Abstract
La culture de neurones hippocampiques primaires in vitro facilite l' interrogation mécaniste de nombreux aspects du développement neuronal. neurones hippocampiques embryonnaires dissociées peuvent souvent se développer avec succès sur des lamelles de verre à haute densité dans des conditions sans sérum, mais les cultures à faible densité nécessitent généralement une alimentation de facteurs trophiques par les co-culture avec une couche glie d'alimentation, la préparation de ce qui peut prendre du temps et laborieux. En outre, la présence de cellules gliales peut fausser l'interprétation des résultats et des études opposent sur les mécanismes spécifiques des neurones. Ici, une méthode simplifiée est présentée pour ultra-basse densité (~ 2.000 neurones / cm 2), à long terme (> 3 mois) la culture de neurones hippocampiques primaire qui est dans des conditions libres de sérum et sans support de cellules gliales. les neurones de basse densité sont cultivées sur des lamelles revêtues de poly-D-lysine et basculés sur les neurones à haute densité cultivées dans une plaque à 24 puits. Au lieu d'utiliser des points de paraffine pour créer un espace between les deux couches de neurones, les expérimentateurs peuvent simplement graver le fond en plastique du puits, où les neurones à haute densité se trouvent, pour créer un microspace propice à la croissance des neurones de basse densité. La co-culture peut être facilement maintenue pendant> 3 mois sans perte significative des neurones de basse densité, ce qui facilite l'étude morphologique et physiologique de ces neurones. Pour illustrer cet état de culture réussie, les données sont fournies pour montrer la formation des synapses profuse dans les cellules de faible densité après culture prolongée. Ce système de co-culture facilite aussi la survie des neurones individuels rares îlots cultivés dans des substrats de poly-D-lysine et donc la formation de liaisons autaptic.
Introduction
Growing neurones hippocampiques dans des conditions in vitro permet l' observation et la manipulation expérimentale de ces neurones qui sont par ailleurs pas possible in vivo. Cette approche expérimentale est largement utilisé pour révéler les mécanismes neuronaux de la croissance, la polarité, la spécification des neurites, le trafic et la localisation subcellulaire des protéines, la formation des synapses et la maturation fonctionnelle 1. Ces tests in vitro des neurones hippocampiques en culture, lorsqu'il est récolté à partir des stades embryonnaires tardives, sont relativement pur (> 90%) des cellules glutamatergiques de la morphologie pyramidale 2. Parce que les neurones ont été cultivées dans une surface 2-D dans des conditions in vitro, cette méthode permet une observation facile, comme l' imagerie en direct ou immunocytochimie (ICC) coloration par un seul plan focal 3; ou manipulations, telles que le traitement médicamenteux et transfections 3-6. Lorsqu'il est cultivé à haute densité, les neurones ont tendance à avoir des taux élevés de survie en raison de co supérieurncentrations de facteurs de croissance sécrétés en plus de la pension alimentaire du milieu de croissance, et aussi à cause de neurites mécanismes de contact dépendant 7. Cependant, la faible densité de neurones hippocampiques sont souhaitables pour des études morphologiques, lorsqu'un neurone peut être imagée dans son intégralité ou colorées pour l'analyse de la CPI. Les neurones de faible densité sont difficiles à maintenir en culture en raison du manque de soutien paracrine et nécessitent donc souvent un soutien trophique d'un gliale (typiquement corticale astrocytes) de couche d'alimentation, qui doit être préparé avant neurone culture 2. Lors de la co-culture avec une couche nourricière de cellules gliales, des neurones de basse densité sont cultivées sur des lamelles couvre-objet, puis basculés au-dessus de la couche de cellules gliales de sorte que les neurones de basse densité et de la glie se font face. Un petit espace confiné entre la glie et les neurones est créée en plaçant des points de cire de paraffine sur les coins des lamelles couvre -objet , en créant ainsi un «sandwich» agencement 2,8,9. Les neurones de faible densité augmentera wurant l'espace confiné entre la glie et la lamelle couvre-objet, ce qui crée un micro-environnement permissif avec des facteurs sécrétés par les concentrés neurones et les cellules gliales. Cette approche donne de faible densité, les neurones entièrement développés qui sont espacés raisonnablement à part, donc de faciliter l'étiquetage de la CPI ou des études en direct d'imagerie.
