Introduction
למרות חילופי גנטי בין שני תאים הוא האירוע המרכזי ברבייה מינית, היא מסתמכת על שרשרת האירועים מקדמים התמיינות תאים, לאפשר בחירה שותף, לבצע איחוי תאי תאים ולשמור על יציבות גנומית. כך מחזור החיים המיניים מציגים את עצמו כמערכת מודל ללמוד מספר השאלות ביולוגיות לגבי מתגים התפתחותי, בתגובה לגירויים חיצוניים, היתוך קרום פלזמה, פרדה כרומוזום, וכו 'היכרות עם שמרי ביקוע מחזור מיני ללמוד תופעות אלה מביאה את היתרונות של גנטיקת העצמה של מודל המערכת, ומבוסס גישות תפוקה גבוהה במיקרוסקופ משוכלל. סקס בשמרי ביקוע הוא אירוע heterotypic בין תא-P ו- M-תא של סוגי הזדווגות ברורים. שני סוגי התאים דיפרנציאלי להביע מספר הגנים 1,2 כולל אלה לייצור של P-המופרש ו- M-פרומונים, פרומון קולטנים Map3 ו Mam2 וכן פרומון פרוטיאהses Sxa1 ו Sxa2. זנים Homothallic, כגון זן h90 נפוץ, לשאת את המידע הגנטי לשני סוגי ההזדווגות בגנום יחיד התאים עוברים דפוס מורכב של מיתוג סוג ההזדווגות לאורך כל מחזור החיים mitotic (הנסקרת נ"צ. 3). מבודד מרובה של ביקוע שמרי heterothallic כי לעתים רחוקות או אף פעם לא יחליף את סוג ההזדווגות משמש גם 4 נפוץ, ובעיקר את h + N (P-type) ו- h -S (M-סוג) זנים.
בשמרי ביקוע, כניסת מחזור החיים המיניים נמצאת תחת רגולציה קפדנית תזונתית. רק בתאי שמרי ביקוע מורעבי חנקן לעצור רביית mitotic ולייצר פרומונים diffusible לאותת נוכחות של שותף הזדווגות ולקדם צעדים נוספים של המחזור המיני (הנסקרת נ"צ. 5). מניעת חנקן דה-מדחיק את הרגולטור תעתיק המפתח של Ste11 ההזדווגות שפועל כמתג התפתחותי ומקדם דוארxpression הזדווגות גנים ספציפיים כולל קולטן פרומון ואת הגנים ייצור פרומון 6,7. אירוסי פרומון קולטן מפעילים את החלבון בשילוב קולטן G-אלפא ואיתות MAPK במורד זרם אשר משפר עוד יותר פעילות תעתיק Ste11 8-10, ובכך להגדיל ייצור פרומון בתוך משוב חיובי בין בני זוג הזדווגות. רמות פרומון הם קריטיים כדי לגרום מצבי קיטוב תאים שונים על ידי ויסות מארגן אדון קוטביות התא, Cdc42 GTPase Rho-משפחה 11. בחשיפה לריכוזים נמוכים פרומון, פעיל Cdc42 היא דמיינה בטלאים דינמיים לחקור את פריפרית התא, ולא צמיחת תאים הוא ציינה בשלב זה. רמות פרומון מוגברים לקדם את התייצבות פעילות Cdc42 לאזור וצמיחה יחיד של הקרנה מקוטבת, כינה את shmoo, מה שמביא תאים שותף בקשר. בהמשך לכך, שני שותפי הזדווגות הפלואידים פתיל כדי ליצור זיגוטה דיפלואידי. מחקר שנערך לאחרונה מגלה הקיומו דואר של מבנה יקטין רומן חיוני היתוך שמורכב על ידי formin מושרה ההזדווגות Fus1 12. מוקד היתוך זה מתרכז תהליכים התלויים שרירן הסוג-V ו- ממקם את המכונות שפלות דופן תא, ובכך מאפשר שיפוץ של דופן התא כדי לאפשר מגע קרום פלזמה ללא תא תמוגה 12. לאחר איחוי תאים תאים, הגרעינים באים במגע ועוברים karyogamy. תנועה בולטת-dynein תלויים גב ו-ושוב של גרעין בתוך הזיגוטה (תנועת זנב סוס) אז מקדם ההתאמה של homologs כרומוזום 13,14, אשר מלווה המיוזה. לבסוף, ארבעה מוצרים של המיוזה ארוזים לתוך נבגים בודדים במהלך נביגה.
