Abstract
Odling primära hippocampus neuroner in vitro underlättar mekanistiska förhör av många aspekter av nervsystemets utveckling. Dissocierade embryonala hippocampus nervceller kan ofta växa framgångsrikt på glastäck vid hög densitet under serumfria betingelser, men låg kulturer densitet kräver normalt en leverans av trofiska faktorer genom samtidig odling av dem med en glia matarskikt, beredning kan vara tidskrävande och mödosam. Dessutom kan närvaron av Glia påverka bedömning av resultat och utgör hinder för studier om neuronspecifika mekanismer. Här är en förenklad metod presenteras för ultralåg densitet (~ 2000 nervceller / cm2), långsiktigt (> 3 månader) primär hippocampus neuron kultur som är under serumfria förhållanden och utan glia cell stöd. Låg densitet neuroner odlas på poly-D-lysin belagda täckglas, och vänt på höga densitet neuroner odlade i en 24-brunnsplatta. Istället för att använda paraffin punkter för att skapa ett utrymme between de två neuronala skikten, kan praktiker helt enkelt etsa plast botten av brunnen, där de höga densitet nervceller bor, för att skapa en microspace främjar låg densitet neuron tillväxt. Co-kultur kan lätt upprätthållas under> 3 månader utan betydande förlust av låga neuroner densitet, vilket underlättar den morfologiska och fysiologiska studier av dessa nervceller. För att illustrera detta framgångsrika odlingsbetingelser, är uppgifter som lämnats för att visa riklig synaps bildning i låg densitet celler efter långvarig kultur. Detta samodlingssystem underlättar också överlevnaden av glesa enskilda neuroner odlade i öar av poly-D-lysin substrat och därmed bildandet av autaptic anslutningar.
Introduction
Växande hippocampus nervceller under in vitro-betingelser möjliggör observation och experimentell manipulation av dessa nervceller som annars inte är möjligt in vivo. Denna experimentella metod används ofta för att avslöja neuronala mekanismer för tillväxt, polaritet, neurite specifikation, trafficking och subcellulär lokalisering av proteiner, synaps bildning och funktionell mognad en. Dessa in vitro odlade hippocampus nervceller, när skördas från sena embryonala stadier, är relativt ren (> 90%) glutamaterga celler av pyramidal morfologi 2. Eftersom neuroner odlades i en 2-D yta under in vitro-betingelser, medger denna metod underlättar observation, såsom levande avbildning eller immuncytokemi (ICC) färgning genom ett enda fokalplan 3; eller manipulationer, såsom läkemedelsbehandling och transfektioner 3-6. När odlas vid hög densitet, nervceller tenderar att ha höga överlevnad på grund av högre concentrations av utsöndrade tillväxtfaktorer förutom matsmältnings stöd från tillväxtmediet, och även på grund av neurit-kontaktberoende mekanismer 7. Emellertid låg densitet hippocampala neuroner är önskvärda för morfologiska studier, där en enskild neuron kan avbildas i sin helhet eller som färgats för ICC-analys. Låg densitet nervceller är svåra att upprätthålla i kultur på grund av bristande parakrina stöd och kräver därför ofta trofiska stöd från en gliaceller (typiskt kortikal astrocyter) matarskikt, som måste framställas före neuron kultur 2. När samodlas med en gliaceller feeder lager, är låg nervceller densitet odlas på täck, och sedan vänt ovanpå Glia skiktet så att de låga nervceller densitet och glia är vända mot varandra. Ett litet trångt utrymme mellan glia och neuroner skapas genom att placera paraffin vax prickar på hörnen av täck, därför att skapa en "sandwich" layout 2,8,9. De låga nervceller densitet kommer att växa wnom det begränsade utrymmet mellan Glia och täckglaset, vilket skapar en tillåtmikromiljö med koncentrerade faktorer utsöndrade av neuroner och glia. Detta tillvägagångssätt ger låg densitet, fullt utvecklade nervceller som är placerade någorlunda isär, därför underlättar ICC märkning eller levande imaging studier.
