Abstract
Culturing נוירונים בהיפוקמפוס העיקריים במבחנת מקלת חקירת מכניסטית של היבטים רבים של התפתחות עצבית. נוירונים בהיפוקמפוס עובריים ניתקו לעתים קרובות יכולים לגדול בהצלחה על זכוכית coverslips בצפיפות גבוהה בתנאי סרום ללא, אבל תרבויות בצפיפות נמוכות בדרך כלל דורשות אספקה של גורמי trophic ידי שיתוף culturing אותם בשכבה מזינה גליה, הכנה אשר יכול להיות זמן רב ומייגעת. בנוסף, הנוכחות של גליה עלולה לבלבל פרשנות של תוצאות ומחקרים ימנעו על מנגנוני נוירון ספציפי. כאן, שיטה פשוטה מוצגת צפיפות נמוכה במיוחד (~ 2,000 נוירונים / 2 סנטימטר), לטווח ארוך (> 3 חודשים) תרבות נוירון בהיפוקמפוס העיקרית היא בתנאים חופשיים בסרום וללא תמיכת תא גליה. נוירונים בצפיפות נמוכים גדלים על coverslips מצופה פולי- D- ליזין, ומתהפכים על נוירונים בצפיפות גבוהים גדלו צלחת 24 גם. במקום להשתמש נקודות פרפין ליצור מרחב between את שתי שכבות עצביות, הנסיינים פשוט יכולים לחרוט בתחתית הפלסטיק של הבאר, שעליו הנוירונים בצפיפות הגבוהים מתגוררים, כדי ליצור microspace תורמת לצמיחת נוירון בצפיפות נמוכה. שיתוף התרבות יכולה להישמר בקלות> 3 חודשים ללא הפסד משמעותי של נוירונים בצפיפות נמוכים, ובכך להקל על הבדיקה מורפולוגית ופיזיולוגית של הנוירונים האלה. כדי להמחיש מצב התרבות המוצלח הזה, נתונים ניתנים להראות היווצרות הסינפסה פזרנית בתאים בצפיפות נמוכים לאחר תרבות ממושכת. מערכת שיתוף תרבות זה מאפשרת גם את ההישרדות של נוירונים בודדים דלילים הגדלים איים של מצעי פולי- D- ליזין וכך היצירה של קשרי autaptic.
Introduction
גידול נוירונים בהיפוקמפוס בתנאים חוץ גופית מאפשר תצפית מניפולציה ניסויית של הנוירונים האלה כי הם אחרת לא ניתן in vivo. גישה ניסויית זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לחשוף את המנגנונים עצביים של צמיחה, קוטביות, מפרט neurite, סחר ולוקליזציה subcellular של חלבונים, היווצרות הסינפסה והתבגרות פונקציונלית 1. במבחנה אלו נוירונים בהיפוקמפוס תרבותיים, כאשר קוצרים בשלבים עובריים מאוחר, יחסית טהורים (> 90%) תאי glutamatergic של מורפולוגיה פירמידת 2. בגלל נוירונים גדלו משטח 2-D בתנאים במבחנה, שיטה זו מאפשרת התבוננות קלה, כגון הדמיה לחיות או immunocytochemistry (ICC) מכתים באמצעות מטוס בודד מוקדי 3; או מניפולציות, כגון טיפול תרופתי ו transfections 3-6. כאשר גדל בצפיפות גבוהה, נוירונים נוטים להיות בעלי שיעור גבוה של הישרדות בגלל שיתוף גבוהncentrations של גורמי גדילה מופרשים בנוסף לתמיכת עיכול מתקשורת הצמיחה, וגם בגלל מנגנוני קשר תלוי neurite 7. עם זאת, נוירונים בהיפוקמפוס נמוך צפיפות רצויים ללימודי מורפולוגיים, שבו נוירון יחיד ניתן הדמיה בשלמותו או מוכתם לניתוח ICC. נוירונים בצפיפות נמוכה קשה לשמור בתרבות בשל חוסר תמיכה paracrine וכך לעיתים קרובות דורשים תמיכה trophic מתוך גליה שכבת מזין (בדרך כלל קליפת המוח astrocyte), אשר צריך להיות מוכן לפני נוירון תרבות 2. כאשר שיתוף תרבותי עם שכבת מזין תאים גליה, הנוירונים בצפיפות נמוכה גדלים על coverslips, ולאחר מכן התהפך על גבי שכבת גליה כך הנוירונים בצפיפות נמוכה גליה הם פונים זה לזה. מקום מוקף קטן בין גליה נוירונים נוצר על ידי הצבת נקודות פראפין על הפינות של coverslips, ולכן יצירת פריסה 'סנדוויץ' 2,8,9. הנוירונים בצפיפות הנמוכים יגדלו within המוקף בין גליה ואת coverslip, אשר יוצר microenvironment מתירנית עם גורמים מרוכזים מופרשים על ידי תאי עצב גליה. גישה זו מניבה בצפיפות נמוכה, נוירונים מפותחים כי הם במרווחים סבירים, ולכן תיוג ICC להקל או בדיקות הדמיה לחיות.
