Introduction
Apesar de intercâmbio genético entre duas células é o evento central na reprodução sexual, ele depende de uma cadeia de eventos que promovem a diferenciação celular, permitem a escolha do parceiro, realizar a fusão célula-célula e manter a estabilidade genômica. Assim, o ciclo de vida sexual se apresenta como um sistema modelo para estudar uma série de questões biológicas sobre interruptores de desenvolvimento, resposta a estímulos extrínsecos, a fusão da membrana plasmática, segregação cromossômica, etc. Explorando a levedura ciclo sexual para estudar esses fenômenos traz os benefícios da genética poderosos do sistema modelo, bem estabelecida abordagens de alto rendimento e de microscopia sofisticado. Sexo em levedura é um evento heterotípica entre uma célula e um P-célula M de tipos de cruzamento distintos. Os dois tipos de células expressam diferencialmente uma série de genes de 1,2, incluindo aqueles para a produção do ácido P- segregada e M-feromonas,-receptores de feromonas map3 e Mam2 bem como feromona-Proteases Sxa1 e Sxa2. Homotálico estirpes, tais como a estirpe H90 comumente utilizado, transportar a informação genética para os dois tipos de acasalamento em um único genoma e as células sofrem um padrão complexo de tipo de acasalamento de comutação ao longo do ciclo de vida do mitótico (revisto em Ref. 3). Vários isolados de levedura heterotálicas que raramente ou nunca mudar tipo de acasalamento também são comumente utilizados 4, o mais proeminente o h + N (P-tipo) e as cepas h S (M-tipo).
Em levedura, a entrada no ciclo de vida sexual está sob regulação nutricional rigorosa. Apenas células de levedura de fissão deficientes em nitrogênio prender reprodução mitótico e produzir feromônios difus�eis para sinalizar a presença de um parceiro de acasalamento e promover novas etapas do ciclo sexual (revisto em Ref. 5). privação de azoto de-reprime o regulador transcricional chave de Ste11 de acoplamento que funciona como um interruptor de desenvolvimento e promove expression de acasalamento genes específicos, incluindo o receptor de feromônio e o feromônio genes de produção de 6,7. Engajamento-receptor de feromônio ativa a proteína-acoplado receptor G-alfa e de sinalização MAPK a jusante que aumenta ainda mais Ste11 atividade transcricional 8-10, aumentando assim a produção de feromônio em um feedback positivo entre os parceiros de acasalamento. Níveis de feromonas são cruciais para induzir diferentes estados de polarização celular, regulando o organizador mestre da polaridade celular, a Rho-família GTPase Cdc42 11. Após a exposição a baixas concentrações de feromonas, Cdc42 activo é visualizado em manchas dinâmicos explorando a periferia da célula, e nenhum crescimento de células é observada nesta fase. níveis de feromônio aumento promover a estabilização da actividade Cdc42 a uma única zona e crescimento de uma projeção polarizada, denominado o shmoo, que traz células parceiras em contato. Posteriormente, os dois parceiros de acasalamento haplóide fundir para formar um zigoto diplóide. Um trabalho recente revela the existência de uma estrutura nova actina essencial para a fusão que é montado pela formin induzida por acasalamento FUS1 12. Este enfoque de fusão concentra processos dependentes tipo V-miosina e posiciona a maquinaria degradação da parede celular, permitindo, assim, a remodelação da parede celular para permitir o contacto da membrana plasmática, sem lise celular 12. Após a fusão célula-célula, os núcleos entram em contato e passam por cariogamia. Um movimento de vai-e-vem dependente da dineína proeminente dentro do núcleo do zigoto (o movimento do cavalo-cauda), em seguida, promove o emparelhamento de homólogos do cromossoma 13,14, que é seguido por meiose. Finalmente, os quatro produtos de meiose são embalados em esporos individuais durante a esporulação.
Devido à sua complexidade e os numerosos passos envolvidos, monitoramento detalhado do acasalamento tem sido um desafio. Duas dificuldades notáveis são que todo o processo leva bem mais de 15 horas e que as células são difíceis de sincronizar. estes difficulties são contornadas por abordagens de microscopia de uma única célula. Aqui um protocolo geral para investigar o ciclo de vida sexual na levedura de fissão é apresentado. Com pequenos ajustes, este protocolo permite o estudo de todas as diferentes etapas do processo, ou seja, a indução de produto do gene de acasalamento, a polarização celular e emparelhamento entre irmãos células após tipo de acasalamento de comutação e entre os parceiros não-irmã, a fusão célula-célula, e pós-fusão horse-tail movimento, a meiose e esporulação. Este método permite 1) visualizar facilmente fluorescente etiquetado proteínas ao longo do tempo pré, durante e pós-fusão; 2) discriminar o comportamento das células do tipo de cruzamento oposto; e 3) medir e quantificar parâmetros como shmooing, mating, fusão ou eficiência esporulação.