Un inconvénient apparent de co-culture de neurone-glie, en plus d'être longue et laborieuse, est qu'elle empêche étude des spécifiques des neurones, ou cellules autonomes, des mécanismes. Bien que ce système est beaucoup moins complexe que in vivo , le tissu neuronal, l' impact de la glie sur le développement des neurones, des facteurs sécrétés par l' intermédiaire non encore totalement définies peuvent confondre les expériences 10. Par conséquent, dans des expériences qui nécessitent l'étude des mécanismes spécifiques de neurones, les conditions de culture définies qui éliminent le sérum et la couche de support gliales sont nécessaires. Une étude antérieure a réussi à cultiver des concentrations faibles de neurones (~ 9000 cellules / cm2) en utilisant un eree dimensionnel matrice d'hydrogel 11. Etant donné que la population neuronale relativement pur peut être cultivé à une densité élevée dans des conditions sans sérum sans support gliale, nous émettons l'hypothèse que l'ultra-faible densité de neurones hippocampiques peuvent être cultivées dans du sérum dépourvu de milieu de culture défini par les co-culture avec des neurones à haute densité, en d'une manière qui est analogue à celle du neurone-glie co-culture classiquement adopté. En effet, haute densité des cultures de neurones hippocampiques dans une configuration «sandwich» ont récemment été utilisé pour soutenir un petit nombre de neurones endocrines magnocellulaires spécialisés 12.
Par conséquent, la co-culture avec des neurones à haute densité peut permettre à des neurones de basse densité pour recevoir les facteurs support trophique qui est suffisante pour permettre la survie à long terme. Ce protocole de neurones mise en culture ultra-basse densité a été ainsi formulée et validée. Le protocole peut être mis en oeuvre dans une seule expérience, en préparant haute densité (~ 250.000 cellules / ml) disneurones hippocampiques sociated d' abord, puis faire une dilution pour obtenir une densité ~ 10.000 neurones / mL (~ 3.000 neurones / lamelle, ou ~ 2.000 neurones / cm 2), ce qui est beaucoup plus faible que la plupart ont déclaré des cultures à faible densité 2,3,9 , 11,13. Cette condition de culture est vaguement appelé culture "ultra-faible densité» et utilisé avec «faible densité» inter-changeable. Les neurones à haute densité sont plaquées sur la poly-D-lysine revêtues de plaques à 24 puits; tandis que les neurones de basse densité sont ensemencées sur des lamelles de verre revêtues de 12 mm de poly-D-lysine qui sont placés dans une autre plaque à 24 puits. Les lamelles avec l'adhésion des neurones de faible densité sont retournées sur le dessus des neurones à haute densité de 2 heures plus tard, après que les neurones sont descendus et fixés aux lamelles. En outre, au lieu d'utiliser des points de cire de paraffine pour élever les lamelles au-dessus de la couche de neurones à haute densité, d'une aiguille de seringue 18 G a été utilisée pour graver le fond des plaques 24 puits avec deux bandes parallèles. Le displ résultantACED, les plastiques adjacentes fournissent un support surélevé pour les lamelles de verre. Cet espace est constamment mesurée à 150-200 um, ce qui permet l'échange d'oxygène et de milieu de culture suffisante, tout en offrant un microenvironnement avec des facteurs trophiques concentrés. Sous cette condition, les neurones de faible densité se développent beaucoup, et peuvent survivre au-delà de trois mois en culture. Lorsque ces neurones sont transfectées avec GFP plasmide après trois semaines de culture, les dendrites sont abondamment parsemés d'épines dendritiques. Comme une preuve de principe, les données sont présentées pour montrer que ce système de co-culture soutient les cultures de densité ultra-faible de neurones hippocampiques ensemencées sur poly-D-Lysine «micro-îles», où les neurones forment des connexions autaptic qui peuvent faciliter l'enquête de la cellule mécanismes -Autonome, réseau indépendant.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales impliquant des souris ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Arizona, et conformes aux directives du NIH.
1. Tissue Source pour hippocampique Neuron Culture
- Pour générer souriceaux prénatales pour la culture des neurones hippocampiques, utiliser des souris de temps enceintes (C57BL6 / J) qui sont élevés dans la maison 17. Le jour avec détection de bouchon vaginal est désigné comme E0.5. Le moment de la récolte prévue pour la culture est E16,5-E17.5.
Remarque: Ce protocole décrit les cultures des deux plaques à 24 puits de deux neurones à haute densité co-culture avec des neurones de basse densité (48 lamelles couvre au total). Pour plus de plaques, les matériaux et les réactifs peuvent être mis à l'échelle en conséquence.
2. Les plaques à 24 puits de préparation pour les cultures à haute densité Neuron
Remarque: Effectuez les étapes (2-3) suivant le jour avant la récolte prévue d'embryons.
- Apportez deux 24 biendes plaques dans la hotte de culture cellulaire, d'ouvrir l'emballage individuel.
- Branchez une aiguille de 18 G de la seringue à une seringue à usage unique 1 ml en plastique.