חסרון לכאורה של תרבות שיתוף נוירון, גליה, מלבד היותם זמן רב ומייגע, הוא בכך שהיא מונעת מחקר של נוירון הספציפי, או תאים אוטונומיים, מנגנונים. למרות מערכת זו היא הרבה פחות מורכבת מאשר vivo רקמה עצבית, השפעה גליה על פיתוח נוירון דרך מופרש, גורמים לא-עדיין-מוגדר באופן מלא יכול לבלבל הניסויים 10. לכן, בניסויים הדורשים חקירת מנגנוני נוירון ספציפיים, תנאי תרבות מוגדרות המסירים בסרום שכבת תמיכת גליה נחוצים. מחקר קודם הצליחה culturing ריכוזים נמוכים של נוירונים (~ 9,000 תאים / 2 ס"מ) באמצעות המטריקס הידרוג'ל ממדי רי 11. מאז אוכלוסייה עצבית יחסית טהורה יכולה להיות מתורבתת בצפיפות גבוהה בתנאים חופשיים בסרום ללא תמיכת גליה, אנו משערים כי צפיפות נמוכה במיוחד של נוירונים בהיפוקמפוס ניתן לגדל במדיום תרבות בסרום חינם שהוגדר על ידי שיתוף culturing אותם עם נוירונים בצפיפות גבוהים, ב באופן מקביל שיתוף תרבות נוירון, גליה אימצה כמקובל. אכן, תרבויות נוירון בהיפוקמפוס צפיפות גבוהה בתצורת 'סנדוויץ' שימשו לאחרונה לתמוך במספר קטן של נוירונים האנדוקרינית magnocellular מתמחה 12.
לכן, שיתוף תרבות עם נוירונים צפיפות גבוהים עלולה לאפשר נוירונים בצפיפות נמוכים כדי לקבל תמיכת גורמי trophic כי די בכך כדי לאפשר הישרדות לטווח ארוכה. פרוטוקול זה של נוירונים צפיפות נמוכה במיוחד culturing ובכך גובש ומאומת. הפרוטוקול יכול להיות מיושם בתוך ניסוי בודד אחד, על ידי הכנת צפיפות גבוהה (~ 250,000 תאים / מ"ל) דיסנוירונים בהיפוקמפוס sociated הראשון, ולאחר מכן ביצוע דילול להניב צפיפות ~ 10,000 נוירונים / מ"ל (~ 3,000 נוירונים / coverslip, או ~ 2,000 נוירונים / 2 ס"מ), שהוא הרבה יותר נמוך מאשר רוב דיווחו תרבויות בצפיפות נמוכה 2,3,9 , 11,13. מצב תרבות זה נקרא רופף כתרבות "אולטרה-נמוך צפיפות 'ומשתמש עם' בצפיפות נמוכה 'בין-changeably. הנוירונים הצפיפות הגבוהים הם מצופים על 24 גם צלחות פולי- D- ליזין מצופות; בעוד נוירונים בצפיפות נמוכה הם זורעים על coverslips זכוכית פולי- D- ליזין מצופה 12 מ"מ אשר ממוקמות בתוך אחר צלחת 24 גם. Coverslips עם הדבקות נוירונים בצפיפות נמוכה הם התהפכו על גבי נוירונים צפיפות הגבוהים 2 hr מאוחר יותר לאחר נוירונים הם צאצאים ומצורפים coverslips. בנוסף, במקום להשתמש נקודות פראפין לרומם את coverslips מעל שכבת נוירון צפיפות הגבוהה, מחט מזרק 18 G שמשה לחרוט בתחתית 24 הצלחות גם עם שני פסים מקבילים. Displ וכתוצאה מכךaced, פלסטיק הסמוך לספק תמיכה גבוהה עבור coverslips הזכוכית. שטח זה נמדד באופן עקבי 150-200 מיקרומטר, המאפשר בינוני חמצן והתרבות מספיק חליפין תוך מתן microenvironment עם גורמי trophic מרוכזים. תחת תנאי זה, הנוירונים בצפיפות הנמוכים לגדול בהרחבה, והוא יכול לשרוד מעבר לשלושה חודשים בתרבות. כאשר נוירונים אלה הם transfected עם פלסמיד GFP לאחר שלושה שבועות בתרבות, הדנדריטים משובצים למכביר עם הקוצים הדנדריטים. כהוכחה עקרוני, הנתונים מוצגים להראות כי מערכת שיתוף תרבות זו תומכת תרבויות צפיפות נמוכה במיוחד של נוירונים בהיפוקמפוס זורעים על '-איים מיקרו' פולי- D- ליזין, שבו יוצרים נוירונים קשרים autaptic שעשויים להקל חקירת התא -autonomous, מנגנוני רשת עצמאית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוצדורות הכרוכות עכברים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת אריזונה, והותאמו להנחיות NIH.
רקמות 1. מקור עבור בהיפוקמפוס Neuron תרבות
- כדי ליצור גורי עכבר טרום לידתי לתרבות נוירון בהיפוקמפוס, משתמש בעכברי זמן בהריון (C57BL6 / J) כי הם גדלו בבית 17. היום עם זיהוי תוסף הנרתיק הוא יועד E0.5. שעת הקציר המתוכנן תרבות היא-E17.5 E16.5.
הערה: פרוטוקול זה מתאר תרבויות של שני 24 גם צלחות של שני נוירונים בצפיפות גבוהה שיתוף culturing עם הנוירונים בצפיפות נמוכה (48 coverslips סך הכל). עבור צלחות יותר, חומרים ריאגנטים וניתן לשנותם בהתאם.
2. 24 גם צלחות הכנה תרבויות נוירון בצפיפות גבוהה
הערה: בצע את השלבים הבאים (2-3) היום לפני הקציר של עוברים המתוכננים.
- תביא שני 24 היטבצלחות לתוך מכסה מנוע תרבית תאים, לפתוח את אריזת הפרט.
- חבר מחט 18 G מזרק מזרק לשימוש חד-פעמי מפלסטיק 1 מ"ל.
