kweekmedium en trypsine oplossing voor enzymatische digestie
- Bereid 60 ml Compleet Cultuur medium door het mengen van de bestanddelen (zie Materials). Gebruik een 50 ml spuit verbonden met een 0,2 urn poriegrootte spuitfilter, filtreer de complete kweekmedium in twee 50 ml conische buizen. Elke buis bevat 30 ml compleet cultuurmedium.
- In een afzonderlijke 50 ml conische buis, voeg -30 ml wasmedium (zie Materialen) en verwarm tot 37 ° C. Deze wordt gebruikt om het weefsel te wassen na enzymatische digestie.
- Bereid de enzymdigestie medium. In een 15 ml conische buis, voeg 4,5 ml wasmedium en 0,5 ml 2,5% trypsine-oplossing en 50 gl 100X DNase I.
- Plaats de complete cultuur medium, Wash medium, en enzym spijsvertering medium in een 37 ° C waterbad.
6. Voorbereiding van de chirurgische instrumenten
- Steriliseren alle chirurgische instrumenten in een sterilisatie zakje: twee kleine schaar, een pincet en twee # 5 pincet.
7. Verwijdering van Brains uit E16.5-E17.5 muizenembryo's en Dissection van Hippocampi
- Bereid twee 10-cm petrischalen gevuld met ijskoude steriele Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS).
- Euthanaseren de muis dam met een intraperitoneale injectie van natrium fenobarbital (100 mg / kg in een volume van ~ 0,5 ml). Na injectie, zodra de dam reactie op teen knijpen verliest, offeren met cervicale dislocatie.
- Spray buik gebied van de dam met 70% ethanol, en een 2-cm lange incisie langs de middellijn van de buik bloot te leggende baarmoeder.
- Verwijder de embryo's en plaats individuele die in een 10-cm diameter petrischaal met koude ontleden HBSS buffer.
- Houd de embryo bij de nek met behulp van een tang, en gebruik een kleine schaar om de eerste snede goed te maken in de middellijn onder het cerebellum niveau en de sectie over het hersenweefsel. Mis het embryo niet onthoofden.
- Steek de rechterzijde topje van de kleine schaar uit caudale regio die open wordt gesneden, helemaal door de rostrale deel van de embryonale hersenen (niet cross middellijn), en maak een snee aan de linkerkant op het niveau van de schedelbasis.
- Steek de linkerkant schaar tip opnieuw om een snee aan de rechterkant te maken. Laat een smalle band van ongesneden schedel bot en huidweefsel aan de rostrale einde, zodat het hele brein opzij kan worden omgedraaid voor eenvoudige extractie.
- Gebruik de punt van de schaar om schep de embryonale hersenen in de HBSS oplossing. Inspecteer de hersenen onder een stereomicroscoop. De hersenen moet intact zonder bruto cut-o zijnff regio's.
- Herhaal deze stappen om alle embryo hersenen te verzamelen.
- Verzamel alle intact hersenen in een nieuwe petrischaaltje met 20 ml koud HBSS buffer. Plaats de petrischaal onder een dissectie microscoop.
- Bekijk de hersenen van buikzijde. Houd de hersenen met een tang aan het caudale einde, plaatst u een scherpe # 5 pincet schuin naar een snee tussen het midden rostrale punt en de staartvin-temporale regio. Herhaal dit voor het andere halfrond. Na het snijden afzonderlijke twee hemisferen met intacte hippocampus van de rest van de hersenstam weefsels.
- Herhaal deze procedure voor elk van de hersenen.
- Zwembad alle ontleed hemisferen, en verwijder de hersenvliezen met behulp van twee paren van # 5 pincet.
- Identificeer de ontwikkeling hippocampus als een gebogen structuur die is opgevouwen in de temporale kwab. Wissel de twee paren van pincet om de hippocampus te scheiden van aangrenzende corticale weefsels. Verzamelen en bundelen alle hippocampi weefsel (zie figuur 1).