- Tenir la seringue, et viser la pointe de l'aiguille à ~ 1 mm à gauche au centre du fond du puits. Appliquer une force modérée (~ 250 g) pour graver le fond du puits (~ 1 mm de long). Une rainure sera formé et les matières plastiques déplacé formeront un support élevé au-dessus de la surface plane de fond de puits. Etch une autre rainure parallèle ~ 1 mm de long à ~ 1 mm vers la droite du centre de la partie inférieure d'une manière similaire.
- Répéter cette étape pour tous les puits des deux plaques 24 puits. Les deux plaques 24 puits utilisées pour la culture à haute densité sont maintenant prêts pour le revêtement de poly-D-lysine (voir l'étape 3.8 ci-dessous).
3. Lamelles Préparation à faible densité Cultures Neuron
- Utilisez 12 mm de diamètre # 1 tour de verre.
- Placer 50 lamelles dans une boîte de Pétri en plastique stérile de 100 mm de diamètre, et plonger les lamellesdans une solution d'éthanol 20 ml de 70%. Placez cette boîte de Pétri sur une plate-forme tournante modérée (70 rpm) vitesse de rotation pendant une heure. Retirer 70% d'éthanol, puis le remplacer par un nouveau lot de 70% d'éthanol. Tourner et laver pendant une heure.
- Jeter la solution de nettoyage à l'éthanol 70%. Ajouter de l'eau stérile (filtrée à travers l'unité de filtre de 0,2 um). Rincer les lamelles rigoureusement en faisant tourner la boîte de Pétri à la main. Rincer trois fois, chaque fois remplaçant par de l'eau stérile frais.
- Placer la boîte de Pétri avec des lamelles à l'intérieur d'une hotte de culture cellulaire stérile à flux laminaire. Aspirer l'eau de rinçage à travers la ligne de vide, et ajouter 10 ml d'eau stérile filtrée pour immerger les lamelles. Les lamelles doivent être stériles et la surface doit être assez propre pour le revêtement de poly-D-lysine.
- Ouvrez deux plaques à 24 puits à partir de leur emballage individuel, et les placer dans la hotte.
- Activer la ligne de vide dans la hotte. Branchez une pointe de pipette 200 pi à la ligne de vide, et d'utiliser un scissor pour couper la pointe pour créer une plus grande ouverture.
- Utilisez une pointe fine # 5 pincette pour ramasser des lamelles de la boîte de Pétri, un à la fois, et d'utiliser la ligne de vide pour sécher complètement la lamelle. Ensuite, placez une lamelle dans chacun des puits de la plaque de 24 puits. Les 50 lamelles nettoyées devraient être assez pour remplir chacun des puits des deux plaques à 24 puits.
- Diluer la solution mère de poly-D-lysine (1 mg / ml) dans une solution de travail (0,1 mg / ml) avec du tampon borate (pH 8,5). Pour les quatre plaques à 24 puits (y compris les deux plaques de haute densité avec fond gravé), préparer 30 ml de solution de travail totale.
- Ajouter 300 ul de 0,1 mg / ml de solution de travail de poly-D-lysine pour chaque puits avec des lamelles de verre. Assurez-vous que les lamelles sont complètement immergés dans une solution. Sinon, utilisez la pointe # 5 pincette pour enfoncer des lamelles contre le fond du puits, et d'utiliser la pointe pour guider la solution de poly-D-lysine pour couvrir toute la surface des lamelles. Inspecter visuellement toutes les lamelles pour faire sure pas d'air a été pris au piège entre la plaque et des lamelles.
- Ajouter 300 ul de 0,1 mg / ml de solution de travail poly-D-lysine à chaque puits de la plaque de culture à haute densité avec un fond gravé. Tournez à la main pour répandre la solution pour couvrir l'ensemble du fond du puits.
- Renvoyer tous les quatre plaques de poly-D-lysine dans l'incubateur de culture, et on incube O / N.
4. Lavage et pré-conditionnement Plaques pour la culture
Remarque: Les étapes suivantes (4-9) sont réalisées au jour de la récolte de tissus.
- Après incubation / revêtement des lamelles et des plaques à 24 puits O / N, amener tous les quatre plaques (deux avec des lamelles de donateurs, deux accepteurs haute densité plaques avec fond en plastique gravé) dans la hotte de culture. Utilisez la ligne de vide pour éliminer la solution de poly-D-lysine.
- Immédiatement après l'enlèvement de la solution de poly-D-lysine, ajouter environ 1 ml d'eau stérile à chaque puits en utilisant une pipette de transfert en plastique. Une fois que tous les puits sont remplisavec de l'eau, laisser reposer pendant 10 min. Enlever l'eau par le vide, puis ajouter 300 pi de milieu de lavage dans chaque puits pour couvrir le fond du puits (avec ou sans lamelles de verre). Ne laissez pas le revêtement de poly-D-lysine dessécher.