- החזק את המזרק, ולכוון את קצה המחט ב ~ 1 מ"מ משמאל למרכז לתחתית הבאר. להפעיל כוח מתון (~ 250 גרם) כדי לחרוט את תחתית הבאר (~ 1 מ"מ אורך). חריץ יוקם ואת והחומרים הפלסטיים שנעקרו יהוו תמיכה מוגבהת מעל פני השטח היטב התחתיים השטוחים. Etch אחר ~ 1 חריץ מקביל באורך מ"מ ב ~ 1 מ"מ מימין במרכז התחתון בצורה דומה.
- חזור על שלב זה עבור כל הבארות של שני 24 גם צלחות. שני 24 גם הצלחות המשמשות תרבות צפיפות גבוהה מוכנות כעת לציפוי עם פולי- D- ליזין (ראה שלב 3.8 להלן).
3. הכנת Coverslips עבור תרבויות נוירון בצפיפות נמוכה
- השתמש זכוכית עגולה בקוטר 12 מ"מ # 1.
- מניחים 50 coverslips בתוך צלחת פטרי פלסטיק סטרילי בקוטר 100 מ"מ, לצלול coverslipsב 20 מ"ל פתרון אתנול 70%. מניחים צלחת פטרי זה על במה מסתובבת עם סיבוב במהירות בינונית (70 סל"ד) במשך שעה. הסר אתנול 70% ולאחר מכן להחליף עם קבוצה חדשה של אתנול 70%. סובב ולשטוף במשך שעה נוספת.
- בטל פתרון ניקוי אתנול 70%. מוסיפים מים סטריליים (מסוננים דרך יחידת מסנן 0.2 מיקרומטר). שוטפים את coverslips בקפדנות על ידי החלפה של צלחת פטרי ביד. לשטוף שלוש פעמים, בכל פעם להחליף עם מים סטריליים טריים.
- מניחים את צלחת פטרי עם coverslips בתוך ברדס תרבית תאים סטריליים עם זרימה למינרית. לשאוב את מי שטיפה דרך הקו הריק, ולהוסיף 10 מ"ל מים מסוננים סטרילית לטבול את coverslips. את coverslips צריך להיות סטרילי ועל פני השטח צריך להיות נקי מספיק לציפוי פולי- D- ליזין.
- להרחיב שני 24 גם צלחות מ באריזות יחידות שלהם, ומניחים אותם בתוך הכובע.
- הפעל את קו ואקום בשכונה. חבר קצה פיפטה 200 μl אל קו ואקום, ולהשתמש scisסור כדי לחתוך את הקצה כדי ליצור פתח גדול יותר.
- השתמש פינצטה # 5 עדין טיפ להרים coverslips מצלחת פטרי, אחד בכל פעם, ולהשתמש בקו ואקום לייבש את coverslip לחלוטין. אז במקום coverslip אחד לתוך כל הבארות של צלחת 24 גם. 50 coverslips לנקות צריך להיות מספיק כדי למלא כל אחת הבארות של שני 24 גם צלחות.
- לדלל את הפתרון המניות פולי- D- ליזין (1 מ"ג / מ"ל) לתוך הפתרון עובד (0.1 מ"ג / מ"ל) עם חיץ borate (pH 8.5). במשך ארבעת 24 גם צלחות (כולל שתי צלחות בצפיפות גבוהה עם תחתית חרוט), להכין 30 מ"ל של תמיסת העבודה הכולל.
- הוספת 300 μl 0.1 מ"ג / מ"ל פתרון העבודה פולי- D- ליזין היטב כל עם coverslips זכוכית. ודא coverslips שקוע לחלוטין בתמיסה. אם לא, השתמש קצה פינצטה # 5 ללחוץ מטה coverslips נגד בתחתית הבאר, ולהשתמש קצה להנחות פתרון פולי- D- ליזין כדי לכסות את כל פני השטח של coverslips. ראייה לבדוק את כל coverslips לעשות suמחדש לא אוויר נלכד בין צלחת coverslips.
- הוספת 300 μl 0.1 מ"ג / מ"ל פתרון העבודה פולי- D- ליזין היטב כל הצלחת תרבות צפיפות גבוהה עם תחתית חרוט. סבוב ביד כדי להפיץ את הפתרון כדי לכסות את כל תחתית הבאר.
- להחזיר את כל ארבע צלחות עם D- ליזין פולי אל האינקובטור תרבות, דגירה O / N.
4. כביסה וצלחות אוויר קדם לתרבות
הערה: השלבים הבאים (4-9) מתבצעים ביום קציר רקמות.
- לאחר דגירה / ציפוי של coverslips וצלחות 24 גם O / N, להביא את כל ארבע צלחות (שני עם coverslips התורם, שתי צלחות בצפיפות גבוהה acceptor עם תחתית פלסטיק חרוט) לתוך מכסה המנוע התרבות. שימוש בקו ואקום להסיר הפתרון פולי- D- ליזין.
- מיד לאחר הסרת הפתרון פולי- D- ליזין, להוסיף ~ 1 מ"ל מים סטריליים היטב כל באמצעות פיפטה העברת פלסטיק. אחרי הכל הבארות מלאותעם מים, ולתת לעמוד במשך 10 דקות. סר מים על ידי ואקום, ואז להוסיף 300 μl לשטוף בינוני בכל טוב כדי לכסות את תחתית הבאר (עם או בלי זכוכית coverslips). אל תתנו פולי- D- ליזין ציפוי להתייבש.
- להחזיר את כל ארבע הצלחות אל האינקובטור התא. הצלחות מוכנות לשימוש לאחר נוירונים בהיפוקמפוס התפזרו ערוכים.
