Abstract
El cultivo de neuronas del hipocampo primaria in vitro facilita el interrogatorio mecanicista de muchos aspectos del desarrollo neuronal. Disociadas las neuronas del hipocampo embrionarias a menudo pueden crecer con éxito en cubreobjetos de vidrio a alta densidad en condiciones libres de suero, pero los cultivos de baja densidad normalmente requieren un suministro de factores tróficos por ellos co-cultivo con una capa de alimentación glia, la preparación de los cuales puede llevar mucho tiempo y laborioso. Además, la presencia de glia puede confundir la interpretación de los resultados y los estudios se oponen sobre los mecanismos específicos de neuronas. A continuación, se presenta un método simplificado de ultra-baja densidad (~ 2.000 neuronas / cm2), a largo plazo (> 3 meses) la cultura de las neuronas del hipocampo primaria que se encuentra bajo condiciones libres de suero y sin apoyo de células glia. neuronas de baja densidad se cultivan en cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina, y se volcó en las neuronas cultivadas de alta densidad en una placa de 24 pocillos. En lugar de utilizar puntos de parafina para crear un espacio between las dos capas neuronales, los experimentadores pueden simplemente grabar el fondo de plástico del pozo, en el que residen las neuronas de alta densidad, para crear un microespacio propicio para el crecimiento de las neuronas de baja densidad. El co-cultivo puede ser mantenido fácilmente durante> 3 meses sin pérdida significativa de neuronas de baja densidad, lo que facilita el estudio morfológico y fisiológico de estas neuronas. Para ilustrar esta condición de cultivo exitoso, se proporcionan los datos para mostrar la formación de sinapsis profusa en las células de baja densidad después del cultivo prolongado. Este sistema de co-cultivo facilita también la supervivencia de las neuronas individuales dispersas cultivadas en islas de sustratos de poli-D-lisina y por lo tanto la formación de conexiones autaptic.
Introduction
Cultivo de neuronas del hipocampo en condiciones in vitro permite la observación y la manipulación experimental de estas neuronas que de otra manera no son posibles en vivo. Este enfoque experimental es ampliamente utilizado para revelar los mecanismos neuronales de crecimiento, la polaridad, la especificación de neuritas, el tráfico y la localización subcelular de las proteínas, la formación de sinapsis y la maduración funcional 1. Estos in vitro neuronas del hipocampo en cultivo, cuando se cosecha a partir de las últimas etapas embrionarias, son relativamente puro (> 90%) de las células glutamatérgicas de la morfología piramidal 2. Debido a que las neuronas se cultivaron en una superficie de 2-D en condiciones in vitro, este método permite la observación fácil, tales como formación de imágenes en vivo o inmunocitoquímica (ICC) tinción a través de un único plano focal 3; o manipulaciones, como el tratamiento de drogas y transfecciones 3-6. Cuando se cultiva a alta densidad, las neuronas tienden a tener altas tasas de supervivencia a causa de una mayor cooperaciónncentrations de factores de crecimiento secretados además de apoyo alimentario a partir de los medios de crecimiento, y también debido a los mecanismos dependientes del contacto neuritas 7. Sin embargo, las neuronas del hipocampo de baja densidad son deseables para los estudios morfológicos, donde una neurona individual se pueden obtener imágenes en su totalidad o teñido para el análisis de la CPI. Neuronas de baja densidad son difíciles de mantener en cultivo debido a la falta de apoyo paracrina y por lo tanto a menudo requieren soporte trófico de un glial (típicamente cortical astrocitos) capa de alimentación, que tiene que ser preparada antes del cultivo de las neuronas 2. Cuando se co-cultivaron con una capa de alimentación de células gliales, las neuronas de baja densidad se cultivan en cubreobjetos, y luego da la vuelta en la parte superior de la capa de células gliales de modo que las neuronas de baja densidad y glia se enfrentan entre sí. Un pequeño espacio confinado entre la glía y las neuronas se crea mediante la colocación de puntos de cera de parafina en las esquinas de los cubreobjetos, por lo tanto la creación de un diseño de "sandwich" 2,8,9. Las neuronas de baja densidad crecerán wentro del espacio confinado entre glia y el cubreobjetos, que crea un microambiente permisiva con factores concentrados secretadas por las neuronas y células gliales. Este enfoque produce baja densidad, las neuronas plenamente desarrollados que están espaciados aparte razonable, por lo tanto, facilitar el etiquetado de la CPI o estudios de imagen en vivo.
