Abstract
Cultura de neurônios do hipocampo primárias in vitro facilita interrogatório mecanicista de muitos aspectos do desenvolvimento neuronal. Dissociadas neurónios do hipocampo embrionárias muitas vezes pode crescer com sucesso em lamelas de vidro de alta densidade, sob condições isentas de soro, mas as culturas de baixa densidade, tipicamente requerem um fornecimento de factores tróficos por co-cultivando-as com uma camada alimentadora de células gliais, a preparação dos quais pode ser demorado e trabalhoso. Além disso, a presença de células da glia pode confundir a interpretação dos resultados de estudos e opõe-se sobre os mecanismos específicos de neurónios. Aqui, um método simplificado é apresentado para ultra-baixa densidade (~ 2.000 neurónios / cm 2), a longo prazo (> 3 meses) cultura de neurónios do hipocampo primário que está sob condições isentas de soro e sem suporte de células da glia. neurónios de baixa densidade são cultivadas em lamelas de poli-revestido D-lisina, e virado em neurónios de alta densidade cultivadas numa placa de 24 poços. Em vez de utilizar pontos de parafina para criar um espaço entrn as duas camadas neuronais, os experimentadores pode simplesmente gravar o fundo de plástico do poço, em que os neurónios de alta densidade reside, para criar um micro-espaço conducente à baixa densidade de crescimento neuronal. A co-cultura pode ser facilmente mantida durante> 3 meses sem perda significativa de neurónios de baixa densidade, facilitando, assim, o estudo morfológico e fisiológico destes neurónios. Para ilustrar esta condição cultura bem sucedida, os dados são fornecidos para mostrar a formação de sinapses profusa em células de baixa densidade após cultura prolongada. Este sistema de co-cultura também facilita a sobrevivência de neurónios individuais esparsos cultivadas em substratos de ilhas de poli-D-lisina e assim a formação de ligações autaptic.
Introduction
Crescer neurónios do hipocampo em condições in vitro permite a observação e manipulação experimental desses neurônios que de outra forma não seriam possíveis in vivo. Esta abordagem experimental é amplamente utilizado para revelar os mecanismos neuronais de crescimento, polaridade, especificação de neurites, tráfico e localização subcelular das proteínas, a formação de sinapses e a maturação funcional 1. Estes neurónios do hipocampo em cultura in vitro, quando colhido de estágios embrionários tardios, são relativamente pura (> 90%) de células glutamatérgicas morfologia piramidal 2. Uma vez que os neurónios foram cultivados em uma superfície 2-D sob condições in vitro, este método permite a fácil observação, tais como imagens ao vivo ou imunocitoquímica (ICC) a coloração por meio de um único plano focal 3; ou manipulações, como o tratamento de droga e transfecções 3-6. Quando cultivadas em alta densidade, os neurônios tendem a ter altas taxas de sobrevivência por causa de maior concentrations de factores de crescimento segregados em adição ao suporte alimentar a partir do meio de crescimento, e também por causa dos mecanismos dependentes de contacto 7 de neurites. No entanto, de baixa densidade neurônios do hipocampo são desejáveis para estudos morfológicos, onde um neurônio individual podem ser visualizados na íntegra ou manchados para análise ICC. Neurônios de baixa densidade são difíceis de manter na cultura devido à falta de apoio parácrina e, portanto, muitas vezes necessitam de suporte trófico de uma camada de alimentação glial (tipicamente cortical astrócitos), que tem de ser preparada antes da neurônio cultura 2. Quando co-cultivadas com uma camada alimentadora de células gliais, os neurónios de baixa densidade são cultivadas em lamelas, e, em seguida, invertida por cima da camada de células da glia para que os neurónios e glia de baixa densidade estão voltadas uma para a outra. Um pequeno espaço confinado entre as células da glia e os neurónios é criado colocando pontos de parafina sobre as esquinas das lamelas, por conseguinte, a criação de um layout "sanduíche" 2,8,9. Os neurónios de baixa densidade aumentará Within o espaço confinado entre glia e as lamelas, o que cria um microambiente permissivo com fatores concentrados secretados pelos neurônios e células gliais. Esta abordagem resulta de baixa densidade, os neurônios totalmente desenvolvidos que são espaçados razoavelmente distante, rotulagem ICC, portanto, facilitar ou estudos de imagem ao vivo.