8. enzymatische afbraak, scheiden in Single Neuronen
- Met een plastic overdracht pipet alle ontleed hippocampus in de enzymatische digestie oplossing die 5 ml wasmedium met 0,25% trypsine + 1X DNase I in een 15 ml conische buis.
- Plaats de buis in een waterbad en incubeer bij 37 ° C gedurende 25 min met tussenpozen voorzichtig omkeren van de buis eenmaal per 5 minuten.
- Na 25 min, verwijder voorzichtig het enzym oplossing met behulp van een hand gehouden plastic pipet door aspiratie. Voeg warm Wash medium tot 10 ml en voorzichtig het weefsel te wassen door langzaam het buisje 5 keer. Verwijder de Wash medium, en voeg 10 ml Wash medium opnieuw voor een extra wasbeurt.
- Verwijder de Wash medium, en voeg 3 ml vers warm Wash medium weer. Schud de buis met de hand rigoureus voor 15 keer aan de verteerde neuronen te verjagen uit het weefsel. Het medium moet troebel nadat de cellen een gewordenopnieuw gescheiden van het weefsel in het wasmedium. Verzamel de celsuspensie in een nieuwe 15 ml conische buis terwijl de resterende weefsel in de buis.
- Voeg nog eens 2 ml Wash medium aan het weefsel, en voorzichtig de resterende weefsel te scheiden door tritureren door een plastic pipet voor ~ 15 keer. Laat zitten voor 5 min. Verzamel de celsuspensie in de nieuwe 15 ml conische buis die bevat verzamelde 'shake-off' cellen.
- Tel de dichtheid van neuronen met een hemocytometer. Meestal kan 3000-5000 cellen per microliter worden verkregen afhankelijk van het aantal embryo's ontleed. Een gemiddeld aantal van 2,5 x 10 7 neuronen worden geschat als de veronderstelling zes embryo's worden ontleed.
- Bereken het benodigde volume van de celsuspensie tot een dichtheid van 250.000 neuronen / ml werd verkregen na toevoeging 30 ml compleet cultuurmedium. Voeg dit volume op een van de twee conische buizen met 30 ml compleet kweekmedium hoge dichtheid neuron plating medium verkregen. <li> Overdracht 1,2 ml van deze hoge dichtheid neuron oplossing nog 30 ml compleet kweekmedium tot een concentratie van ~ 10.000 neuronen / ml verkregen. Gebruik deze verdunning om de low-density dekglaasjes zaad.
9. Plating van neuronen en lange termijn Co-cultuur
- Breng de twee 24-well platen met geëtst bodems voor hoge dichtheid neuronen in de celkweek kap. Verwijder de 300 pi medium voorwaarde van vacuüm. Plate 0,6 ml high density celsuspensies op 250.000 neuronen / ml.
- Breng de andere twee 24-well platen met dekglaasjes in de cultuur kap en verwijder de voorwaarde 300 ul medium met vacuüm. Plaat 0,6 ml lage dichtheid celsuspensies bij 10.000 neuronen / ml op de dekglaasjes in de twee 24-well platen.
- Terug vier 24-well platen in de incubator. Laat zitten voor 2 uur.
- Flip de lage dichtheid dekglaasjes met het naleven neuronen aan de hoge cultuur dichtheid. Zorg ervoor dat de neuronen worden tegenover elkaar (dat wil zeggen, not gescheiden door de glazen dekglaasje). Plaats dan de twee platen met co-cultuur aan de incubator.
10. Co-cultuur Sustaining
- Feed co-kweken door toevoegen 300 ul vers voedingsmedium (zie Materialen) op dag in vitro (DIV) 5. Het is niet nodig om 50% van de oorspronkelijke complete kweekmedium te verwijderen, zoals door veel andere studies. Het voedingsmedium bevat ook 15 uM cytosine arabinoside (Ara-C, tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM opbrengst) om de kans op verontreiniging glia en proliferatie minimaliseren.