En uppenbar nackdel med neuron-glia samodling, bortsett från att vara tidsödande och arbetskrävande, är att det förhindrar studium av neuronspecifika, eller cellautonoma, mekanismer. Även om detta system är mycket mindre komplex än in vivo nervvävnad, glia inverkan på neuron utveckling genom utsöndrade, ännu-inte-helt-definierade faktorer kan förväxla experimenten 10. Därför i experiment som kräver utredning av neuron specifika mekanismer, definierade odlingsbetingelser som tar bort serum och glia stödskiktet är nödvändiga. En tidigare studie har lyckats odla låga koncentrationer av neuroner (~ 9000 celler / cm 2) med användning av en three dimensionell hydrogelmatris 11. Eftersom en relativt ren neuronal population kan odlas vid hög densitet under serumfria betingelser utan glial stöd, vi hypotesen att ultra-låg densitet av hippocampusneuroner kan odlas i serumfritt definierat odlingsmedium genom samodling dem med hög densitet neuroner, i ett sätt som är analogt med den konventionellt antagit neuron-glia samodling. I själva verket, med hög densitet hippocampus neuron kulturer i en "sandwich" konfiguration har nyligen använts för att stödja ett litet antal specialiserade magnocellulära endokrina neuroner 12.
Därför kan co-kultur med hög densitet nervceller tillåta låg nervceller densitet att få trofiska faktorer stöd som är tillräcklig för att möjliggöra långsiktig överlevnad. Detta protokoll att odla extremt låg densitet neuroner således formuleras och valideras. Protokollet kan genomföras inom ett enda experiment, genom att förbereda hög densitet (~ 250.000 celler / ml) distressebolag hippocampus neuroner först, och sedan göra en utspädning för att ge en densitet ~ 10000 neuroner / ml (~ 3000 nervceller / täck, eller ~ 2.000 neuroner / cm2), vilket är mycket lägre än de flesta rapporterade låg densitet kulturer 2,3,9 , 11,13. Denna kultur tillstånd löst kallad ultra-låg densitet "kultur och används med" låg densitet "inter-changeably. De höga densitets neuroner stryks ut på poly-D-lysin belagda 24-brunnars plattor; medan de låga neuroner densitets ympas på poly-D-lysin belagda 12-mm täckglas av glas som är placerade inuti en annan 24-brunnars platta. Täck med vidhäftande låg nervceller densitet är vänt ovanpå hög densitet nervceller två timmar senare efter nervceller härstammar och fästa vid täck. Dessutom istället för att använda paraffinvax prickar för att höja täckglasen ovanför hög densitet neuronskikt ades ett 18 G sprutnål för att etsa ned i plattor med 24 brunnar med två parallella ränder. Den resulterande deplAced, angränsande plast ger en förhöjd stöd för glastäck. Detta utrymme är konsekvent mäts vid 150-200 ^ m, vilket tillåter tillräckligt med syre och odlingsmediet utbyte samtidigt som den ger en mikromiljö med koncentrerade trofiska faktorer. Under detta tillstånd, de låga nervceller densitet växa i stor utsträckning, och kan överleva mer än tre månader i odling. När dessa neuroner transfekteras med GFP-plasmid efter tre veckor i odling, är dendriterna ymnigt översållad med Dendritutskotten. Som ett bevis på princip uppgifter presenteras för att visa att detta samarbete kultur Systemet stöder ultralåg densitet kulturer av hippocampus nervceller seedade på poly-D-lysin "mikro öar", där nervceller bildar autaptic anslutningar som kan underlätta utredning av cell -autonomous, nätverksoberoende mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer som involverar möss godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Arizona, och överensstämde med NIH riktlinjer.
1. vävnadskälla för hippocampus Neuron kultur
- För att generera prenatal mus valpar till hippocampus neuron kultur, använda tids dräktiga möss (C57BL6 / J) som föds upp i huset 17. Dagen med vaginal plug-avkänning betecknas som E0.5. Den planerade skördetid för kultur är E16.5-E17.5.
Obs: Detta protokoll beskriver kulturer av två 24-hålsplattor av två hög densitet neuroner samodling med låg densitet neuroner (48 täck totalt). För fler plattor, material och reagens kan skalas på motsvarande sätt.
2. 24-brunnsplattor Förberedelse för High Density Neuron kulturer
Obs: Utför följande steg (2-3) dagen före den planerade skörden av embryon.
- Ta två 24 välplattor i cellodling huven, öppnar den individuella förpackningen.
- Ansluta en 18 G sprutnål till en 1 ml plastengångsspruta.