Uma aparente desvantagem de co-cultura neurônio-glia, além de ser demorado e trabalhoso, é que ele impede estudo da específicos de neurónios ou células-autônoma, mecanismos. Embora este sistema é muito menos complexo do que in vivo do tecido neural, impacto glia em neurônio desenvolvimento através secretadas, fatores não-ainda-completamente-definidos podem confundir as experiências 10. Portanto, em experiências que requerem a investigação dos mecanismos específicos de neurónios, as condições de cultura definidas que remover o soro e a camada de suporte da glia são necessárias. Um estudo anterior teve sucesso na cultura de baixas concentrações de neurónios (~ 9.000 células / cm 2) usando um thmatriz de hidrogel dimensional ree 11. Uma vez que uma população de neurónios relativamente puro pode ser cultivado a elevada densidade, sob condições isentas de soro, sem apoio da glia, que a hipótese de que ultra-baixa densidade de neurónios do hipocampo pode ser cultivada em meio de cultura isento de soro definido por co-cultura destas com neurónios de alta densidade, em uma forma que é análogo ao processo de co-cultura neurónio-glia convencionalmente adoptada. Com efeito, a alta densidade de hipocampo de culturas de neurónios em uma configuração "sandwich" têm sido recentemente utilizadas para suportar um pequeno número de neurónios magnocelulares endócrinas especializadas 12.
Portanto, co-cultura com os neurônios de alta densidade podem permitir que os neurônios de baixa densidade para receber fatores suporte trófico que seja suficiente para permitir a sobrevivência a longo prazo. Este protocolo de neurônios ultra-baixa densidade de cultivo foi assim formulado e validado. O protocolo pode ser implementada dentro de uma única experiência, através da preparação de alta densidade (~ 250000 células / ml) de disneurónios do hipocampo sociada em primeiro lugar, e, em seguida, fazer uma diluição para se obter uma densidade de ~ 10.000 neurónios / mL (~ 3.000 neurónios / lamela, ou ~ 2.000 neurónios / cm2), que é muito mais baixa do que a maioria relatado culturas de baixa densidade 2,3,9 , 11,13. Esta condição cultura é vagamente referida como cultura "ultra-baixa densidade" e utilizada com "baixa densidade" inter-changeably. Os neurónios de alta densidade são plaqueadas em poli-D-lisina revestidas placas de 24 poços; enquanto que os neurónios de baixa densidade são semeadas em lamelas de vidro de 12 mm revestidas com poli-D-lisina, que são colocados dentro de outra placa de 24 poços. As lamelas com aderindo neurónios de baixa densidade são viradas na parte superior dos neurónios de alta densidade de 2 horas mais tarde, após os neurónios são descidos e ligado às lamelas. Além disso, em vez de utilizar pontos de cera de parafina para elevar as lamelas acima do neurónio da camada de alta densidade, uma agulha de seringa de 18 G foi utilizada para gravar o fundo das placas de 24 poços com duas tiras paralelas. O displ resultanteACED, plásticos adjacentes fornecer um suporte elevado para as lamelas de vidro. Este espaço é constantemente medido a 150-200 mm, o que permite a troca de oxigênio e meio de cultura suficiente, proporcionando um microambiente com fatores tróficos concentradas. Sob esta condição, os neurônios de baixa densidade crescer extensivamente, e pode sobreviver mais de três meses em cultura. Quando esses neurônios são transfectadas com plasmídeo GFP após três semanas em cultura, os dendritos são profusamente ornamentada com espinhas dendríticas. Como prova de princípio, os dados são apresentados para mostrar que este sistema de co-cultura suporta culturas ultra-baixa densidade de neurônios do hipocampo semeadas em poli-D-lisina "micro-ilhas", onde os neurônios formam conexões autaptic que podem facilitar a investigação de células , mecanismos -autonomous de rede independentes.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade do Arizona, e conformado com as diretrizes do NIH.
1. Tissue Fonte para hipocampo Neuron Cultura
- Para gerar filhotes de rato pré-natal para hipocampo neurônio cultura, usar camundongos tempo grávidas (C57BL6 / J) que são criados na casa 17. O dia de detecção com rolhão vaginal é designado como E0.5. O tempo de colheita prevista para a cultura é E16.5-E17.5.
Nota: Este protocolo descreve culturas de duas placas de 24 poços de dois neurónios de alta densidade de co-cultura com os neurónios de baixa densidade (48 lamelas no total). Para mais placas, materiais e reagentes pode ser dimensionado correspondentemente.
2. As placas de 24 poços de preparação para Alta Densidade culturas de neurônios
Nota: Execute as seguintes etapas (2-3) no dia antes da colheita prevista de embriões.
- Traga dois 24 bemplacas dentro do capuz de cultura de células, abrir a embalagem individual.
- Conectar uma agulha de 18 G seringa para uma utilização única seringa de 1 ml de plástico.
