Abstract
Dyrking primære hippocampus nevroner in vitro letter mekanistisk avhør av mange aspekter av neuronal utvikling. Dissosierte embryoniske hippocampale neuroner kan ofte vokse med hell på dekkglass ved høy tetthet under serumfrie betingelser, men kulturer med lav tetthet vanligvis krever en tilførsel av trofiske faktorer ved ko-dyrking av dem med en gliaceller mater lag, fremstilling av disse kan være tidkrevende og arbeidskrevende. I tillegg kan tilstedeværelsen av gliaceller forvirre tolkning av resultater og være til hinder for studier av neuron-spesifikke mekanismer. Her er en forenklet fremgangsmåte presentert for ultra-lav densitet (~ 2000 neuroner / cm 2), lang sikt (> 3 måneder) primære hippocampale nervecelle kultur som er under serumfrie forhold og uten glia celle støtte. tetthet neuroner lave dyrkes på poly-D-lysin-belagte dekkglass, og vendt på nerveceller med høy tetthet dyrket i en 24-brønns plate. I stedet for å bruke parafin punkter for å skape et mellomrom between de to nevrale lag, kan forskere bare etse plast bunnen av brønnen, på hvilke de høye neuroner tetthet bor, for å skape en MICRO bidrar til neuronvekst lav tetthet. Den ko-kulturen kan lett opprettholdes i> 3 måneder uten betydelig tap av neuroner lav densitet, noe som letter den morfologiske og fysiologiske studium av disse neuroner. For å illustrere dette vellykket kulturen tilstand, data gitt for å vise rikelig synapse formasjonen i cellene lav tetthet etter langvarig kultur. Dette co-kultur system forenkler også overlevelsen av spredte enkeltnerveceller dyrket i øyene i poly-D-lysin underlag og dermed dannelsen av autaptic tilkoblinger.
Introduction
Økende hippocampus-neuroner under in vitro betingelser muliggjør observasjon og eksperimentell manipulasjon av disse neuroner som ellers ikke er mulig in vivo. Dette eksperimentell tilnærming er mye brukt for å avsløre nevronale mekanismer for vekst, polaritet, neuritt-spesifikasjon, handel og subcellulær lokalisering av proteiner, synapse formasjon og funksjonell modning 1. Disse in vitro-dyrkede hippocampale neuroner, når høstet fra sene embryonale stadier, er forholdsvis rent (> 90%) glutamaterge celler av pyramideformet morfologi 2. Fordi neuroner ble dyrket i en 2-D overflate under in vitro-betingelser, gir denne metode lett observasjon, slik som levende avbildning eller immunocytokjemi (ICC) farging gjennom et enkelt fokusplanet 3; eller manipulasjoner, som medikamentell behandling og trans 3-6. Når vokst med høy tetthet, nevroner tendens til å ha høy forekomst av overlevelse på grunn av høyere concentrations av utskilt vekstfaktorer i tillegg til næringsmiddel støtte fra vekstmediet, og også på grunn av neurite kontaktavhengige mekanismer 7. Imidlertid lav densitet hippocampale neuroner er ønskelige for morfologiske studier, hvor en enkelt neuron kan avbildes i sin helhet eller farget for ICC analyse. Tetthet neuroner lav er vanskelig å opprettholde i kultur grunn av manglende støtte parakrin og således krever ofte trofisk støtte fra en glial (typisk kortikale astrocytt) mater lag, som må fremstilles før neuron kultur 2. Når ko-dyrket med en glial cellemater lag, blir neuroner lav tetthet dyrket på dekkglass, og deretter snudd på toppen av gliaceller lag slik at neuroner og glia lav densitet er vendt mot hverandre. En liten begrenset plass mellom gliaceller og nevroner er skapt ved å plassere parafinvoks prikker på hjørnene av dekkglass, derfor skape en "sandwich layout 2,8,9. Nervecellene lav tetthet vil vokse wTVen på det trange rommet mellom gliaceller og dekkglass, som skaper en ettergivende mikromiljøet med konsentrerte faktorer utskilles av nevroner og gliaceller. Denne tilnærmingen gir lav tetthet, fullt utviklede nevroner som er fordelt rimelig hverandre, derfor legge til rette for ICC merking eller levende bildediagnostikk.