- Retour quatre plaques à l'incubateur de cellules. Les plaques sont prêtes à utiliser une fois que les neurones hippocampiques dispersés sont préparés.
5. Préparation de la Culture Complete Medium, et trypsine Solution pour Enzymatic Digestion
- Préparer 60 ml de milieu de culture complet en mélangeant les ingrédients (voir Matériaux). Utiliser une seringue de 50 ml, relié à un filtre de taille de la seringue de 0,2 um pores, filtrer le milieu de culture complet en deux 50 ml tubes coniques. Chaque tube contient 30 ml de milieu de culture complet.
- Dans un 50 ml tube conique séparé, ajouter ~ 30 ml de milieu de lavage (voir Matériaux) et le réchauffer à 37 ° C. Il sera utilisé pour laver le tissu après digestion enzymatique.
- Préparer le milieu de digestion enzymatique. Dans un 15 ml tube conique, ajouter 4,5 ml de milieu de lavage et une solution de 0,5 ml de trypsine 2,5%, et 50 pi de DNase I. 100X
- Placez le milieu de culture complet, milieu de lavage, et l'enzyme moyenne digestion dans un bain d'eau à 37 ° C.
6. Préparation des outils chirurgicaux
- Stériliser tous les instruments chirurgicaux dans un sachet de stérilisation: deux petits ciseaux, une paire de pinces et deux # 5 pinces.
7. Retrait de Brains de E16,5-E17.5 embryons de souris, et Dissection des hippocampes
- Préparer deux 10 cm de Pétri plats remplis de solution glacée de stérile Hank équilibrée sel (HBSS).
- Euthanize le barrage de souris avec une injection intrapéritonéale de phénobarbital de sodium (100 mg / kg dans un volume de ~ 0,5 ml). Après l'injection, une fois que le barrage perd réponse à pincement de l'orteil, sacrifier à la dislocation cervicale.
- Vaporiser abdomen du barrage avec 70% d'éthanol, et de faire une longue incision de 2 cm le long de la ligne médiane de l'abdomen pour exposerl'utérus.
- Retirez les embryons et placer ceux individuels dans une boîte de Pétri de diamètre 10 cm avec un tampon HBSS de dissection froide.
- Tenir l'embryon par le cou à l'aide d'une pince, et d'utiliser un petit ciseaux pour faire la première à droite coupée sur la ligne médiane au-dessous du niveau de cervelet et de la section à travers le tissu cérébral. Ne pas décapiter l'embryon.
- Insérez la pointe du côté droit de la petite ciseaux de la région caudale qui est coupé ouvert, tout au long de la partie rostrale du cerveau embryonnaire (ne pas la ligne médiane transversale), et faire une coupe sur le côté gauche au niveau de la base du crâne.
- Insérez à nouveau la pointe gauche de ciseaux de côté pour faire une coupure sur le côté droit. Laisser une bande étroite de uncut os du crâne et de tissus de la peau à l'extrémité rostrale, de sorte que l'ensemble du cerveau peut être basculé de côté pour l'extraction facile.
- Utilisez la pointe de ciseaux pour évider le cerveau embryonnaire dans la solution HBSS. Inspectez le cerveau sous un microscope à dissection. Le cerveau doit être intact, sans coupe-o brutrégions ff.
- Répétez ces étapes pour recueillir tous les cerveaux d'embryons.
- Ramassez tous les cerveaux intacts dans une nouvelle boîte de Pétri contenant 20 ml de tampon HBSS froid. Placer la boîte de Pétri sous un microscope de dissection.
- Voir le cerveau de la face ventrale. Tout en maintenant le cerveau avec une pince à l'extrémité caudale, insérez une forte # 5 brucelles en diagonale pour faire une coupe entre le point rostrale milieu et la région caudale-temporelle. Répétez cette opération pour l'autre hémisphère. Après la coupe, deux hémisphères séparés avec hippocampe intact du reste des tissus du tronc cérébral.
- Répétez cette opération pour chacun des cerveaux.
- Rassembler tous les hémisphères disséqués, et enlever les méninges en utilisant deux paires de pinces # 5.
- Identifier l'hippocampe en développement comme une structure incurvée qui est repliée à l'intérieur du lobe temporal. Alternez les deux paires de pinces pour séparer l'hippocampe de tissus corticaux attenant. Recueillir et mettre en commun toutes les hippocamtissu pi (voir la figure 1).
8. Enzymatic Digestion, séparée en Neurones simples
- En utilisant une pipette de transfert en plastique, transférer toutes les hippocampes disséqué dans la solution de digestion enzymatique contenant 5 ml de milieu de lavage avec 0,25% de trypsine + 1 x DNase I dans un tube conique de 15 ml.