- Håll sprutan, och sikta nålspetsen vid ~ 1 mm kvar till mitten av botten av brunnen. Tillämpa måttlig kraft (~ 250 g) för att etsa botten av brunnen (~ 1 mm långa). Ett spår kommer att bildas och plastmaterial förskjutna kommer att utgöra en förhöjd stöd ovanför den plana botten brunnens yta. Etsa en annan ~ 1 mm långt parallella spår vid ~ 1 mm till höger om mitten av botten på ett liknande sätt.
- Upprepa detta steg för alla brunnarna i två 24-brunnars plattor. De två 24-brunnars plattor som används för hög densitet kultur är nu redo för beläggning med poly-D-lysin (se steg 3.8 nedan).
3. Täck Förberedelse för Low Density Neuron kulturer
- Använd 12-mm diameter # 1 runda glas.
- Placera 50 täck inuti en 100 mm diameter steril petriskål av plast, och dränka täcki 20 ml 70% etanollösning. Placera petriskål på en roterande plattform med måttlig (70 rpm) rotationshastighet för en timme. Ta bort 70% etanol och sedan ersätta med en ny sats av 70% etanol. Rotera och tvätta ytterligare en timme.
- Kassera 70% etanol rengöringslösning. Tillsätt steril vatten (filtrerades genom 0,2 | j, m filterenhet). Skölj täckglasen noggrant genom att rotera petriskålen för hand. Skölj tre gånger, varje gång ersätta med färskt sterilt vatten.
- Placera petriskål med täck inuti en steril cellodling huva med laminärt flöde. Aspirera sköljvattnet genom vakuumledningen och tillsätt 10 ml filtrerade sterilt vatten att doppa täck. Täck bör vara steril och ytan ska vara ren nog för poly-D-lysin beläggning.
- Öppna två 24-hålsplattor från deras individuella förpackningar, och placera dem i huven.
- Slå på vakuumledningen i huven. Ansluta en 200 mikroliter pipettspets till vakuumledningen, och använda en SCIsor för att skära spetsen för att skapa en större öppning.
- Använda en fin spets # 5 pincett för att plocka upp täckglasen från petriskålen, en i taget, och använda vakuumledningen för att fullständigt torka täckglas. Placera sedan en täck i var och en av brunnarna i 24-brunnar. 50 rengjorda täck bör vara tillräckligt för att fylla var och en av brunnarna i två 24-hålsplattor.
- Späd poly-D-lysin stamlösning (1 mg / ml) in i arbetslösning (0,1 mg / ml) med boratbuffert (pH 8,5). För de fyra 24-brunnsplattor (inklusive två hög densitet plattor med etsad botten), förbereda 30 ml av den totala arbetslösning.
- Tillsätt 300 | il 0,1 mg / ml poly-D-lysin arbetslösning till varje brunn med täckglas av glas. Se till att täck är helt nedsänkta i lösningen. Om inte, använd # 5 pincett spetsen för att trycka ner täckglas mot botten av brunnen, och använda spetsen för att vägleda poly-D-lysin-lösning för att täcka hela ytan av täckglas. Inspektera alla täck att SUre ingen luft var instängd mellan plattan och täck.
- Tillsätt 300 | il 0,1 mg / ml poly-D-lysin arbetslösning till varje brunn av den höga densiteten odlingsplatta med etsad botten. Rotera för hand för att sprida lösningen för att täcka hela botten av brunnen.
- Returnera alla fyra plattorna med poly-D-lysin till odlingsinkubator, och inkubera O / N.
4. Tvätt- och Pre-konditionePlattor för kultur
Obs: Följande steg (4-9) genomförs på dagen för vävnads skörd.
- Efter inkubation / beläggning av täckglas och 24-brunnars plattor O / N, bringa alla fyra plattor (två med donetäckglas, två acceptor högdensitets-plattorna med etsad plast botten) in i odlings huven. Använda vakuumledningen för att avlägsna poly-D-lysin lösning.
- Omedelbart efter avlägsnandet av de poly-D-lysin lösning, tillsätt ~ 1 ml sterilt vatten till varje brunn med användning av en plast överföringspipett. När alla brunnarna är fylldamed vatten, låt stå i 10 min. Avlägsna vatten genom vakuum, tillsätt sedan 300 | il tvättmedium i varje brunn för att täcka botten av brunnen (med eller utan täckglas). Låt inte poly-D-lysin beläggning torka ut.
- Returnera alla fyra plåtar till cellen inkubatorn. Plattorna är redo att använda när de spridda hippocampus nervceller framställs.