בגלל המורכבות שלה ואת הצעדים הרבים המעורבים, ניטור של הזדווגות מפורט כבר מאתגר. שני קשיים בולטים הן כי התהליך כולו לוקח הרבה מעל חמישה עשר שעות וכי תאים קשים לסנכרן. אלה דifficulties אפשר להערים על ידי גישות מיקרוסקופיה תא בודד. הנה פרוטוקול החקירה כללי מחזור החיים מינית בשמרי ביקוע מוצגים. עם שינויים קלים, פרוטוקול זה מאפשר הלימוד של כל השלבים השונים של התהליך, כלומר האינדוקציה של תוצר גן הזדווגות, קיטוב תא זיווג בין-תאי ואחות אחרי מיתוג סוג ההזדווגות בין בני זוג לא-אחות, היתוך תאי תאים, ופוסט היתוך סוס זנב התנועה, המיוזה ו נביגה. שיטה זו מאפשרת ל -1) בקלות לדמיין fluorescently מתויג חלבונים לאורך זמן מראש, במהלך פיוז'ן פוסט; 2) להפלות את התנהגותם של תאים מסוג ההזדווגות מול; ו -3) למדוד ולכמת פרמטרים כגון shmooing, הזדווגות, איחוי או יעיל נביגה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניתוח מיקרוסקופי של רבייה מינית שמרי ביקוע
1. הכנת Media
- הכן בינוני מינימום נביגה (MSL-N) 15 על ידי ערבוב המרכיבים הבאים: גלוקוז: 10 גר '/ ל, KH 2 PO 4: 1 גר' / ל, NaCl: 0.1 גר '/ ל, MgSO 4 · 7H 2 O: 0.2 גר' / ל הוספת יסודות קורט (10,000x): 100 μl / L, ויטמינים (1,000x): 1 מ"ל / L, ו -0.1 M CaCl 2 מ"ל / L. מסנן לעקר באמצעות מסנן גודל 0.22 מיקרומטר נקבוביים ולאחסן בטמפרטורת חדר (RT).
- השתמש ויטמינים הבאים (1,000x) במלאי: Pantothenate: L / g 1, ניקוטינית חומצה: 10 גר '/ ל, אינוזיטול: 10 גר' / ל, ביוטין: 10 מ"ג / ליטר. מסנן לעקר באמצעות מסנן גודל נקבובי 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
- השתמש יסודות קורט הבאים (10,000x) במלאי: חומצת בור: 5 גר '/ ל, MnSO 4: 4 g / L, ZnSO 4 · 7H 2 O: 4 g / L, FeCl 2 · 6H 2 O: 2 גר' / ל Moo 3,: 0.4 גר '/ ל, KI: 1 גר' / ל, CuSO 4· 5H 2 O: 0.4 גר '/ ל, חומצה ציטרית: 10 גר' / ל. מסנן לעקר באמצעות מסנן גודל נקבובי 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
- הכן MSL-N Agarose 2% (המשמש לייצור תאי כרית agarose) על ידי שילוב של 10 מ"ל MSL-N עם 0.2 גרם של agarose. ממיסים עבור ~ 2 דקות בהספק גבוה במיקרוגל עד להמסת agarose ו -0.5 מ"ל aliquot צינורות microcentrifuge. חנות ב RT.
- הכן בינוני מינימום נביגה עם חנקן (MSL + N) מ MSL-N ידי הוספת (NH 4) 2 SO 4: 1 גר '/ ל, לאוצין: 0.225 g / L, אדנין: 0.225 g / L, אורציל: 0.225 g / L . מסנן לעקר באמצעות מסנן גודל נקבובי 0.22 מיקרומטר. חנות ב RT.
הערה: לאוצין, אדנין ו אורציל מתווספים בינוני זו כדי לאפשר צמיחה של זני auxotrophic. יש לכלול תוספת חומצות אמינו נוספת אם הזן המשמש נושא auxotrophy מובהק (למשל his3Δ). כמו כן, שים עבודה עם זני prototroph מלא מומלץ, כמו שרקזנים כאלה ייאפשרו יעילות הזדווגות גבוהה. - כן 200 מיליליטר VALAP לאיטום קאמרי. בכוס להוסיף משקל זהה של לנולין, וזלין (או וזלין אחר), וכן פרפין. תערובת חום בטמפרטורה נמוכה ומערבבים מדי פעם עד לקבלת תערובת אחידה היטב. Aliquot את התערובת לתוך כמה צלחות פטרי קטנות. חנות ב RT.
2. זני שמרים Culturing ביקוע לניסויים מזווגים (איור 1).
- יום 1, ערב:
לחסן טרי זנים ומפוספסים מן התקשורת מוצקה לתוך צינורות תרבות המכילים 3 מיליליטר של MSL + N. השתמש צינורות שטוח בתחתית בקוטר כ -2.5 ס"מ. השתמש צינורות או צלוחיות תרבות אחרים עם נפח תרבות מותאם. דגירה לילה (O / N) עם רועד ב 25 ° C, 200 סל"ד. אם עובד עם זני heterothallic, לחסן בנפרד.- לדלל השעיות תא התקשורת למחרת בבוקר כדי לוודא שיש תרבויות צפיפות אופטית נמדד ב 600 ננומטר (OD 600) של 0.4-0.8 בערב.
הערה:OD 600 מדידות כמו פרוקסי של ריכוז התא עבור שמרים ביקוע הם ליניאריים בטווח של כ 0.1-1.0. לקבלת OD ספקטרופוטומטר שלנו 600 = 0.1 תואמים 1.4 x 10 6 תאים לכל מיליליטר. לכן, אם ראשוני OD 600 קורא הם מחוץ לטווח זה דגימות צריכות להיות דלילות / מרוכז למדידות אמינות.
- לדלל השעיות תא התקשורת למחרת בבוקר כדי לוודא שיש תרבויות צפיפות אופטית נמדד ב 600 ננומטר (OD 600) של 0.4-0.8 בערב.