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Protocol
análise de microscopia de reprodução sexual levedura
1. Preparação de Meios
- Prepare meio de esporulação Mínimo (MSL-N) 15 por mistura dos seguintes componentes: Glucose: 10 g / l, KH 2 PO 4: 1 g / L, NaCl: 0,1 g / L, MgSO4 · 7H 2 O: 0,2 g / EU. Adicionar oligoelementos (10.000x): 100 uL / L, vitaminas (1.000X): 1 mL / L, e 0,1 M de CaCl2 ml / L. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 e armazenar a temperatura ambiente (RT).
- Utilize a seguinte Vitaminas (1.000x) da: Pantotenato: 1 g / L, ácido nicotínico: 10 g / l, inositol: 10 g / L, Biotina: 10 mg / L. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C.
- Use os seguintes elementos-traço (10.000 vezes) inventário: Ácido Bórico: 5 g / L, MnSO4: 4 g / L, ZnSO4 · 7H 2 O: 4 g / L, FeCl 2 · 6H 2 O: 2 g / l , MoO 3: 0,4 g / L, KI: 1 g / L, CuSO4· 5H 2 O: 0,4 g / l, ácido cítrico a 10 g / L. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C.
- Prepare MSL-N de agarose a 2% (utilizado para fazer câmaras bloco de agarose) combinando 10 ml de N-MSL com 0,2 g de agarose. Derreta para ~ 2 min em alta potência em um forno de microondas até dissolver agarose e alíquotas de 0,5 ml em tubos de microcentrífuga. Armazenar à temperatura ambiente.
- Prepare meio de esporulação mínima com azoto (MSL + N) do MSL-N através da adição de (NH 4) 2 SO 4: 1 g / L, leucina: 0,225 g / L, adenina: 0,225 g / L, uracilo: 0,225 g / L . Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 um. Armazenar à temperatura ambiente.
Nota: leucina, adenina e uracilo são adicionados a este meio para permitir o crescimento de estirpes auxotróficas. Suplemento de amino-ácido adicional deve ser incluído se a cepa utilizada carrega uma auxotrofia distinta (por exemplo his3Δ). Observe também que o trabalho com cepas plenamente prototrófica é recomendado, já que apenastais estirpes vai permitir alta eficiência de acoplamento. - Prepare 200 ml valap para vedação de câmara. Numa proveta de adicionar pesos iguais, de lanolina, vaselina (ou outro vaselina), e parafina. mistura de calor a baixa temperatura e mexa ocasionalmente até ficar bem misturado. Alíquota da mistura em vários pequenos pratos de petri. Armazenar à temperatura ambiente.
2. Cepas A cultura de fissão de levedura para Experimentos de acoplamento (Figura 1).
- Dia 1, Evening:
Inocular estirpes recém-listradas de meios sólidos em tubos de cultura contendo 3 ml de MSL + N. Use tubos de fundo plano de diâmetro de cerca de 2,5 cm. Use outros tubos de cultura ou de frascos de cultura com um volume adaptado. Incubar durante a noite (O / N) com agitação a 25 ° C, 200 rpm. Se trabalhar com linhagens heterotálicas, inocular separadamente.- Dilui-se suspensões de células em meios na manhã seguinte para assegurar que as culturas possuem uma densidade óptica medida a 600 nm (DO600) de 0,4-0,8 durante a noite.
Nota:OD 600 medições como um proxy de concentração de células de levedura são lineares no intervalo de cerca de 0,1-1,0. Para o nosso espectrofotómetro OD 600 = 0,1 corresponde a 1,4 x 10 6 culas por ml. Assim, se OD inicial de 600 leituras são fora deste intervalo amostras precisa ser diluído / concentrada para medições confiáveis.
- Dilui-se suspensões de células em meios na manhã seguinte para assegurar que as culturas possuem uma densidade óptica medida a 600 nm (DO600) de 0,4-0,8 durante a noite.
- Dia 2, Evening:
Dilui-se as células em 20 ml de meio MSL + N para DO600 = 0,025 em frascos de 100 ml. Incubar estirpes de O / N a 30 ° C, 200 rpm.