Un inconveniente evidente de co-cultivo neurona-glía, además de ser lento y laborioso, es que evita estudio de específicos de neuronas, o células autónomas, mecanismos. Aunque este sistema es mucho menos complejo que in vivo el tejido neural, células gliales impacto sobre el desarrollo de las neuronas a través de factores definidos, que aún no es totalmente segregadas pueden confundir a los experimentos 10. Por lo tanto, en los experimentos que requieren la investigación de mecanismos específicos de neuronas, las condiciones de cultivo definidos que eliminar el suero y la capa de apoyo glial son necesarios. Un estudio previo ha tenido éxito en el cultivo de bajas concentraciones de neuronas (~ 9.000 células / cm 2) usando un THmatriz de hidrogel dimensiones ree 11. Desde una población neuronal relativamente puro puede cultivarse a alta densidad en condiciones libres de suero sin apoyo glial, que postula que ultra-baja densidad de neuronas del hipocampo se puede cultivar en suero libre definido medio de cultivo por los co-cultivo con las neuronas de alta densidad, en de una manera que es análoga a la neurona-glía co-cultivo convencionalmente adoptado. De hecho, la alta densidad de las neuronas del hipocampo culturas en una configuración de "sandwich" se han utilizado recientemente para apoyar a un pequeño número de neuronas magnocelular endocrinas especializadas 12.
Por lo tanto, co-cultivo con las neuronas de alta densidad puede permitir que las neuronas de baja densidad que reciben apoyo factores tróficos que es suficiente para permitir la supervivencia a largo plazo. Este protocolo de neuronas ultra-baja densidad de cultivo fue así formulado y validado. El protocolo puede implementarse dentro de un único experimento, mediante la preparación de alta densidad (~ 250.000 células / ml) dislas neuronas del hipocampo no asociados primero, y luego hacer una dilución para producir una densidad de ~ 10.000 neuronas / ml (~ 3.000 neuronas / cubreobjetos, o ~ 2.000 neuronas / cm 2), que es mucho más bajo que la mayoría informó de cultivos de baja densidad 2,3,9 , 11,13. Esta condición se conoce la cultura libremente como cultura "ultra-baja densidad 'y se utiliza con" baja densidad "de manera intercambiable. Las neuronas de alta densidad se colocan en el poli-D-lisina placas de 24 pocillos recubiertas; mientras que las neuronas de baja densidad se siembran en cubreobjetos de vidrio de 12 mm recubiertos con poli-D-lisina que se colocan dentro de otra placa de 24 pocillos. Los cubreobjetos con adherir neuronas de baja densidad se da la vuelta en la parte superior de las neuronas de alta densidad 2 horas más tarde después de que las neuronas se descienden y se unen a los cubreobjetos. Además, en lugar de utilizar puntos de cera de parafina para elevar los cubreobjetos por encima de la capa de neuronas de alta densidad, se utilizó una aguja de jeringa de 18 G para grabar la parte inferior de las placas de 24 pocillos con dos franjas paralelas. El resultado MostrAced, plásticos adyacentes proporcionar un soporte elevado para los cubreobjetos de vidrio. Este espacio se mide constantemente a 150-200 micras, lo que permite suficiente intercambio de oxígeno y medio de cultivo al tiempo que proporciona un microambiente con factores tróficos concentradas. Bajo esta condición, las neuronas de baja densidad crecen mucho, y pueden sobrevivir más allá de tres meses en cultivo. Cuando estas neuronas son transfectadas con el plásmido GFP después de tres semanas de cultivo, las dendritas están profusamente salpicado de espinas dendríticas. Como prueba de principio, los datos se presentan para mostrar que este sistema de co-cultivo apoya culturas ultra-baja densidad de neuronas del hipocampo sembradas en poli-D-lisina 'micro-islas', donde las neuronas forman conexiones autaptic que pueden facilitar la investigación de células , mecanismos independientes de la red -autonomous.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Arizona, y se ajustaban a las directrices del NIH.
1. El tejido del hipocampo Fuente de Neurona Cultura
- Para generar crías prenatales de ratón para el cultivo de neuronas del hipocampo, utilizar ratones en tiempo de embarazo (C57Bl6 / J) que se crían en la casa 17. Al día con la detección del tapón vaginal se designa como E0.5. El tiempo de la cosecha prevista para la cultura es E16.5-E17.5.
Nota: Este protocolo describe las culturas de dos placas de 24 pocillos de dos neuronas de alta densidad cocultivo con las neuronas de baja densidad (48 cubreobjetos en total). Para más placas, materiales y reactivos se pueden ampliar correspondientemente.
2. Las placas de 24 pocillos de preparación para alta densidad de cultivos de neuronas
Nota: Realice los pasos siguientes (2-3) el día antes de la cosecha planificada de embriones.
- Trae dos de 24 pocillosplacas en la campana de cultivo celular, abrir el envase individual.
- Conectar una aguja de 18 G a una jeringa 1 ml de plástico de un solo uso de la jeringa.
