Introduction
Хотя обмен генетическим материалом между двумя ячейками является центральным событием в половом размножении, он опирается на цепи событий, которые способствуют дифференциации клеток, позволяют по выбору партнера, осуществляют слияние клеток клеток и поддержания стабильности генома. Таким образом, половой жизненный цикл представляет себя в качестве модельной системы для изучения ряда биологических вопросов , связанных с развитием коммутаторов, реакция на внешние раздражители, плазма слияния мембран, сегрегации хромосом и т.д. исследуя делящихся дрожжей полового цикла для изучения этих явлений приносит выгоды от мощные генетика Модель системы, устоявшихся высокой пропускной способности подходов и утонченный микроскопии. Секс в делящихся дрожжей является гетеротипичной событие между Р-клетки и М-клетки различных типов спаривания. Эти два типа клеток дифференцированно выражают ряд генов , в том числе 1,2 для производства секретируемого Р- и М-феромоны, феромонов-рецепторов Map3 и Mam2, а также феромона-протеяSES Sxa1 и Sxa2. Homothallic штаммы, такие как обычно используемые H90 штамма, несут генетическую информацию для обоих типов спаривания в одном геноме , и клетки претерпевают сложную картину переключения типа спаривания на протяжении митотического жизненного цикла (см. Обзор 3). Множественные изоляты гетероталличных делящихся дрожжей , которые редко или никогда не переключать тип спаривания также обычно используются 4, наиболее заметно Н + N (P-типа) и Н (М -S-типа) штаммов.
В делящихся дрожжей, вступление в половой жизненный цикл находится под строгим питательного регулирования. Только азотные голодали дрожжевые клетки деления задержать митотическую воспроизводства и производят диффундирующего феромоны , чтобы сигнализировать наличие брачного партнера и продвигать дальнейшие шаги полового цикла (см. Обзор 5). лишение азота де-репрессирует ключевым регулятором транскрипционный спариванию Ste11, который действует в качестве переключателя развития и способствует еXpression скрещивания специфических генов , включая рецептор феромона и феромона генов производства 6,7. Взаимодействие с феромонами-рецептор активирует рецептор белка связью G-альфа и вниз по течению сигнализации МАРК , который дополнительно усиливает Ste11 транскрипционную активность 8-10, тем самым увеличивая выработку феромонов в положительной обратной связи между брачных партнеров. Уровни Феромонные имеют решающее значение , чтобы побудить различные состояния клеточной поляризации путем регулирования главного организатора клеточной полярности, в Rho-семейства GTPase Cdc42 11. При воздействии низких концентрациях феромонов, активный Cdc42, визуализируется в динамических пластырей, исследующих периферию клетки, а не роста клеток не наблюдается на данном этапе. Повышенные уровни феромона способствовать стабилизации активности Cdc42 в одной зоне и роста поляризованной проекции, называют Shmoo, который приносит партнерам клетки в контакте. Впоследствии два гаплоидных партнеры сопрягаемые сплавить, чтобы сформировать диплоидные зиготы. Последние работы показывает, тысе существование нового структуры актина , необходимой для слияния , который собран с помощью сопрягаемой-индуцированной формина Fus1 12. Этот слитый фокус концентратов типа V миозина зависимые процессы и позиционирует клеточной стенки машины деградации, таким образом , позволяя ремоделирование клеточной стенки , чтобы обеспечить контакт с плазматической мембраной без лизиса клеток 12. После слияния клетка-клетка, ядра вступают в контакт и подвергаются кариогамии. Известный динеин-зависимой возвратно-поступательное движение ядра внутри зиготы (лошадь хвост движения) , а затем способствует спаривание хромосом гомологов 13,14, за которым следует мейоза. И, наконец, четыре продукты мейоза упаковывают в индивидуальные споры во время споруляции.