Nota: culturas de células do tipo selvagem deve chegar a OD 600 ~ 0,8 na manhã seguinte (15 horas depois). Se estiver a trabalhar com estirpes com maior tempo de geração ajustar diluição em conformidade. - Dia 3, Manhã:
Medida OD600 para verificar que as culturas têm densidade celular de OD600 ~ 0,8. Se trabalhar com linhagens heterotálicas, misture um número igual de células parceiras. células de pelotas em 1000 xg e transferir para um 1,5 mltubo. Lave as células três vezes em 1 ml de meio MSL-N. Re-suspender as células em 3 ml de meio MSL-N e diluir as células a OD 600 = 1,5.- Para monitorar o acasalamento entre as células irmã células montar diretamente para geração de imagens (ver Protocolo Secção 2.4). Use estirpes H90 homotálico, em que tipo de acasalamento de comutação terá lugar durante as divisões mitóticas que ocorrem após a privação de azoto. montagem imediata de células sobre a almofada de agarose assegura que, após a divisão celular, associado células permanecer ao lado do outro.
- Para monitorar a polarização celular (dinâmica exploratórios e shmooing) incubar 1-3 ml de cultura de células a 30 ° C, 200 rpm durante 3-4 h antes de células de montagem para imagiologia. Dentro destas 3-4 horas, terá ocorrido a última divisão mitótica. Algumas células vão ter iniciado a polarização, mas a maioria só vai estar começando sua dinâmica de polarização exploratórios.
- Para monitorizar a fusão célula-célula incubar 1-3 ml de cultura de células a 30 ° C, 200 rpm durante 4-6 h priou a células de montagem para imagiologia.
- Monitorar eventos de fusão pós-incubar 1-3 ml de culturas celulares a 30 ° C, 200 rpm, durante 8 h antes de células de montagem para imagiologia.
- Para monitorar a resposta a uma concentração de feromonas específicas (apenas para estirpes heterotálicas) incubar 3 ml de cultura de células a 30 ° C, 200 rpm durante 3-4 h antes de células de montagem para imagiologia.
- Retire o tubo de microcentrífuga MSL-N contendo a partir do bloco de calor C 95 ° (ver secção Protocolo 2.4.1. Abaixo). Adicionar P-factor ou factor-M na concentração desejada directamente na agarose MSL-N derretido. Misture bem em vortex antes da preparação pad imediata.
- Após a montagem da célula, a almofada incubar durante 15-30 min a 25 ° C antes da imagiologia. -Factor P e factor-M feromonas foram usadas a partir de uma solução stock de 1 mg / ml em metanol.
Nota: Se o trabalho com estirpes mutantes tempos de incubação podem variar. A aglomeração das células pode ocorrer após incubação prolongada em m líquidaEDIA e pode ser particularmente forte em algumas estirpes mutantes. células aglutinados não podem ser manchadas sobre almofadas de agarose em uma única camada e, assim, são difíceis de focagem automática e imagem. Em caso de extenso aglutinação celular células em almofadas de agarose montagem imediatamente após lavagens e re-suspensão em meios-falta de azoto (como no protocolo Secção 2.3.1.) E incubar a 30 ° C antes da imagiologia.
- Montagem Cells for Imaging:
- Prepare MSL-N almofadas de agarose a 16 por fusão de uma alíquota num bloco de calor a-95 ° C durante 10-15 min e adicionar 200 ul entre duas lâminas de vidro separadas por espaçadores (Figura 1B). Use espaçadores com uma espessura de 0,5 mm ~. Para fazer os espaçadores, de uso tiras cortadas de cartão, como a que está fornecido com enzimas de restrição.
- Pellet 100 ul de células a 1000 x g durante 1 min, remover o sobrenadante e as células em meio de 2-4 ul residual re-suspender. Não re-suspensão em meio fresco em que atrasaacasalamento.
- Após 2-3 min remova cuidadosamente os espaçadores e a lâmina de vidro superior. Se várias cepas são para ser montado, prepare a célula se concentra antes de preparar a almofada de agarose.
- Adicionar 1 ml de células para a almofada e esperar até a queda começa secagem (~ 1 min) antes de cobrir com tampa de deslizamento e selando com valap.
- Deixe que a almofada de se sentar durante pelo menos 30 min antes de imagem a 25 ° C ou TA.
- Para se obter uma mistura de células em vários estágios de acasalamento, fazer uma almofada imediatamente após lavagens em MSL-N (ver secção 2.3.) E incuba-se a 18 ° CO / N (~ 15 h). Essa abordagem é útil para geração de imagens de células em fases distintas de acasalamento com alta resolução temporal ou amostras com sinal fraco.
Imagem 3. Em células vivas de células de levedura de acoplamento
- Ajustar as Definições de aquisição.