- Placer le tube dans un bain d'eau et on incube à 37 ° C pendant 25 min, avec inversion douce intermittente du tube une fois toutes les 5 min.
- Après 25 min, retirez soigneusement la solution enzymatique à l'aide d'une pipette en plastique à la main tenue par aspiration. Ajouter milieu chaud Lavage à 10 ml et laver délicatement le tissu en inversant lentement le tube 5 fois. Retirer le moyen de lavage, et d'ajouter à nouveau 10 ml de milieu de lavage pour un lavage supplémentaire.
- Retirer le moyen de lavage, et ajouter 3 ml de milieu frais chaud Laver à nouveau. Agiter le tube à la main rigoureusement pendant 15 fois pour déloger les neurones digérées du tissu. Le milieu devrait devenir turbide fois que les cellules d'unre séparée du tissu dans le milieu de lavage. Recueillir la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 15 ml conique, tout en laissant le tissu restant dans le tube.
- Ajouter un autre 2 ml de milieu de lavage du tissu, et séparer délicatement le tissu restant en triturant à travers une pipette en plastique pour ~ 15 fois. Laisser reposer pendant 5 min. Piscine La suspension cellulaire dans le nouveau tube de 15 ml conique qui contient recueilli les cellules 'Shake-off ».
- Comptez la densité des neurones avec un hémocytomètre. Typiquement, 3000-5000 cellules par microlitre peuvent être obtenus en fonction du nombre d'embryons disséqués. Un nombre moyen de 2,5 x 10 7 neurones sont estimés en supposant , si six embryons sont disséqués.
- Calculer le volume nécessaire de cette suspension cellulaire pour donner une densité de 250.000 neurones / ml lorsqu'ils sont ajoutés à 30 ml du milieu de culture complet. Ajouter ce volume à l'un des deux tubes coniques de 30 ml milieu de culture complet pour donner le neurone moyen de plaquage à haute densité. <li> Transfert de 1,2 ml de cette solution de neurones à haute densité à une autre 30 ml de milieu de culture complet pour donner une concentration d'environ 10.000 neurones / ml. Utilisez cette dilution pour ensemencer les lamelles de faible densité.
9. Placage des Neurosciences à long terme Co-culture
- Amener les deux plaques de 24 puits dont le fond est gravé pour les neurones à haute densité dans la hotte de culture cellulaire. Retirez le support 300 condition ul par le vide. Plate 0,6 ml de suspensions cellulaires de haute densité à 250.000 neurones / ml.
- Apportez les deux autres plaques à 24 puits avec des lamelles dans la hotte de la culture, et éliminer le milieu 300 condition ul par le vide. Plaque 0,6 ml de faible densité des suspensions de cellules à 10.000 neurones / ml sur les lamelles à l'intérieur des deux plaques 24 puits.
- Retour quatre plaques à 24 puits à l'incubateur. Laisser reposer pendant 2 h.
- Retournez les lamelles de faible densité avec adhérant neurones à la culture à haute densité. Assurez - vous que les neurones sont face à face (c. -à- nOt séparés par la lamelle de verre). Ensuite, retournez les deux plaques avec co-culture à l'incubateur.
10. Co-culture Sustaining
- Nourrissez co-cultures en ajoutant 300 pi de milieu d'alimentation fraîche (voir Matériaux) au jour in vitro (DIV) 5. Il n'y a pas besoin d'enlever 50% de l' original milieu de culture complet, tel que rapporté par de nombreuses autres études. Le milieu d'alimentation contient également de 15 uM cytarabine (Ara-C, pour donner une concentration finale de 5 pM) afin de minimiser le risque de contamination et prolifération gliale.
- Suite à cette alimentation initiale, ajouter 300 ul de milieu d'alimentation frais sans Ara-C au bien chaque semaine. Si la culture est maintenue pendant plus d'un mois, remplacer la moitié du milieu avec un milieu d'alimentation fraîche chaque semaine au-delà d'un point de temps par mois (avec la première demi-remplacement du milieu au DIV33). Morphologiquement, à la fois haute densité et les neurones de faible densité semblent en bonne santé jusqu'à trois mois (le plus long temps observé par l'experimenters).
11. Illustration d'une densité expérimentale de manipulation bas Neuron Transfection
Remarque: Lors de la transfection dans les neurones de faible densité est souhaitée, un protocole de phosphate de calcium simple peut être adopté. Nous avons trouvé que les cultures à faible densité ont une meilleure efficacité de la transfection avec le protocole de phosphate de calcium avant DIV12, mais ils peuvent être transfectées avec une efficacité beaucoup plus faible à DIV21 ou plus, au cours de laquelle les épines dendritiques sont proéminents. La faisabilité de la transfection de la faible culture neurone de densité est illustré par transfection neurones avec un plasmide pEGFP-C3 (voir ci-dessous).