5. הכנת בינוני תרבות שלמה, ואת טריפסין פתרון עבור עיכול אנזימטי
- כן 60 מיליליטר בינוני תרבות שלמה על ידי ערבוב המרכיבים (ראה חומרים). השתמש מזרק 50 מ"ל מחובר עם מסנן מזרק גודל 0.2 מיקרומטר נקבוביות, לסנן המדיום תרבות שלמה לשתי צינורות חרוטי 50 מ"ל. כל שפופרת מכילה 30 מ"ל בינוני תרבות שלמה.
- בתוך צינור חרוטי 50 מ"ל נפרד, להוסיף ~ 30 מ"ל בינוני לשטוף (ראה חומרים) ולחמם אותו עד 37 מעלות צלזיוס. זה ישמש כדי לשטוף את הרקמה לאחר עיכול אנזימטי.
- הכן את מדיום עיכול אנזים. ב -15 מ 'צינור חרוטי l, להוסיף 4.5 מ"ל בינוני לשטוף 0.5 מ"ל 2.5% פתרון טריפסין, ו -50 μl 100X DNase I.
- מניח את מדיום תרבות השלם, בינוני Wash, אנזים בינוני עיכול באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
6. הכנת כלי כירורגי
- לעקר את כל הכלים כירורגית בתוך כיס עיקור: שני מספריים קטנים, זוג מלקחיים ושני פינצטה # 5.
הסרת 7. של מוח מן E16.5-E17.5 עכבר עוברים, ו Dissection של hippocampi
- הכן שני 10 סנטימטרי פטרי מנות מלאות קר כקרח, תמיסת המלח המאוזנת של האנק סטרילית (HBSS).
- להרדים את הסכר העכבר עם זריקה intraperitoneal של phenobarbital נתרן (100 מ"ג / ק"ג בנפח של ~ 0.5 מ"ל). לאחר ההזרקה, פעם הסכר מאבד בתגובה קמצוץ הבוהן, להקריב עם נקע בצוואר הרחם.
- ריסוס באזור הבטן של הסכר עם אתנול 70%, ולעשות חתך ארוך 2 ס"מ לאורך קו האמצע של הבטן לחשוףהרחם.
- הסר את העוברים ולמקם אותם בנפרד בצלחת פטרי בקוטר של 10 ס"מ עם חיץ HBSS לנתח קר.
- החזק את העובר על ידי הצוואר באמצעות מלקחיים, ולהשתמש מספריים קטנים כדי להפוך את הזכות לחתוך הראשון קו האמצע מתחת לרמת המוח הקטנה וסעיף ברחבי רקמת המוח. אל לערוף את העובר.
- הכנס את הקצה בצד ימין של המספריים הקטנים מאזור הזנב כי הוא חתך פתוח, כל הדרך דרך החלק המקורי של המוח העוברי (לא קו אמצע צלב), ולעשות חתך בצד השמאל ברמה של בסיס גולגולת.
- הכנס את הקצה המספרי אגף השמאל שוב לעשות חתך בצד ימין. השאר פס צר של עצם גולגולת מלוטש רקמת עור בסוף המקורי, כך שהמוח כולו ניתן התהפך בצד חילוץ קל.
- השתמש בקצה מספרי כדי לגרוף את המוח העוברי לתוך תמיסת HBSS. בדוק את המוח תחת מיקרוסקופ לנתח. המוח צריך להיות שלם ללא חתך-o ברוטואזורי ff.
- חזור על שלבים אלה כדי לאסוף את כל המוחות העובר.
- לאסוף את כל המוח שלם בצלחת פטרי חדשה המכילה 20 מ"ל חיץ HBSS קר. מניחים את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
- הצג את המוח מצד הגחון. תוך כדי לחיצה על המוח עם מלקחיים בסוף הזנב, להכניס פינצטה # 5 חדה באלכסון לעשות חתך בין נקודת מקורי התיכון ובאזור הזנב-טמפורלית. חזור על פעולה זו עבור חצי הכדור השני. לאחר חיתוך, שתי ההמיספרות נפרדות עם ההיפוקמפוס שלם משאר רקמות גזע המוח.
- חזור על פעולה זו עבור כל אחד המוחות.
- שחייה כולן ההמיספרות הגזורה, ולהסיר את קרומי המוח באמצעות שני זוגות של פינצטה 5 #.
- זהה את ההיפוקמפוס בפיתוח כמבנה מעוקל כי הוא מקופל בתוך האונה הטמפורלית. החלף את שני זוגות פינצטה להפריד את ההיפוקמפוס מן הסמוך רקמות קליפת המוח. אסוף וברכה כל hippocamרקמת pi (ראה איור 1).
8. אנזימתי עיכול, פרד נוירונים בודדים
- בעזרת פיפטה העברת פלסטיק, להעביר את כל hippocampi גזור לתוך התמיסה עיכול אנזימטי המכיל בינוני 5 מ"ל לשטוף עם 0.25% טריפסין + 1X DNase אני צינור חרוטי 15 מ"ל.
- מניחים את הצינור בתוך אמבט מים ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות, עם היפוך עדין לסירוגין של הצינור פעם אחת בכל 5 דקות.
- לאחר 25 דקות, להסיר בזהירות את פתרון האנזים בעזרת פיפטה פלסטיק כף יד על ידי שאיפה. הוסף בינוני לשטוף חם ל -10 מ"ל לשטוף בעדינות את הרקמה על ידי היפוך לאט הצינור 5 פעמים. הסר בינוני לשטוף, ולהוסיף 10 בינוני מ"ל לשטוף שוב לשטוף נוספים.