- יום 2, ערב:
לדלל התאים ב 20 מ"ל של התקשורת MSL + N כדי OD 600 = 0.025 100 מ"ל צלוחיות. דגירת זני O / N ב 30 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד.
הערה: בתרביות תאי wild-type צריכות להגיע OD 600 ~ 0.8 למחרת בבוקר (15 שעות מאוחר יותר). אם עובד עם זנים עם זמן דור כבר להתאים דילול בהתאם. - יום 3, הבוקר:
מדוד OD 600 לוודא שיש תרבויות צפיפות התאים של OD 600 ~ 0.8. אם עובד עם זני heterothallic, לערבב מספר שווה של תאי שותף. תאים גלולים XG ב 1000 ולהעביר 1.5 מיליליטרצינור. שטפו תאים שלוש פעמים 1 מ"ל של מדיום MSL-N. Re להשעות תאים 3 מ"ל של מדיום MSL-N ו לדלל התאים OD 600 = 1.5.- כדי לפקח זיווג בין תאי אחות ישירות הר תאי הדמיה (ראה פרוטוקול סעיף 2.4). השתמש זני h90 homothallic, שבה מיתוג סוג ההזדווגות יתקיים במהלך חטיבות mitotic שהתרחשו לאחר קיפוח חנקן. הרכבה מיידי של תאים על כרית agarose מבטיח כי, לאחר חלוקת התא, אחות-התאים נשארים אחד ליד השני.
- כדי לפקח קיטוב תא (דינמיקת גישוש shmooing) דגירה 1-3 מיליליטר של תרבית תאים על 30 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד במשך 3-4 שעות לפני תאי הרכבת הדמיה. בתוך 3-4 אלה hr, חטיבת mitotic האחרונה תהיה התרחשה. כמה תאים יהיו יזמיו קיטוב, אבל הכי פשוט יהיה החל דינמיקת קיטוב הגישוש שלהם.
- כדי לפקח איחוי תאים תאים דגירה 1-3 מ"ל של תרבית תאים על 30 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד במשך 4-6 שעות פריאו הרכבת תאי הדמיה.
- כדי לפקח אירועים שלאחר היתוך דגירת 1-3 מיליליטר של תרביות תאים על 30 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד במשך 8 שעות לפני הרכבת תאי הדמיה.
- כדי לפקח בתגובת ריכוז פרומון מסוים (רק עבור זני heterothallic) דגירה 3 מיליליטר של תרבית תאים על 30 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד במשך 3-4 שעות לפני הרכבת תאי הדמיה.
- הסר את צינור microcentrifuge MSL-N-המכיל מהגוש 95 ° C החום (ראה סעיף 2.4.1 פרוטוקול. להלן). להוסיף P-גורם או M-גורם בריכוז הרצוי ישירות agarose MSL-N נמס. מערבבים היטב על ידי vortexing לפני ההכנה כרית מיידית.
- לאחר תא הרכבה, דגירת הכרית במשך 15-30 דק 'ב 25 ° C לפני ההדמיה. P-factor ו פרומונים M-גורם שימשו מפתרון המניות של 1 מ"ג / מ"ל מתנול.
הערה: אם עובד עם מוטצית זני פעמי דגירה עשויות להשתנות. התקבצות של תאים עלולה להתרחש לאחר דגירה ממושכת מ נוזלedia ועלול להיות חזק במיוחד זנים מוטנטים כמה. תאים מגושמים לא ניתן הבחינו על כריות agarose בשכבה אחת ובכך שקשה פוקוס אוטומטי ותמונה. במקרה התקבצות תא נרחב הר תאים על כריות agarose מייד לאחר שטיפות מחדש השעיה בתקשורת חסרת-חנקן (כמו באזור הפרוטוקול 2.3.1.) דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה.
- הרכבת תאי הדמיה:
- כן MSL-N רפידות agarose 16 על ידי המסת דוגמא מתמיסה בסיסית בתוך גוש חום 95 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות והוספה 200 μl בין שתי שקופיות זכוכית מופרדות מפרידים (האיור 1B). השתמש מפרידים בעובי של ~ 0.5 מ"מ. כדי להפוך מפרידים, רצועות שימוש לגזור קרטון, כגון נמסר כי עם אנזימי הגבלה.
- גלולה 100 μl של תאים XG ב 1000 דקות 1, להסיר את supernatant מחדש להשעות תאים בינוניים שיורית 2-4 μl. לא מחדש להשעות במדיום טרי כמו שהוא מעכבהזדווגות.
- לאחר 2-3 דקות להסיר בזהירות מפרידי שקופיות הזכוכית העליונות. אם מספר זנים הם להיות מותקנים, להכין את התא מתרכז לפני הכנת כרית agarose.
- הוסף 1 μl של תאים לרפד ולחכות עד הטיפה ומתחילה לנגב (~ 1 דק ') לפני הכיסוי עם תלוש כיסוי ואיטום עם VALAP.
- תן הכרית לשבת במשך לפחות 30 דקות לפני ההדמיה של 25 מעלות צלזיוס או RT.