- A DIV21, retirer 600 ul de milieu conditionné à partir de chaque puits de la co-culture, et de le transférer à une nouvelle plaque de 24 puits. Puis ajouter 600 pi de milieu d'alimentation fraîche à la co-culture pour le ramener au volume initial.
- Transférer les lamelles dans la nouvelle plaque de 24 puits avec 600 pi de milieu conditionné. Assurez-vous que leles neurones de faible densité sont tournés vers le haut. Placez les plaques de haute densité et les nouvelles plaques avec des lamelles de retour dans l'incubateur.
- Préparer deux tubes de 1,5 ml stériles. Dans un tube, ajouter 600 ul 2X HEPES solution saline tamponnée (HBS) solution. Calculer le volume de 12 pg pEGFP C3-ADN basée sur la concentration de plasmide. Dans l'autre tube, ajouter 74 ul de CaCl2 (2 M stock) et le volume d'eau qui après avoir ajouté le plasmide fera 600 pi. Bien mélanger par pipetage, puis ajouter l'ADN plasmidique. Lentement, bien mélanger. Que les deux tubes reposer pendant 5 min à température ambiante.
- Alors que la main-tenant le tube 2X HBS et en agitant modérément la solution sur un mélangeur, ajouter tous les 600 ul de la solution goutte ADN-CaCl2 à goutte 600 ul 2X HBS tube. Il est essentiel que le précipité formé est sous la forme de granulés 'de sable fin ». Mélange trop forte et trop rapide est pas souhaitable, car il sera plus susceptible de produire de grandes précipités flake' comme neige », which a considérablement moindre efficacité de transfection en fonction de nos observations.
- Laissez le précipité continuer à se former dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min.
- Ajouter 100 ul précipité à chaque puits contenant une faible densité des neurones sur les lamelles, goutte à goutte et uniformément. Remettre la plaque dans l'incubateur et incuber pendant 2 heures. En supposant que la majeure partie du CaCl2 est sous forme libre, il en résulte une concentration d'environ mM Ca2 + 17,6, qui peut être toxique pour les neurones après une incubation prolongée.
- Préparer un tube de 50 ml conique avec un milieu ~ 50 ml Wash, réchauffer à 37 ° C.
- Au bout de 2 h, amener le neurone à basse densité avec du phosphate de calcium précipite l'ADN dans la hotte. Ramassez chaque lamelle individuelle avec une forte # 5 brucelles, et le tremper trois fois dans le milieu de 50 ml de lavage pour laver brièvement. Puis le retourner aux neurones de haute densité dans ses plaques de co-culture d'origine, avec les neurones de faible densité vers le bas.
- Continuer jusqu'à ce que la cultureles neurones de culture de faible densité sur des lamelles sont récoltées pour des études.
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Representative Results
Le protocole décrit ici permet de succès ultra-faible densité, la culture à long terme des neurones glutamatergiques purs sans avoir besoin de cellules gliales servant de couche d'alimentation. Le protocole est schématisée sur la figure 1, qui comprend la préparation de haute densité (de poly-D-lysine revêtu 24 puits) et les neurones de basse densité (à la poly-D-lysine lamelles de verre revêtues) séparément, et la co-culture subséquente qui peut être maintenue jusqu'à trois mois.
Les figures 2A et 2B sont des illustrations des neurones à haute densité et basse densité à 5 jours après l' ensemencement. culture basse densité est d'environ 30 fois moins de densité. Les deux neurones subissent les stades de développement typiques tel que décrit par Kaech et Banker (2006). Au jour 14, à la fois haute densité et les neurones de faible densité montrent des structures dendritiques complexes, comme l'a révélé des images DIC (figures 2C,D, noter les deux panneaux sont du même champ avec différents plans focaux, comme le montre l'emplacement de gravure). Lorsque ces neurones sont colorées avec un anticorps MAP2 pour révéler les dendrites, aucune différence significative dans le nombre de dendrites (t 13 = 1,27, p> 0,05; mesurée par dendritique numéro de pointe) et la longueur dendritiques totale (t 16 = 1,41, p> 0,05 ) par neurone entre la haute densité et les neurones de faible densité se trouvent (figure 2E, F).