- הסר בינוני לשטוף, ולהוסיף 3 מ"ל של מדיום חם לשטוף טרי שוב. לנער את הצינור ביד בקפדנות במשך 15 פעמים כדי לסלק את הנוירונים מתעכל מן הרקמה. המדיום צריך להיות עכור כאשר התאיםמחדש מופרדים מן הרקמה לתוך המדיום לשטוף. אסוף את ההשעיה תא צינור חרוטי 15 מ"ל חדש תוך השארת הרקמה הנותרת בצינור.
- להוסיף עוד 2 בינוני מ"ל Wash לרקמה, בעדינות להפריד את הרקמה הנותרת ידי triturating באמצעות פיפטה פלסטיק עבור ~ 15 פעמים. בואו לשבת במשך 5 דקות. פינת ההשעיה התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל חדש שמכיל שנאספו'לזעזע פעמי של התאים.
- לספור את הצפיפות של נוירונים עם hemocytometer. בדרך כלל, 3,000-5,000 תאים לכל microliter ניתן להשיג תלוי את מספר העוברים הגזורים. מספר ממוצע של 2.5 x 10 7 נוירונים נאמד אם בהנחת שש עוברים הם גזורים.
- חשב את נפח הדרושים של ההשעיה תא זה להניב צפיפות מ"ל 250,000 נוירונים / כאשר מתווסף בינוני תרבות 30 מ"ל השלם. להוסיף נפח זה אחד משני צינורות חרוטי המכיל 30 מ"ל בינוני תרבות שלמה להניב המדיום ציפוי נוירון צפיפות גבוהה. <li> העברת 1.2 מ"ל של תמיסת נוירון צפיפות גבוהה זה 30 מ"ל אחר בינוני תרבות שלמה להניב ריכוז של נוירונים ~ 10,000 / מ"ל. השתמש דילול זה לזרוע את coverslips בצפיפות נמוכה.
ציפוי 9. של נוירונים ארוך טווח משותף תרבות
- תביא את שני 24 גם צלחות עם תחתית חרוטה עבור נוירונים בצפיפות גבוהים לתוך מכסה מנוע תרבית תאים. סור 300 מדיום תנאי μl ידי ואקום. פלייט השעיות תא צפיפות 0.6 מ"ל גבוה ב 250,000 נוירונים / מ"ל.
- תביא את הצלחות שני 24 גם אחרות עם coverslips לתוך מכסה מנוע התרבות, ולהסיר 300 מדיום תנאי μl ידי ואקום. פלייט 0.6 מ"ל השעיות תא בצפיפות נמוכה ב 10,000 נוירונים / מ"ל על coverslips בתוך שני 24 גם צלחות.
- להחזיר את כל 24 גם ארבע הצלחות אל האינקובטור. בואו לשבת במשך שעה 2.
- תהפוך את coverslips בצפיפות הנמוך עם הדבקות נוירונים לתרבות בצפיפות הגבוהה. ודא הנוירונים זה מול זה (כלומר, nOT מופרד coverslip הזכוכית). ואז להחזיר את שתי צלחות עם שיתוף התרבות אל האינקובטור.
עמית תרבות 10. Sustaining
- Feed שיתוף תרבויות על ידי הוספת 300 μl בינוני Feed טרי (ראה חומרים) ביום במבחנה (DIV) 5. אין צורך להסיר 50% של מדיום תרבות שלם המקורי, כפי שדווח על ידי מחקרים רבים אחרים. מדיום ההאכלה גם מכיל 15 מיקרומטר arabinoside ציטוזין (Ara-C, להניב לריכוז סופי של 5 מיקרומטר) כדי לצמצם את הסיכוי של זיהום גליה ושגשוגם.
- בעקבות האכלה ראשונית זו, להוסיף 300 μl בינוני Feed טרי ללא ערה-C לבאר כל שבוע. האם התרבות להישמר במשך יותר מחודשת, להחליף מחצית הבינונית עם מדיום Feed טרי מדי שבוע מעבר לנקודת פעם אחת בחודש (עם חצי החלפת הבינוני הראשונה DIV33). מורפולוגית, הוא צפיפות גבוהה נוירונים בצפיפות נמוכה נראות בריאות עד שלושה חודשים (הזמן הארוך ביותר שנצפה על ידי experimenters).
איור 11. של Transfection Neuron צפיפות ניסיוני מניפולציה-נמוך
הערה: כאשר transfection בנוירונים בצפיפות הנמוכים הוא רצוי, פרוטוקול סידן פוספט פשוט יכול להיות מאומץ. מצאנו כי תרבויות בצפיפות נמוכה יש יעילות transfection טוב יותר עם פרוטוקול סידן פוספט לפני DIV12, אבל הם יכולים להיות transfected עם יעילות נמוכה בהרבה בבית DIV21 ומעלה, במהלכן הקוצים הדנדריטים הם בולטים. היתכנותו של transfection של הנוירון בצפיפות הנמוך התרבותי מודגמת על ידי transfecting נוירונים עם פלסמיד pEGFP-C3 (ראה להלן).
- בשעת DIV21, להסיר 600 μl מותנה בינוני מכל טוב של שיתוף התרבות, ולהעביר אותו לצלחת 24 באר חדשה. לאחר מכן להוסיף 600 μl בינוני Feed הטרי אל התרבות המשותפת להביא אותו בחזרה לנפח המקורי.
- מעבירים את coverslips לתוך צלחת 24 באר חדשה עם 600 μl מותנה בינוני. ודאנוירונים בצפיפות נמוכה כלפי מעלה. מניח את צלחות צפיפות הגבוהות הצלחות החדשות עם coverslips בחזרה בחממה.