- Segurar a seringa, e tem como objectivo a ponta da agulha no ~ 1 mm à esquerda do centro do fundo do poço. Aplicar uma força moderada (~ 250 g) para gravar o fundo da cavidade (~ 1 mm de comprimento). Uma ranhura vai ser formado e os materiais de plástico deslocado vai formar um suporte elevada acima da superfície de fundo plana bem. Etch outra ranhura paralela ~ 1 mm de comprimento a ~ 1 mm para a direita do centro da parte inferior de uma forma semelhante.
- Repetir esta etapa para todos os poços das duas placas de 24 poços. As duas placas de 24 poços utilizados para a cultura de alta densidade estão agora prontos para o revestimento com poli-D-lisina (veja o passo 3.8 abaixo).
3. Lamelas Preparação para a Baixa Densidade culturas de neurônios
- Use de 12 mm de diâmetro # 1 de vidro redondo.
- Coloque 50 lamelas dentro de um 100 mm de diâmetro plástico estéril prato de petri, e submergir lamelasem solução de etanol a 20 ml de 70%. Coloque esta placa de petri em uma plataforma giratória com moderada (70 rpm) Rotação de velocidade durante uma hora. Retirar 70% de etanol e, em seguida, substitua-o por um novo lote de 70% de etanol. Gire e lavar por mais uma hora.
- Eliminar a solução de limpeza de etanol a 70%. Adiciona-se água esterilizada (filtrado através da unidade de filtro de 0,2 um). Lavar as lamelas rigorosamente fazendo girar a placa de Petri com a mão. Lavar três vezes, cada vez que a substituição com água estéril fresco.
- Coloque a placa de Petri com lamelas dentro de uma capa de cultura de células estéril com fluxo laminar. Aspirar a água de limpeza através da linha de vácuo, e adicione 10 ml filtrados água estéril para mergulhar as lamelas. As lamelas de cobertura deve ser estéril e a superfície deve estar limpa suficiente para o revestimento de poli-D-lisina.
- Abra duas placas de 24 poços de sua embalagem individual, e colocá-los na capa.
- Ligar a linha de vácuo na capa. Conecte uma ponta de pipeta de 200 mL para a linha de vácuo, e usar um scissor para cortar a ponta para criar uma abertura maior.
- Use uma de ponta fina # 5 pinça para pegar lamelas da placa de Petri, um de cada vez, e usar a linha de vácuo para secar completamente a lamela. Em seguida, coloque uma lamela em cada um dos poços da placa de 24 poços. As lamelas 50 limpos deve ser suficiente para encher cada um dos poços das duas placas de 24 poços.
- Dilui-se a solução stock de ácido poli-D-lisina (1 mg / ml) em solução de trabalho (0,1 mg / ml) com tampão de borato (pH 8,5). Para as quatro placas de 24 poços (incluindo duas placas de alta densidade com fundo gravado), preparar 30 ml de solução de trabalho total.
- Adicionar 300 ul de 0,1 mg / ml de solução de trabalho de poli-D-lisina a cada poço com lamelas de vidro. Certifique-se as lamelas estão completamente imersos em solução. Se não, utilizar a ponta da pinça # 5 para pressionar para baixo lamelas contra o fundo do poço, e utilizar a ponta para orientar a solução de poli-D lisina para cobrir toda a superfície das lamelas. Inspecione visualmente todas as lamelas para fazer sure sem ar estava preso entre a placa e lamelas.
- Adicionar 300 ul de 0,1 mg / solução de trabalho de poli-D-lisina ml a cada poço da placa de cultura de alta densidade com fundo gravado. Rodar à mão para espalhar a solução para cobrir toda a parte inferior do poço.
- Retornar todos os quatro placas com poli-D-lisina para a incubadora de cultura, e incuba-O / N.
4. Placas de lavagem e pré-condicionamento para a Cultura
Nota: Os passos seguintes (4-9) são levadas a cabo no dia da colheita de tecido.
- Após incubação / revestimento de lamelas e placas de 24 poços, o / n, trazer todas as quatro placas (com duas lamelas doadoras, duas chapas de alta densidade aceitadores com fundo de plástico gravadas) na capa de cultura. Utilizar a linha de vácuo para remover a solução de poli-D lisina.
- Imediatamente a seguir à remoção da solução de poli-D-lisina, adicionar ~ 1 ml de água estéril para cada poço utilizando uma pipeta de transferência de plástico. Depois de todos os poços são preenchidoscom água, deixe descansar por 10 min. Remover a água por vácuo, em seguida, adicionar meio de lavagem 300 uL em cada poço para cobrir o fundo do poço (com ou sem lamelas de vidro). Não deixe que o revestimento de poli-D lisina secar.