5. Framställning av Complete odlingsmedium, och trypsinlösning för enzymatisk digerering
- Förbered 60 ml komplett odlingsmedium genom blandning av beståndsdelarna (se Material). Använd en 50 ml spruta förbunden med en 0,2 | im-porstorlek sprutfilter, filtrera komplett odlingsmediet i två 50 ml koniska rör. Varje rör innehåller 30 ml Complete odlingsmedium.
- I en separat 50 ml koniskt rör, tillsätt ~ 30 ml tvättmedium (se Material) och värm upp till 37 ° C. Detta kommer att användas för att tvätta vävnaden efter enzymatisk spjälkning.
- Förbered enzymdigeremediet. I en 15 ml koniskt rör, tillsätt 4,5 ml tvättmedium och 0,5 ml 2,5% trypsin lösning, och 50 ^ 100X DNas I.
- Placera fullständigt odlingsmedium, tvättmedium, och enzymdigerering medium i en 37 ° C vattenbad.
6. Beredning av kirurgiska verktyg
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg i en sterilisering påse: två små saxar, en pincett och två # 5 pincett.
7. Borttagning av hjärnor från E16.5-E17.5 musembryon, och Dissekering av hippocampi
- Förbered två 10-cm petri rätter fyllda med iskall, steril Hanks balanserade saltlösning (HBSS).
- Avliva musen dammen med en intraperitoneal injektion av natrium-fenobarbital (100 mg / kg i en volym av ~ 0,5 ml). Efter injektion, en gång dammen förlorar svar på tå nypa, offra med halsdislokation.
- Spraya dammens buken området med 70% etanol, och göra en 2-cm långt snitt längs mittlinjen av buken för att exponeralivmodern.
- Ta bort embryon och placera enskilda artiklar i en 10-cm diameter petriskål med kallt dissekera HBSS buffert.
- Håll embryot i nacken med hjälp av en pincett, och använda en liten sax för att göra det första snittet höger i mittlinjen under lillhjärnan nivå och avsnitt på hjärnvävnaden. Inte halshugga embryot.
- För in den högra sidan spetsen av den lilla sax från caudal region som skärs upp, hela vägen genom den rostrala delen av den embryonala hjärnan (inte korsmittlinjen), och göra ett snitt på vänster sida på den nivå på skallbasen.
- Sätt i vänster sida sax spets igen för att göra ett snitt på höger sida. Lämna ett smalt band av oklippt skallben och hudvävnad vid rostralt slutet, så att hela hjärnan kan fällas undan för enkel extraktion.
- Använd spetsen på sax att ösa ut den embryonala hjärnan i HBSS lösning. Inspektera hjärnan under ett dissektionsmikroskop. Hjärnan bör vara intakt utan någon brutto cut-off regioner.
- Upprepa dessa steg för att samla alla embryo hjärnor.
- Samla alla intakta hjärnor i en ny petriskål innehållande 20 ml kall HBSS buffert. Placera petriskålen under ett dissektionsmikroskop.
- Se hjärnan från ventrala sidan. Håll ner hjärnan med pincett vid den bakre änden, infoga en skarp # 5 pincett diagonalt för att göra ett snitt mellan mitten rostralt punkten och caudal-temporala regionen. Upprepa detta för den andra halvklotet. Efter kapning, separata två halvklot med intakt hippocampus från resten av hjärnstammen vävnader.
- Upprepa detta för vart och ett av hjärnan.
- Pool alla dissekerade hjärnhalvorna och ta bort hjärnhinnorna med två par # 5 pincett.
- Identifiera utvecklings hippocampus som en krökt struktur som viks i tinningloben. Alternera de två paren av pincett för att separera hippocampus från angränsande kortikala vävnader. Samla och samla alla hippocampi vävnad (se figur 1).
8. enzymatisk uppslutning, separat till en enda Neurons
- Med hjälp av en plast överföringspipett, överföra all dissekerade hippocampi i den enzymatiska nedbrytning lösning innehållande 5 ml tvättmedium med 0,25% trypsin + 1X DNas I i en 15 ml koniska rör.
- Placera röret inuti ett vattenbad och inkubera vid 37 ° C under 25 min, med intermittent försiktig inverterande av röret en gång i varje 5 min.
- Efter 25 minuter, försiktigt bort enzymlösningen med hjälp av en handhållen plastpipett genom aspiration. Tillsätt varmt Wash-medium till 10 ml och tvätta försiktigt vävnaden genom att långsamt vända röret 5 gånger. Ta bort tvättmediet, och tillsätt 10 ml tvättmedium igen för en extra tvätt.