- הכן שני צינורות 1.5 מ"ל סטרילי. בשנת צינור אחד, להוסיף 600 μl 2X HEPES שנאגרו מלוחים פתרון (HBS). חשב את נפח של 12 מיקרוגרם pEGFP-C3 DNA מבוסס על ריכוז פלסמיד. בצינור האחר, להוסיף 74 2 μl CaCl (2 מניות M) ואת נפח המים לאחר הוספת פלסמיד יגרום 600 μl. מערבבים היטב על ידי pipetting ולאחר מכן להוסיף פלסמיד דנ"א. לאט ומערבבים היטב. תן שני הצינורות לשבת במשך 5 דקות ב RT.
- בעוד אחיזת ידיים הצינור 2X HBS ובמתינות להסעיר את פתרון מיקסר, להוסיף את כל 600 μl הירידה פתרון ה- DNA-CaCl 2 אחר טיפה אל הצינור 600 μl 2X בהרוורד. זה קריטי, כי המשקע שנוצר הוא בצורת גרגירים 'חול דק'. ערבוב חזק מדי ומהר מדי אינה רצויה, שכן לא תהיה יותר סביר לייצר "משקעים flake' דמוי שלג גדול, whicיש h דראמטי יעיל transfection נמוך מבוסס על התצפיות שלנו.
- בואו המשקע ממשיכים להיווצר בחושך ב RT במשך 30 דקות.
- הוספת 100 μl המשקע היטב כל המכיל נוירון בצפיפות נמוכה על coverslips, טיפה אחר טיפה ובאופן שווה. מחזירים את הצלחת באינקובטור, דגירה במשך שעה 2. בהנחה שרוב CaCl 2 הוא בצורה חופשית, זו התוצאה ריכוז של ~ 17.6 מ"מ Ca 2 +, אשר עלולים להיות רעילים לנוירונים הבאים דגירה ממושכת.
- להכין צינור חרוטי 50 מ"ל עם ~ 50 בינוני מ"ל Wash, לחמם אותו על 37 מעלות צלזיוס.
- בסוף 2 שעות, להביא את נוירון בצפיפות נמוכה עם פוספט DNA סידן שוקע מכסה המנוע. תרימי כל coverslip הפרט עם פינצטה # 5 חד, ולטבול אותו שלוש פעמים המדיום 50 מ"ל לשטוף לשטוף אותו בקצרה. ואז להחזירו הנוירונים בצפיפות הגבוהים בצלחות שיתוף התרבות המקוריות, עם נוירונים בצפיפות נמוכים פונים כלפי מטה.
- המשך התרבות עדהנוירונים התרבות בצפיפות הנמוכים על coverslips נקצרים ללימודים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר צפיפות נמוכה במיוחד מוצלחת, לתרבות לטווח הארוכה של נוירונים glutamatergic הטהורים ללא הצורך של תאי גליה משמשים שכבת מזין. הפרוטוקול שרטט באיור 1, הכוללת הכנה של צפיפות גבוהה (על פולי- D- ליזין מצופה 24 בארות) ונוירונים בצפיפות נמוכה (על coverslips זכוכית מצופה poly-D- ליזין) בנפרד, ואת שיתוף התרבות שלאחר מכן שיכולה להישמר עד שלושה חודשים.
דמויות 2 א ו -2 הם איורים של צפיפות גבוהה נוירונים נמוך צפיפות בבית 5 ימים לאחר ציפוי. תרבות צפיפות נמוכה היא כ -30 לקפל פחות בצפיפות. נוירונים שניהם עוברים שלבי התפתחות טיפוסיים כפי שתואר על ידי Kaech ובנקאי (2006). באותו היום 14, הוא צפיפות גבוהה נוירונים בצפיפות נמוכה להראות מבנים הדנדריטים משוכללים, כפי שעולים תמונות DIC (2C הדמוי,D, לב הוא הלוחות הם מאותו השדה עם מטוסי מוקד שונים, כפי שמוצגים על ידי המיקום של לחרוט). כאשר הנוירונים האלה מגואלות נוגדנים MAP2 לחשוף את דנדריטים, לא נמצא הבדל משמעותי במספר של דנדריטים (t 13 = 1.27, p> 0.05; נמדד לפי מספר טיפ הדנדריטים) ואורך הדנדריטים הכולל (t 16 = 1.41, p> 0.05 לכל נוירון) בין צפיפות גבוהה נוירונים בצפיפות נמוכה נמצאים (איור 2E, F).
תיוג Immunocytochemistry משמש כדי לחשוף סינפסות glutamatergic פונקציונלית. אנו משתמשים צביעה כפולה לתייג למקטע הקולטן NMDA NR1 ואת למקטע קולטן AMPA GluR1 (איור 3 א), וסינפסות תפקודית (puncta-מקומי שיתוף בצהוב) ניתן לזהות בקלות לכמת באמצעות ImageJ. נוירונים בצפיפות נמוכה גם מסומנים עם נוגדנים נגד MAP2 סמן חלבון הדנדריטים,בשילוב עם p-טאו סמן חלבון אקסונלית. תיוג פעמים זה מאפשר הבחנה ברורה של דנדריטים אקסונים (איור 3 ב). תרבויות צפיפות נמוכה יכולה גם להיות transfected בהצלחה עם פלסמידים DNA בשיטות סידן פוספט, אם כי קצב transfection הוא בדרך כלל נמוך מאוד בשלבים מאוחרים יותר (<0.2 נוירונים% כאשר transfected ב DIV21). איור 3 ג ממחיש כי transfection EGFP יכול לחשוף מורפולוגיה העצבית, ו לדקלם מבני עמוד שדרה הדנדריטים בסדר גלויים. לבסוף, כמו הוכחה של קונספט, נוירונים צפיפות נמוכה במיוחד ניתן לגדל בתנאים המקדמים autapse היווצרות (איור 3D). נוירונים autaptic צפיפות נמוכה במיוחד אלה גדל על 'מיקרו-איי' מצופה פולי- D- ליזין יכול להיגרם נוירון מזין צפיפות גבוהה מעבר 2 חודשים עם פרוטוקול שיתוף תרבות זו.