Nota: As configurações de aquisição de imagem aqui apresentados foram otimizados para a plataforma DeltaVision composto por uma personalização Olympus IX-71microscópio invertido com o Plano de Apo 60X / 1,42 NA ou U-Plano de Apo 100X / 1,4 objectivos de NA, uma câmera CoolSnap HQ2 e um 7 cores introspecção SSI unidade combinada iluminador. O equipamento é controlado por softWoRx v4.1.2 que também permite a auto-focagem digital.- Assegure-se que os intervalos de focagem automática não excedam 15 min uma vez que o Z-tração sobre um tempo mais longo pode ultrapassar a capacidade do sistema de auto-focagem de software. Se estiver usando um sistema de focagem baseada em hardware, use intervalos maiores.
- Ajuste o intervalo de imagem. Captar imagens a cada 10 minutos para ~ 15 hr como ponto de partida quando se trabalha com uma proteína fluorescente etiquetado pela primeira vez. Este intervalo fornece uma boa visão geral de todo o processo de acasalamento, sem branqueamento extensivo.
- Imagem com intervalos de 5 min ou mais curtas para mais precisamente eventos de tempo, como a fusão. intervalos mais curtos exigem fluoróforos fortes que permitam baixos tempos de exposição e pouco branqueamento. Para geração de imagens com intervalos inferiores a microscopia de 1 min evitar O / Ne em vez disso se preparar uma mistura de todas as fases de acoplamento tal como detalhado na Secção 2.4.6 Protocolo.
- Ajustar a imagem tempo de exposição. tempos de exposição de teste entre 50 e 300 ms. Destinam-se a estabelecer um equilíbrio entre a relação sinal-ruído e fotodegradação de alcançar um grande número de pontos de tempo com um sinal perceptível (normalmente mais de 100).
- Ajustar Z-seccionamento. Secções cada 0,3 pm, cobrindo 5 uM fornecer uma boa profundidade da imagem. Note-se que aumenta ainda mais foto-lesão de corte Z, que podem ser minimizados através da utilização do OAI (integração eixo óptico - aquisição de um único varrimento da profundidade total da amostra). Bom sistema de foco automático reduz a necessidade de muitas Z-seções e é altamente recomendado.
- Dicas para estudar comportamentos específicos-Type Acasalamento:
- Para as estirpes heterotálicas, usar H- e H + células expressando fluoróforos diferentes, de modo que os dois tipos de células podem ser distinguidas. Use qualquer fluoropho geneticamente codificadoestá expresso como uma versão citosólica ou fusão de uma proteína endógena, embora tenhamos tido um bom sucesso com sfGFP, uma variante de dobrar rápida de GFP 17. Proteínas endógenas são geralmente etiquetado no seu local genómico endógeno por recombinação homóloga 14.
- Para as estirpes homotálico, expressar uma proteína citosólica fluorescente geneticamente codificado sob o controlo de promotores específicos do tipo de acasalamento, tais como os dos genes de receptores de feromonas map3 e mam2 para conduzir a expressão em células P e M, respectivamente. Os promotores de map3 e mam2 estão inativas durante o crescimento vegetativo e são induzidas mediante privação de nitrogênio 18,19. Constructos de condução da expressão de GFP citosólico ou mCherry sob o controlo de um destes promotores são tipicamente integrados num locus genómico (ura4, Leu1) que não interfere com a progressão normal do ciclo de vida sexual 12.
4. Quantificação de acasalamento e fusão Eficiências
- Para quantificar a eficiência de fusão e de acoplamento 11,12, células no local directamente após MSL-N de lavagem sobre MSL-N almofadas de agarose, tal como no passo 2.3.1, supra, e deixar durante 24 horas a 25 ° C antes da imagiologia (Figura 1A). Usando este protocolo um tipo selvagem estirpe eficiência de acoplamento homotálico ~ atinge 60% e a eficiência de fusão de 99%. Para testar se qualquer redução nestes valores observados em estirpes mutantes reflectir um fenótipo terminal ou um atraso, repetir a experiência com um tempo de incubação 36 h.
- Calcular a eficiência de acasalamento como
pares de acasalamento incluem zigotos, asco, e pares de células não fundidas identificados a partir desua posição e crescimento para cada um dos outros. - Calcular a eficiência de fusão como
Nota: pares de acasalamento fundidas são identificados pela sua capacidade de formar esporos, se for conhecido que o mutante sob estudo não influencia a esporulação. Se a esporulação não pode ser utilizado como leitura para fora, a fusão é determinada através da observação da propagação de um marcador citosólica expressa em apenas um dos parceiros de acoplamento em ambos os parceiros.
pares de acasalamento incluem zigotos, asco, e pares de células não fundidas identificados a partir desua posição e crescimento para cada um dos outros. 