- Mantenga la jeringa, y el objetivo de la punta de la aguja en ~ 1 mm a la izquierda del centro de la parte inferior del pozo. Aplicar una fuerza moderada (~ 250 g) para grabar la parte inferior del pozo (~ 1 mm de largo). Una ranura se formará y los materiales de plástico desplazado formará un soporte de elevada por encima de la superficie de pocillos de fondo plano. Etch otra ranura paralela ~ 1 mm de longitud en ~ 1 mm a la derecha del centro de la parte inferior de una manera similar.
- Repita este paso para todos los pocillos de las placas de 24 pocillos. Las dos placas de 24 pocillos utilizados para el cultivo de alta densidad están ahora listos para el revestimiento con poli-D-lisina (véase el paso 3.8 más adelante).
3. Los cubreobjetos Preparación de baja densidad cultivos de neuronas
- Utilice diámetro # 1 redondo de vidrio de 12 mm.
- Introducir 50 cubreobjetos dentro de un diámetro de 100 mm placa de Petri de plástico estéril, y sumergir cubreobjetosen solución de etanol 20 ml 70%. Coloque esta placa de Petri en una plataforma giratoria con moderada (70 rpm) Velocidad de rotación durante una hora. Retirar el 70% de etanol y luego reemplazarlo con un nuevo lote de 70% de etanol. Rotar y lavar durante otra hora.
- Desechar la solución de limpieza de etanol al 70%. Añadir agua estéril (filtrado a través de la unidad de filtro de 0,2 micras). Enjuagar los cubreobjetos rigurosamente mediante la rotación de la placa de Petri con la mano. Enjuague tres veces, cada vez reemplazando con agua fresca estéril.
- Coloque la placa de Petri con cubreobjetos dentro de una campana de cultivo celular estéril con flujo laminar. Aspirar el agua de lavado a través de la línea de vacío, y añadir 10 ml de agua filtrada estéril para sumergir a los cubreobjetos. Los cubreobjetos deben ser estériles y la superficie deben ser lo suficientemente limpia para el recubrimiento de poli-D-lisina.
- Abra dos placas de 24 pocillos de su embalaje individual, y los colocan en la campana.
- Encienda la línea de vacío en la campana. Conectar una punta de pipeta de 200 l a la línea de vacío, y utilizar un LICsor para cortar la punta para crear una abertura más grande.
- Utilice una punta fina # 5 pinzas para recoger cubreobjetos de la placa de Petri, uno a la vez, y el uso de la línea de vacío para secar completamente el cubreobjetos. A continuación, coloque un cubreobjetos en cada uno de los pocillos de la placa de 24 pocillos. Los cubreobjetos 50 limpiados deben ser suficientes para llenar cada uno de los pocillos de las placas de 24 pocillos.
- Diluir la solución madre de poli-D-lisina (1 mg / ml) en solución de trabajo (0,1 mg / ml) con tampón de borato (pH 8,5). Para las cuatro placas de 24 pocillos (incluyendo dos placas de alta densidad con fondo grabado al agua fuerte), preparar 30 ml de solución de trabajo total.
- Añadir 300 solución de trabajo de poli-D-lisina l 0,1 mg / ml a cada pocillo con cubreobjetos de vidrio. Asegúrese de que los cubreobjetos se sumergen completamente en solución. Si no es así, utilice la punta de las pinzas # 5 para presionar hacia abajo cubreobjetos contra el fondo del pozo, y el uso de la punta para guiar solución de poli-D-lisina para cubrir toda la superficie de los cubreobjetos. inspeccionar visualmente todos los cubreobjetos para hacer sure hay aire quedó atrapado entre la placa y cubreobjetos.
- Añadir 300 l 0,1 mg / solución de trabajo de poli-D-lisina ml a cada pocillo de la placa de cultivo de alta densidad con parte inferior grabado al agua fuerte. Girar a mano para difundir la solución para cubrir todo el fondo del pozo.
- Devolver todos los cuatro placas con poli-D-lisina a la incubadora de cultivo, y se incuba O / N.
4. Lavado y acondicionamiento previo Platas de Cultura
Nota: Los pasos siguientes (4-9) se llevan a cabo en el día de la cosecha de tejidos.
- Después de la incubación / recubrimiento de cubreobjetos y placas de 24 pocillos S / N, tenga todos los cuatro placas (dos con cubreobjetos donantes, dos placas de alta densidad aceptores con fondo de plástico grabado al agua fuerte) en la campana de cultivo. Utilice la línea de vacío para eliminar la solución de poli-D-lisina.
- Inmediatamente después de la eliminación de la solución de poli-D-lisina, añadir ~ 1 ml de agua estéril a cada pocillo usando una pipeta de transferencia de plástico. Después de que todos los pocillos se llenancon agua, dejar reposar durante 10 minutos. Eliminar el agua por vacío, a continuación, añadir 300 l medio de lavado en cada pocillo para cubrir el fondo del pozo (con o sin cubreobjetos de vidrio). No permita que el recubrimiento con poli-D-lisina se seque.