- Ta bort tvättmediet, och tillsätt 3 ml färskt varm tvättmediet igen. Skaka röret för hand noggrant för 15 gånger för att få bort de spjälkade nervceller från vävnaden. Mediet bör bli grumlig när celler enre separeras från vävnaden in i tvättmediet. Samla cellsuspensionen i ett nytt 15 ml koniskt rör medan den kvarvarande vävnaden i röret.
- Lägga till ytterligare två ml tvättmedium till vävnaden, och försiktigt separera kvarvarande vävnaden genom triturering genom en plastpipett för ~ 15 gånger. Låt stå i 5 minuter. Pool cellsuspensionen i den nya 15 ml koniska rör som innehåller samlas "skaka-off 'celler.
- Räkna tätheten av nervceller med en hemocytometer. Typiskt kan 3000-5000 celler per mikroliter erhållas beroende på antalet embryon dissekerade. Ett genomsnittligt antal 2,5 x 10 7 nervceller uppskattas om man antar sex embryon dissekeras.
- Beräkna volymen som behövs av denna cellsuspension för att ge en densitet av 250.000 neuroner / ml vid tillsats till 30 ml komplett odlingsmedium. Lägga till denna volym till en av de två koniska rör innehållande 30 ml komplett odlingsmedium för att ge den hög densitet neuron plätering medium. <li> Överför 1,2 ml av denna höga densitet neuron lösningen till en annan 30 ml komplett odlingsmedium för att ge en koncentration av ~ 10000 neuroner / ml. Använd denna utspädning för att ympa låg densitet täck.
9. plätering av nervceller och Long Term Co-kultur
- Bringa de två 24-brunnars plattor med etsade bottnar för höga densitets neuroner in i cellodlings huven. Ta bort 300 pl förutsättning mediet genom vakuum. Plate 0,6 ml hög densitet cellsuspensioner på 250.000 neuroner / ml.
- Bringa de andra två 24-brunnars plattor med täckglas i odlings huva, och avlägsna 300 pl förutsättning mediet genom vakuum. Plate 0,6 ml lågdensitets cellsuspensioner vid 10000 neuroner / ml på täckglasen inuti de två 24-brunnars plattor.
- Returnera alla fyra 24-brunnsplattor till inkubatorn. Låt sitta i 2 timmar.
- Vänd låga täck densitet med vidhäftande neuroner till hög densitet kultur. Se till att nervceller är vända mot varandra (dvs not åtskilda av glastäck). tillbaka då de två plattorna med co-kultur till inkubatorn.
10. Co-kultur Röstning
- Feed co-kulturer genom att tillsätta 300 pl färsk Feed medium (se Material) vid dag in vitro (DIV) 5. Det finns inget behov av att ta bort 50% av den ursprungliga komplett odlingsmedium, som rapporterats av många andra studier. Matningsmediet innehåller även 15 fiM cytosinarabinosid (Ara-C, för att ge en slutlig koncentration av 5 ^ M) för att minimera risken för kontaminering glia och proliferation.
- Efter denna första utfodring, tillsätt 300 | il färskt matningsmedium utan Ara-C till brunnen varje vecka. Bör kulturen skall förvaras i mer än en månad, ersätta hälften av mediet med färskt Feed-medium varje vecka efter en månad tidpunkt (med det första mediet halv-byte vid DIV33). Morfologiskt, både hög densitet och låg nervceller densitet ser friska upp till tre månader (den längsta tiden observeras av expertisimenters).
11. Illustration av en experimentell manipulation låg densitet Neuron transfektion
Obs: När transfektion i låga nervceller densitet önskas, kan en enkel kalciumfosfat protokoll antas. Vi har funnit att låga kulturer densitet har bättre transfektionseffektivitet med kalciumfosfat protokollet innan DIV12, men de kan transfekteras med mycket lägre effektivitet vid DIV21 eller äldre, under vilken tid Dendritutskotten är framträdande. Genomförbarheten av transfektion av odlade lågdensitets neuron illustreras genom att transfektera neuroner med en pEGFP-C3-plasmiden (se nedan).
- Vid DIV21, ta bort 600 konditionerat medium från varje brunn i co-kultur il, och överföra den till en ny 24-brunnar. Lägg sedan till 600 l färskt Feed medium till co-kultur för att föra den tillbaka till den ursprungliga volymen.