En åpenbar ulempe med neuron-glia ko-kultur, bortsett fra å være tidkrevende og arbeidskrevende, er at det hindrer studie av neuron-spesifikke, eller celle-autonome, mekanismer. Selv om dette systemet er langt mindre komplisert enn in vivo nevrale vev, gliaceller innvirkning på neuron utvikling gjennom utskilt, ikke-ennå-fullt-definerte faktorer kan forvirre forsøkene 10. Derfor, i eksperimenter som krever undersøkelse av nervecellen spesifikke mekanismer, definerte dyrkningsbetingelser som fjerner serum og glial bærersjikt er nødvendige. En tidligere studie har lykkes i å dyrke lave konsentrasjoner av nerveceller (~ 9000 celler / cm 2) ved hjelp av en three dimensjonal hydrogel matrise 11. Siden et relativt rent neuronal populasjon kan bli dyrket til høy tetthet i henhold til serum-frie betingelser uten glial støtte, hypoteser om vi at ultra-lav tetthet av hippokampale neuroner kan bli dyrket i serumfritt definert kulturmedium ved ko-dyrking av dem med nerveceller med høy tetthet, i en måte som er analog med den konvensjonelt innført neuron-glia ko-kulturen. Faktisk har høy tetthet hippocampus nevronkulturer i en "sandwich konfigurasjon nylig blitt brukt til å støtte et lite antall spesialiserte magnocellular endokrine nevroner 12.
Derfor kan ko-kultur med nevroner høy tetthet tillate nerveceller med lav tetthet for å motta trofiske faktorer støtte som er tilstrekkelig for å muliggjøre langvarig overlevelse. Denne protokollen av dyrknings nevroner ultra-low density ble dermed formulert og validert. Protokollen kan gjennomføres innenfor en enkelt eksperiment, ved å fremstille med høy tetthet (~ 250.000 celler / ml) disassosieres hippocampale neuroner først, og deretter å lage en fortynning for å gi en tetthet ~ 10000 neuroner / ml (~ 3000 neuroner / dekkglass, eller ~ 2000 neuroner / cm 2), som er mye lavere enn de rapportert lav tetthet kulturer 2,3,9 , 11,13. Denne kulturen tilstanden er løst referert til som "ultra-low density" kultur og brukes med "low-density" inter-changeably. Neuronene med høy tetthet blir sådd ut på poly-D-lysin-belagte 24-brønners plater; mens neuronene lav densitet blir sådd ut på poly-D-lysin-belagte 12 mm dekkglass som er plassert inne i en annen 24-brønns plate. Glassene med holde tetthet nevroner lave snudd på toppen av nevroner høy tetthet 2 timer senere etter nervecellene stammer og festet til Dekk. I tillegg, i stedet for å bruke parafinvoks punkter for å heve glassene over høy tetthet neuron lag, ble en 18 G nål sprøyte som brukes for å etse bunnen av de 24 brønners plater med to parallelle striper. Den resulterende displAced, tilstøtende plast gir en forhøyet støtte for dekkglass. Denne plassen er konsekvent målt ved 150-200 nm, noe som gir tilstrekkelig oksygen og dyrkingsmedium utveksling samtidig som det gir en mikromiljøet med konsentrerte trofiske faktorer. Under denne tilstanden, nervecellene lav tetthet vokse mye, og kan overleve utover tre måneder i kultur. Når disse nevronene blir tilført med GFP plasmid etter tre uker i kultur, er dendritter voldsomt besatt med dendrittutløperne. Som et bevis på prinsipp, blir data presentert for å vise at dette samarbeidet kultur Systemet støtter tetthet kulturer av hippocampus nevroner seeded på poly-D-lysin 'mikro-øyenes, hvor nervecellene danner autaptic forbindelser som kan fremme undersøkelse av celle ultra-lav -autonomous, nettverksuavhengig mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer mus ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Arizona, og likedannet NIH retningslinjer.
1. Tissue kilde for hippocampus Neuron Kultur
- For å generere prenatal museunger for hippocampus nevron kultur, bruke tids drektige mus (C57BL6 / J) som er avlet i huset 17. Dagen med vaginal plug påvisning er utpekt som E0.5. Den planlagte innhøstingen for kultur er E16.5-E17.5.
Merk: Denne protokollen beskriver kulturer av to 24-brønns plater av to nerveceller med høy tetthet ko-dyrking med nerveceller med lav tetthet (48 dekkglass totalt). For flere plater, materialer og reagenser kan skaleres tilsvarende.
2. 24-brønners plater klargjøring for High Density Neuron kulturer
Merk: Utfør følgende trinn (2-3) dagen før planlagt høsting av embryoer.
- Ta med to 24 godtplatene inn i cellekultur panseret, åpne den individuelle emballasje.
- Koble en 18 G sprøyte nål til en 1 ml plast engangssprøyte.