Из-за своей сложности и многочисленных этапов, детальный мониторинг вязки была сложной. Два заметных трудностей в том, что весь процесс занимает хорошо более пятнадцати часов, и что клетки трудно синхронизировать. Эти difficulties обходят с помощью подходов микроскопии одноклеточных. Здесь общий протокол для исследования половой жизненный цикл у делящихся дрожжей представлен. С незначительными изменениями, этот протокол позволяет исследовать все различные этапы процесса, а именно индукции продукта гена спаривания, поляризации клеток и спаривания между сестринских клеток после переключения типа спаривания и между партнерами, не сестра, слияния клетка-клетка, и пост-фьюжн хвощ движения, мейоза и спорообразование. Этот метод позволяет 1) легко визуализировать флуоресцентно меченных белков с течением времени до, во время и после слияния; 2) различать поведение клеток противоположного типа спаривания; и 3) измерения и количественной оценки таких параметров, как shmooing, вязки, фьюжн или эффективность спорообразования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Микроскопия анализ делящихся дрожжей полового размножения
1. Подготовка СМИ
- Подготовка Минимальная споруляционная среда , (MSL-N) 15 путем смешивания следующих компонентов: глюкоза: 10 г / л, КН 2 РО 4: 1 г / л, NaCl: 0,1 г / л, MgSO 4 · 7H 2 O: 0,2 г / Л. Добавить Микроэлементы (10,000x): 100 мкл / л, витамины (1,000x): 1 мл / л, и 0,1 М CaCl 2 мл / л. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра с размером частиц 0,22 мкм пор и хранить при комнатной температуре (RT).
- Используйте следующие витамины (1,000x) Наличие на складе: пантотенат: 1 г / л, никотиновая кислота: 10 г / л, инозитол: 10 г / л, биотин: 10 мг / л. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра с размером частиц 0,22 мкм пор и хранят при температуре 4 ° С.
- Используйте следующие элементы трассировки (10,000x) Наличие на складе: борная кислота: 5 г / л, MnSO 4: 4 г / л, ZnSO 4 · 7H 2 O: 4 г / л, FeCl 2 · 6H 2 O: 2 г / л , МоО 3: 0,4 г / л, К.И.: 1 г / л, CuSO 4· 5H 2 O: 0,4 г / л, Лимонная кислота: 10 г / л. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра с размером частиц 0,22 мкм пор и хранят при температуре 4 ° С.
- Подготовка MSL-N 2% агарозный (для изготовления агарозном камер ДОП) путем объединения 10 мл MSL-N с 0,2 г агарозы. Melt в течение ~ 2 мин при высокой мощности в микроволновой печи до агарозном не растворится и аликвотные 0,5 мл в микроцентрифужных пробирках. Хранить при комнатной температуре.
- Готовят Минимальная споруляционная среда , с азотом (MSL + N) от MSL-N путем добавления (NH 4) 2 SO 4: 1 г / л, лейцин: 0,225 г / л, аденин: 0,225 г / л, урацил: 0,225 г / л , Фильтр-стерилизовать с использованием фильтра размером пор 0,22 мкм. Хранить при комнатной температуре.
Примечание: лейцин, аденина и урацила добавляют к этой среде, чтобы обеспечить рост ауксотрофных штаммов. Дополнительная добавка аминокислотному должна быть включена , если используемый штамм несет ярко выраженный ауксотрофию (например his3Δ). Обратите внимание, что работа с полностью прототроф штаммов рекомендуется, так как толькотакие штаммы позволит высокую эффективность спаривании. - Подготовьте 200 мл VALAP для камеры уплотнения. В химическом стакане, добавить равные веса ланолин, вазелин (или другого вазелин) и парафином. Тепловая смесь при низкой температуре и помешивать, пока тщательно не смешано. Аликвотировать смесь на несколько маленьких чашках Петри. Хранить при комнатной температуре.
2. Культивирование делящихся дрожжей Штаммы для вязки экспериментов (Рисунок 1).
- День 1, Вечер:
Привить свеже прожилками штаммов из твердых сред в культуральные пробирки, содержащие 3 мл MSL + N. Используйте плоским дном трубы диаметром около 2,5 см. Используйте другие трубки культуры или колб с адаптированной объема культуры. Выдержите в течение ночи (O / N) при встряхивании при 25 ° C, 200 оборотов в минуту. При работе с гетероталличных штаммов, прививают отдельно.- Развести суспензии клеток в средствах массовой информации на следующее утро , чтобы убедиться , что культуры имеют оптическую плотность при 600 нм (OD 600) от 0,4-0,8 в вечернее время .
Заметка:OD 600 измерений как прокси - сервер концентрации клеток для делящихся дрожжей линейны в диапазоне приблизительно 0,1-1,0. Для нашего спектрофотометра OD 600 = 0,1 соответствует 1,4 × 10 6 клеток на мл. Таким образом, если исходная OD 600 считывает находятся за пределами этого диапазона образцы должны быть разбавлены / сгущенного для надежных измерений.
- Развести суспензии клеток в средствах массовой информации на следующее утро , чтобы убедиться , что культуры имеют оптическую плотность при 600 нм (OD 600) от 0,4-0,8 в вечернее время .
- 2-й день, вечер:
Развести клеток в 20 мл MSL + N сред для OD 600 = 0,025 в 100 мл колбах. Инкубируйте штаммы O / N при 30 ° C, 200 оборотов в минуту.