- Devolver las cuatro placas al incubador celular. Las placas están listas para usar una vez que las neuronas del hipocampo dispersas se preparan.
5. Preparación del medio de cultivo completo, y la tripsina solución de digestión enzimática
- Preparar 60 ml de medio de cultivo completo por mezcla de los ingredientes (ver Materiales). Usar una jeringa de 50 ml conectado con un filtro de jeringa de tamaño 0,2 micras de poro, se filtra el medio de cultivo completo en dos tubos de 50 ml cónicos. Cada tubo contiene 30 ml de medio de cultivo completo.
- En un tubo cónico de 50 ml separado, añadir ~ 30 ml de medio de lavado (ver Materiales) y calentarlo hasta 37 ° C. Esto se utiliza para lavar el tejido después de la digestión enzimática.
- Preparar el medio de digestión enzimática. En una de 15 mtubo cónico de l, añadir 4,5 ml de medio de lavado y solución de tripsina 0,5 ml 2,5%, y 50 l 100X DNasa I.
- Coloque el medio de cultivo completo, medio de lavado, y la enzima medio de la digestión en un baño de agua a 37 ° C.
6. Preparación de herramientas quirúrgicas
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos en una bolsa de esterilización: dos tijeras pequeñas, un par de pinzas y dos # 5 pinzas.
7. La eliminación de los cerebros de E16.5-E17.5 embriones de ratón, y la disección de los hipocampos
- Preparar dos 10-cm petri llenas de platos, solución enfriada con hielo estéril salina equilibrada de Hank (HBSS).
- La eutanasia a la presa de ratón con una inyección intraperitoneal de fenobarbital sódico (100 mg / kg en un volumen de ~ 0,5 ml). Después de la inyección, una vez que la presa pierde respuesta a la pizca dedo del pie, sacrificar con dislocación cervical.
- Rocíe el área del abdomen de la madre con 70% de etanol, y hacer una larga incisión de 2 cm a lo largo de la línea media del abdomen para exponerel útero.
- La toma de embriones y colocar los individuales en una placa de Petri de diámetro de 10 cm con disección fría tampón HBSS.
- Mantenga el embrión por el cuello con una pinza, y el uso de una pequeña tijera para hacer el primer corte justo en la línea media por debajo del nivel del cerebelo y la sección a través del tejido cerebral. No decapitar al embrión.
- Inserte la punta derecha de la pequeña tijera de región caudal que se corta abierta, todo el camino a través de la parte rostral del cerebro embrionario (no hacer la línea media transversal), y haga un corte en el lado izquierdo a nivel de la base del cráneo.
- Inserte la punta de tijera lateral izquierda de nuevo para hacer un corte en el lado derecho. Deja una banda estrecha de los huesos del cráneo sin cortes y tejidos de la piel en el extremo rostral, de manera que todo el cerebro puede dar la vuelta a un lado para la extracción fácil.
- Use la punta de tijera para sacar el cerebro embrionario en la solución de HBSS. Inspeccionar el cerebro bajo un microscopio de disección. El cerebro debe estar intacto sin bruta corte-oregiones ff.
- Repita estos pasos para recoger todos los cerebros de embriones.
- Recoger todos los cerebros intactos en una nueva placa de Petri que contiene 20 ml de tampón HBSS frío. Coloque la placa de Petri bajo un microscopio de disección.
- Ver el cerebro de un lado ventral. Mientras mantiene pulsado el cerebro con una pinza en el extremo caudal, inserte un fuerte # 5 pinzas en diagonal para hacer un corte entre el punto medio y rostral la región caudal-temporal. Repita este procedimiento para el otro hemisferio. Después de cortar, separadas dos hemisferios con hipocampo intacto del resto de los tejidos del tronco cerebral.
- Repita este procedimiento para cada uno de los cerebros.
- En común todos los hemisferios disecados, y quitar las meninges utilizando dos pares de pinzas # 5.
- Identificar el hipocampo en desarrollo como una estructura curva que se pliega dentro del lóbulo temporal. Alternar los dos pares de pinzas para separar el hipocampo de tejidos contiguas corticales. Recoger y reunir toda la hippocamtejido pi (véase la figura 1).
8. La digestión enzimática, separada en neuronas individuales
- Usando una pipeta de transferencia de plástico, la transferencia de todos los hipocampos diseccionado en la solución de digestión enzimática que contiene 5 ml de medio de lavado con 0,25% de tripsina + 1X DNasa I en un tubo cónico de 15 ml.
- Se coloca el tubo en el interior de un baño de agua y se incuba a 37 ° C durante 25 min, con inversora suave intermitente del tubo una vez en cada 5 min.