- Na deze eerste voeden, voeg 300 ul vers Feed medium zonder Ara-C naar de put elke week. Indien de kweek gedurende meer dan één maand worden bewaard, vervangen de helft van het medium met vers voedingsmedium wekelijks na één maand tijdspunt (het eerste medium halve vervanging op DIV33). Morfologisch, zowel hoge dichtheid en lage dichtheid neuronen zien er gezond uit tot drie maanden (de langste tijd waargenomen door de experimenters).
11. Illustratie van een experimentele manipulatie-Low Density Neuron Transfectie
Opmerking: Wanneer transfectie in lage dichtheid neuronen gewenst is, kan een eenvoudige calciumfosfaat protocol worden vastgesteld. We hebben gevonden dat lage dichtheid culturen betere transfectie-efficiëntie met calciumfosfaat protocol voor DIV12, maar kunnen worden getransfecteerd met veel lagere efficiëntie bij DIV21 of ouder, gedurende welke tijd dendritische prominent. De haalbaarheid van de transfectie van gekweekte neuron lage dichtheid illustreert neuronen transfecteren met een plasmide pEGFP-C3 (zie hieronder).
- Bij DIV21, verwijder 600 ul geconditioneerde medium van elk putje van de co-cultuur, en over te dragen aan een nieuwe 24-well plaat. Voeg vervolgens 600 ul vers voedingsmedium aan de co-kweek om het terug naar het oorspronkelijke volume te brengen.
- Breng de dekglaasjes in de nieuwe 24-well plaat met 600 pl geconditioneerd medium. Zorg ervoor dat delage dichtheid neuronen naar boven. Plaats de hoge dichtheid platen en de nieuwe platen met dekglaasjes opnieuw in de incubator.
- Bereid twee 1,5 ml steriele buizen. In één buis, voeg 600 ul 2X HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS). Bereken het volume van 12 ug pEGFP-C3 DNA basis van plasmideconcentratie. In de andere buis, voeg 74 ui CaCl2 (2 M voorraad) en de hoeveelheid water die na het toevoegen van 600 pi plasmide maakt. Meng goed door pipetteren en voeg dan plasmide-DNA. Langzaam meng goed. Laat beide buizen zitten 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Terwijl de hand houden van de 2X HBS buis en matig schudden van de oplossing op een mixer, voeg alle van de 600 pi van het DNA-CaCl2 oplossing druppel voor druppel op de 600 pi 2X HBS buis. Het is cruciaal dat het gevormde precipitaat in de vorm van korrels fijn zand. Mengen te sterk en te snel is niet wenselijk, omdat het meer waarschijnlijk zal produceren grote 'snow flake'-achtige neerslagen, which heeft drastisch lagere transfectie-efficiëntie op basis van onze waarnemingen.
- Laat het neerslag nog steeds gevormd worden in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Voeg 100 ul neerslag in elk putje dat een lage dichtheid neuron op de dekglaasjes bevat, druppelsgewijs en gelijkmatig. Zet de plaat incubator en incubeer gedurende 2 uur. Uitgaande meeste CaCl 2 in vrije vorm, resulteert dit in een concentratie van ~ 17,6 mM Ca2 +, die toxisch voor neuronen na langdurige incubatie kan zijn.
- Bereid een 50 ml conische buis met ~ 50 ml Wash medium, warm het op tot 37 ° C.
- Aan het eind van 2 uur, breng de lage dichtheid neuron met DNA-calciumfosfaat precipitaten in de kap. Pick-up elke individuele dekglaasje met een scherp # 5 pincet, en dompel het drie keer in de 50 ml Wash medium om het kort te wassen. Dan terug naar de hoge dichtheid neuronen in de oorspronkelijke co-kweekplaten met lage dichtheid neuronen naar beneden.