Примечание: культуры дикого типа клеток должна достигать OD 600 ~ 0,8 следующее утро (15 ч позже). При работе со штаммами с более длительным временем генерации регулировки разбавления соответственно. - 3-й день, Утро:
Мера OD 600 , чтобы проверить , что культуры имеют плотность клеток OD 600 ~ 0,8. При работе с гетероталличных штаммов, смешать равные количества клеток-партнеров. Гранул клетки при 1000 XG и передачи в 1,5 млтрубка. Мыть клетки три раза в 1 мл MSL-N среды. Повторное приостановить клеток в 3 мл MSL-N среды и разбавленных клетки до OD 600 = 1,5.- Для того, чтобы следить за спаривание между родственными клетками непосредственно монтировать клетки для получения изображений (см Protocol раздел 2.4). Используйте homothallic H90 штаммы, в которых переключение типа спаривания будет происходить во время митотических делений , происходящих после лишения азота. Непосредственная установка ячеек на агарозном колодки гарантирует, что, после того, как клеточное деление, сестра-клетки остаются рядом друг с другом.
- Для контроля поляризации клеток (динамики поисково-разведочных и shmooing) инкубировать 1-3 мл клеточной культуры при 30 ° С, 200 оборотов в минуту в течение 3-4 ч перед монтажом клеток для визуализации. В течение этих 3-4 ч, последний митотическое деление будет иметь место. Несколько клетки инициировали поляризацию, но большинство из них будет просто начинать их разведочные динамику поляризации.
- Для того, чтобы контролировать слияние клеток-клеток инкубировать 1-3 мл клеточной культуры при 30 ° С, 200 оборотов в минуту в течение 4-6 ч ИРПили монтажа ячеек для работы с изображениями.
- Для мониторинга пост-синтеза инкубировать 1-3 мл клеточных культур при температуре 30 ° С, 200 оборотов в минуту в течение 8 часов перед монтажом клеток для получения изображения.
- Для того, чтобы контролировать реакцию на определенной концентрации феромона (только для гетероталличных штаммов) инкубировать 3 мл клеточной культуры при 30 ° С, 200 оборотов в минуту в течение 3-4 ч до начала монтажа клеток для получения изображения.
- Удалите MSL-N-содержащий микроцентрифужных трубку от C тепла блока 95 ° (смотри раздел 2.4.1 протокола. Ниже). Добавить P-фактор, или М-фактор в нужной концентрации непосредственно в расплавленном MSL-N агарозы. Хорошо перемешать встряхиванием перед тем непосредственной подготовки площадки.
- После монтажа клеток, инкубировать площадку в течение 15-30 мин при температуре 25 ° C до визуализации. P-фактор и М-фактор феромоны были использованы из исходного раствора 1 мг / мл в метаноле.
Примечание: При работе с мутантные штаммы, время инкубации может изменяться. Слипание клеток может происходить после длительной инкубации в жидком мEdia и может быть особенно сильным в некоторых мутантных штаммов. Слипаются клетки не могут быть замечены на агарозном колодки в одном слое и, следовательно, трудно автофокусировкой и изображения. В случае обширной клеточной слипания клеток смонтировать на агарозном колодки сразу после промывки и повторно суспензию, в азотом не хватает средств массовой информации (как и в разделе 2.3.1 протокола.) И инкубировать их при 30 ° С до визуализации.
- Монтаж ячейки для работы с изображениями:
- Подготовьте MSL-N агарозном колодки 16 путем плавления аликвоты в 95 ° C тепловой блок в течение 10-15 мин и добавляя 200 мкл между двумя стеклянными слайдами , разделенных прокладками (рис 1B). Используйте распорки толщиной ~ 0,5 мм. Для того, чтобы распорки, использование полосы вырезать из картона, как, например, поставляется с ферментами рестрикции.
- Гранул 100 мкл клеток при 1000 х г в течение 1 мин, удалить супернатант и повторно приостанавливать клетки в остаточном 2-4 мкл среды. НЕ повторно приостанавливать в свежей среде, как он задерживаетспаривание.
- Через 2-3 мин осторожно снимите распорки и верхнюю предметное стекло. Если несколько штаммов должны быть установлены, подготовить клетка концентрируется перед приготовлением агарозном площадку.
- Добавляют 1 мкл клеток на площадку и ждать, пока капля не начнет сушки (~ 1 мин) перед покрытием с крышкой скольжения и уплотнения с VALAP.
- Пусть площадку сидеть в течение по крайней мере за 30 мин до обработки изображений при 25 ° С или комнатной температуре.