- Överföra täckglasen in i den nya 24-brunnar med 600 konditionerat medium il. Se till attlåg nervceller densitet är vända uppåt. Placera de höga densitetsplattorna och de nya plattor med täckglasen tillbaka i inkubatorn.
- Bered två 1,5 ml sterila rör. I ett rör, tillsätt 600 pl 2X HEPES saltlösning (HBS) lösning. Beräkna volymen av 12 mikrogram pEGFP-C3 DNA baserad på plasmid koncentration. I det andra röret, tillsätt 74 | il CaCl2 (2 M stock) och volymen av vatten som efter tillsats av plasmiden kommer att göra 600 | il. Blanda väl genom att pipettera och sedan lägga plasmid-DNA. Sakta blanda väl. Låt båda rören stå under 5 min vid RT.
- Medan hand håller 2X HBS röret och måttligt omrörning av lösningen på en mixer, lägga till alla 600 ul DNA-CaCl2 lösning droppvis till 600 pl 2X HBS rör. Det är kritiskt att den bildade fällningen är i form av "fin sand 'granuler. Blandning för stark och alltför fort är inte önskvärt, eftersom det kommer mer sannolikt producera stora "snö flake' liknande fällningar, which har dramatiskt lägre transfektionseffektivitet baserad på våra observationer.
- Låt fällningen fortsätter att bildas i mörker vid RT i 30 min.
- Tillsätt 100 l fällningen till varje brunn som innehåller låg densitet neuron på täck, droppe för droppe och jämnt. Återföra plattan till inkubatorn och inkubera i 2 h. Om man antar det mesta av CaCl 2 är i fri form, detta resulterar i en koncentration av ~ 17,6 mM Ca2 +, som kan vara toxiskt för neuroner efter långvarig inkubering.
- Förbered en 50 ml koniska rör med ~ 50 ml tvättmedium, värm upp till 37 ° C.
- Vid slutet av 2 h, ta med den låga densiteten neuron med DNA-kalciumfosfat utfällningar in i huven. Plocka upp varje enskild täck med en skarp # 5 pincett, och doppa den tre gånger i 50 ml tvättmediet att tvätta den kort. Sedan tillbaka till de höga densitet nervceller i sin ursprungliga co-odlingsplattor med låga nervceller densitet nedåt.
- Fortsätt kulturen tillslåg densitet kultur nervceller på täck skördas för studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs här möjliggör framgångsrik ultralåg densitet, långvarig odling av rena glutamaterga neuroner utan behov av gliaceller som fungerar som ett matarskikt. Protokollet är i diagramform i Figur 1, som innebär framställning av hög densitet (på poly-D-lysin belagda 24 brunnar) och låg densitet neuroner (på poly-D-lysin belagda täckglas av glas) separat, och efterföljande samodling som kan upprätthållas upp till tre månader.
Figurerna 2A och 2B är illustrationer av hög densitet och låg densitet nervceller på 5 dagar efter plätering. Låg densitet kultur är approximativt 30 gånger mindre i densitet. Båda nervceller genomgår typiska utvecklingsstadier som beskrivs av Kaech och Banker (2006). Vid dag 14, både hög densitet och låg nervceller densitet visar arbetade dendritiska strukturer, vilket framgår av DIC bilder (figurerna 2C,D, notera båda panelerna är från samma område med olika fokalplan, vilket framgår av placeringen av Etch). När dessa nervceller färgas med MAP2 antikropp att avslöja dendriter, inga signifikanta skillnader i antalet dendriter (t 13 = 1,27, p> 0,05, mätt med dendritiska tips nummer) och total dendritiska längd (t 16 = 1,41, p> 0,05 ) per neuron mellan hög densitet och låg nervceller densitet finns (Figur 2E, F).