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Representative Results
Fissão crescimento do fermento e Acasalamento Dynamics após a remoção da fonte de nitrogênio
Como privação de nitrogênio é um pré-requisito para o início da reprodução sexual na levedura de fissão, estirpe de tipo selvagem H90 homotálico foi monitorada mediante mudança de para médio privado de azoto rico em nitrogênio (Figura 2), seguindo o protocolo apresentado na Figura 1. Resumidamente, as células foram cultivadas O / N a fase exponencial (DO600 = 0,5) em meio MSL + N, recolhido, lavado e re-suspenso em N-MSL meio líquido a DO final 600 = 1,5. A cada alíquotas de 2 horas de células foram calcofluor-coradas e fotografada (Figura 2A - D).
Calcofluor coloração (Figura 2A), revelou que em meio rico em azoto, ~ 21% das células foram septating (n> 300, figura 2B) e que o comprimento médio de célula na division foi de 15,2 ± 1,4 uM (n = 50, Figura 2C). As células que não se dividem mostrou uma ampla distribuição de comprimentos de células (8-14 uM; n> 200, Figura 2D). Contudo, duas horas após a mudança para o médio MSL-N houve uma alteração drástica na distribuição de comprimento de células que não se dividem, com mais de 60% de células que são mais curtos do que 9 uM (n> 200, Figura 2D). A formação de septos celular também foi detectado no comprimento reduzido de 9,8 ± 0,8 um (n = 50, Figura 2A, 2C). Também foi observada uma redução adicional de comprimento de ambos não se dividem e células em divisão, como tempo em MSL-N aumentou. Com efeito, depois de 8 h a formação de septos índice da cultura diminuiu abaixo de 2% (n> 300) e mais de 85% das células preso o seu ciclo celular em comprimentos mais curtos de 7 uM (n> 200, Figura 2D).
As células começaram a formar pares de acasalamento quatro horas após a mudança para o líquido MSL-Nmédio (<1%, Figura 2A). Subsequentemente, o número de pares de acoplamento aumenta rapidamente e 8 h após a mudança de 10% de células envolvido um parceiro de acoplamento (n> 200, figura 2B).
Para controlar a dinâmica de acasalamento, 6 horas após a indução da fome, uma alíquota de células foi também montado sobre MSL-N almofada de agarose para imagiologia. As células foram submetidos a shmooing, fusão e esporulação (Figura 2E, 2F) na posterior 21 horas sem qualquer sincronia aparente (Filme S1). A eficiência de acasalamento depende da posição relativa e densidade das células em um determinado campo de visão, com mais de 60% de células envolvido um parceiro quando posicionado densamente em uma monocamada (Figura 2G e Filme S1).
As estirpes de tipo selvagem heterotálicas h levedura de fissão H- + e foram também submetidos ao mesmo protocolo, com umN passo adicional de mistura h células h- + e numa proporção de um-para-um, no momento da remoção do azoto. Similares de fome e de acasalamento dinâmicas foram observados, mas a eficiência de acasalamento foi ligeiramente inferior (Figura 2G, Filme S2).
Monitoramento Dynamics of fluorescente etiquetado proteínas em células de levedura Acasalamento de fissão
H- células para monitorizar a dinâmica do tipo V-miosina Myo52 (Ref 20) em células de acoplamento, de forma exponencial cultivadas que expressam Myo52-3GFP a partir do locus nativo foram misturadas com células de h + que expressam de forma semelhante Myo52-tdTomato, bem como GFP citosólica do P -cell promotor map3 específico. A suspensão de células foi lavada, diluída em meio de MSL-N e incubou-se durante 6 h a 30 ºC, 200 rpm antes da montagem em células MSL-N almofadas de agarose para imagiologia S / N a intervalos de 10 min.
Como relatado anteriormente 11,12 Myo52 zonas dinâmicas inicialmente formadas em todo o córtex celular (Figura 3A, pontas de seta e Filme S3). Myo52 sinal foi depois estabilizado (Figura 3A, setas e Filme S3) num único foco apenas antes do evento de fusão, que foi visualizado pela transferência do sinal de GFP citosólica a partir de H + para dentro da célula de H- (Figura 3A e Filme S3) . O sinal Myo52-tdTomato também pode ser observada no pescoço de fusão durante a sua expansão, mas nenhum sinal perceptível era evidente à medida que o zigoto passou a esporulação (Figura 3A e Filme S3).