- Hold sprøyten, og tar sikte på nålespissen ved ~ 1 mm til venstre for midten av bunnen av brønnen. Anvende moderat kraft (~ 250 g) for å etse bunnen av brønnen (~ 1 mm). Et spor vil bli dannet, og de plastmaterialer forskyves vil danne en opphøyet støtte over den flate bunn brønnoverflaten. Etse en annen ~ 1 mm lange parallelle spor på ~ 1 mm til høyre for midten av bunnen på en lignende måte.
- Gjenta dette trinnet for alle brønnene på de to 24-brønners plater. De to 24-brønns plater som brukes til tetthet kultur høy er nå klar for belegning med poly-D-lysin (se trinn 3.8 nedenfor).
3. Dekk Forberedelse til lav tetthet Neuron kulturer
- Bruker 12 mm diameter # 1 runde glass.
- Plasser 50 Dekk inne i en 100 mm diameter steril plast petriskål, og senk Dekki 20 ml 70% etanol-løsning. Plasser denne petriskål på en roterende plattform med moderat (70 rpm) hastighet rotasjon i en time. Fjern 70% etanol og deretter erstatte med en ny ladning med 70% etanol. Roter og vaske for en time.
- Kast 70% etanol rengjøringsmiddel. Legg sterilt vann (filtrert gjennom 0,2 um filter enhet). Skyll glassene grundig ved dreining av petriskålen for hånd. Skyll tre ganger, hver gang erstatte med friskt sterilt vann.
- Sett petriskål med dekkglass inne i en steril cellekultur hette med laminær strømning. Aspirer skyllevannet gjennom vakuum linje, og legge til 10 ml filtrert sterilt vann til å dyppe glassene. Dekkglass bør være sterile og overflaten må være ren nok for poly-D-lysin belegg.
- Åpne to 24-brønners plater fra sine individuelle pakking, og plassere dem i panseret.
- Slå på vakuum linjen i panseret. Koble til en 200 mL pipette tips til vakuum linje, og bruk en SCISsor å kutte spissen for å skape en større åpning.
- Bruk en fin-spiss # 5 pinsett for å plukke opp dekkglass fra petriskålen, en om gangen, og bruke vakuum linje for fullstendig å tørke dekkglass. Deretter plasserer en dekkglass i hver av brønnene i 24-brønns plate. De 50 rensede Glassene bør være nok til å fylle hver av brønnene i de to 24-brønns plater.
- Fortynn poly-D-lysin stamoppløsning (1 mg / ml) inn i arbeidsløsning (0,1 mg / ml) med boratbuffer (pH 8,5). For de fire 24-brønners plater (inkludert to high density plater med etset bunn), fremstille 30 ml total arbeidsoppløsning.
- Tilsett 300 ul 0,1 mg / ml poly-D-lysin arbeid løsning til hver brønn sammen med dekkglass. Sørg glassene er helt oppslukt i løsningen. Hvis ikke, bruk pinsett tips # 5 å trykke ned dekk mot bunnen av brønnen, og bruk spissen for å lede poly-D-lysin løsning for å dekke hele overflaten av dekkglass. Inspiser alle glassene for å gjøre sure ingen luft ble fanget mellom platen og Dekk.
- Tilsett 300 ul 0,1 mg / ml poly-D-lysin arbeid løsning til hver brønn av den høye tettheten kulturplaten med etset bunn. Dreie for hånd for å spre løsningen for å dekke hele bunnen av brønnen.
- Returnere alle de fire platene med poly-D-lysin til kultur inkubator, og inkuber O / N.
4. Vask og Pre-condition tallerker Culture
Merk: Følgende trinn (4-9) blir utført på dagen av vev innhøsting.
- Etter inkubasjon / belegg av dekkglass og 24-brønners plater O / N, bringe alle fire platene (to med donor dekkglass, to akseptor med høy densitet, plater med etsede plastbunn) i kulturen hette. Bruke vakuumlinjen for å fjerne poly-D-lysin løsning.
- Umiddelbart etter fjerning av poly-D-lysin løsning, tilsett ~ 1 ml sterilt vann til hver brønn ved anvendelse av en plast overføring pipette. Etter fylles alle brønnenemed vann, la stå i 10 min. Fjerne vann ved hjelp av vakuum, og deretter legge til 300 ul vaskemediet i hver brønn for å dekke bunnen av brønnen (med eller uten dekkglass). Ikke la poly-D-lysin belegg tørke ut.
- Returnere alle fire plater til celleinkubator. Platene er klare til bruk når de dispergerte hippocampus nevroner er forberedt.