<E16.5-E17.5 strong> באיור 1. איור סכמטי של צפיפות גבוהה פרוטוקול שיתוף התרבות בצפיפות נמוכה. (א) העכבר המוח העובריים נאספים, hippocampi הם גזור החוצה מתעכל עם טריפסין. (ב) מתעכל hippocampi נשטפים, מתחלק נוירונים בודדים, מצופה בצפיפות גבוהה (250,000 תאים / מ"ל) ב -24 צלחות היטב; בינתיים, בצפיפות נמוכה (10,000 תאים / מיליליטר) נוירונים הם מצופים על coverslips. הבארות לתרבות בצפיפות גבוהה חקוקות עם מחט מזרק 18 G לספק תמיכה גבוהה עבור coverslips. (ג) איור של שיתוף התרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. שניהם צפיפות גבוהה נוירונים בצפיפות נמוכה יש שיתוף פיתוח מורפולוגיים mparable ב שיתוף תרבות. (A, B) Photomicrographs מראה צפיפות ציפוי של שני צפיפות גבוהה שכבה בצפיפות נמוכה. (C, D) תמונות DIC מראה צמיחה neurite נרחב בשני גבוהה (C) בצפיפות נמוכה (D) נוירונים. הנוירונים בצפיפות נמוכה על coverslip נחים ממש מעל נוירונים בצפיפות גבוהה. שים לב למיקום של תמיכת פלסטיק הגבוהה. (E) תיוג Immunocytochemistry של MAP2 חלבון הדנדריטים. (F) כימות (ממוצע ± SEM) של אורך הדנדריטים הכולל ומספר קצה הדנדריטים לכל נוירון. לא נמצא הבדל משמעותי (NS) נתפס בין צפיפות גבוהות נוירונים בצפיפות נמוכה גדלו שיתוף תרבות. סרגל קנה מידה (ב ', ד'), 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
FO: keep-together.within-page = "1"> 
איור 3. מניפולציות ניסוייות של נוירונים בצפיפות נמוכים גדלו שיתוף תרבות. (א) תיוג Immunocytochemistry בתרבות בצפיפות נמוכה מאפשר זיהוי של סינפסה פונקציונלי מוגדר על ידי שיתוף תיוג של GluR1 (ירוק) NR1 (אדום). (ב) Co-תיוג של (מג'נטה) MAP2 חלבון הדנדריטים העצבי וחלבון אקסונלית p-טאו (ירוק). (C) תא עצב בהיפוקמפוס בצפיפות נמוכה טרנספקציה עם פלסמיד pEGFP-C3, מראה הקוצים הדנדריטים פזרני. (ד) תא עצב צפיפות נמוכה מוכן על פולי- D- ליזין '-האי מיקרו', גדל על גבי נוירונים בצפיפות גבוהה. אלקטרודה תיקון הקלטה ממלאת הנוירון עם hydrazide Alexa-555 כדי לחשוף את המורפולוגיה של הנוירון. סרגל קנה מידה של מחלת אלצהיימר, 20 מיקרומטר.7fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבות לטווח ארוך של נוירונים glutamatergic אולטרה-נמוך צפיפות בהיפוקמפוס בתנאים חופשית בסרום. ב ~ 2000 נוירונים / 2 ס"מ, הצפיפות היא לפחות שני לקפל נמוך יותר מאשר ברוב ההכנות תרבות 'צפיפות נמוכה "עם או בלי תמיכה גליה שדווח על ידי הספרות הקיימת 2,3,11,13,14. בנוסף להיותו צפיפות נמוכה במיוחד, פרוטוקול זה הוא רומן ומשמעותי בשתי דרכים יותר. ראשית, אין שכבת מזין גליה נדרשת כמו הנוירונים בצפיפות הנמוכים להשיג תמיכת גורם trophic מן הנוירונים בצפיפות הגבוהים, כי הם בתוך קרבה פיזית קרובה, למרות שאין קשרים סינפטיים או מגע ישיר בין נוירונים בתרבית בצפיפויות שונות. פרוטוקול זה מבטל את הצורך בהכנה בשכבת גליה לקראת ניסויי התרבות המתוכננים, ומאפשר הוא צפיפות גבוהה תרבויות בצפיפות נמוכות לגדול בו זמנית. הכין בשכבת גליה יכול להימשך זמן רב ואניספרות aborious, ורוב משתמשת הקורטקס גור עכברוש בילוד 2. לכן, עבור מעבדות שעובדות עם עכברים בלבד, זה דורש מאמצים נוספים בהיקפים ניכרים. יתרה מכך, בניסויים שבם מנגנונים ספציפיים עצביים נחקרים, בנוכחות גליה בתרבות השיתוף יכולה להיות רצויה, משום שהוא מונע תופעות שנצפו ייחוס ספציפי נוירונים, גליה או האינטראקציה בין שני סוגי תאי 10. בנוסף, לתרבות גליה, תוספת סרום הוא 2,15 חובה, וזה עלול לזהם את שיתוף תרבות גליה-נוירון להציג לערפלנים נוספים. תכונה חשובה אחת של הפרוטוקול שלנו היא כי שיתוף התרבות היא בתנאים בינוניים מוגדרים. אנחנו בהחלט להשתמש במדיום תרבות שלמה ללא תוספת סרום, ולמצוא שאם לוח הזמנים חילופי בינוני התרבות אחריו בקפדנות, את תרבות שיתוף יכול להתקיים מעבר לשלושה חודשים, אשר אמור לספק את רוב הניסויים. כי אין כמעט שוםנוכחות גליה, מגבלה אחת של טכניקה זו היא כי יש להיזהר בעת עריכת השוואות עם התוצאות של ספרות המשתמשות שיתוף תרבויות גליה-נוירון.