- Después de 25 minutos, retire con cuidado la solución enzimática utilizando una pipeta de plástico de mano por aspiración. Añadir medio caliente de lavado a 10 ml y lavar suavemente el tejido invirtiendo lentamente el tubo 5 veces. Retire el medio de lavado, y añadir 10 ml de medio de lavado de nuevo por un lavado adicional.
- Retire el medio de lavado, y añadir 3 ml de medio de lavado con agua tibia fresca de nuevo. Agitar el tubo con la mano rigurosamente durante 15 horas para desalojar las neuronas digeridos desde el tejido. El medio debe ser turbia vez que las células unare separada del tejido en el medio de lavado. Recoger la suspensión celular en un nuevo tubo de 15 ml cónico, dejando el tejido restante en el tubo.
- Añadir otro medio de 2 ml de lavado en el tejido, y separar suavemente el tejido restante por trituración a través de una pipeta de plástico para ~ 15 veces. Dejar reposar durante 5 minutos. Aunar la suspensión de células en el nuevo tubo cónico de 15 ml que contiene células recogió 'Shake-off'.
- Contar la densidad de las neuronas con un hemocitómetro. Típicamente, 3.000-5.000 células por microlitro se pueden obtener en función del número de embriones disecados. Se estima que un número medio de 2,5 x 10 7 neuronas si se supone que seis embriones se disecan.
- Calcular el volumen necesario de esta suspensión de células para dar una densidad de 250.000 neuronas / ml cuando se añade a los 30 ml de medio de cultivo completo. Añadir este volumen a uno de los dos tubos cónicos de 30 ml que contienen medio de cultivo completo para producir el medio neurona chapado de alta densidad. <li> Transferir 1,2 ml de esta solución neurona de alta densidad a otros 30 ml de medio de cultivo completo para producir una concentración de ~ 10.000 neuronas / ml. Utilice esta dilución para sembrar los cubreobjetos de baja densidad.
9. Chapado de las neuronas y largo plazo Co-cultura
- Llevar las dos placas de 24 pocillos con fondos grabadas para las neuronas de alta densidad en la campana de cultivo celular. Retire el medio precondición 300 l por vacío. Placa 0,6 ml de suspensiones celulares de alta densidad en 250.000 neuronas / ml.
- Llevar las otras dos placas de 24 pocillos con cubreobjetos en la campana de cultivo, y se elimina el medio precondición 300 l por vacío. Placa de 0,6 ml de suspensiones de células de baja densidad a 10.000 neuronas / ml en los cubreobjetos dentro de las dos placas de 24 pocillos.
- Devolver las cuatro placas de 24 pocillos a la incubadora. Deje reposar durante 2 horas.
- Voltear los cubreobjetos de baja densidad con adherir neuronas a la cultura de alta densidad. Asegúrese de que las neuronas se enfrentan entre sí (es decir, nOT separados por el cubreobjetos de vidrio). A continuación, regrese las dos placas con el co-cultivo de la incubadora.
Sostenimiento 10. Co-cultura
- Alimentar co-cultivos mediante la adición de 300 l medio de alimentación fresco (ver Materiales) en días in vitro (DIV) 5. No hay necesidad de eliminar 50% de medio de cultivo completo original, según lo informado por muchos otros estudios. El medio de alimentación también contiene 15 mM arabinósido de citosina (Ara-C, para dar una concentración final de 5 mM) para reducir al mínimo la posibilidad de contaminación y proliferación glia.
- Después de esta primera alimentación, añadir 300 l medio de alimentación fresca y sin Ara-C para el bien cada semana. En caso de que la cultura se mantuvo durante más de un mes, reemplace la mitad del medio con medio fresco cada semana alimentación más allá de un punto de tiempo de mes (con la primera mitad de reemplazo de medio a DIV33). Morfológicamente, tanto de alta densidad y de baja densidad de neuronas se ven saludables hasta tres meses (el tiempo más largo observado por el experimenters).
11. Ilustración de una experimental Manipulación de baja densidad neurona transfección
Nota: Cuando se desea la transfección en las neuronas de baja densidad, un protocolo de fosfato de calcio simple puede ser adoptado. Hemos encontrado que los cultivos de baja densidad tienen una mejor eficacia de la transfección con el protocolo de fosfato de calcio antes de DIV12, pero se pueden transfectar con mucha menor eficiencia en DIV21 o más, tiempo durante el cual las espinas dendríticas son prominentes. La viabilidad de la transfección de la neurona cultivadas de baja densidad se ilustra mediante la transfección de las neuronas con un plásmido pEGFP-C3 (ver más abajo).
- En DIV21, eliminar 600 l medio condicionado de cada pocillo de la co-cultivo, y transferirlo a una nueva placa de 24 pocillos. A continuación, añadir 600 l de medio fresco de avance para el co-cultivo para que vuelva al volumen original.