Monitorar o comportamento de células de levedura de fissão heterotálicas Expostos a feromonas externas
Células h- heterotálicas sem o protease Sxa2 que degrada P-factor para a dessensibilização prontamente responder às fator P sintético. um h- sxa2Δ estirpe, expressando SCD2-GFP como um marcador para a Cdc42 activo 11, foi cultivado em meio MSL N +, em conformidade com o protocolo descrito. As células foram lavadas em meio MSL-N e incubou-se durante 4 h a 30 ºC. MSL-N almofadas de agarose contendo metanol (dados não mostrados), 0,1 ug / ml (baixa feromona, Figura 3B) ou 1 ug / ml (alta feromona, Figura 3C) de factor-P foram preparadas, cortada e colocada numa nova corrediça para gerar mini-pastilhas contendo diferentes quantidades de feromonas. 0,5 ul de suspensão de células foi montado em cada mini-pastilhas para imagiologia S / N a intervalos de 5 min.
Em concordância com os resultados publicados 11, baixos níveis de fator de P promoveu a formação de zonas SCD2 dinâmicos sem crescimento (Figura 3B, filme S4), enquanto altos níveis de fator-P estabilizado uma única zona SCD2, induzindo assim shmoo alongamento da pole uma célula (Figura 3C, Filme S5).
Figura 1:.. Representação esquemática do Protocolo (A) Representação esquemática dos protocolos usados para monitorar o ciclo de vida sexual levedura e (B) para preparar as amostras de levedura de fissão para geração de imagens de longo prazo Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .
Figura 2:. Crescimento e acasalamento dinâmica das células de levedura de fissão passou de MSL + N para MSL-N mídia micrografias (A) epifluorescência de células manchadas de calcofluor deslocado para a mídia MSL-N para os períodos de tempo indicados. (B) Percentagemcélulas de septating (linha azul-escura, n> 300 por ponto de tempo) e acasalamento (linha azul-claro, n> 300 por ponto de tempo) deslocou-se para a mídia MSL-N para os períodos de tempo indicados. (C) Tempo médio de células septating deslocado para a mídia MSL-N para os períodos de tempo indicados (n = 50 por ponto de tempo, exceto 8 horas timepoint onde n = 20). (D) distribuição do comprimento das células que não se dividem deslocado para o meio MSL-N para os períodos de tempo indicados (n> 200 por ponto de tempo). (E) Fração média de não fundido (linha azul-escuro), fundido (linha azul-claro) e esporulação (linha preta) células em uma população de H90 levedura do tipo selvagem deslocou-se para a mídia MSL-N para os períodos de tempo indicados e montado sobre uma almofada de ágar a ponto das 6 horas (n> 900 células por ponto de tempo a partir de três diferentes timelapses). As células foram consideradas quando fundido sem parede celular de refracção entre os parceiros foi visível nas micrografias DIC e formação de paredes de células de esporos foi usada para marcar para SPorulating células. Micrografias (F) DIC de células de acasalamento deslocado para a mídia MSL-N para os períodos de tempo indicados. (G) a eficiência de acoplamento em função da densidade de células em almofadas de agarose para H90 (pontos azul-escuro) e H + células / h- (light-azuis pontos) deslocou-se para a mídia MSL-N, durante 24 horas. A densidade mais adequado de células para geração de imagens de longo prazo é alcançado a cerca de 25.000 células / mm 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Dinâmico localização de proteínas fluorescentes durante o acasalamento de levedura de fissão (A) deconvolved micrografias plano z epifluorescência individuais de células com os genótipos indicados deslocado de MSL + N para meios MSL-N, durante 6 h e montado sobreMSL-N bloco de agarose durante o tempo indicado. As setas indicam zonas Myo52-3GFP dinâmicos e a seta aponta Myo52 localização no foco de fusão. (B), (C) deconvolved único plano z micrografias de epifluorescência de células com genótipos indicados deslocado de MSL + N para meios MSL-N, durante 4 h e montado sobre MSL-N mini-pastilhas de agarose contendo 0,1 ug / ml (B) ou 1 ug / ml (c), factor-P durante o tempo indicado. As setas indicam dinâmico (B) ou zonas (C) SCD2-GFP estáveis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme Suplementar 1: timelapse DIC de tipo selvagem ce levedura H90 fissão lls que foram durante 6 horas antes da imagem sedentos de azoto. (Clique direito a download).
Suplementar Movie 2: . Timelapse DIC de tipo selvagem células de levedura de fissão h- h + e que foram misturados e durante 6 horas antes da imagem sedentos de nitrogênio (clique com o botão direito para baixar).