5. Utarbeidelse av Komplett Kultur Medium, og Trypsin Løsning for enzymatisk fordøyelse
- Fremstille 60 ml komplett kulturmedium ved blanding av bestanddelene (se Materials). Bruke en 50 ml sprøyte forbundet med et 0,2 um porestørrelse-sprøytefilter, filtrere komplett kulturmedium inn i to 50 ml koniske rør. Hvert rør inneholder 30 ml komplett kulturmedium.
- I en separat 50 ml konisk rør, tilsett ~ 30 ml Wash medium (se Materials) og varme den opp til 37 ° C. Dette vil bli anvendt for å vaske vevet etter enzymatisk oppslutning.
- Forbered enzymet fordøyelsen medium. I en 15 ml konisk rør, tilsett 4,5 ml Wash medium og 0,5 ml 2,5% trypsin løsning, og 50 ul 100X DNase I.
- Sette hele kulturmediet, Wash medium, og enzymoppslutning medium i et 37 ° C vannbad.
6. Utarbeidelse av kirurgiske verktøy
- Steriliser alle kirurgiske verktøy i en steriliseringspose: to små saks, en pinsett og to # 5 pinsett.
7. Fjerning av Brains fra E16.5-E17.5 mus embryoer, og Disseksjon av Hippocampi
- Fremstille to 10 cm Petri-skåler fylt med is-kald, steril Hanks balanserte saltløsning (HBSS).
- Avlive mus dam med en intraperitoneal injeksjon av natrium-fenobarbital (100 mg / kg i et volum på ~ 0,5 ml). Etter injeksjon, når demningen mister respons på tå klype, ofre med halshugging.
- Spray demningen mage-område med 70% etanol, og lage en to-cm langt innsnitt langs midtlinjen av magen for å eksponerelivmoren.
- Fjern embryoene og plassere enkelte varer i 10 cm diameter petriskål med kaldt dissekere HBSS buffer.
- Hold embryo ved halsen ved hjelp av en pinsett, og bruke en liten saks til å gjøre det første kuttet rett i midtlinjen under lillehjernen nivå og del på hjernevevet. Ikke halshogge embryo.
- Sett side tuppen av den lille sakse fra kaudal region som er kuttet åpen rett, hele veien gjennom den rostrale del av den embryonale hjernen (ikke på tvers av midtlinjen), og et snitt på venstre side på nivå med skallebasis.
- Sett venstre saksespissen siden på nytt for å gjøre et kutt på høyre side. La et smalt bånd av uskåret skallebenet og hudvev ved rostrale enden, slik at hele hjernen kan vippes til side for lett uttrekking.
- Bruk tuppen av sakse å øse ut embryonale hjernen inn i HBSS løsning. Inspiser hjernen under et dissekere mikroskop. Hjernen skal være intakt uten brutto cut-off regioner.
- Gjenta disse trinnene for å samle alle embryo hjerner.
- Samle alle de intakte hjerne i en ny petriskål inneholder 20 ml kald HBSS buffer. Plasser petriskål under et mikroskop disseksjon.
- Vis hjernen fra ventral side. Mens du holder nede hjernen med pinsett på caudal slutten, setter et skarpt # 5 pinsett diagonalt for å gjøre et kutt mellom midten rostralt punkt og hale-tinning. Gjenta dette for den andre halvkulen. Etter å kutte, separat to halvkuler med intakt hippocampus fra resten av hjernen stamceller.
- Gjenta dette for hver av hjernen.
- Pool alle dissekert halvkuler, og fjerne hjernehinnene som bruker to par # 5 pinsett.
- Identifisere utviklings hippocampus som en buet struktur som er brettet i tinninglappen. Alternere de to par av pinsetter for å skille hippocampus fra tilstøtende kortikale vev. Samle og bassenget hele hippocampi vev (se figur 1).
8. Enzymatisk fordøyelse, separat i single nevroner
- Ved hjelp av en plast overføring pipette, overføre all dissekert hippocampi inn i den enzymatiske fordøyelse oppløsning inneholdende 5 ml Wash-medium med 0,25% trypsin + 1X DNase I i et 15 ml konisk rør.
- Plasser røret inne i et vannbad og inkuber ved 37 ° C i 25 min, med intermitterende milde inverterende av røret en gang i hver 5 min.
- Etter 25 min, forsiktig fjerne enzymet løsning ved hjelp av en håndholdt plast pipette ved aspirasjon. Legg varm Wash medium til 10 ml og vaskes forsiktig vevet ved sakte røret ble snudd 5 ganger. Fjern Wash medium, og tilsett 10 ml Wash medium igjen for en ekstra vask.