היבט נוסף רומן של פרוטוקול זה הוא שאנחנו להשתמש בשיטה פשוטה כדי ליצור מרחב מייקרו יעיל בין הנוירונים בצפיפות הגבוהים גדלו על החלק התחתון של צלחת 24 היטב, הנוירון בצפיפות הנמוך הדבק coverslips הזכוכית היא יושבת בדיוק מעל. מחקרים קודמים משתמשים נקודות פרפין להחיל את coverslips מצופה להעלות את coverslips ב ~ 500 מיקרומטר מעל שכבת מזין גליה 2,8,9. הכנת נקודות פרפין דורשת בגודל הנכון בטמפרטורה נכונה, אשר דורש כמות סבירה של מאמצים ותרגול. לשם השוואה, תחריט פשוט על חלקי הפלסטיק התחתון גם עם מחט 18 G מספק תמיכה עבור coverslips כמו גם הפרדה טובה בין שתי השכבות של נוירונים. השתמשנו במתקן הקלטת תיקון מהדק עם מד Z דיגיטלי, כדי לקבוע ליןשטח אוזן בין שתי שכבת נוירונים ידי התמקדות הצפיפות הגבוהה ולאחר מכן על השכבות בצפיפות הנמוכות באמצעות מטרת טבילה במי 60X, ומוצא כי החלל הוא בדרך כלל 150-200 מיקרומטר (179.4 +/- 25.3 מיקרומטר, n = 5 ). מרחב צר זה (בהשוואה לזה שנוצר על ידי נקודות שעווה) עשוי לתרגם עלייה מהירה יותר, וריכוז גבוה של גורמי neurotrophic, ולכן מתן תמיכה מספקת עבור הנוירון בצפיפות הנמוך לגדול. למרות החלל הצר הזה עשוי להעלות שאלות על שער הדולר בינוני תרבות והאם בחלל הקטן יותר מעכב נוירונים מלקבל חמצן תמיכה תזונתית, התוצאות שלנו מראות כי זה לא סביר דאגה. נהפוך הוא, מצאנו כי נוירונים צפיפות גבוהה תחת coverslips גם לגדול טוב יותר (שיעור הישרדות גבוה, עץ הדנדריטים משוכלל יותר puncta הסינפטי יותר על ידי מכתים NR1, מידע לא מוצג) לעומת הנוירונים בצפיפות גבוהה מאותה הכנה אבל בלי שכיסה coverslips. לכן, פרוטוקול פשוט זה לא רק מהיר, פשוט, אבל גם יעיל מאוד בשמירה היא צפיפות גבוהה נוירונים בצפיפות נמוכה.
Culturing נוירונים בהיפוקמפוס במבחנה דורש ציפוי של מצעים בקידום צמיחה, כגון פולי-D- ליזין ו / או laminin / קולגן 5,16. למרות בחירה הכנה מדוקדקות של coverslips הזכוכית היא קריטיות להישרדות עצבית יעילה, מצאנו כי עם מכסה הזכוכית בחרנו, ניקיון יסודי עם אתנול 70% מספיק, ובכך מבטל את הצורך של טיפול קשה (למשל, רותח בחומצות) של coverslips. לאחר coverslips מנקה באתנול וייבש ואקום, הזכוכית נראית להידרופוביים בשל הציפוי המקורי. עם זאת, ציפוי מוצלח של 0.1 מ"ג / פולי-D- ליזין מיליליטר חיץ borate צריך לעבד את הידרופילי משטח זכוכית, כך שכאשר coverslips נאספת ממי הכביסה, שכבה אחידה של מים, כי הוא שווהניתן לצפות מתפשטים ברחבי משטח הזכוכית כולו. מצאנו כי זה חשוב ביותר. אחרת הנוירונים סביר להניח למות לאחר ציפוי בשל ציפוי מספיק. למרות נוירונים בהיפוקמפוס בצפיפות נמוכה רק נבדקים בפרוטוקול זה, צפוי כי סוגי נוירונים אחרים (למשל, נוירונים בקליפת המוח, הנוירונים גרגיר cerebellar, או אוכלוסיות עצביות מיוחדות) יכולים גם להתקיים בצפיפות נמוכה בנוכחות מזינה נוירון צפיפות גבוהה שִׁכבָה. לבסוף, כאשר הפרוטוקול פשוט הזאת הוא הלך, אפשר לצפות לקצור נוירונים צפיפות נמוכים במיוחד בריאים. יישומים רחבים כגון תיוג immunocytochemistry, הדמיה לחיות, מחקרים מורפולוגיים הקלטת אלקטרופיזיולוגיה יכולים כל להתנהל על נוירונים אלה בעקבות הליכים סטנדרטיים 16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. Cultureing Nerve Cells. , 2nd edition, 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