- Ga door met de cultuur totde lage dichtheid cultuur neuronen op dekglaasjes worden geoogst voor studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven protocol maakt succesvolle ultra-lage dichtheid, langetermijnkweek zuivere glutamaat neuronen zonder de noodzaak van glia cellen dienen als voedsterlaag. Het protocol is schematisch weergegeven in figuur 1, die de bereiding van hoge dichtheid (op poly-D-lysine-gecoate 24 wells) en lage dichtheid neuronen (op poly-D-lysine beklede dekglaasjes) omvat afzonderlijk, en vervolgens co-cultuur kan worden maximaal drie maanden aangehouden.
Figuren 2A en 2B zijn illustraties van de hoge dichtheid en lage dichtheid neuronen bij 5 dagen na uitplaten. Lage kweekdichtheid ongeveer 30 maal minder dichtheid. Beide neuronen ondergaan typische ontwikkelingsstadia zoals geschetst door Kaech en Banker (2006). Op dag 14 zowel hoge dichtheid en lage dichtheid neuronen vertonen uitgebreide dendritische structuren, zoals blijkt uit DIC beelden (figuren 2C,D, nota beide panelen zijn uit hetzelfde gebied met verschillende beeldvlakken, zoals blijkt uit de locatie van etsen). Wanneer deze neuronen worden gekleurd met MAP2 antilichaam tegen de dendrieten, geen significante verschillen in het aantal dendrieten (t13 = 1,27, p> 0,05, gemeten door dendritische tip nummer) openbaren en totale dendritische lengte (t 16 = 1,41, p> 0,05 ) per neuron tussen de hoge dichtheid en lage dichtheid neuronen worden gevonden (figuur 2E, F).
Immunocytochemie labeling wordt gebruikt om functionele glutamaat synapsen onthullen. We gebruiken dubbele kleuring labelen de NMDA receptor subeenheid NR1 en de AMPA receptor subeenheid GluR1 (figuur 3A), en functionele synapsen (co-gelokaliseerd puncta geel) kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd en gekwantificeerd met behulp ImageJ. Lage dichtheid neuronen worden ook gemerkt met antilichaam tegen dendritische eiwit marker MAP2,in combinatie met axonale eiwitmerker p-Tau. Deze dubbel-labeling maakt duidelijk onderscheid van dendrieten en axonen (Figuur 3B). Lage dichtheid kweken kunnen ook met succes worden getransfecteerd met DNA plasmiden via calciumfosfaat, waarbij echter de transfectie is typisch zeer laag in latere stadia (<0,2% neuronen wanneer getransfecteerd in DIV21). Figuur 3C illustreert dat EGFP transfectie neuronale morfologie onthullen en renderen fijne dendritische wervelkolom structuren zichtbaar. Tenslotte, als proof of concept, ultra-lage dichtheid neuronen kunnen worden gekweekt onder omstandigheden die de vorming autapse (Figuur 3D) bevorderen. Deze ultra-lage dichtheid autaptic neuronen gekweekt op poly-D-lysine gecoate 'micro-eilanden kan worden ondersteund door de hoge dichtheid feeder neuron tot voorbij 2 maanden met deze co-cultuur protocol.