- Fjern Wash medium, og tilsett 3 ml fersk varm Wash medium igjen. Rist røret for hånd strengt til 15 ganger for å fjerne de fordøyde neuroner fra vevet. Mediet bør bli grumsete når cellene enre adskilt fra vevet inn i vaskemediet. Samle cellesuspensjonen i en ny 15 ml konisk rør og samtidig la den gjenværende vev i røret.
- Legg til en annen 2 ml vaskemedium til vevet, og forsiktig skille gjenværende vev ved triturering gjennom en plastpipette for ~ 15 ganger. La sitte i 5 min. Pool cellesuspensjonen inn i den nye 15 ml konisk rør som inneholder samlet 'riste-off' celler.
- Telle tettheten av nerveceller med et hemocytometer. Vanligvis kan 3,000-5,000 celler pr mikroliter oppnås, avhengig av antall embryoer dissekert. En gjennomsnittlig antall på 2,5 x 10 7 nevroner er beregnet hvis forutsatt seks embryoer blir dissekert.
- Beregne volumet som trengs av denne cellesuspensjon for å gi en tetthet på 250.000 neuroner / ml når de tilsettes til 30 ml komplett kulturmediet. Legg dette volumet til en av de to koniske rør som inneholdt 30 ml komplett kultur medium til å gi den høye tettheten neuron pletteringsmedium. <li> Overfør 1,2 ml av denne høye tetthet neuron løsning til en annen 30 ml komplett kulturmedium for å gi en konsentrasjon på ~ 10.000 nevroner / ml. Bruk denne fortynningen til frø low-density Dekk de.
9. Plating av nevroner og Long Term Co-kultur
- Bringe de to 24-brønns plater med etset bunner for nerveceller med høy tetthet og i cellekultur hette. Fjern 300 mL forutsetning medium ved hjelp av vakuum. Plate 0,6 ml med høy densitet cellesuspensjoner ved 250000 nevroner / ml.
- Ta med de to andre 24-brønners plater med dekkglass i kulturen hette, og fjerne 300 mL forutsetning medium ved hjelp av vakuum. Plate 0,6 ml lavdensitets-cellesuspensjoner ved 10.000 neuroner / ml på objektglassene inne i to 24-brønns plater.
- Returnere alle fire 24-brønners plater til inkubatoren. La sitte i 2 timer.
- Flip med lav densitet Dekkglass med holde nerveceller i kultur med høy tetthet. Pass på at nervecellene står overfor hverandre (dvs. not atskilt av dekkglass). Gå deretter tilbake de to platene med co-kultur til inkubatoren.
10. Co-kultur Opphold
- Fôr co-kulturer ved å legge 300 mL frisk feed medium (se Materials) på dag in vitro (DIV) 5. Det er ikke nødvendig å fjerne 50% av opprinnelig Komplett Kultur medium, som rapportert av mange andre studier. Tilførsels medium også inneholder 15 uM cytosin-arabinosid (Ara-C, til å gi en endelig konsentrasjon på 5 uM) for å minimalisere sjansen for glia forurensning og proliferasjon.
- Etter denne startfôring, tilsett 300 mL frisk feed mellom uten Ara-C til brønnen hver uke. Dersom kulturen holdes i mer enn en måned, erstatte halvparten av mediet med friskt næringsmedium hver uke utover en måned tidspunkt (med den første mellom halv-erstatning ved DIV33). Morfologisk, både høy tetthet og tetthet nevroner lave se sunn inntil tre måneder (lengst tid observert av experimenters).
11. Illustrasjon av en eksperimentell manipulasjon-lav tetthet Neuron Transfeksjon
Merk: Når transfeksjon i nevroner lav tetthet er ønsket, kan en enkel kalsiumfosfat protokollen bli vedtatt. Vi har funnet at kulturer med lav tetthet har bedre transfeksjonseffektivitet med kalsiumfosfat-protokoll før DIV12, men de kan bli transfektert med mye lavere effektivitet ved DIV21 eller eldre, i løpet av hvilken tid dendrittutløperne er fremtredende. Muligheten for transfeksjon av de dyrkede nervecellen med lav densitet er illustrert ved å transfektere neuroner med en pEGFP-C3-plasmid (se nedenfor).
- På DIV21, fjerne 600 mL klimaanlegg medium fra hver brønn på co-kultur, og overføre den til en ny 24-brønns plate. Deretter legger 600 mL frisk feed medium til co-kultur for å bringe den tilbake til den opprinnelige volum.