- Retornar todos os quatro placas para a incubadora celular. As placas estão prontos para usar uma vez que os neurônios do hipocampo dispersos estão preparados.
5. Preparação de completa Meio de Cultura, e tripsina Solução para digestão enzimática
- Preparar 60 ml de meio de cultura completo por mistura dos ingredientes (ver Materiais). Usar uma seringa de 50 ml ligado com um filtro de seringa de 0,2 um de tamanho de poro, filtrar o meio de cultura completo em dois tubos cónicos de 50 ml. Cada tubo contém 30 ml de meio de cultura completo.
- Em um tubo de 50 ml separado, adicionar ~ 30 ml de meio de lavagem (veja Materiais) e aquecê-lo até 37 ° C. Isto irá ser utilizado para lavar o tecido após a digestão enzimática.
- Prepara-se o meio de digestão com enzimas. Em uma 15 ml tubo cónico, adicionar 4,5 ml de meio de lavagem e solução de tripsina a 0,5 ml de 2,5%, e 50 ul de DNase I. 100X
- Colocar o meio de cultura completo, meio de lavagem, e enzima meio digestão em um banho de água a 37 ° C.
6. Preparação de instrumentos cirúrgicos
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em uma bolsa de esterilização: duas pequenas tesouras, um par de pinças e dois # 5 pinças.
7. A remoção dos cérebros de E16.5-E17.5 embriões de camundongos, e dissecção de Hippocampi
- Preparar dois de 10 cm cheios com pratos de petri, solução gelada estéril de Hank equilibrada de sal (HBSS).
- Eutanásia da barragem rato com uma injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (100 mg / kg num volume de ~ 0,5 mL). Após a injeção, uma vez que a barragem perde resposta a pitada dedo do pé, sacrificar com deslocamento cervical.
- Spray de área do abdômen da barragem com 70% de etanol, e fazer uma longa incisão de 2 cm ao longo da linha média do abdómen para exporo útero.
- Retire os embriões e coloque as individuais em uma placa de Petri de diâmetro de 10 cm com dissecação fria tampão HBSS.
- Segure o embrião pelo pescoço usando uma pinça, e usar uma pequena tesoura para fazer a primeira à direita cortada na linha média abaixo do nível cerebelo e seção em todo o tecido cerebral. Não decapitar o embrião.
- Insira a ponta do lado direito da pequena tesoura da região caudal, que é cortado aberto, todo o caminho através da parte rostral do cérebro embrionário (não linha média de cruz), e fazer um corte no lado esquerdo ao nível da base do crânio.
- Insira a ponta tesoura lateral esquerda novamente para fazer um corte no lado direito. Deixe uma faixa estreita de osso do crânio sem cortes e tecidos da pele na extremidade rostral, de modo que todo o cérebro pode ser virado de lado para a extração fácil.
- Use a ponta da tesoura para colher o cérebro embrionário na solução HBSS. Inspecione o cérebro sob um microscópio de dissecação. O cérebro deve estar intacto, sem corte-o brutoregiões ff.
- Repita essas etapas para recolher todos os cérebros de embriões.
- Recolher todos os cérebros intactos em uma nova placa de Petri contendo 20 ml de tampão HBSS frio. Colocar a placa de petri sob um microscópio de dissecção.
- Ver o cérebro do lado ventral. Mantendo pressionado o cérebro com uma pinça na extremidade caudal, inserir uma afiada # 5 pinça na diagonal para fazer um corte entre o ponto rostral do meio e da região caudal-temporal. Repita esse procedimento para o outro hemisfério. Após o corte, separados dois hemisférios com hipocampo intactas do resto dos tecidos do tronco cerebral.
- Repita esse procedimento para cada um dos cérebros.
- Piscina todos os hemisférios dissecados, e remover as meninges usando dois pares de # 5 pinças.
- Identificar o hipocampo em desenvolvimento, como uma estrutura curva que é dobrada para dentro do lobo temporal. Alternar os dois pares de pinças para separar o hipocampo a partir de tecidos adjacentes corticais. Recolher e reunir toda a hippocamtecido PI (ver Figura 1).
8. digestão enzimática, separar-se em neurônios individuais
- Usando uma pipeta de transferência de plástico, transferir todo o hipocampos dissecados para a solução de digestão enzimática contendo 5 ml de meio de lavagem com 0,25% de tripsina + 1X ADNase I em um tubo de 15 ml.
- Colocar o tubo dentro de um banho de água e incuba-se a 37 ° C durante 25 min, com inversão suave intermitente do tubo, uma vez em cada 5 min.