- Для того, чтобы получить смесь клеток на различных стадиях спаривания, сделать площадку сразу после мытья в MSL-N (см раздел 2.3.) И инкубировать при температуре 18 ° CO / N (~ 15 ч). Этот подход полезен для визуализации клеток на различных стадиях спаривания с высоким временным разрешением или образцов со слабым сигналом.
3. Live-ячейки изображения дрожжевых клеток стыковочных
- Настройка параметров изображения приобретения.
Примечание: Настройки получения изображения, представленные здесь, были оптимизированы для платформы DeltaVision, состоящей из настроенного Olympus IX-71инвертированный микроскоп с Plan Apo 60X / 1.42 NA или U-Plan Apo 100Х / 1.4 цели NA, камера CoolSNAP HQ2 и Insight SSI 7 цвета в сочетании блок осветителя. Оборудование управляется softWoRx v4.1.2, который также позволяет цифровой автофокусировку.- Убедитесь в том, что интервалы автофокусировка не превышают 15 мин, так как Z-дрейф в течение длительного времени может превысить пропускную способность системы программного обеспечения автофокусировку. При использовании аппаратных средств на основе системы автофокусировку, использовать большие интервалы.
- Настройка интервала формирования изображения. Делать снимки каждые 10 мин в течение ~ 15 часов в качестве отправной точки при работе с флуоресцентно меченый белок впервые. Этот интервал обеспечивает хороший обзор всего процесса спаривания без обширного отбеливания.
- Изображение с 5-минутными интервалами или короче для более точного времени событий, таких как слияние. Более короткие интервалы требуют сильных флуорофоры, позволяющие малое время воздействия и немного отбеливания. Для получения изображений с интервалом менее 1 мин избегать O / N микроскопиии вместо того, чтобы приготовить смесь из всех стадий сопрягаемых как подробно описано в Протоколе раздел 2.4.6.
- Настройка изображения времени экспозиции. Время экспозиции испытания от 50 до 300 мс. Цель, чтобы найти баланс между отношением сигнал-шум и фотообесцвечивания, чтобы достичь большого количества временных точек с различимым сигналом (обычно более 100).
- Отрегулируйте Z-секционирования. Разделы каждые 0,3 мкм покрытие 5 мкм обеспечивают хорошую глубину изображения. Следует отметить, что Z-секционирования еще больше увеличивает фото-повреждения, которые могут быть сведены к минимуму с помощью УРР (оптической оси интеграции - один захват развертки от общей глубины образца). Хорошая система автоматической фокусировки уменьшает потребность во многих Z-образных секций и настоятельно рекомендуется.
- Советы по изучению Спаривание типоспецифичной Behaviors:
- Для гетероталличных штаммов используют H- и H + клеток , экспрессирующих различные флуорофоры, таким образом , что два типа клеток можно отличить. Используйте любой генетически кодируемых fluorophoвновь выражается в виде цитозольного версии или слияния с эндогенного белка, хотя мы имели хороший успех с sfGFP, быстро складывая вариант GFP 17. Эндогенные белки, как правило , помечены на их эндогенного геномного локуса с помощью гомологичной рекомбинации 14.
- Для homothallic штаммов, выражают генетически кодируемых цитозольного флуоресцентный белок под контролем специфических промоторов типа спаривания таких как генов рецептора феромона map3 и mam2 для управления экспрессией в P и M клеток, соответственно. Инициаторы map3 и mam2 неактивны во время вегетативного роста и индуцируется при голодании азота 18,19. Формирует вождения выражение цитозольного GFP или mCherry под контролем этих промоторов , как правило , интегрированы в геномный локус (ura4, leu1) , что не мешает нормальной прогрессии полового жизненного цикла 12.
4. Количественное присоединительных и Fusion Efficiencies
- Для количественной оценки спаривание и слитые эффективность 11,12, SPOT клеток непосредственно после того, как MSL-N моют на MSL-N агарозы колодки, как в шаге 2.3.1 выше, и оставьте в течение 24 ч при 25 ° С до визуализации (рис 1А). Используя этот протокол о homothallic дикого типа штамма эффективность спаривание достигает ~ 60% и эффективность сварки 99%. Чтобы проверить любое уменьшение этих значений, наблюдаемых у мутантных штаммов, отражают ли терминальную фенотип или задержку, повторить эксперимент с временем инкубации 36 ч.