"> Filme Suplementar 3: deconvolved epifluorescência único plano z e DIC Timelapse de células que expressam h- Myo52-3GFP a partir do locus nativo misturado com H + células expressando Myo52-tdTomato a partir do locus nativo da GFP e citosólica a partir do promotor específico de células map3 P . as células foram cultivadas em meio MSL-N durante 6 horas a 30 ºC antes da imagem. Transferência de GFP citosólico na célula h- define o tempo de fusão. (clique direito a download).
Filme Suplementar 4: deconvolved epifluorescência único plano z e DIC timelapse de células sxa2 h- expressing SCD2-GFP a partir do seu promotor nativo tratado com fator P / ml 0,1 g. As células foram cultivadas em meio MSL-N durante 4 horas a 30 ºC antes de imagem. (Clique direito a download).
Suplementar Filme 5: . Deconvolved epifluorescência único plano z e DIC Timelapse de células que expressam sxa2 h- SCD2-GFP a partir do seu promotor nativo tratado com-fatores P / ml de 1 ug As células foram cultivadas em meio MSL-N, durante 4 h a 30 ºC antes de imagem. (clique direito a download).
| YSM995 | h- wt |
| YSM1371 | H + em peso |
| YSM 1396 | wt H90 |
| YSM2534 | h- myo52-3GFP :: kanMX |
| YSM2730 | h + myo52-tdTomato :: natMX Pmap3: GFP :: ura4 + @ ura4locus |
| YSM2731 | H- SCD2-GFP :: :: natMX sxa2Δ kanMX |
Tabela S1: estirpes utilizadas neste estudo.
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Discussion
condições ambientais e disponibilidade de nutrientes em particular, afetam fortemente a fisiologia da levedura de fissão. Privação de nitrogênio é necessário para compromisso com a reprodução sexual e, inicialmente, leva a mudanças marcantes na progressão do ciclo celular mitótico (Ref. 21 e Figura 2). Após a remoção do azoto população em crescimento exponencial, o tamanho das células em divisão diminui rapidamente (Figura 2C) e a maioria das células deter a progressão mitótica mais curto do que o comprimento de recém-nascidos células cultivadas exponencialmente (Ref. 21 e Figura 2D). Como as células de tipos de acoplamento opostos deter a progressão mitótico eles se envolvem acasalamento parceiros e prosseguir para formar zigotos e esporulam (Figura 2B, 2E, 2F). No caso de uma monocamada bidimensional de células de tipo selvagem, ao longo de sessenta por cento de células H90 vai envolver um parceiro, e quase todos serão submetidos a fusão celular (Figura 2G (Figura 2G). Um dos aspectos mais críticos do protocolo para obter eficiências elevadas de acasalamento é assegurar que as células são mantidos dentro das densidades indicadas por toda parte. Monitorização dos parâmetros de tamanho de célula e a eficiência de acoplamento conforme mostrado na Figura 2, em seguida, fornece um controlo simples que as células estão a entrar a reprodução sexual eficientemente.
Fazemos notar que, uma vez que falta qualquer forma de acasalamento fonte de azoto (mesmo pequenas quantidades de amino-ácidos e bases azotadas são excluídos), altas eficiências de acoplamento, tais como os apresentados na Figura 2E e 2G são apenas obtidos com estirpes prototróf totalmente. estirpes auxotróf iças pode ser usado, mas requerem um cuidado adicional para garantir que as células são mantidas em todos os momentos dentro densidades celulares indicadas no protocolo. Mesmo com cuidados, sóserá observado mais baixas eficiências de acoplamento. a eficiência de acoplamento é também influenciada pela temperatura, com as eficiências observadas inferiores a uma temperatura elevada, o que pode limitar o uso de alelos mutantes sensíveis à temperatura durante o processo de acasalamento.
O método aqui apresentado é utilizado principalmente para geração de imagens de longo prazo de repórteres fluorescentes. Uma vez que formação de imagens é realizada durante o período de tempo longo, uma imagem com qualidade de acasalamento de levedura de fissão é altamente dependente da configuração microscopia disponível. Por isso, a estabilidade do microscópio set-up, a sua sensibilidade e o acesso a um sistema de autofocagem são críticos. De qualquer software ou baseado no sistema de focagem automática de hardware built-in são possíveis. Além disso, para aumentar o rendimento, permitindo que uma platina motorizada aquisição multiponto é uma outra qualidade importante.