- Após 25 min, remova cuidadosamente a solução de enzima usando um portátil pipeta de plástico por aspiração. Adicionar meio quente Wash 10 ml e lavar cuidadosamente o tecido lentamente invertendo o tubo 5 vezes. Remover o meio Wash, e adicionar 10 ml de meio Wash novamente por uma lavagem adicional.
- Remover o meio Wash, e adicionar 3 ml de meio fresco quente Wash novamente. Agitar o tubo à mão rigorosamente durante 15 vezes para desalojar os neurónios digeridos a partir do tecido. O meio deve tornar-se turva uma vez que a células de umestá separada do tecido para dentro do meio de lavagem. Recolha a suspensão de células em um novo tubo de 15 mL cónico, deixando o tecido que permanece no tubo.
- Adicione outro meio de 2 ml de lavagem para o tecido, e suavemente separar o tecido restante por trituração através de uma pipeta de plástico para ~ 15 vezes. Deixe descansar por 5 min. Reunir a suspensão de células para o novo tubo de 15 ml cônico que contém coletadas células "shake-off '.
- Contagem a densidade de neurônios com um hemocitômetro. Tipicamente, 3,000-5,000 células por microlitro pode ser obtido de acordo com o número de embriões dissecados. Um número médio de 2,5 x 10 7 neurônios são estimados se assumindo seis embriões são dissecados.
- Calcular o volume necessário desta suspensão de células para se obter uma densidade de 250.000 neurônios / ml quando adicionada a 30 ml de meio de cultura completo. Adicionar este volume para um dos dois tubos cónicos de 30 ml contendo meio de cultura completo para se obter a forma neurónio chapeamento de alta densidade. <li> Transferir 1,2 ml desta solução neurónio alta densidade de mais 30 ml de meio de cultura completo para se obter uma concentração de ~ 10.000 neurônios / ml. Use esta diluição para semear as lamelas de baixa densidade.
9. chapeamento de neurônios e Long Term Co-cultura
- Traga as duas placas de 24 poços com fundos gravadas para neurónios de alta densidade dentro do capuz de cultura de células. Remover o meio 300 ul condição prévia por vácuo. Placa 0,6 ml suspensões de células de alta densidade de 250.000 neurônios / ml.
- Traga as outras duas placas de 24 poços com lamelas dentro do capuz de cultura, e remover o meio de 300 ul por condição de vácuo. Placa 0,6 ml de suspensões de células de baixa densidade a 10000 neurônios / mL sobre as lamelas dentro das duas placas de 24 poços.
- Regressar todas as quatro placas de 24 poços para a incubadora. Deixe descansar por 2 horas.
- Virar as lamelas de baixa densidade com aderindo neurônios para a cultura de alta densidade. Certifique-se os neurônios estão enfrentando uns aos outros (isto é, not separados pela lamela de vidro). Em seguida, retornar as duas placas com co-cultura para a incubadora.
Sustentando 10. Co-cultura
- Co-culturas de alimentação por adição de 300 ul de meio de alimentação fresco (ver Materiais) em dias in vitro (DIV) 5. Não há necessidade de remover 50% do meio de cultura completo original, como relatado por muitos outros estudos. O meio de alimentação também contém 15 | iM de citosina-arabinósido (Ara-C, para se obter uma concentração final de 5 uM) para minimizar a possibilidade de contaminação da glia e proliferação.
- Seguindo essa alimentação inicial, adicione 300 ml meio de alimentação fresco sem Ara-C para o bem a cada semana. No caso de a cultura ser mantidos por mais de um mês, substitua metade do meio com meio de alimentação fresco todas as semanas para além de um ponto de tempo mês (com o primeiro semestre de substituição meio a DIV33). Morfologicamente, tanto de alta densidade e de baixa densidade neurônios parecem saudáveis até três meses (o maior tempo observado pelo experimenters).
11. Ilustração de um Experimental Manipulation de baixa densidade Neuron transfecção
Nota: Quando a transfecção em neurónios de baixa densidade é desejada, pode ser adoptado um protocolo de fosfato de cálcio simples. Verificou-se que as culturas de baixa densidade tem uma melhor eficácia de transfecção com o protocolo de fosfato de cálcio antes DIV12, mas eles podem ser transfectadas com muito menor eficácia em DIV21 ou mais, tempo durante o qual as espinhas dendriticas são proeminentes. A viabilidade de transfecção do neurónio cultivadas a baixa densidade é ilustrada pelos neurónios transfecção com um plasmídeo pEGFP-C3 (ver abaixo).
- No DIV21, remover 600 ul meio condicionado de cada poço da co-cultura, e transferi-lo para uma nova placa de 24 poços. Em seguida, adicione 600 mL de meio fresco de alimentação à co-cultura para trazê-lo de volta ao volume original.