- Рассчитать эффективность как ответная
Спаривание пары включают зиготы, аски и Незакрепленное пар клеток, выявленных изих положение и рост в сторону друг друга. - Рассчитать эффективность синтеза в качестве
Примечание: Конденсированные пары сопрягаемых идентифицируют по их способности образовывать споры, если известно, что мутант при исследовании не влияет на спорообразование. Если спорообразования не может быть использован в качестве считывания, слитый определяется путем наблюдения за распространением цитозольного маркера, выраженное в только одного сопрягаемой партнера в обоих партнеров.
Спаривание пары включают зиготы, аски и Незакрепленное пар клеток, выявленных изих положение и рост в сторону друг друга. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Деление роста дрожжей и Спаривание динамика при удалении источника азота
В азотное голодание является необходимым условием для начала полового размножения в делящихся дрожжей дикого типа homothallic H90 штамм контролировали при переходе от азота богатых азотом лишенной среды (рисунок 2), в соответствии с протоколом , описанной на рисунке 1. В кратком изложении, клетки выращивались O / N в экспоненциальной фазе (OD 600 = 0,5) в MSL + N среде, собирали, промывали и ресуспендировали в MSL-N жидкой среде до конечной OD 600 = 1,5. Каждые 2 часа аликвоты клеток были calcofluor окрашенных и образ (рис 2A - D).
Calcofluor окрашивание (Фигура 2А) показали , что в обогащенной азотом среде ~ 21% клеток были septating (п> 300, рис 2B) и что средняя длина клеток в дивиSion составила 15,2 ± 1,4 мкм (п = 50, Рис 2С). Непролиферирующих клетки показали широкое распределение длин ячеек (8-14 мкм, N> 200, рис 2D). Тем не менее, через два часа после перехода к MSL-N среде было резкое изменение в распределении длины непролиферирующих клеток, с более чем 60% клеток , находящихся короче 9 мкм (п> 200, рис 2D). Сотовый также перегородок обнаружен на уменьшенной длиной 9,8 ± 0,8 мкм (п = 50, рис 2А, 2С). Было также отмечено дальнейшее сокращение длины обоих непролиферирующих и делящихся клеток, как время в MSL-N увеличилось. Действительно, после 8 часов индекс перегородок культуры снизился ниже 2% (п> 300) и более 85% клеток арестовал их клеточный цикл при длине короче 7 мкм (п> 200, рис 2D).
Клетки начали формировать спаривание пар по четыре часа после сдвига к жидкости MSL-Nсредний (<1%, рис 2А). Впоследствии количество пар сопрягаемых быстро возрастало и 8 ч после сдвига на 10% клеток занимается матовую партнера (п> 200, рис 2В).
Для того, чтобы следить за динамикой спаривание, 6 ч после индукции голодном, аликвоту клеток также установлена на MSL-N агарозном площадку для работы с изображениями. Клетки подвергались shmooing, фьюжн и споруляции (рис 2E, 2F) в последующие 21 ч без каких - либо видимых синхронности (Movie S1). Эффективность спаривание зависит от относительного положения и плотности клеток в заданном поле зрения, с более чем 60% клеток занимается партнер , когда они расположены плотно в монослоя (рис 2G и Movie S1).
Штаммы дикого типа гетероталличный Н + и h- делящихся дрожжей также были подвергнуты тому же протоколу сп дополнительная стадия смешивания Н + и Н- клеток в соотношении один к одному в момент удаления азота. Сходные голодание и соединяемые динамика, но эффективность спаривание была несколько ниже (рис 2G, Movie S2).
Мониторинг динамики флуоресцентно меченных белков в Спаривание осколочного дрожжевые клетки
Для того, чтобы следить за динамикой типа V миозина Myo52 (спр 20) в спаривании клеток, выращенных в геометрической прогрессии h- клетки , экспрессирующие Myo52-3GFP из родного локуса были смешаны с ч + клетки аналогично экспрессии Myo52-tdTomato, а также цитозольного GFP из P -клетки специфический map3 промотор. Суспензию клеток промывали, разбавленный в MSL-N среды и инкубировали в течение 6 ч при 30 ° С, 200 оборотов в минуту до установки клеток на MSL-N агарозном колодки для O / N изображений с интервалом в 10 мин.
Как сообщалось ранее 11,12 Myo52 первоначально образуются динамические зоны по всей клетке коры (рис 3А, Наконечники и Movie S3). Myo52 сигнал затем стабилизируется (рис 3А, стрелки и Movie S3) в одном фокусе непосредственно перед событием фьюжн, который визуализируется путем передачи цитозольного сигнала GFP с ч + в h- клетки (рис 3A и фильм S3) , Сигнал Myo52-tdTomato также может наблюдаться при слитого шеи при его расширении , но не различимы сигнала не было видно , как зигота приступил к споруляции (рис 3A и Movie S3).