Immunocytokemi märkning används för att avslöja funktionella glutamaterg synapser. Vi använder dubbel färgning att märka NMDA-receptorn subenheten NR1 och AMPA-receptorn subenheten GluR1 (figur 3A), och funktionella synapser (samlokaliserade puncta i gult) kan lätt identifieras och kvantifieras med hjälp av ImageJ. Låg densitet nervceller också märkt med antikropp mot dendritiska proteinmarkör MAP2,i kombination med axonal proteinmarkör p-Tau. Denna dubbel märkning tillåter tydlig åtskillnad av dendriter och axoner (Figur 3B). Låg densitet kulturer kan också framgångsrikt transfekteras med DNA-plasmider med användning av kalciumfosfatmetoder, även om transfektion hastigheten är normalt mycket låg i senare skeden (<0,2% neuroner när transfekterade vid DIV21). Figur 3C visar att EGFP transfektion kan avslöja neuronal morfologi och göra fina dendritiska ryggraden strukturer synliga. Slutligen, som en proof of concept, ultralåg nervceller densitet kan odlas under förhållanden som främjar autapse bildning (Figur 3D). Dessa ultra-låg densitet autaptic neuroner odlade på poly-D-lysin belagda "mikro öar" kan upprätthållas av hög densitet matar neuron till bortom 2 månader med detta samarbete kultur-protokollet.
<strong> Figur 1. Schematisk illustration av den höga densitet och låg densitet co-kultur-protokollet. (A) E16.5-E17.5 mus embryonala hjärnor samlas in, hippocampi dissekeras ut och digererades med trypsin. (B) som kluvits hippocampi tvättas, separeras i enstaka nervceller, och ströks ut vid hög densitet (250000 celler / ml) på 24-brunnsplattor; under tiden, har låg densitet (10000 celler / ml) neuroner utströks på täckglas. Brunnarna för hög densitet kultur etsas med en 18 G injektionsnål för att ge en förhöjd stöd för täck. (C) Illustration av co-kultur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Både hög densitet och låg nervceller densitet samarmparable morfologiska utvecklingen i sam-kultur. (A, B) Mikrofotografier visar plätering densitet av både hög densitet och låg densitet skiktet. (C, D) DIC bilder som visar omfattande neurite tillväxt i både hög (C) och låg densitet (D) neuroner. De låg densitet neuroner på täck vilar precis ovanför de höga densitet nervceller. Notera placeringen av den upphöjda plaststöd. (E) Immuncytokemi märkning av dendritiska protein MAP2. (F) Kvantifiering (medelvärde ± SEM) av den totala dendritiska längd och dendritiska tips nummer per neuron. Ingen signifikant skillnad (ns) sågs mellan hög densitet och låg densitet nervceller som odlas i co-kultur. Skala bar i (B, D), 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
fo: keep-together.within-page = "1"> 
Figur 3. Experimentella manipulationer med låg densitet nervceller som odlas i co-kultur. (A) Immuncytokemi märkning låg densitet kultur medger identifiering av funktionella synaps definieras genom samtidig märkning av GluR1 (grön) och NR1 (röd). (B) Co-märkning av neuronala dendritiska protein MAP2 (magenta) och axonal protein p-Tau (grön). (C) En låg densitet hippocampus neuron transfererats med pEGFP-C3 plasmiden, visar ymnig Dendritutskotten. (D) En låg densitet neuron beredd på poly-D-lysin "mikro-ö", och odlas på toppen av hög densitet nervceller. En inspelning lappelektroden fyller neuron med Alexa-555 hydrazid för att avslöja morfologin av neuron. Skalstrecket i AD, 20 | j, m.7fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar ett detaljerat protokoll för långtidsodling av ultra-låg densitet hippocampus glutamaterga neuroner under serumfria förhållanden. Vid 2000 neuroner / cm2, är densiteten ~ åtminstone två gånger lägre än de flesta "låg densitet" kultur preparat med eller utan glia stöd rapporterats av befintlig litteratur 2,3,11,13,14. Förutom att vara ultra-låg densitet, är detta protokoll ny och betydande i ytterligare två sätt. För det första behövs ingen glia matarskikt som låg nervceller densitet få trofisk faktor stöd från hög densitet nervceller som ligger inom nära fysisk närhet, även om det inte finns några synapsförbindelser eller direkt kontakt mellan nervceller odlade på olika densiteter. Detta protokoll eliminerar behovet av att förbereda glia mono inför de planerade odlingsförsök, och tillåter både hög densitet och låg kulturer densitet att växa samtidigt. Framställning av glia monolager kan vara tidskrävande och laborious, och de flesta litteratur använder neonatal råttungar cortex 2. Därför, för laboratorier som arbetar med endast möss, kräver betydande ytterligare ansträngningar. Ännu viktigare, i experiment där neuronala specifika mekanismer undersöks, kan närvaron av Glia i co-kultur vara önskvärt, eftersom det hindrar skriva observerade effekter specifikt till nervceller, glia eller samspelet mellan de två celltyper 10. Dessutom, för glia kultur, är serumsupplement obligatorisk 2,15, och detta kan förorena glia-neuron co-kultur och införa ytterligare felkällor. En viktig egenskap hos våra protokoll är att sam-kultur är under definierade mediumförhållanden. Vi använder strikt komplett odlingsmedium utan serumsupplement, och finner att om odlingsmediet utbyte schema är strikt följs, kan samodling upprätthållas längre än tre månader, som bör uppfylla de flesta experiment. Eftersom det finns praktiskt taget ingenglia närvaro, är en begränsning av denna teknik att försiktighet bör iakttas när man jämför med resultaten av litteratur som använder glia-neuron co-kulturer.