- Transferir as lamelas na nova placa de 24 poços com 600 ul de meio condicionado. Verifique se oneurônios de baixa densidade fiquem virados para cima. Colocar as placas de alta densidade e as novas placas com lamelas de volta na incubadora.
- Preparar dois tubos de 1,5 ml estéreis. Em um tubo, adicionar 600 mL 2X HEPES solução salina (HBS) tamponada. Calcular o volume de 12 ug de ADN pEGFP-C3 com base na concentração de plasmídeo. No outro tubo, adicionar 74 ul de CaCl 2 (2 M da) e o volume de água que após a adição do plasmídeo irá fazer 600 ul. Misturar bem por pipetagem e em seguida, adicionar o DNA de plasmídeo. Lentamente, misture bem. Deixe que ambos os tubos de sentar-se durante 5 min à TA.
- Enquanto mão segurando o tubo 2X HBS e moderadamente agitando a solução em um misturador, adicione todos os 600 ul a queda solução de DNA-CaCl2 a gota a 600 mL tubo de 2X HBS. É fundamental que o precipitado formado é na forma de granulado de areia fina '. Misturar muito forte e muito rápido não é desejável, uma vez que será mais provável produzir grandes 'precipitados flake'-like neve, which tem drasticamente menor eficiência de transfecção com base em nossas observações.
- Deixe o precipitado continuam a formar-se no escuro à temperatura ambiente durante 30 min.
- Adicionar 100 ul precipitado a cada poço que contém neurônios de baixa densidade sobre as lamelas, gota a gota e uniformemente. Retorno da placa para incubadora e incubar durante 2 horas. Assumindo que a maior parte do CaCl2 é na forma livre, isto resulta numa concentração de ~ 17,6 mM de Ca 2+, que pode ser tóxico para os neurónios após a incubação prolongada.
- Prepare um tubo cônico de 50 mL com meio ~ 50 ml Wash, aquecê-lo até 37 ° C.
- Ao fim de 2 h, trazer o neurónio de baixa densidade com fosfato de cálcio-ADN precipita dentro do capuz. Pegue cada lamela indivíduo com uma afiada # 5 pinça, e mergulhá-lo três vezes no meio Wash 50 ml de lavá-lo brevemente. Em seguida, devolvê-lo aos neurônios de alta densidade em seus pratos co-cultura original, com os neurônios de baixa densidade virada para baixo.
- Continuar até a culturaos neurônios de cultura de baixa densidade em lamelas são colhidas para estudos.
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Representative Results
O protocolo aqui descrito permite bem sucedida de ultra-baixa densidade, a cultura de longo prazo de neurónios glutamatérgicos puros sem a necessidade de células da glia que servem como uma camada alimentadora. O protocolo é diagramado na Figura 1, que envolve a preparação de alta densidade (em poli-D-lisina revestido 24 poços) e de neurónios de baixa densidade (em lamelas de vidro revestidas com poli-D-lisina), em separado, e subsequente co-cultura que pode ser mantida até três meses.
As Figuras 2A e 2B são ilustrações dos neurónios de alta densidade e de baixa densidade aos 5 dias após o plaqueamento. cultura de baixa densidade é de cerca de 30 vezes menos em densidade. Ambos os neurônios passam por fases típicas de desenvolvimento, conforme descrito pela Kaech e Banker (2006). No dia 14, tanto de alta densidade e de baixa densidade neurónios mostram estruturas dendríticas elaborados, como revelado por imagens DIC (Figuras 2C,D, observar os dois painéis estão no mesmo campo a diferentes planos focais, como mostrado pela localização do etch). Quando esses neurônios estão manchadas com anticorpo MAP2 para revelar os dendritos, não houve diferenças significativas no número de dendritos (t 13 = 1,27, p> 0,05; medido pelo número dendrítica ponta) e comprimento dendríticas total (t 16 = 1,41, p> 0,05 ) por neurônio entre a alta densidade e de baixa densidade neurônios são encontrados (Figura 2E, F).