Контроль за поведением гетероталличных делящихся дрожжей клетки подвержены влиянию внешних феромоны
Гетероталличных h- клетки , лишенные протеазы Sxa2 , который унижает P-фактор для десенсибилизации легко реагировать на синтетический P-фактора. h- sxa2Δ штамм, экспрессирующих SCD2-GFP в качестве маркера для активного Cdc42 11, выращивали в MSL + N среде, в соответствии с описанным протоколом. Клетки промывали в MSL-N среды и инкубировали в течение 4 ч при 30 ° С. MSL-N агарозы колодки , содержащие метанол (данные не показаны), 0,1 мкг / мл (низкая феромон, фигура 3В) или 1 мкг / мл (высокий феромон, 3С) Р-фактора были подготовлены, разрезанная и позиционируется на новый слайд для создания мини-прокладок, содержащих разное количество феромонов. 0,5 мкл клеточной суспензии была установлена на каждой мини-площадок для O / N изображений с интервалом 5 мин.
В соответствии с опубликованными результатами 11, низкие уровни P-фактор способствовал формированию динамических зон SCD2 без роста (рис 3B, Movie S4), в то время как высокие уровни P-фактора стабилизировался одну зону SCD2, тем самым вызывая Shmoo удлинение от одной клетки полюса (Figure 3C, Movie S5).
Рисунок 1:.. Схематическое представление протокола (А) Схематическое описание протоколов , используемых для контроля делящихся дрожжей половой жизненный цикл и (В) для приготовления образцов делящихся дрожжей для длительного изображения Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть большую версию этой фигуры ,
На рисунке 2:. Рост и Спаривание Динамика Деление клеток дрожжей сдвинуты от MSL + N к MSL-N - медиа (А) эпифлуоресцентной микрофотографии calcofluor окрашенных клеток сдвинуты на MSL-N средах в течение указанных периодов времени. (Б) Процентиз septating (темно-синяя линия, п> 300) на временной точке и спаривание (светло-синяя линия, п> 300 на временной точки) клетки перешли на MSL-N средах в течение указанных периодов времени. (С) Средняя длина septating клеток сдвинуты на MSL-N средах в течение указанных периодов времени (п = 50 за временной точки , за исключением 8 ч временной точки , где п = 20). (D) распределение Длина непролиферирующих клеток сдвинуты на MSL-N среды в течение указанных периодов времени (п> 200 на временной точке). (E) Средняя доля нерасплавленный (темно-синяя линия), плавленый (светло-синяя линия) и спорообразующих (черная линия) клеток в популяции H90 дикого типа дрожжей перешли на MSL-N средах в течение указанных периодов времени и монтируется на агаровой площадку на временной точки 6 ч (N> 900 клеток на временной точки из трех различных timelapses). Клетки считаются слиты при отсутствии рефракции клеточной стенки между партнерами не было видно в микрофотографии DIC и формирования спорово клеточной стенки была использована, чтобы выиграть для зрorulating клетки. (F) , DIC микрофотографии сопрягаемых клеток сдвинуты на MSL-N средах в течение указанных периодов времени. (G) эффективность Спаривание в зависимости от плотности клеток на агарозном колодки для H90 (темно-синих точек) и Н + / Н- (светло-голубые точки) клетки перешли на MSL-N СМИ в течение 24 часов. Наиболее подходящая плотность клеток для долгосрочного изображения достигается при приблизительно 25000 клеток / мм 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3:. Динамическая локализация флуоресцентных белков во время делящихся дрожжей Спаривание (A) деконволюции одиночный г-плоскости эпифлуоресцентной микрофотографии клеток с указанными генотипами сместился от MSL + N на MSL-N СМИ в течение 6 часов и устанавливается наMSL-N агарозном площадку в течение указанного времени. Наконечники указывают динамические зоны Myo52-3GFP и стрелка указывает локализацию Myo52 на слитого фокусе. (В), (С) деконволюции сингл плоскости г эпифлуоресцентной микрофотографии клеток с указанными генотипами сдвинуты от MSL + N на MSL-N средах в течение 4 ч , и смонтированный на MSL-N агарозном мини-прокладок , содержащих 0,1 мкг / мл (В) или 1 мкг / мл (с) Р-фактора в указанное время. Наконечники указывают на динамическую (В) или стабильные зоны (С) SCD2-GFP. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Справочная Фильм 1: DIC Timelapse дикого типа дрожжей H90 деления CE LLS , которые были азотно-голодали в течение 6 ч до визуализации. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
Справочная Фильм 2: . DIC Timelapse дикого типа Н + и Н- дрожжей деления клеток , которые были смешаны и азотно-голодали в течение 6 ч до визуализации (правой кнопкой мыши , чтобы загрузить).