- כדי לקבל תערובת של תאים בשלבים שונים של הזדווגות, לבצע משטח מיד לאחר שטיפות ב MSL-N (ראה סעיף 2.3.) ו לדגור על 18 ° CO / N (~ 15 שעות). גישה זו שימושית עבור הדמית תאים בשלבי הזדווגות נפרדות עם רזולוציה גבוהה זמנית או דוגמאות עם אות חלשה.
3. Live- תא הדמיה של תאי שמרי הזדווגות
- התאם גדרות רכישת תמונה.
הערה: הגדרות רכישת תמונה המוצגת כאן היו אופטימיזציה עבור פלטפורמת DeltaVision המורכבת IX-71 אולימפוס אישיתמיקרוסקופ הפוכה עם תכנית Apo 60X / 1.42 NA או U-תכנית Apo 100X / 1.4 מטרות NA, מצלמת CoolSnap HQ2 וכן מאייר היחיד בשילוב Insight SSI 7 צבע. החומרה נשלטת על ידי v4.1.2 softWoRx כי גם מאפשר autofocusing הדיגיטלי.- ודא כי מרווחי autofocusing לא יעלו על 15 דקות מאז להיסחף-Z לאורך זמן ארוך יותר יכול לעלות את היכולת של מערכת autofocusing תוכנה. אם באמצעות מערכת autofocusing מבוסס חומרה, להשתמש במרווחים גדולים יותר.
- התאם מרווח הדמיה. קח תמונות כל 10 דקות במשך ~ 15 שעות כנקודת מוצא כשעובדים עם מתויג חלבון fluorescently בפעם הראשונה. מרווח זה מספק סקירה טובה של תהליך ההזדווגות כולו ללא הלבנה נרחבת.
- תמונה עם 5 מרווחי דקות או קצרים לאירועי שעה במדויק יותר כגון היתוך. במרווחי זמן קצרים יותר דורשים fluorophores החזק המאפשר פעמי חשיפה נמוכות לבן קטן. עבור הדמיה עם מרווחים מתחת ל -1 דקות להימנע O / מיקרוסקופיה Nובמקום להכין תערובת של כל שלבי ההזדווגות כמפורט בסעיף 2.4.6 פרוטוקול.
- התאם זמן חשיפת תמונה. פעמי חשיפת מבחן בין 50 ל 300 אלפיות שניים. מטרתם היא למצוא איזון בין יחס אות-רעש photobleaching כדי להשיג מספר רב של נקודות זמן עם אות ניתן להבחין (בדרך כלל מעל 100).
- התאם-חתך Z. מדורים כל 0.3 מיקרומטר 5 מיקרומטר כיסוי לספק עומק הדמיה טוב. שים לב-נזק התמונה עליות נוספות חתך-Z, אשר ניתן למזער על ידי שימוש OAI (אינטגרציה לציר האופטי - רכישה לטאטא יחיד של עומק כלל המדגם). מערכת פוקוס אוטומטי טוב מפחיתה את הצורך Z- קטעים רבים והוא מומלץ מאוד.
- טיפים ללמוד התנהגויות זיווג סוג ספציפיות:
- עבור זני heterothallic, השתמש h- ו- H + תאי מבטאי fluorophores ברור, כך ששני סוגי התאים ניתן להבחין. השתמש בכל fluoropho מקודד גנטימחדש הביע כגרסה או היתוך cytosolic לחלבון אנדוגני, אם כי יש לנו הצלחה טובה עם sfGFP, גרסה מהירה מתקפלים של GFP 17. חלבונים אנדוגניים בדרך כלל מתויגים ב מוקד הגנומי אנדוגני שלהם על ידי רקומבינציה הומולוגי 14.
- עבור זני homothallic, לבטא חלבון פלואורסצנטי cytosolic מקודד גנטי בשליטת יזמים ספציפיים סוג ההזדווגות כגון אלה של גני קולטן פרומון map3 ו mam2 לנהוג הביטוי בתאי P ו- M, בהתאמה. היזמים של map3 ו mam2 אינם פעילים במהלך הצמיחה וגטטיבי והם המושרה על רעב חנקן 18,19. בונה נהיגה הביטוי של ה- GFP cytosolic או mCherry בשליטת היזמים אלה משולבים בדרך כלל מוקד גנומית (ura4, leu1) כי אינו מתערב עם התקדמות נורמלית במחזור חיי המין 12.
4. כימות היעילות המזווגת ופיוז'ן
- כדי לכמת את היעילות ההזדווגות ואיחוי 11,12, תאים במקום מיד לאחר MSL-N לשטוף על כריות agarose MSL-N, כמו בשלב 2.3.1 לעיל, ולהשאיר למשך 24 שעות ב 25 ° C לפני הדמיה (איור 1 א). שימוש בפרוטוקול זה יעילות הזדווגות זן פראי סוג homothallic מגיעה ~ 60% ויעילות פיוז'ן 99%. כדי לבחון האם ירידה בכמות הערכים אלה נצפו זנים מוטנטים לשקף פנוטיפ מסוף או עיכוב, לחזור על הניסוי עם זמן דגירה 36 שעות.