- Overfør glassene i den nye 24-brønns plate med 600 ul kondisjonert medium. Sørg for atnevroner lav tetthet vender oppover. Plasser de høye plater tetthet og de nye platene med dekk tilbake i inkubatoren.
- Forbered to 1,5 ml sterile rør. I en tube, tilsett 600 ul 2X HEPES-bufret saltvann (HBS) løsning. Beregn volum av 12 ug pEGFP-C3 DNA basert på plasmid konsentrasjon. På den andre røret, tilsett 74 ul CaCl2 (2 M lager) og volumet av vann som etter tilsetning av plasmidet vil gjøre 600 pl. Bland godt ved pipettering og deretter legge plasmid DNA. Sakte bland godt. La begge rør sitte i 5 min ved RT.
- Mens hånd holder 2X HBS rør og moderat risting av løsningen på en mikser, tilsett alle de 600 mL løsningen dråpe DNA-CaCl 2 for dråpe til 600 ul 2X HBS tube. Det er viktig at det dannede bunnfall er i form av "fin sand 'granuler. Blanding for sterk og for fort er ikke ønskelig, siden det vil mer sannsynlig produsere store "snø flake' lignende utfellinger, hh har dramatisk lavere transfeksjon effektivitet basert på våre observasjoner.
- La utfellingen fortsetter å dannes i mørket ved romtemperatur i 30 minutter.
- Tilsett 100 mL Fallet til hver brønn som inneholder lav tetthet nevron på glassene, dråpe for dråpe og jevnt. Returnere platen til inkubator, og inkuber i 2 timer. Forutsatt at det meste av CaCl2 er i fri form, resulterer dette i en konsentrasjon på ~ 17,6 mM Ca2 +, som kan være toksisk for nevroner etter forlenget inkubering.
- Forbered en 50 ml konisk rør med ~ 50 ml Wash medium, kan den varmes opp til 37 ° C.
- Ved slutten av 2 timer, bringe den lave tetthet neuron med DNA-kalsiumfosfat utfelles i hetten. Plukk opp hver enkelt dekkglass med en skarp # 5 pinsett, og dypp den tre ganger i 50 ml Wash medium for å vaske det kort. Deretter returnere det til nevroner høy tetthet i sine opprinnelige co-kultur plater, med nevroner lav tetthet vender nedover.
- Fortsett kulturen tilmed lav densitet kultur neuroner på dekkglass høstes for studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen er beskrevet her gjør det mulig for vellykket ultra-lav tetthet, langtidskultur av rene glutamaterge nevroner uten behov av gliaceller som tjener som et matersjikt. Protokollen er diagramed i figur 1, som innbefatter fremstilling av høy tetthet (på poly-D-lysin-belagte 24 brønner) og lav tetthet nevroner (på poly-D-lysin-belagte dekkglass) hver for seg, og etterfølgende ko-kultur som kan opprettholdes inntil tre måneder.
Figurene 2A og 2B er illustrasjoner av nerveceller med høy tetthet og lav tetthet på 5 dager etter utplating. Lav tetthet kultur er ca 30 ganger mindre i tetthet. Begge nevroner gjennomgå typiske utviklingsstadier som skissert av KAECH og Banker (2006). På dag 14, både høy tetthet og tetthet nevroner lave vise forseggjort dendrittiske strukturer, som avslørt av DIC bilder (figur 2C,D, oppmerksom på begge paneler er fra det samme felt med forskjellige brennplan, som vist ved plasseringen av hakk). Når disse nevronene er farget med MAP2 antistoff for å avsløre dendritter, ingen signifikante forskjeller i antall dendritter (t 13 = 1,27, p> 0,05, målt ved dendrittiske tips nummer) og total dendrittiske lengde (t 16 = 1,41, p> 0,05 ) per neuron mellom høy tetthet og tetthets nevroner lave blir funnet (figur 2E, F).
Immunocytochemistry merking brukes til å avdekke funksjonelle glutamaterge synapser. Vi bruker dobbelt farging for å merke NMDA-reseptor-underenheten NR1 og AMPA-reseptor-underenheten GluR1 (figur 3A), og funksjonelle synapser (samlokalisert puncta i gult) kan lett identifiseres og kvantifiseres ved hjelp av ImageJ. Lav tetthet nevroner er også merket med antistoff mot dendrittiske protein markør MAP2,i kombinasjon med aksonal protein markør p-Tau. Denne doble-merking gjør klart skille av dendritter og aksoner (Figur 3B). Kulturer med lav tetthet kan også med hell transfektert med DNA-plasmider ved hjelp av kalsiumfosfatfremgangsmåter, selv om transfeksjon hastigheten er typisk meget lav på senere stadier (<0,2% neuroner når transfektert ved DIV21). Figur 3C illustrerer at EGFP transfeksjon kan avsløre neuronal morfologi, og gjengi fin dendrittiske ryggrad strukturer synlige. Til slutt, som et bevis på konseptet, nevroner ultra-lav tetthet kan dyrkes under forhold som fremmer autapse dannelse (Figur 3D). Disse ultra-low density autaptic nevroner dyrket på poly-D-lysin belagte 'mikro-øyenes kan opprettholdes ved høy tetthet mater nervecelle til utover 2 måneder med denne co-kulturen protokollen.