"> Справочная Фильм 3: деконволюции одного г-плоскости эпифлуоресцентной и DIC Timelapse Н- клеток , экспрессирующих Myo52-3GFP из родного локуса смешивают с ч + клетки , экспрессирующие Myo52-tdTomato от родного очага и цитозольного GFP из P-клеток специфического промотора map3 . клетки выращивали в MSL-N среде в течение 6 ч при 30 ° с до обработки изображений. Передача цитозольного GFP в h- клетке определяет время сварки. (нажмите правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
Справочная Фильм 4: деконволюции одного г-плоскости эпифлуоресцентной и DIC Timelapse Н- sxa2 клеток ехрressing SCD2-GFP из своего нативного промотора обрабатывали 0,1 мкг / мл P-фактора. Клетки выращивали в MSL-N среде в течение 4 ч при 30 ° С до обработки изображений. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
Справочная Фильм 5: . Деконволюции сингл плоскости г эпифлуоресцентной и ДИК Timelapse Н- sxa2 клеток , экспрессирующих SCD2-GFP от его природного промотора обрабатывают 1 мкг / мл Р-фактора Клетки выращивали в MSL-N среде в течение 4 ч при 30 ° С Перед визуализации. (щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
| YSM995 | h- мас |
| YSM1371 | ч + вес |
| YSM 1396 | H90 мас |
| YSM2534 | h- myo52-3GFP :: kanMX |
| YSM2730 | ч + myo52-tdTomato :: natMX Pmap3: GFP :: ura4 + @ ura4locus |
| YSM2731 | h- SCD2-GFP :: natMX sxa2Δ :: kanMX |
Таблица S1: Штаммы , используемые в данном исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Условия окружающей среды, а также наличие питательных веществ, в частности, сильно влияют на физиологию делящихся дрожжей. Азотное голодание необходимо для приверженности к половому размножению и первоначально приводит к поразительным изменениям в прогрессии митотического клеточного цикла (см. 21 и Рисунок 2). После удаления азота из экспоненциально растущего населения, размер ячейки при делении быстро уменьшается (рис 2С) и большинство клеток арестовывать митоза короче , чем длина новорожденными экспоненциально , выращенных клеток (Ref. 21 и рис 2D). Поскольку клетки противоположных типов спаривания арест митоза они участвуют спаривание партнеров и приступить к образуют зиготы и образуют споры (рис 2B, 2E, 2F). В случае двумерного монослоя клеток дикого типа, более шестидесяти процентов H90 клеток будет привлекать партнера, и почти все будет проходить слияние клеток (рис 2G (рис 2G). Одним из наиболее важных аспектов протокола, чтобы получить высокую эффективность спаривание, чтобы гарантировать, что клетки находятся в пределах указанных плотностей повсюду. Мониторинг размера ячейки и эффективности спаривание параметров , как показано на рисунке 2 , а затем обеспечивает простое управление , что клетки эффективно ввод половое размножение.
Отметим , что, так как спаривание среды без какого - либо источника азота (даже низкие количества аминокислот и азотистых оснований исключены), высокая эффективность спаривание , такие как представлены на рисунке 2E и 2G получаются только с полностью прототрофных штаммов. Ауксотрофные штаммы могут быть использованы, но требуют дополнительного ухода, чтобы гарантировать, что клетки все время поддерживают в плотности клеток, указанных в протоколе. Даже с осторожностью, толькобудет наблюдаться снижение коэффициента полезного спаривание. Эффективность Спаривание также зависит от температуры, с более низкой эффективностью, наблюдаемых при повышенной температуре, что может ограничить использование чувствительных к температуре мутантных аллелей в процессе спаривания.
Метод, представленный здесь, в основном используется для долгосрочного визуализации флюоресцентных репортеров. Поскольку визуализация выполняется в течение длительного периода времени, успешное визуализация делящихся дрожжей вязки сильно зависит от настройки микроскопии доступной. Для этого, устойчивость микроскопа настройке, его чувствительность и доступ к системе автоматической фокусировки имеют решающее значение. Либо на основе программного обеспечения или встроенных аппаратных систем автофокусировка возможны. Кроме того, для увеличения пропускной способности, моторизованный этап позволяет приобретение многоточечной является еще одним важным качеством.