<strong> Figuur 1. Schematische weergave van de hoge dichtheid en lage dichtheid co-cultuur protocol. (A) E16.5-E17.5 muis embryonale hersenen verzameld, hippocampus worden uitgesneden en gedigereerd met trypsine. (B) verteerd hippocampus worden gewassen, gescheiden in enkele neuronen en uitgeplaat bij hoge dichtheid (250.000 cellen / ml) met 24 putjes; Ondertussen zijn lage dichtheid (10.000 cellen / ml) neuronen uitgeplaat op dekglaasjes. De putjes voor museum dichtheid geëtst met een 18 G naald tot een verhoogde steun voor de dekglaasjes verschaffen. (C) Illustratie van de co-cultuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Zowel hoge dichtheid en lage dichtheid neuronen comparable morfologische ontwikkeling in co-kweek. (A, B) Microfoto's tonen uitplaatdichtheid van zowel hoge dichtheid en lage dichtheid laag. (C, D) DIC beelden die aanzienlijke groei van neurieten in zowel hoge (C) en lage densiteit (D) neuronen. De lage dichtheid neuronen op dekglaasje rusten recht boven de hoge dichtheid neuronen. Noteer de locatie van de verhoogde kunststofdrager. (E) Immunocytochemie etikettering van dendritische eiwit MAP2. (F) Kwantificering (gemiddelde ± SEM) van de totale dendritische lengte en dendritische tip nummer per neuron. Geen significant verschil (ns) werd waargenomen tussen hoge dichtheid en lage dichtheid neuronen gekweekt in co-cultuur. Schaal bar in (B, D), 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
fo: keep-together.within-page = "1"> 
Figuur 3. Experimentele manipulaties van lage dichtheid neuronen gekweekt in co-kweek. (A) immunocytochemie etikettering lage kweekdichtheid maakt de identificatie van functionele synaps gedefinieerd door co-labeling van GluR1 (groen) en NR1 (rood). (B) Co-labeling van neuronale dendritische eiwit MAP2 (magenta) en axonaal eiwit p-Tau (groen). (C) Een lage dichtheid hippocampale neuron getransfecteerd met plasmide pEGFP-C3, met overvloedig dendritische. (D) Een lage dichtheid neuron opgesteld op poly-D-lysine micro-eiland en gekweekt bovenop de hoge dichtheid neuronen. Een opname strookelektrode vult de neuron met Alexa-555 hydrazide aan de lichaamsvorm van de neuron onthullen. Schaal bar in AD, 20 urn.7fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een gedetailleerd protocol voor de lange termijn de cultuur van ultra-lage dichtheid hippocampale glutamaat neuronen onder serum-vrije omstandigheden. Bij ~ 2000 neuronen / cm 2, de dichtheid ten minste twee maal lager dan de meeste lage dichtheid voor bereiding met of zonder glia steun van de bestaande literatuur 2,3,11,13,14 gerapporteerd. Naast het feit dat ultra-lage dichtheid, dit protocol is nieuw en belangrijk in twee opzichten. Eerst wordt geen glia feeder layer nodig als lage dichtheid neuronen verkrijgen trofische factor steun van de hoge dichtheid neuronen die binnen nauwe fysieke nabijheid, hoewel er geen synaptische verbindingen of direct contact tussen de neuronen gekweekt bij verschillende dichtheden. Dit protocol overbodig bereiden glia monolaag vóór de geplande kweekexperimenten en kunnen zowel hoge dichtheid en lage dichtheid culturen gelijktijdig kweken. Bereiding van de glia monolaag kan tijdrovend en laborious, en de meeste literatuur maakt gebruik van neonatale rat pup cortex 2. Daarom is voor laboratoria die werken met alleen muizen, dit vergt aanzienlijke extra inspanningen. Belangrijker in experimenten waarbij neuronale specifieke mechanismen worden onderzocht op de aanwezigheid van glia in de co-cultuur ongewenst, omdat het voorkomt toeschrijven waargenomen effecten specifiek neuronen, glia en de interactie tussen de twee celtypen 10. Bovendien, voor glia cultuur, serum supplement is verplicht 2,15, en dit kan de glia-neuron co-cultuur besmetten en de invoering van bijkomende verstorende factoren. Een belangrijk kenmerk van ons protocol is dat de co-cultuur onder gedefinieerde mediumomstandigheden. We maken gebruik van strikt het complete cultuur medium zonder serum aan te vullen, en vind dat als het kweekmedium ruil wordt opgevolgd, de co-cultuur kan worden volgehouden meer dan drie maanden, die de meerderheid van de experimenten moeten voldoen. Omdat er nauwelijksglia aanwezigheid, een beperking van deze techniek is dat voorzichtigheid geboden bij het vergelijken met de resultaten van de literatuur dat glia-neuron co-culturen gebruiken.