En annan ny aspekt av detta protokoll är att vi använder en enkel metod för att skapa en effektiv mikro-utrymmet mellan hög densitet nervceller odlas på botten av 24-brunnar, och låg densitet neuron anslutit sig till glastäck sitter precis ovanför. Tidigare studier använder paraffin prickar som tillämpas på de belagda täckglas för att höja täckglasen vid ~ 500 | im ovanför Glia matarskikt 2,8,9. Framställning av paraffin punkter kräver rätt storlek och rätt temperatur, vilket kräver en rimlig mängd insatser och praxis. I jämförelse, en enkel etsning på brunnens botten plast med en 18 G nål ger stöd för täck samt god separation mellan de två skikten av nervceller. Vi har använt en patch clamp inspelning rigg med digital Z mätare för att bestämma den linöra utrymmet mellan två lager av nervceller genom att fokusera på hög densitet och sedan på densitetsskikt låga använder en 60X nedsänkning i vatten mål, och fann att utrymmet är typiskt 150-200 pm (179,4 +/- 25,3 pm, n = 5 ). Denna smalare utrymme (jämfört med den som genereras av vax punkter) kommer sannolikt att översätta till en snabbare ökning, och högre koncentration av neurotrofiska faktorer, därför ger tillräckligt stöd för låg densitet neuron att växa. Även om detta snävare utrymme kan väcka frågor om graden av odlingsmediet utbyte och huruvida mindre utrymme hindrar nervceller från att få syre och näringstillskott, visar våra resultat att detta sannolikt inte ett bekymmer. Tvärtom fann vi att de höga densitet nervceller under täck växa också bättre (högre överlevnad, mer genomarbetade dendritiska träd och mer synaptiska puncta av NR1 färgning, data visas ej) jämfört med hög densitet nervceller från samma beredning men utan den överliggande coverslips. Därför är denna enkelt protokoll inte bara snabb, enkel, men också mycket effektiv för att upprätthålla både hög densitet och låg neuroner densitet.
Odling hippocampusneuroner in vitro kräver beläggning av tillväxtfrämjande substrat, såsom poly-D-lysin och / eller laminin / kollagen 5,16. Även noggranna val och beredning av täckglas är avgörande för effektiv neuronal överlevnad, har vi funnit att med täckglaset vi valt, räcker det med en noggrann rengöring med 70% etanol, vilket eliminerar behovet av hårdare behandling (t.ex. kokning i syror) av täck. Efter täckglas rengörs i etanol och torkades genom vakuum, verkar glaset att vara hydrofobt beroende på den ursprungliga beläggningen. Emellertid framgångsrik beläggning av 0,1 mg / ml poly-D-lysin i boratbuffert bör göra glasytan hydrofil, så att när täckglasen plockas upp från tvättvattnet, ett likformigt skikt av vatten som är jämntsprider sig över hela glasytan kan observeras. Vi fann att detta är mycket viktigt. Annars nervceller kommer sannolikt att dö efter plätering på grund av otillräcklig beläggning. Även om endast låg densitet hippocampus neuroner testas i detta protokoll, kan det förväntas att andra neuronala typer (t.ex., kortikala neuroner, cerebellära granulat neuroner, eller specialiserade neurala populationer) också kan upprätthållas vid låg densitet i närvaro av en hög densitet neuron matare lager. Slutligen, när detta enkelt protokoll följs, kan man förvänta sig att skörda friska ultralåg neuroner densitet. Breda tillämpningar såsom immunocytokemi märkning, levande avbildning, morfologiska studier och elektro inspelning kan alla utföras på dessa neuroner efter standardprocedurer 16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. Cultureing Nerve Cells. , 2nd edition, 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