étiquetage Immunocytochimie est utilisé pour révéler les synapses glutamatergiques fonctionnels. Nous utilisons une double coloration pour marquer le NMDA sous - unité de récepteur NR1 et la sous - unité de récepteur AMPA GluR1 (figure 3A), et synapses fonctionnelles (punctas co-localisée en jaune) peuvent être facilement identifiés et quantifiés en utilisant ImageJ. neurones de faible densité sont également marquées avec un anticorps contre dendritique marqueur protéique MAP2,en combinaison avec le marqueur de protéine axonale p-Tau. Ce double marquage permet distinction claire des dendrites et des axones (figure 3B). Les cultures à faible densité peuvent également être transfectées avec succès avec des plasmides d'ADN en utilisant des procédés de phosphate de calcium, bien que le taux de transfection est généralement très faible , à des stades ultérieurs (<0,2% des neurones lorsqu'il est transfecté à DIV21). La figure 3C montre que la EGFP transfection peut révéler la morphologie neuronale, et rendre fines structures de la colonne vertébrale dendritique visible. Enfin, comme une preuve de concept, les neurones ultra-basse densité peuvent être cultivées dans des conditions qui favorisent la formation autapse (Figure 3D). Ces neurones autaptic densité ultra-faible cultivées sur poly-D-lysine enrobées «micro-îles» peuvent être soutenus par le chargeur neurone haute densité au-delà de 2 mois avec ce protocole de co-culture.
<strong> Figure 1. Représentation schématique de la haute densité et à faible protocole de co-culture de densité. (A) E16,5-E17.5 souris cerveaux embryonnaires sont collectées, hippocampes sont disséqués et digérées avec de la trypsine. (B) hippocampes sommairisé sont lavés, séparés en neurones simples, et plaqué à haute densité (250.000 cellules / ml) sur des plaques à 24 puits; Entre-temps, une faible densité (10.000 cellules / ml), les neurones sont étalées sur des lamelles. Les puits de culture à haute densité sont gravées avec une aiguille de seringue 18 G pour fournir un support surélevé pour les lamelles. (C) Illustration de la co-culture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Les deux haute densité et les neurones de faible densité ont codéveloppement morphologique mparable en co-culture. (A, B) photomicrographies montrant la densité de placage à la fois de haute densité et de la couche de faible densité. Images (C, D) DIC montrant une croissance extensive de neurites à la fois élevé (C) et de faible densité (D) neurones. Les neurones de faible densité sur la lamelle reposent droit au-dessus des neurones à haute densité. Noter l'emplacement du support en matière plastique posée. Étiquetage (E) Immunocytochimie de dendritique MAP2 de protéines. (F) Quantification (moyenne ± ETM) de longueur dendritiques totale et le nombre de pointe dendritique par neurone. Aucune différence significative (ns) a été observée entre la haute densité et les neurones de faible densité cultivés en co-culture. Barre d'échelle (B, D), 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Les manipulations expérimentales des neurones cultivés à faible densité en co-culture (A) . Marquage immunocytochimique dans la culture à faible densité permet d' identifier synaptique fonctionnelle définie par co-marquage de GluR1 (vert) et NR1 (rouge). (B) Co-étiquetage des neurones dendritique MAP2 de protéines (magenta) et la protéine axonale p-Tau (vert). (C) Un neurone hippocampique basse densité transfectées avec pEGFP-C3 plasmidique, montrant épines dendritiques profuses. (D) un neurone de faible densité préparé de poly-D-lysine "micro-island» et cultivé sur des neurones à haute densité. Une électrode de patch d'enregistrement remplit le neurone avec Alexa-555 hydrazide pour révéler la morphologie du neurone. Barre d'échelle dans la MA, 20 um.7fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous présentons un protocole détaillé pour la culture à long terme des neurones glutamatergiques hippocampiques ultra-basse densité dans des conditions sans sérum. A ~ 2000 neurones / cm 2, la densité est au moins deux fois plus faible que la plupart des préparations «faible densité» de la culture , avec ou sans le soutien de la glie rapportée par la littérature existante 2,3,11,13,14. En plus d'être ultra-faible densité, ce protocole est nouvelle et significative de deux façons. Tout d'abord, aucune couche glie d'alimentation est nécessaire que les neurones de faible densité obtenir un soutien de facteur trophique des neurones de haute densité qui sont à proximité physique, même si il n'y a pas de connexions synaptiques ou un contact direct entre les neurones cultivés à différentes densités. Ce protocole permet d'éliminer la nécessité d'une préparation de cellules gliales monocouche avant les expériences de culture prévue et permet à la fois une densité élevée et des cultures à faible densité de croître en même temps. Préparation de la monocouche de cellules gliales peut être chronophage et lla littérature aborious, et la plupart utilise le rat nouveau - né chiot corticales 2. Par conséquent, pour les laboratoires qui travaillent avec des souris seulement, cela nécessite des efforts supplémentaires importants. Plus important encore , dans des expériences où des mécanismes spécifiques de neurones sont étudiés, la présence de cellules gliales dans la co-culture peut être indésirable, car il empêche les effets de attribuons observé spécifiquement pour les neurones, les cellules gliales ou l'interaction entre les deux types de cellules 10. En outre, pour la culture de cellules gliales, supplément de sérum est obligatoire 2,15, ce qui peut contaminer le co-culture glie-neurone et d' introduire des facteurs de confusion supplémentaires. Une caractéristique importante de notre protocole est que la co-culture est dans des conditions moyennes définies. Nous utilisons strictement le milieu de culture complet, sans supplément de sérum, et constatons que si la culture horaire de change moyen est strictement suivie, la co-culture peut être maintenue au-delà de trois mois, ce qui devrait satisfaire la majorité des expériences. Parce qu'il n'y a pratiquement pas d'présence de cellules gliales, une limitation de cette technique est que la prudence devrait être exercée lorsque l'on compare avec les résultats de la littérature qui utilisent glie-neurones co-cultures.