<strong> Figur 1. Skjematisk illustrasjon av høy tetthet og lav tetthet ko-kultur-protokollen. (A) E16.5-E17.5 mus embryonale hjerner ble oppsamlet, hippocampi dissekeres ut og kuttet med trypsin. (B) i samle hippocampi blir vasket, delt opp i enkelt neuroner, og sådd ut i høy tetthet (250.000 celler / ml) i 24 brønners plater; i mellomtiden har lav densitet (10.000 celler / ml) neuronene sådd ut på dekkglass. Brønnene for tetthet kulturen høy er etset med en 18 G nål sprøyte for å tilveiebringe en opphøyet støtte for dekkglass. (C) Illustrasjon av co-kulturen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Både høy tetthet og tetthets neuroner lave har comparable morfologiske utviklingen i ko-kulturen. (A, B) Mikrofotografier viser plating tetthet av både høy tetthet og tetthet lag lav. (C, D) DIC bilder som viser omfattende neurite vekst i både høy (C) og lav densitet (D) neuroner. Nervecellene lav tetthet på dekk hviler rett over nevroner høy tetthet. Legg merke til plasseringen av den hevede plast støtte. (E) Immunocytochemistry merking av dendrittiske protein MAP2. (F) Kvantifisering (gjennomsnitt ± SEM) av total dendrittiske lengde og dendrittiske spiss antall pr neuron. Ingen signifikant forskjell (ns) ble sett mellom høy tetthet og tetthet nevroner lave dyrket i co-kultur. Scale bar i (B, D), 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
fo: keep-together.within-page = "1"> 
Figur 3. Eksperimentelle manipulasjoner av nerveceller med lav tetthet dyrket i ko-kulturen. (A) Immunocytochemistry merking i kultur lav tetthet tillater identifisering av funksjonell synapse definert ved ko-merking av GluR1 (grønn) og NR1 (rød). (B) Co-merking av neuronal dendrittiske protein MAP2 (magenta) og aksonal protein p-Tau (grønn). (C) En lav tetthet hippocampale nervecelle transfektert med pEGFP-C3 plasmid, viser rikelig dendrittutløperne. (D) En lav tetthet nevron forberedt på poly-D-lysin 'mikro-øy ", og dyrket på toppen av nevroner høy tetthet. Et opptak patch elektrode fyller neuron med Alexa-555 hydrazide å avsløre morfologi av nervecellen. Scale bar i AD, 20 mikrometer.7fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer en detaljert protokoll for langsiktig kultur for ultra-low density hippocampus glutamaterge nevroner i henhold til serumfrie forhold. På ~ 2000 neuroner / cm 2, er tettheten i det minste to ganger lavere enn de fleste "lav tetthet" kultur-preparater, med eller uten glia støtte rapportert av eksisterende litteratur 2,3,11,13,14. I tillegg til å være ultra-lav tetthet, er denne protokollen ny og vesentlig i to måter. For det første er det ikke glia matersjikt nødvendig som neuronene lav densitet oppnå trofisk faktor støtte fra neuronene med høy tetthet som er i tett fysisk nærhet, selv om det ikke er noen synaptiske forbindelser eller direkte kontakt mellom nerveceller dyrket på forskjellige tettheter. Denne protokollen eliminerer behovet for fremstilling av gliaceller monolag i forkant av den planlagte kultur eksperimenter, og tillater både høy tetthet og lav tetthet kulturer til å vokse samtidig. Fremstilling av gliaceller monolaget kan være tidkrevende og laborious, og mest litteratur bruker neonatal rotte pup cortices 2. Derfor, for laboratorier som arbeider med bare mus, dette krever betydelige ekstra innsats. Enda viktigere, i eksperimenter hvor neuronal spesifikke mekanismer er undersøkt, kan tilstedeværelsen av gliaceller i ko-kulturen være uønsket, fordi det hindrer tillegge observerte effekter spesielt til neuroner, glia eller samspillet mellom de to celletypene 10. I tillegg, for gliaceller kultur, er serum supplement obligatorisk 2,15, og dette kan forurense glia-nevron co-kultur og innføre ytterligere konfunderende faktorer. En viktig funksjon i vår protokoll er at co-kultur er under definerte mellom forhold. Vi strengt bruke Complete Kultur medium uten serum supplement, og finner ut at dersom kulturmediet utveksling planen er strengt fulgt, kan det co-kulturen opprettholdes utover tre måneder, noe som bør tilfredsstille de fleste eksperimenter. Fordi det er nesten ingengliaceller tilstedeværelse, en begrensning av denne teknikken er at det bør utvises forsiktighet når man sammenligner med resultatene av litteratur som bruker glia-nevroner co-kulturer.