Een ander nieuw aspect van dit protocol is dat we een eenvoudige methode om een effectieve micro-ruimte tussen de hoge dichtheid neuronen gekweekt op de bodem van de 24-well plaat, en de lage neuron dichtheid gehecht aan de dekglaasjes recht boven zitten maken. Eerdere studies gebruikt paraffine stippen aangebracht op het gecoate dekglaasjes de dekglaasjes bij ~ 500 urn boven de glia voedsterlaag 2,8,9 verhogen. Bereiding van paraffine punten vereist de juiste grootte en juiste temperatuur, waarbij een redelijke hoeveelheid inspanningen en praktijk brengen. Ter vergelijking, een eenvoudige etsen op de putbodem polymeren met een 18 G naald ondersteunt de dekglaasjes en goede scheiding tussen de twee lagen van neuronen. We hebben gebruik gemaakt van een patch clamp opname rig met digitale Z meter om de lin bepalenoor ruimte tussen de twee lagen van neuronen door zich op de hoge dichtheid en de lagen lage dichtheid met een 60X water immersie objectief, en vonden dat de ruimte is typisch 150-200 urn (179,4 +/- 25,3 um, n = 5 ). Deze smallere ruimte (vergeleken met die was gegenereerd door dots) waarschijnlijk vertalen naar een snellere stijging en hogere concentratie van neurotrofe factoren, dus voldoende ondersteuning voor de lage dichtheid neuron groeien. Hoewel dit smallere ruimte vragen over de snelheid van de kweekmedium-uitwisseling en de vraag of de kleinere ruimte belemmert neuronen van het verkrijgen van zuurstof en nutritionele ondersteuning kunnen verhogen, onze resultaten laten zien dat dit waarschijnlijk geen probleem. Integendeel, we vonden dat de hoge dichtheid neuronen onder dekglaasjes ook betere (hogere overleving, meer uitgebreide dendritische structuur en synaptische puncta door NR1 kleuring, gegevens niet getoond) groeien in vergelijking met de hoge dichtheid neuronen van hetzelfde preparaat zonder het bedekken coverslips. Daarom is deze eenvoudig protocol is niet alleen snel, eenvoudig, maar ook zeer effectief bij het instandhouden van zowel hoge dichtheid en lage dichtheid neuronen.
Kweken van hippocampale neuronen in vitro coaten van groeibevorderende substraten, zoals poly-D-lysine en / of laminine / collageen 5,16 vereist. Hoewel zorgvuldige selectie en bereiding van dekglaasjes cruciaal zijn voor effectieve neuronale overleving, hebben we ontdekt dat met de dekglas selecteerden we een grondige reiniging met 70% ethanol volstaat dus ontkennen de noodzaak van strengere behandeling (bijvoorbeeld koken in zuren) van de dekglaasjes. Na de dekglaasjes in ethanol gereinigd en gedroogd onder vacuüm, het glas lijkt hydrofoob te zijn door de oorspronkelijke bekleding. Echter succesvolle bekleding van 0,1 mg / ml poly-D-lysine in boraatbuffer moet het glasoppervlak hydrofiel te maken, zodat wanneer de dekglaasjes worden opgehaald van het waswater, een uniforme laag water gelijkmatigverspreid over het gehele glasoppervlak kan worden waargenomen. We vonden dat dit van cruciaal belang. Anders wordt de neuronen zal waarschijnlijk sterven na plating vanwege onvoldoende coating. Hoewel slechts lage dichtheid hippocampale neuronen onderzocht met dit protocol, wordt verwacht dat andere neuronale types (bijvoorbeeld corticale neuronen, cerebellaire granule neuronen, of gespecialiseerde neurale populaties) ook kunnen worden opgelopen bij lage dichtheid in de aanwezigheid van een hoge dichtheid neuron feeder laag. Slot, wanneer deze eenvoudig protocol wordt gevolgd, kan men verwachten oogsten gezonde ultralage dichtheid neuronen. Brede toepassingen zoals immunocytochemie etikettering, live imaging, morfologische studies en elektrofysiologie opname kunnen allemaal worden uitgevoerd op deze neuronen volgens standaardprocedures 16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. Cultureing Nerve Cells. , 2nd edition, 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