Un autre aspect novateur de ce protocole est que nous utilisons une méthode simple pour créer un micro-espace efficace entre les neurones de haute densité cultivées sur le fond de la plaque de 24 puits, et le neurone de faible densité adhéré aux lamelles de verre assis juste au-dessus. Des études antérieures utilise des points de paraffine appliquées aux lamelles revêtues de soulever les lamelles à ~ 500 um au-dessus de la couche d'alimentation de cellules gliales 2,8,9. Préparation de points paraffine nécessite la bonne taille et bonne température, ce qui exige une quantité raisonnable d'efforts et de la pratique. En comparaison, une simple gravure sur les plastiques de fond de puits avec une aiguille de 18 G fournit un support pour les lamelles ainsi qu'une bonne séparation entre les deux couches de neurones. Nous avons utilisé un appareil d'enregistrement patch clamp avec compteur numérique Z pour déterminer le linl'espace de l'oreille entre les deux couches de neurones en se concentrant sur la haute densité, puis sur les couches de faible densité en utilisant un objectif à immersion d'eau 60X, et a constaté que l'espace est typiquement 150-200 um (179,4 +/- 25,3 um, n = 5 ). Cet espace plus étroit (par rapport à celle générée par des points de cire) est susceptible de se traduire par une hausse plus rapide et plus forte concentration de facteurs neurotrophiques, offrant ainsi un soutien suffisant pour le neurone à faible densité de croître. Bien que cet espace étroit peut soulever des questions sur le taux de la culture d'échange moyen et si le plus petit espace empêche les neurones de l'obtention de l'oxygène et un soutien nutritionnel, nos résultats montrent que cela ne devrait pas une préoccupation. Au contraire, nous avons constaté que les neurones de haute densité sous les lamelles poussent également mieux (taux de survie plus élevé, arbre dendritique plus élaborée et plus puncta synaptique par NR1 coloration, données non présentées) par rapport aux neurones de haute densité à partir de la même préparation, mais sans le cov superposanterslips. Par conséquent, ce protocole simple est non seulement rapide, simple, mais aussi très efficace dans le maintien à la fois de haute densité et les neurones de faible densité.
La culture de neurones hippocampiques in vitro nécessite le revêtement de substrats favorisant la croissance, tels que la poly-D-lysine et / ou de la laminine / collagène de 5,16. Bien que la sélection minutieuse et la préparation de lamelles de verre sont essentiels pour la survie neuronale efficace, nous avons constaté que le verre de couverture , nous avons choisi, un nettoyage en profondeur avec 70% d' éthanol est suffisante, niant ainsi la nécessité d' un traitement plus sévère (par exemple, le point d' ébullition des acides) des lamelles couvre-objet. Une fois que les lamelles sont nettoyées dans l'éthanol et séché sous vide, le verre hydrophobe semble être dû à l'enrobage d'origine. Cependant, un revêtement réussi de 0,1 mg / ml de poly-D-lysine dans un tampon borate doit rendre hydrophile la surface du verre, de sorte que lorsque les lamelles sont récupérés à partir de l'eau de lavage, une couche uniforme de l'eau qui est uniformémentétalement sur la surface du verre peut être observée. Nous avons constaté que cela est d'une importance cruciale. Sinon, les neurones seront très probablement mourir après placage grâce à un revêtement insuffisant. Bien que seulement une faible densité des neurones hippocampiques sont testées dans ce protocole, il est prévu que d' autres types de neurones (par exemple, les neurones corticaux, les neurones granulaires du cervelet, ou les populations de neurones spécialisés) peuvent également être maintenus à une faible densité en présence d'un neurone d' alimentation à haute densité couche. Enfin, lorsque ce protocole simple est suivi, on peut espérer récolter les neurones ultra-faible densité en bonne santé. Applications larges telles que l' étiquetage de l' immunocytochimie, l' imagerie en direct, des études morphologiques et l' enregistrement d'électrophysiologie peuvent tous être effectués sur ces neurones suivants procédures standard 16,17.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
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