- חישוב יעילות הזדווגות כמו
זוגות זיווג לכלול zygotes, asci, וזוגות תא unfused זיהה מןהמיקום ואת הצמיחה שלהם אחד כלפי אחרים. - חישוב יעיל היתוך כמו
הערה: זוגות הזדווגות חיפוי מזוהים על ידי היכולת שלהם ליצור נבגים אם ידוע כי המוטציה נחקרת אינה משפיעה נביגה. אם נביגה לא ניתן להשתמש כמו-אאוט לקרוא, ההיתוך נקבע על ידי התבוננות הפצת סמן cytosolic לידי ביטוי רק אחד מבני זוג הזדווגות לתוך שני בני הזוג.
זוגות זיווג לכלול zygotes, asci, וזוגות תא unfused זיהה מןהמיקום ואת הצמיחה שלהם אחד כלפי אחרים. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צמיחת ביקוע שמרים והזדווגות Dynamics עם וסילוק מקור חנקן
כמו רעב חנקן הוא תנאי הכרחי חניכה של רבייה מינית בשמרי ביקוע, h90 זן homothallic wild-type היה פיקוח על מעבר בין חנקן עשיר עד בינוני מקופח חנקן (איור 2), בעקבות הפרוטוקול המתואר באיור 1. בקצרה, תאים גדלו O / N לשלב מעריכים (OD 600 = 0.5) במדיום MSL + N, אסף, רחץ מחדש תלוי במדיום נוזל MSL-N כדי OD הסופי 600 = 1.5. כל 2 aliquots hr של תאים היו calcofluor מוכתם צילמו (איור 2 א - ד).
מכתים Calcofluor (איור 2 א) עולה כי במדיום חנקן עשירי ~ 21% של התאים היו septating (n> 300, איור 2B) וכי אורך התא הממוצע ב diviשיאון היה 15.2 ± 1.4 מיקרומטר (n = 50, איור 2C). תאים המתחלקים עישון הראו הפצה רחבה של אורכי תא (8-14 מיקרומטר; n> 200, איור 2 ד). עם זאת, שעתיים אחרי המשמרת עד בינוני MSL-N חל שינוי דרסטי בחלוקת אורך של תאים שאינם מתחלקים, הפועלת למעלה מ -60% של התאים היו יותר נמוכות 9 מיקרומטר (n> 200, איור 2 ד). גם תא septation זוהה על אורך מופחת של 9.8 ± 0.8 מיקרומטר (n = 50, איור 2 א, 2 ג). הפחתה נוספת באורך של שני הלא המפריד חלוקת תאים נצפתה גם, ככל שזמן ב MSL-N גדל. ואכן, אחרי 8 שעות מדד septation של התרבות ירד מתחת ל -2% (n> 300) מעל 85% של תאים נעצר מחזור התא שלהם באורכים של פחות מ -7 מיקרומטר (n> 200, איור 2 ד).
תאים החל להיווצר ההזדווגות זוגות ארבע שעות אחרי המשמרת לנוזל MSL-Nבינוני (<1%, איור 2 א). בהמשך מספר זוגות הזדווגות גדל בקצב מהיר ו -8 שעות לאחר משמרת 10% של תאים עוסקות שותף הזדווגות (n> 200, איור 2 ב).
כדי לפקח דינמיקת הזדווגות, 6 שעות לאחר אינדוקציה רעבה, aliquot של תאים הוצב גם על כרית agarose MSL-N הדמיה. תאים שעברו shmooing, פיוז'ן נביגה (איור 2E, 2F) ב -21 שעות לאחר מכן ללא כל סינכרון לכאורה (סרט S1). היעילות ההזדווגות תלוי את המיקום היחסי וצפיפות של תאים בתחום מסוים של נוף, עם למעלה מ 60% של תאים עוסקת שותף כשהוא מוצב בצפיפות בשכבה (איור 2G ו סרט S1).
שמרי ביקוע wild-type heterothallic h + ו- h- הזנים גם ייחשפו לאותה הפרוטוקול עםn נוסף צעד של ערבוב h + ותאי h- על יחס אחד-על-אחד בזמן סילוק חנקן. דינמיקת מרעב הזדווגות דומה נצפתה, אבל יעילויות ההזדווגות הייתה נמוכות במעט (2G איור, סרט S2).
ניטור Dynamics של חלבונים fluorescently Tagged בתאי שמרים מזווג ביקוע
כדי לפקח על הדינמיקה של סוג-V שרירן Myo52 (אסמכתא 20) בתאים ההזדווגות, תאים h- גדלה במהירות להביע Myo52-3GFP מן הלוקוס הילידים היו מעורבים עם h + תאים המבטאים באופן דומה Myo52-tdTomato, כמו גם GFP cytosolic מן P דו תאי אמרגן map3 ספציפי. ההשעיה התא נשטף, מדולל בינוני MSL-N וטופחו במשך 6 שעות ב 30 ºC, 200 סל"ד לפני תאים לתלייה על כריות agarose MSL-N עבור O / הדמיה N ב 10 מרווחי דקות.
כפי שדווח בעבר 11,12 Myo52 בתחילה נוצרו אזורי דינאמי ברחבי קליפת התא (איור 3A, ראשי חץ סרט S3). Myo52 האות התייצב אז (איור 3 א, חצי הסרט S3) ב מוקד יחיד רק לפני אירוע ההיתוך, אשר היה דמיין ידי העברת אות GFP cytosolic מן h + לתוך תא h- (איור 3 א ו סרט S3) . האות Myo52-tdTomato יכול להיות גם ציין בצוואר היתוך במהלך התפשטותו אבל אין אות להבחין ניכרה כמו הזיגוטה המשיך נביגה (איור 3 א ו סרט S3).