rotulagem imunocitoquímica é usado para revelar sinapses glutamatérgicas funcionais. Usamos coloração dupla para marcar o receptor de NMDA subunidade NR1 e a subunidade do receptor de AMPA GluR1 (Figura 3A), e sinapses funcionais (pontos lacrimais co-localizado no amarelo) podem ser prontamente identificados e quantificados utilizando o ImageJ. neurônios de baixa densidade também são etiquetados com anticorpo contra dendrítica MAP2 marcador de proteína,em associação com o marcador da proteína Tau-p axonal. Este duplo-rotulagem permite distinção clara dos dendritos e axônios (Figura 3B). Culturas de baixa densidade também pode ser transfectadas com sucesso com plasmídeos de ADN, utilizando métodos de fosfato de cálcio, embora a taxa de transfecção é normalmente muito baixo em fases posteriores (<0,2% neurónios quando transfectadas em DIV21). A figura 3C ilustra que EGFP transfecção pode revelar morfologia neuronal, e processar estruturas de espinha dendrítica fina visível. Por último, como uma prova de conceito, os neurónios de ultra-baixa densidade podem ser cultivadas sob condições que promovam a formação autapse (Figura 3D). Esses neurônios autaptic ultra-baixa densidade cultivados no poli-D lisina revestidos 'micro-ilhas "pode ser sustentado pelo alimentador neurônio alta densidade para além de 2 meses com este protocolo de co-cultura.
<forte> Figura 1. ilustração esquemática da alta densidade e baixo protocolo de co-cultura de densidade. (A) do rato E16.5 E17.5-cérebros embrionários são recolhidos, são hipocampos dissecados e digerido com tripsina. (B) hipocampos digeridos são lavadas, separadas em neurónios individuais, e plaqueadas a uma densidade elevada (250.000 células / mL) em placas de 24 poços; No entretanto, de baixa densidade (10.000 células / ml) neurónios são plaqueadas em lamelas. Os poços para cultura de alta densidade são gravadas com uma agulha de seringa de 18 G para proporcionar um suporte elevado para as lamelas. (C) Ilustração da co-cultura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Ambos alta densidade e de baixa densidade neurônios têm codesenvolvimento morfológico mparable em co-cultura. (A, B) As fotomicrografias que mostram densidade de revestimento de ambos alta densidade e a camada de baixa densidade. Imagens (C, D) DIC que mostram grande crescimento de neurites em ambos elevada (C) e os neurónios de baixa densidade (d). Os neurônios de baixa densidade sobre lamela estão descansando logo acima dos neurônios de alta densidade. Note-se a localização do suporte de plástico levantada. (E) Imunocitoqu�ica rotulagem de MAP2 proteína dendrítica. (F) Quantificação (média ± SEM) de comprimento dendríticas total e número da ponta dendrítica por neurônio. Não houve diferença significativa (ns) foi observada entre alta densidade e de baixa densidade neurônios cultivados em co-cultura. Barra de escala em (B, D), 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. manipulações experimentais de neurónios de baixa densidade cultivadas em co-cultura. (A) Imunocitoquímica rotulagem em cultura de baixa densidade permite a identificação de sinapse funcional definido através de co-marcação de GluR1 (verde) e NR1 (vermelho). (B) Co-rotulagem de neuronal dendrítica MAP2 proteína (magenta) e proteína axonal p-Tau (verde). (C) Um neurônio hipocampo baixa densidade transfectadas com plasmídeo pEGFP-C3, mostrando espinhas dendríticas profusa. (D) Um neurónio de baixa densidade preparados em poli-D-lisina 'micro-ilha ", e cultivadas em cima dos neurónios de alta densidade. Um eléctrodo de remendo gravação enche o neurónio com Alexa-555 hidrazida para revelar a morfologia do neurónio. barra de escala no AD, 20 mm.7fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apresenta-se um protocolo detalhado para a cultura de longo prazo de ultra-baixa densidade de hipocampo de neurónios glutamatérgicos sob condições isentas de soro. Em ~ 2000 neurônios / cm 2, a densidade é pelo menos duas vezes menor do que a maioria preparações "baixa densidade" de cultura com ou sem apoio glia relatado pela literatura existente 2,3,11,13,14. Além de ser ultra-baixa densidade, este protocolo é nova e significativa em mais duas formas. Em primeiro lugar, nenhuma camada de alimentador de glia é necessário como os neurônios de baixa densidade obter suporte factor trófico dos neurônios de alta densidade que estão dentro de proximidade física, mesmo que não haja conexões sinápticas ou contato direto entre os neurônios cultivados em diferentes densidades. Este protocolo elimina a necessidade de preparar as células da glia em monocamada em frente das experiências de cultura planeados, e permite tanto de alta densidade e de baixa densidade culturas a crescer simultaneamente. Preparação da monocamada de células da glia pode ser demorado e Lliteratura aborious, ea maioria usa ratos neonatal filhote córtices 2. Portanto, para os laboratórios que trabalham com apenas ratos, o que exige esforços adicionais significativos. Mais importante ainda, em experiências em que os mecanismos neuronais específicas são investigados, a presença de células da glia em co-cultura pode ser indesejável, porque evita os efeitos observados atribuindo especificamente para os neurónios, células gliais ou a interacção entre os dois tipos de células 10. Além disso, para a cultura de células gliais, suplemento de soro é obrigatória 2,15, e isso pode contaminar a co-cultura glia-neurônio e introduzir fatores de confusão adicionais. Uma característica importante do nosso protocolo é que a co-cultura é sob condições de meio definido. Usamos estritamente o meio de cultura completo, sem suplemento de soro, e que se encontra a programação troca de meio de cultura é estritamente seguido, a co-cultura pode ser sustentada para além de três meses, que deve satisfazer a maioria das experiências. Uma vez que não há praticamente nenhumapresença glia, uma limitação desta técnica é que o cuidado deve ser exercido quando se compara com os resultados da literatura que usam glia-neurônio co-culturas.