- La transferencia de los cubreobjetos en la nueva placa de 24 pocillos con 600 l de medio condicionado. Asegúrate quelas neuronas de baja densidad se vean hacia arriba. Colocar las placas de alta densidad y las nuevas placas con cubreobjetos de la espalda en la incubadora.
- Se preparan dos tubos de 1,5 ml estériles. En uno de los tubos, añadir 600 l de HEPES 2X solución salina (HBS) amortiguada. Calcular el volumen de pEGFP-C3 ADN 12 g basado en la concentración de plásmido. En el otro tubo, añadir 74 l (Stock 2 M) CaCl 2 y el volumen de agua que después de la adición de plásmido hará 600 l. Mezclar bien con la pipeta y luego añadir el ADN plásmido. Poco a poco mezclar bien. Deje que los dos tubos se calienten durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Mientras que la mano que sostiene el tubo-2X HBS y moderadamente agitando la solución en un mezclador, añadir todos los 600 l de la solución caiga en el ADN-CaCl2 a gota con los 600 l tubo de 2X HBS. Es crítico que el precipitado formado está en la forma de gránulos 'de arena fina. Mezcla demasiado fuerte y demasiado rápido no es deseable, ya que será más probable producir grandes 'precipitados flake'-como la nieve, which tiene mucho más baja eficacia de transfección basado en nuestras observaciones.
- Deje el precipitado continuar para formar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.
- Añadir precipitado de 100 l a cada pocillo que contiene las neuronas de baja densidad en los cubreobjetos, gota a gota y de manera uniforme. Devolver la placa a la incubadora, y se incuba durante 2 horas. Suponiendo la mayor parte del CaCl 2 está en forma libre, esto resulta en una concentración de ~ mM Ca 2 + 17.6, que puede ser tóxico para las neuronas después de la incubación prolongada.
- Preparar un tubo cónico de 50 ml con medio de ~ 50 ml de lavado, deje que se caliente hasta 37 ° C.
- Al final de 2 h, llevar la neurona de baja densidad con fosfato de ADN-calcio precipitados en la campana. Recoge cada cubreobjetos individuo con una fuerte # 5 pinzas, y la inmersión tres veces en el medio de lavado 50 ml para lavar brevemente. Entonces volver a las neuronas de alta densidad en sus placas de co-cultivo originales, con las neuronas de baja densidad hacia abajo.
- Continuar con el cultivo hastalas neuronas de cultivo de baja densidad sobre cubreobjetos se cosechan para los estudios.
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Representative Results
El protocolo descrito aquí permite éxito densidad ultra-baja, cultivo a largo plazo de las neuronas glutamatérgicas puro sin la necesidad de células de la glia que actúa como una capa de alimentación. El protocolo se esquematiza en la Figura 1, que implica la preparación de alta densidad (en poli-D-lisina recubierto de 24 pocillos) y las neuronas de baja densidad (en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-D-lisina) por separado, y la posterior co-cultivo que puede mantenerse hasta tres meses.
Figuras 2A y 2B son ilustraciones de las neuronas de alta densidad y de baja densidad a los 5 días después de la siembra. cultura de baja densidad es de aproximadamente 30 veces menos de la densidad. Los dos neuronas se someten a etapas del desarrollo típico como se indica por Kaech y banquero (2006). En el día 14, ambos de alta densidad y de baja densidad de neuronas muestran estructuras dendríticas elaborados, según lo revelado por DIC imágenes (Figuras 2C,D, tenga en cuenta los dos paneles son del mismo campo con diferentes planos focales, como se muestra por la ubicación de etch). Cuando estas neuronas se tiñeron con anticuerpos MAP2 para revelar las dendritas, no hubo diferencias significativas en el número de dendritas (t 13 = 1,27, p> 0,05; medido por el número dendríticas punta) y la longitud dendrítica total de (t 16 = 1,41, p> 0,05 ) por neurona entre la alta densidad y de baja densidad de neuronas se encuentran (Figura 2 e, F).