מעקב אחר התנהגותם של תאים שמרים ביקוע Heterothallic החשוף פרומונים חיצוניים
תאי h- Heterothallic חסרי הפרוטאז Sxa2 הזה מבזה P-factor עבור הקהיה מגיבים במהירות P-גורם סינטטי. h- sxa2Δ, להביע Scd2-GFP כסמן Cdc42 פעיל 11, היה גדל במדיום MSL + N, בהתאם לפרוטוקול תיאר. תאים נשטפו במדיום MSL-N וטופחו במשך 4 שעות ב 30 ºC. רפידות agarose MSL-N המכילות מתנול (מידע לא מוצג), 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר (פרומון נמוך, איור 3B) או 1 מיקרוגרם / מיליליטר (פרומון גבוה, איור 3 ג) של P-גורם הוכנו, לחתוך ואת מיקומו על שקופית חדשה כדי ליצור כריות מיני המכילות כמויות פרומון שונות. 0.5 μl של השעית תא היה רכוב על כל כריות מיניות עבור O / הדמית N ב 5 מרווחי דקות.
הקונקורדנציה עם תוצאות שפורסמו 11, רמות P-גורם נמוכים קדמו את הקמת אזורי Scd2 הדינמיים ללא צמיחה (האיור 3B, סרט S4), ואילו רמות גבוהות של P-גורם התייצבו אזור Scd2 יחיד, ובכך גרימת התארכות shmoo מקוטב תא אחד (Figure 3C, סרט S5).
איור 1:.. ייצוג סכמטי של הפרוטוקול (א) תיאור סכמטי של הפרוטוקולים המשמשים לניטור שמרים ביקוע מחזור חיים מיניים (B) להכין שמרים דגימות ביקוע הדמיה לטווח ארוך אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .
איור 2:. צמיחה Dynamics הזדווגות של תאים ביקוע שמרים נעו MSL + N כדי MSL-N מדיה (א) micrographs epifluorescence של תאים מוכתם calcofluor עבר MSL-N התקשורת לתקופות המצוין של זמן. (B) אחוזשל septating (קו כחול כהה, n> 300 לכל timepoint) ו- (אור כחול קו, n> 300 לכל timepoint) הזדווגות תאים מוזזים למדיה MSL-N לתקופות המצוינות של זמן. (ג) ממוצע אורך של תאי septating מוזז למדיה MSL-N לתקופות המצוינות של זמן (n = 50 לכל timepoint למעט 8 שעות timepoint כאשר n = 20). (ד) חלוקת אורך של תאים שאינם מתחלקים מוזזת עד בינוני MSL-N לתקופות המצוינות של זמן (n> 200 לכל timepoint). (E) שבריר הממוצע של (קו הכחול כהה) unfused, התמזג (קו קל-כחול) sporulating (קו שחור) תאי אוכלוסייה של שמרי h90 wild-type מוזז למדיה MSL-N לתקופות המצוינות של זמן רכוב על גבי כרית אגרה hr timepoint 6 (n> 900 תאים לכל timepoint משלושה מעברים זמן שונים). התאים נחשבו התמזגו כשאף דופן תא שבירה בין השותפים הייתה גלויה micrographs דסק"ש ההיווצרות של דופן תא הנבג שמש לזכות sporulating תאים. (F) micrographs דסק"ש של תאי הזדווגות מוזז למדיה MSL-N לתקופות המצוינות של זמן. (G) יעילות מזווג כפונקציה של צפיפות התאים על כריות agarose עבור h90 (נקודות בצבע כחול כהה) ו- H + / H- (תכלת נקודות) תאים מוזז למדיה MSL-N למשך 24 שעות. הצפיפות המתאימה ביותר של תאים עבור הדמיה לטווח ארוך מושג על כ 25,000 תאים / מ"מ 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. לוקליזציה דינמי של חלבונים פלורסנט במהלך ביקוע שמרים מזווג (א) deconvolved micrographs מטוס- z epifluorescence תאים אחת עם גנוטיפים הצביע מוזז מ MSL + N כדי MSL-N התקשורת במשך 6 שעות ו מותקן על גביMSL-N כרית agarose בפעם המצוינת. ראשי חץ עולים אזורי Myo52-3GFP דינמיים על החץ מציין לוקליזציה Myo52 במוקד ההיתוך. (ב), (ג) deconvolved יחיד מטוס- z micrographs epifluorescence של תאים עם גנוטיפ המצוין מוזז מ MSL + N למדיה MSL-N עבור 4 שעות רכוב על כריות מיני agarose MSL-N המכיל 0.1 מיקרוגרם / מ"ל (B) או 1 מיקרוגרם / מיליליטר (C) של P-גורם בפעם המצוינת. ראשי חץ עולים דינמי (B) או יציבים (C) אזורי Scd2-GFP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט משלימה 1: timelapse דסק"ש של ce שמרים ביקוע h90 wild-type LLS שהיו מורעבים חנקן במשך 6 שעות לפני הדמיה. (קליק ימני להוריד).