Outro aspecto inovador do presente protocolo é que utilizar um método simples para criar um micro-espaço eficaz entre os neurónios de alta densidade cultivadas na parte inferior da placa de 24 poços, e o neurónio de baixa densidade aderiram às lamelas de vidro sentam-se logo acima. Estudos anteriores usa pontos de parafina aplicadas para as lamelas revestidas para aumentar as lamelas em ~ 500 mm acima da camada de células da glia 2,8,9 alimentador. Preparação de pontos de parafina requer o tamanho certo e temperatura certa, o que exige uma quantidade razoável de esforço e prática. Em comparação, uma simples gravura sobre os plásticos bem fundo com uma agulha G 18 fornece suporte para as lamelas, bem como uma boa separação entre as duas camadas de neurônios. Temos usado um equipamento de correção de gravação braçadeira com medidor Z digital para determinar a linespaço da orelha entre as duas camadas de neurónios, centrando-se na alta densidade e, em seguida, as camadas de baixa densidade usando uma objectiva de imersão em água 60X, e descobriram que o espaço é, tipicamente, de 150-200 um (179,4 +/- 25,3 uM, n = 5 ). Este espaço estreito (em comparação com aquela gerada por pontos de cera) é susceptível de se traduzir em um aumento mais rápido e maior concentração de fatores neurotróficos, portanto, fornecendo apoio suficiente para o neurônio de baixa densidade para crescer. Embora este espaço limitado pode levantar questões sobre a taxa de câmbio meio de cultura e se o espaço menor impede neurônios de obtenção de oxigênio e suporte nutricional, os nossos resultados mostram que isso não é provável uma preocupação. Pelo contrário, verificou-se que os neurónios de alta densidade ao abrigo das lamelas também crescer melhor (maior taxa de sobrevivência, mais elaborada árvore dendrítica e mais pontos lacrimais sináptica por coloração com NR1, dados não mostrados), em comparação com os neurónios de alta densidade a partir da mesma preparação, mas sem o cov sobrepondoerslips. Portanto, este protocolo simples não é apenas rápido, simples, mas também muito eficaz na manutenção tanto de alta densidade e de baixa densidade neurônios.
A cultura de neurónios de hipocampo in vitro requer o revestimento de substratos de promotores do crescimento, tais como poli-D-lisina e / ou laminina / colagénio 5,16. Embora selecção meticulosa preparação e de lamelas de vidro são críticos para a sobrevivência neuronal eficaz, verificou-se que com a tampa de vidro que seleccionado, uma limpeza completa com etanol a 70% é suficiente, negando assim a necessidade de um tratamento mais severo (por exemplo, fervendo em ácidos) das lamelas. Depois de as lamelas são limpas em etanol e secou-se por vácuo, o vidro parece ser hidrofóbico devido ao revestimento inicial. No entanto, o revestimento bem sucedido de 0,1 mg / ml de poli-D-lisina em tampão borato devem tornar a superfície hidrófila de vidro, de modo que quando as lamelas são recolhidas a partir da água de lavagem, uma camada uniforme de água que é uniformementeque se espalham pela superfície de vidro inteiro pode ser observada. Descobrimos que isso é extremamente importante. Caso contrário, os neurônios provavelmente irá morrer após o plaqueamento devido ao revestimento insuficiente. Embora apenas baixa densidade neurónios do hipocampo são testados neste protocolo, espera-se que outros tipos neuronais (por exemplo, os neurónios corticais, neurónios de grânulos de cerebelo, ou populações neuronais especializadas) também pode ser mantida a baixa densidade na presença de um neurónio alimentador de alta densidade camada. Por último, quando este protocolo simples é seguida, pode-se esperar para colher os neurônios saudáveis de densidade ultra-baixos. Amplas aplicações como a rotulagem imunocitoquímica, imagens ao vivo, estudos morfológicos e gravação de eletrofisiologia podem ser realizados sobre esses neurônios seguintes procedimentos padrão 16,17.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
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