La inmunocitoquímica etiquetado se utiliza para revelar las sinapsis glutamatérgicas funcionales. Utilizamos doble tinción para marcar el receptor de NMDA NR1 subunidad y la subunidad del receptor AMPA GluR1 (Figura 3A), y las sinapsis funcionales (co-localizados en puntos lagrimales amarilla) pueden ser fácilmente identificados y cuantificados usando ImageJ. neuronas de baja densidad también se marcan con anticuerpo contra dendríticas MAP2 marcador de proteína,en combinación con marcador de proteína axonal p-Tau. Esta doble etiquetado permite una clara distinción de las dendritas y axones (Figura 3B). Cultivos de baja densidad también se pueden transfectar con éxito con plásmidos de ADN utilizando métodos de fosfato de calcio, aunque la tasa de transfección es típicamente muy baja en etapas posteriores (<0,2% de las neuronas cuando se transfecta en DIV21). La Figura 3C ilustra que EGFP transfección puede revelar la morfología neuronal, y hacer que las estructuras de la espina dendrítica finas visibles. Por último, como una prueba de concepto, las neuronas de ultra-baja densidad pueden ser cultivadas bajo condiciones que promueven la formación de autapse (Figura 3D). Estas neuronas autaptic ultra baja densidad cultivadas en poli-D-lisina revestidos 'micro-islas pueden ser sostenidas por la neurona alimentador de alta densidad de más de 2 meses con este protocolo de co-cultivo.
<strong> Figura 1. Ilustración esquemática de la alta densidad y el protocolo de baja densidad de co-cultivo. (A) de ratón E16.5-E17.5 cerebros de embriones se recogen, hipocampos se diseccionaron y se digirieron con tripsina. (B) hipocampos digeridos se lava, se separa en las neuronas individuales, y en placas a alta densidad (250.000 células / ml) en placas de 24 pocillos; Mientras tanto, de baja densidad (10.000 células / ml), las neuronas se sembraron en cubreobjetos. Los pocillos para el cultivo de alta densidad están grabados con una aguja de jeringuilla 18 G para proporcionar un soporte elevado para los cubreobjetos. (C) Ilustración de la co-cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Tanto alta densidad y de baja densidad de neuronas han codesarrollo morfológico mparable en co-cultivo. (A, B) Las fotomicrografías que muestran densidad de placas tanto de alta densidad y la capa de baja densidad. Imágenes (C, D) DIC que muestran un amplio crecimiento de neuritas en tanto alta (C) y (D) las neuronas de baja densidad. Las neuronas de baja densidad sobre cubreobjetos están descansando justo encima de las neuronas de alta densidad. Tenga en cuenta la ubicación del soporte de plástico elevada. Etiquetado (E) La inmunocitoquímica de la proteína MAP2 dendríticas. (F) La cuantificación (media ± SEM) de la longitud dendrítica total y el número de punta dendrítica por neurona. No hay diferencia significativa (ns) se observó entre alta densidad y de baja densidad de neuronas cultivadas en co-cultivo. La barra de escala en (B, C), 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. manipulaciones experimentales de las neuronas de baja densidad cultivadas en co-cultivo. (A) etiquetado inmunocitoquímica en cultivo de baja densidad permite la identificación de sinapsis funcional definido por la co-etiquetado de GluR1 (verde) y NR1 (rojo). (B) Co-etiquetado de proteína dendrítica neuronal MAP2 (magenta) y la proteína axonal p-Tau (verde). (C) Una neurona del hipocampo de baja densidad transfectadas con pEGFP-C3 plásmido, que muestra las espinas dendríticas profusas. (D) Una neurona de baja densidad preparado en poli-D-lisina 'micro-isla', y se cultivaron en la parte superior de las neuronas de alta densidad. Un electrodo de parche de grabación se llena la neurona con Alexa-555 hidrazida para revelar la morfología de la neurona. La barra de escala en AD, 20 micras.7fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se presenta un protocolo detallado para el cultivo a largo plazo de ultra baja densidad de neuronas glutamatérgicas del hipocampo en condiciones libres de suero. En 2000 ~ neuronas / cm2, la densidad es al menos dos veces menor que la mayoría de los preparativos de baja densidad 'de cultivo con o sin el apoyo glía reportado por la literatura existente 2,3,11,13,14. Además de ser ultra-baja densidad, este protocolo es nueva y significativa en dos formas más. En primer lugar, no se necesita ninguna capa de alimentación de células gliales como las neuronas de baja densidad obtener apoyo factor trófico de las neuronas de alta densidad que están dentro de la proximidad física, a pesar de que no hay conexiones sinápticas o el contacto directo entre las neuronas cultivadas en diferentes densidades. Este protocolo elimina la necesidad de preparar monocapa glia por delante de los experimentos de cultivo previstas, y permite tanto de alta densidad y los cultivos de baja densidad a crecer de forma simultánea. Preparación de la monocapa de glia puede consumir mucho tiempo y laborious la literatura, y la mayoría utiliza las cortezas de las crías de rata neonatal 2. Por lo tanto, para los laboratorios que trabajan con sólo los ratones, esto requiere esfuerzos adicionales significativos. Más importante aún, en experimentos en los que se investigan los mecanismos específicos neuronales, la presencia de la glía en el co-cultivo puede ser indeseable, ya que evita efectos atribuir observado específicamente a las neuronas, glia, o la interacción entre los dos tipos de células 10. Además, para el cultivo de células gliales, suplemento de suero es obligatorio 2,15, y esto puede contaminar la glía-neurona co-cultivo e introducir factores de confusión adicionales. Una característica importante de nuestro protocolo es que el co-cultivo es bajo condiciones de medio definido. Nosotros usamos estrictamente el medio de cultivo completo y sin suplemento de suero, y encontramos que si el horario de cambio medio de cultivo se sigue estrictamente, el co-cultivo puede ser sostenido por más de tres meses, lo que debería satisfacer a la mayoría de los experimentos. Debido a que prácticamente no haypresencia glía, una limitación de esta técnica es que se debe tener precaución cuando se comparan con los resultados de la literatura que utilizan glía-neurona co-cultivos.