סרט משלימה 2: . Timelapse דסק"ש של + h wild-type ותאי שמרים ביקוע h- שהיו מעורבים וחנקן מורעבים עבור 6 שעות לפני הדמיה (קליק ימני להוריד).
"<סרט משלימה 3: epifluorescence z-מטוס בודד deconvolved ו timelapse דסק"ש של תאים h- להביע Myo52-3GFP מן הלוקוס יליד מעורבב עם h + תאים המבטאים Myo52-tdTomato מן הלוקוס יליד GFP cytosolic מן האמרגן map3 P-תאים ספציפיים . התאים גדלו ב MSL-N בינונית במשך 6 שעות ב 30 ºC לפני הדמיה. העברת GFP cytosolic לתוך התא h- מגדיר את זמן היתוך. (קליק ימני להוריד).
סרט משלימה 4: epifluorescence z-מטוס בודד deconvolved ו timelapse דסק"ש של exp תאים sxa2 h- ressing Scd2-GFP מן האמרגן המקורי שלו שטופל 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר גורם P. תאים גדלו במדיום MSL-N עבור 4 שעות ב 30 ºC לפני ההדמיה. (קליק ימני להוריד).
סרט משלימה 5: . Epifluorescence z-מטוס בודד deconvolved ודסק"ש timelapse של תאים sxa2 h- להביע Scd2-GFP מן האמרגן המקורית שלו שטופלו 1 מיקרוגרם / מ"ל P-גורם התאים גדלו במדיום MSL-N עבור 4 שעות ב 30 ºC לפני ההדמיה. (קליק ימני להוריד).
| YSM995 | h- WT |
| YSM1371 | h + WT |
| YSM 1396 | WT h90 |
| YSM2534 | h- myo52-3GFP :: kanMX |
| YSM2730 | h + myo52-tdTomato :: natMX Pmap3: GFP :: ura4 + @ ura4locus |
| YSM2731 | scd2-GFP h- :: natMX sxa2Δ :: kanMX |
S1 טבלה: זנים המשמשים במחקר זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תנאים סביבתיים, וזמינות מזינה בפרט, מאוד משפיעים על הפיסיולוגיה שמרים ביקוע. רעב חנקן הכרחי מחויב הרבייה המינית בתחילה מובילה לשינויים בולטים את התקדמות מחזור תא mitotic (Ref. 21 ואיור 2). לאחר הסרת חנקן מן האוכלוסייה גדלה באופן אקספוננציאלי, גודל תא בחטיבה יורד במהירות (איור 2 ג) ואת רוב התאים לעצור התקדמות mitotic קצרה מהאורך של תאים גדלו במהירות שזה עתה נולד (Ref. 21 והאיור 2D). ככל שהתאים של סוגי ההזדווגות מול לעצור התקדמות mitotic הם עוסקים ההזדווגות שותפים ולהמשיך ליצור zygotes ו sporulate (תרשים 2B, 2E, 2F). במקרה של בשכבה דו-ממדית של תאי wildtype, מעל שישים אחוז של תאי h90 יעסוק שותף, וכמעט כל יעבור איחוי תאים (איור 2G (איור 2G). אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול להשיג יעילויות הזדווגות גבוהות הוא להבטיח כי תאים נשמרים בתוך הצפיפויות המצוינות ברחבי. ניטור פרמטרי הזדווגות גודל תא יעיל כפי שמוצג באיור 2 ולאחר מכן מספק שליטה פשוטה שתא נכנסות רבייה מינית ביעילות.
נציין כי, מאז הזדווגות חוסר בינוני מכל מקור חנקן (אפילו כמויות נמוכות של חומצות אמינו ובסיסי חנקן אינם נכללים), יעילויות הזדווגות גבוהות כמו אלה שהוצגו באיור 2E ו 2G מתקבלות רק עם זני prototrophic מלא. זנים Auxotrophic ניתן להשתמש, אבל דורשים טיפול נוסף על מנת להבטיח כי התאים הם בכל עת שמר בתוך צפיפות התא נאמר בפרוטוקול. אך גם עם טיפול, רקיעילות הזדווגות נמוכה תקוים. יעילות מזווגת מושפעת גם טמפרטורה, עם יעילות נמוכה יותר נצפתה בטמפרטורה גבוהה, אשר עשוי להגביל את השימוש של אללים מוטנטים רגישים לטמפרטורה במהלך תהליך ההזדווגות.
השיטה המוצגת כאן משמשת בעיקר עבור הדמיה לטווח ארוך של כתבי ניאון. בגלל הדמיה מבוצעת על תקופה ארוכה, הדמיה מוצלחת של הזדווגות שמרים ביקוע תלויה מאוד על התקנת מיקרוסקופ הזמינה. לשם כך, על יציבות הגדרת מיקרוסקופ, הרגישות ונגישותו מערכת פוקוס אוטומטית הן קריטיות. כך או מבוסס תוכנה או מובנית מערכות פוקוס אוטומטי חומרה אפשריות. בנוסף, כדי להגדיל את התפוקה, במה ממונעת המאפשרת רכישה מרובה עוד תכונה חשובה.