A qualidade de imagem é limitada pelas propriedades do fluoróforo de interesse. Os tempos de incubação distintas em meio líquido MSL-N detalhado na Protocol Secção 2.3 são destinadas a otimizar a fluorescência em proteínas marcadas induzido por feromonas e minimizando o branqueamento desnecessária por imagem única que acoplam-se as fases de interesse. Enquanto proteínas abundantes ou altamente focalizadas fluorescente etiquetado permitem aquisição de centenas de pontos de tempo ao longo de todo o ciclo de vida sexual (Filme S3), outras proteínas são um desafio para a imagem sobre esses longos períodos devido a foto-branqueamento. A qualidade da imagem, também depende do fluororo escolhido, tipicamente um derivado de GFP. Observamos repetidamente que sfGFP 17 (superfolder GFP), que se dobra com uma cinética rápida, desde sinal superior durante o processo de acasalamento, possivelmente porque forte autofagia induz turnover de proteína rápida. É importante ressaltar que nós não monitorar a disponibilidade de oxigênio necessário para a maturação da proteína fluorescente 17,22. Assim, recomenda-se ter cuidado na utilização de medições de fluorescência para quantificar os níveis de proteínas expressas após as células são Mounted em lâminas, ou a utilização de dispositivos microfluídicos permeáveis oxigênio alternativas para realizar tais experimentos. Além disso, as almofadas de agarose manchado com as células durante a noite e mantidas a 18 ° C O / N tem sido muito útil para a imagem repórteres fracos tais como pastilhas contêm uma mistura de células em todas as fases de reprodução sexual.
Acoplamento de levedura que não apresenta a sincronia e as células pode ser facilmente visto shmooing iniciar a par de outras células já esporulantes (Filmes S1, S2). Tais dinâmica populacional torna, técnicas bioquímicas granel clássicos difícil de usar, tornando a microscopia de células individuais descrito aqui um método de escolha. Todas as abordagens baseadas em microscopia podem, em princípio, ser aplicada a células preparadas com o protocolo aqui descrito. É importante ressaltar que estas abordagens podem monitorar processos que apresentam acasalamento dinâmicas específicas do tipo, como a fusão célula-célula descrito por Dudin e colegas 12. Para monitorar assimetria, repórteres tipo de acasalamentotêm sido particularmente úteis (Figura 3A). A diferenciação entre os dois tipos de acasalamento é facilmente alcançada quando se trabalha com estirpes heterotálicas empregando fluoróforos diferentes para marcar proteínas no H- e H + células. No entanto, isso não é viável para as estirpes homotálico. Uma abordagem desenvolvida para diferenciar o tipo de acoplamento de células H90 é expressar proteínas citosólicas fluorescentes sob o controlo de promotores específicos do tipo de acasalamento. Em especial, os promotores dos genes de receptores de feromonas map3 e mam2 foram usadas para dirigir a expressão de proteínas GFP ou mCherry em P e células M, respectivamente. Além disso, estes marcadores permitiram temporização precisa da fusão célula-célula, visualizado como a transferência do sinal de fluorescência a partir de uma célula parceiro para o outro.
Feromonas de acasalamento são determinantes cruciais para avançar por fases distintas de reprodução sexuada em leveduras 11,23. Diferentes níveis de feromônio chumbo sintético para estados de polarização de células distintas em levedura (Figura 3B, 3C e Ref. 11). O protocolo incluiu acima permite avaliar como os níveis de feromônio exógenos distintos afetam fisiologia celular. Uma vez que a protease de feromonas Sxa2 degrada rapidamente P-fator, uma estirpe mutante heterotálicas onde a protease foi eliminado foi usada para obter resultados reprodutíveis. No entanto, em misturas de células de tipos de cruzamento oposto, não só os níveis, mas também a distribuição espacial das feromonas emitidos por um parceiro de acoplamento são susceptíveis de ser importante. Analisando os efeitos da distribuição espacial feromônio na resposta das células exigirá o desenvolvimento de configurações mais sofisticadas, tais como dispositivos microfluídicos empregados em brotamento levedura 24,25.
Em resumo, é apresentado um método básico para a microscopia de longa duração do ciclo de vida sexual de levedura de fissão. pequenos ajustes para este protocolo permitirá pesquich concentrar em respostas celulares em fases distintas do ciclo de vida sexual. Combinando esta abordagem com ferramentas bioquímica das células individuais e dispositivos microfluídicos vai promover ainda mais levedura reprodução sexual como um sistema modelo poderoso.
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Acknowledgments
AV foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado de longo prazo EMBO. Pesquisa no laboratório de Martin é financiado por uma bolsa ERC Starting (GeometryCellCycle) e uma subvenção Science Foundation Nacional Suíço (31003A_155944) para SGM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
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