качество изображения ограничивается свойствами флуорофора интереса. Явные время инкубации в жидком MSL-N среде, описанной в ProtocoРаздел 2.3 л направлены на оптимизацию флуоресценции на феромонных индуцированных меченых белков и свести к минимуму ненужное отбеливание с помощью визуализации только сопряженная стадии интереса. В то время как обильные или сильно сконцентрированные флуоресцентно меченных белков позволяют приобретение сотни временных точках в течение всего жизненного цикла сексуального (фильм S3), другие белки являются достаточно сложными для изображения в течение продолжительного срока времени из - за фото-отбелки. Качество изображения также зависит от выбранного флуорофора, обычно производное GFP. Мы неоднократно наблюдали , что sfGFP 17 (superfolder GFP), который складывается с быстрой кинетикой, при условии , превосходный сигнал в процессе спаривания, возможно потому , что сильный аутофагия вызывает быстрый оборот белка. Важно отметить, что мы не контролировать наличие кислорода , необходимого для созревания флуоресцентного белка 17,22. Таким образом, рекомендуется проявлять осторожность при использовании флуоресцентных измерений для количественного определения уровней белков, выраженных после того, как клетки являются mounted на слайды, или использовать альтернативные кислорода проницаемые устройства микрофлюидики для проведения подобных экспериментов. Кроме того, агарозы колодки пятнистый с клетками в вечернее время и выдерживали при 18 ° С O / N были очень полезны для изображения слабых репортеров, поскольку такие колодки содержат смесь клеток на всех этапах полового размножения.
Спаривание у делящихся дрожжей не проявляет синхронность и клетки могут быть легко видеть , инициируя shmooing наряду с другими клетками уже спорообразующих (Фильмы S1, S2). Такая динамика популяций оказывает классические, объемные биохимические методы сложны в использовании, что делает единую микроскопии клеток, описанный здесь способ выбора. Всю микроскопию подходы, основанные на в принципе, могут быть применены к клеткам, приготовленных с протоколом, описанным здесь. Важно отметить, что эти подходы могут контролировать процессы , которые демонстрируют сопряженная динамику типов специфических , таких как слияние клетка-клетка , описываемого Дудина и его коллегами 12. Для контроля асимметрии, репортерам типа спариваниябыли особенно полезны (Фиг.3А). Различия между этими двумя типами сопрягаемых легко достигается при работе с гетероталличных штаммов с использованием различных флуорофоров помечать белки в Н- и Н + клеток. Тем не менее, это не представляется возможным для homothallic штаммов. Подход , разработанный , чтобы дифференцировать тип спаривания H90 клеток выразить цитозольных флуоресцентные белки под контролем специфических промоторов типа спаривания. В частности, были использованы промоторы генов map3 рецепторов феромонов и mam2 для приведения в действие экспрессию GFP или mCherry белков в P и M клеток соответственно. Кроме того, эти маркеры позволили точной синхронизации клеточного слияния клеток, визуализируются как передача флуоресцентного сигнала от одного партнера клетки к другой.
Спаривание феромоны являются важнейшими факторами , определяющими прогрессирует через различные стадии полового размножения у дрожжей 11,23. Различные уровни синтетического феромона приводят к различных состояний клеток поляризации в делящихся дрожжей (рис 3B, 3C и Ref. 11). Протокол включен выше, позволяет оценить, насколько различные экзогенные уровни феромонов влияют на клеточную физиологию. Поскольку феромон протеазы Sxa2 быстро деградирует P-фактор, а гетероталличный мутантный штамм, где протеаза был удален был использован для получения воспроизводимых результатов. Тем не менее, в смесях клеток противоположных типов спаривания, а не только уровни, но и пространственное распределение феромонов, испускаемых матовую партнера могут быть важными. Анализируя влияние феромонов пространственного распределения по реакции клеток потребует разработки более сложных установок , таких как микрофлюидики устройств , работающих на почкующихся дрожжей 24,25.
Таким образом, мы представляем базовый метод для долгосрочной микроскопии полового жизненного цикла дрожжей деления. Незначительные корректировки этого протокола позволяют researч сосредоточиться на клеточных реакций на различных этапах жизненного цикла сексуального. Комбинируя этот подход с одиночными инструментами клеток биохимия и микрофлюидики устройств будет способствовать дальнейшему укреплению делящихся дрожжей половое размножение в качестве мощной модельной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
AV была поддержана долгосрочной докторантуру EMBO. Исследования, проведенные в лаборатории Мартина финансируется за счет гранта ERC Starting (GeometryCellCycle) и грант научного фонда Швейцарский национальный (31003A_155944) до СГМ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