Otro aspecto novedoso de este protocolo es que usamos un método simple para crear un micro-espacio efectivo entre las neuronas de alta densidad que crecen en la parte inferior de la placa de 24 pocillos, y la neurona baja densidad adherido a los cubreobjetos de vidrio se sienta justo encima. Estudios previos utiliza puntos de parafina aplicadas a los cubreobjetos recubiertos de elevar los cubreobjetos en ~ 500 m por encima de la capa de alimentación de células gliales 2,8,9. Preparación de puntos de parafina requiere que el tamaño y la temperatura adecuada, lo que exige una cantidad razonable de esfuerzo y práctica. En comparación, un grabado simple en los plásticos pocillos de fondo con una aguja de 18 G proporciona soporte para los cubreobjetos, así como una buena separación entre las dos capas de neuronas. Hemos utilizado un equipo de grabación de patch clamp con metro Z digital para determinar la linespacio del oído entre las dos capas de neuronas, centrándose en la alta densidad y luego en las capas de baja densidad utilizando un objetivo de inmersión en agua 60X, y se encontró que el espacio es típicamente 150 a 200 micras (179,4 +/- 25,3 m, n = 5 ). Este espacio más estrecho (en comparación con la generada por los puntos de cera) es probable que se traducen en un aumento más rápido, y una mayor concentración de factores neurotróficos, por lo tanto, la prestación de apoyo suficiente para que la neurona de baja densidad para crecer. A pesar de que este espacio estrecho puede plantear preguntas sobre el tipo de cambio medio de cultivo y si el espacio más pequeño impide neuronas a partir de la obtención de oxígeno y el apoyo nutricional, nuestros resultados muestran que esto no es probable una preocupación. Por el contrario, hemos encontrado que las neuronas de alta densidad en virtud de los cubreobjetos también crecen mejor (mayor tasa de supervivencia, árbol dendrítico más elaborada y más puntos lagrimales sináptica por tinción NR1, datos no mostrados) en comparación con los altos neuronas de densidad de la misma preparación, pero sin la superposición de coverslips. Por lo tanto, este sencillo protocolo no sólo es rápido, simple, pero también muy eficaz en el mantenimiento tanto de alta densidad y de baja densidad de neuronas.
El cultivo de las neuronas del hipocampo in vitro requiere recubrimiento de promotores del crecimiento sustratos, tales como poli-D-lisina y / o laminina / colágeno 5,16. Aunque meticulosa selección y preparación de cubreobjetos de vidrio son críticos para la supervivencia neuronal eficaz, se ha encontrado que con el vidrio de cubierta se seleccionaron, una limpieza a fondo con 70% de etanol es suficiente, lo que anula la necesidad de un tratamiento más severo (por ejemplo, ebullición en ácidos) de los cubreobjetos. Después los cubreobjetos se limpian en etanol y se secaron al vacío, el cristal parece ser hidrófobo debido al revestimiento original. Sin embargo, el recubrimiento con éxito de 0,1 mg / ml de poli-D-lisina en tampón de borato deben convertir los hidrófila la superficie de vidrio, de modo que cuando los cubreobjetos son recogidos desde el agua de lavado, una capa uniforme de agua que es de manera uniformela difusión a través de toda la superficie del vidrio se puede observar. Hemos encontrado que esto es de importancia crítica. De lo contrario, las neuronas más probable morir después de la siembra debido al recubrimiento insuficiente. Aunque las neuronas del hipocampo única baja densidad se prueban en este protocolo, se espera que otros tipos neuronales (por ejemplo, las neuronas corticales, neuronas granulares de cerebelo, o poblaciones neuronales especializados) también se pueden mantener a baja densidad en presencia de un alimentador de la neurona de alta densidad capa. Por último, cuando se sigue este sencillo protocolo, se puede esperar para cosechar las neuronas sanas de ultra-baja densidad. Amplias aplicaciones tales como el etiquetado inmunocitoquímica, imágenes en vivo, los estudios morfológicos y el registro electrofisiológico todos pueden llevarse a cabo sobre estas neuronas siguientes procedimientos estándar 16,17.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
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