איכות הדמיה מוגבלת על ידי המאפיינים של fluorophore של עניין. זמני הדגירה הברורים במדיום נוזל MSL-N המפורט Protocoסעיף l 2.3 הם שמטרתן ייעול קרינה על חלבונים מתויגים-induced פרומון ומזעור הלבנה מיותר על ידי הדמיה בשלבי הזדווגות רק עניין. בעוד חלבונים בשפע או focalized מאוד המתויגים fluorescently לאפשר רכישת מאות נקודות זמן במהלך מחזור החיים של המיני כולו (סרט S3), חלבונים אחרים הם מאתגרים לתדמית מעל פעמים כה ארוכות בשל צילום לבן. איכות תמונה תלויה גם fluorophore נבחר, בדרך כלל נגזרת GFP. צפינו שוב ושוב כי 17 sfGFP (superfolder GFP), אשר מקפל עם קינטיקה מהירה, ובלבד אות מעולה במהלך תהליך ההזדווגות, אולי בגלל autophagy החזק גורם מחזור חלבון מהיר. חשוב לציין, אנו לא לעקוב אחר זמינות של חמצן הכרחי התבגרות חלבון פלואורסצנטי 17,22. לפיכך, מומלץ להיות זהיר באמצעות מדידות קרינה לכמת את הרמות של חלבונים הביעו לאחר תאי mounteד גבי שקופיות, או להשתמש במכשירי מיקרופלואידיקה חדירים אלטרנטיבת חמצן לבצע ניסויים כאלה. בנוסף, רפידות agarose מנוקדות תאים בערב והמשיכו ב -18 ºC O / N היה מאוד שימושי לכתבים חלשים תמונה כמו כריות כאלה מכילות תערובת של תאים בכל שלבי רבייה מינית.
זיווג בשמרים ביקוע אינה התערוכה בתיאום ותאי ניתן לראות בקלות ליזום shmooing לצד תאים אחרים כבר sporulating (סרטים S1, S2). הדינמיקה באוכלוסייה זו הופכת קלאסית, טכניקות ביוכימיות בתפזורת קשה לשימוש, מה שהופך מיקרוסקופיה תא בודד המתואר כאן שיטה של בחירה. כל הגישות המבוסס על מיקרוסקופיה יכולות עקרונית להיות מיושמות על התא מוכן עם הפרוטוקול המתואר כאן. חשוב לציין, גישות אלה יכולים לנטר תהליכים כי תערוכת הזדווגות דינמיקת סוג ספציפי כגון איחוי תאי תאים שתאר דודין ועמיתיו 12. כדי לפקח לכתבים אסימטריה, סוג ההזדווגותכבר שימושי במיוחד (איור 3 א). ההבחנה בין שני סוגי ההזדווגות מושגת בקלות כשעובדת עם זני heterothallic ידי העסקת fluorophores הברור לתייג חלבוני h- ו- H + תאים. עם זאת, זה לא ריאלי עבור זני homothallic. גישה פותחת על מנת להבחין בין סוגי ההזדווגות של תאי h90 היא להביע חלבוני ניאון cytosolic בשליטת יזמים ספציפיים סוג ההזדווגות. בפרט, היזמים של גנים קולטן פרומון map3 ו mam2 שימשו לנהוג ביטוי של חלבונים GFP או mCherry ב P ותאים M בהתאמה. יתר על כן, סמנים אלה מותר תזמון מדויק של היתוך תאים תאים, דמיינו כמו העברת אות ניאון מתא שותף אחד למשנהו.
פרומונים הזדווגות הם המכריעים עבור התקדמות דרך שלבים שונים של רבייה מינית בשמרים 11,23. רמות שונות של עופרת פרומון סינתטי מצבי קיטוב התא ברורים בשמרים ביקוע (איור 3 ב, 3 ג ו Ref. 11). הפרוטוקול כלול לעיל מאפשר להעריך כיצד רמות פרומון אקסוגניים המובהקות להשפיע על פיזיולוגית תא. מכיוון פרוטאז פרומון Sxa2 במהירות מדרדרת P-factor, זן מוטנטי heterothallic שבו פרוטאז נמחק שימש כדי להשיג תוצאות לשחזור. עם זאת, תערובות של תאים מסוגי הזדווגות הפוכים, לא רק את הרמות אלא גם את הפריסה המרחבית של פרומונים הנפלט שותף הזדווגות צפוי להיות חשוב. לניתוח השפעות הפצת פרומון מרחבית על תגובת תא ידרוש פיתוח של setups המתוחכם יותר כגון התקני מיקרופלואידיקה המועסקים על ניצני שמרים 24,25.
לסיכום, אנו מציגים שיטה בסיסית מיקרוסקופיה לטווח ארוך של מחזור החיים המיניים של שמרי ביקוע. שינויים קלים לפרוטוקול זה לאפשר research להתמקד תגובות הסלולר ב שלבים שונים של מחזור החיים המיניים. שילוב גישה זו עם כלים ביוכימיה תא בודדים והתקנים מיקרופלואידיקה יהיה לקדם רביית שמרים מינית ביקוע כמערכת מודל עצמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
AV נתמכה על ידי עמיתי הבתר EMBO לטווח ארוך. מחקר במעבדת מרטין ממומן על ידי מענק מוצא ERC (GeometryCellCycle) ומענק קרן הלאומי למדע שוויצרי (31003A_155944) כדי SGM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