En annen ny aspekt av denne protokollen er at vi bruker en enkel metode for å skape en effektiv mikro-rom mellom nerveceller med høy tetthet dyrket på bunnen av den 24-brønners plate, og den lave tetthet neuron klebet til dekkglass som sitter rett ovenfor. Tidligere studier bruker parafin punkter på de belagte Dekk å heve glassene på ~ 500 mikrometer over gliaceller mater lag 2,8,9. Utarbeidelse av parafin prikker krever riktig størrelse og riktig temperatur, noe som krever en rimelig mengde innsats og praksis. Til sammenligning, en enkel etsing på brønnbunnen plastmaterialer med en 18 G nål gir støtte for dekkglass, så vel som god separasjon mellom de to lag av nerveceller. Vi har brukt en patch clamp opptak rigg med digital Z meter å bestemme linøre plass mellom de to lag av neuroner ved å fokusere på den høye tetthet og deretter på lag med lav densitet ved hjelp av et 60X objektiv nedsenking i vann, og fant at plassen er typisk 150 til 200 um (179,4 +/- 25,3 um, n = 5 ). Dette smalere plass (sammenlignet med det som genereres av voks prikker) er sannsynlig å oversette til en raskere økning, og høyere konsentrasjon av neurotrofiske faktorer, derfor gir tilstrekkelig støtte for den lave tettheten nervecellen til å vokse. Selv om dette smalere plass kan reise spørsmål om graden av kultur medium utveksling og om den mindre plass hindrer nerveceller fra å skaffe oksygen og ernæringsmessig støtte, våre resultater viser at dette ikke er sannsynlig en bekymring. Tvert imot, har vi funnet at tettheten neuroner høye under Dekk også vokse bedre (høyere overlevelse, mer forseggjort dendritisk tre og mer synaptiske puncta ved NR1 farging, data ikke vist) sammenlignet med nevroner høy tetthet fra samme preparat men uten den overliggende coverslips. Derfor er denne enkel protokoll ikke bare rask, enkel, men også meget effektiv i å opprettholde både høy tetthet og tetthets neuroner lave.
Dyrking hippocampale neuroner in vitro krever belegning av vekstfremmende substrater, slik som poly-D-lysin og / eller laminin / kollagen 5,16. Selv om omhyggelig utvelgelse og fremstilling av dekkglass er kritiske for effektiv neuronal overlevelse, er det funnet at med dekkglasset vi valgt, er en grundig rengjøring med 70% etanol er tilstrekkelig, og dermed opphever behovet for strengere behandling (for eksempel koking i syrer) av glassene. Etter glassene blir rengjort i etanol og tørket ved hjelp av vakuum, synes glasset til å være hydrofob på grunn av det opprinnelige belegg. Imidlertid vellykket belegning av 0,1 mg / ml poly-D-lysin i boratbuffer skulle gi glassoverflaten hydrofil, slik at når objektglassene blir plukket opp fra vaskevannet, et ensartet lag av vann som er jevntsprer seg over hele glassoverflaten kan observeres. Vi har funnet at dette er kritisk viktig. Ellers neuronene vil mest sannsynlig dø etter plating på grunn av utilstrekkelig belegg. Selv om bare lav densitet hippocampale neuroner blir testet i denne protokollen, er det ventet at andre neuronale typer (f.eks, kortikale neuroner, cerebellare granulceller neuroner, eller spesialiserte nervepopulasjoner) kan også opprettholdes ved lav tetthet, i nærvær av en høy tetthet neuron mater lag. Til slutt, når denne enkle protokollen blir fulgt, kan man forvente å høste friske ultra-lav tetthet neuroner. Brede programmer som immunocytochemistry merking, live bildebehandling, morfologiske studier og elektrofysiologi opptak kan alle bli gjennomført på disse nevronene følgende standard prosedyrer 16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. Cultureing Nerve Cells. , 2nd edition, 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
