Introduction
على الرغم من صرف الجيني بين خليتين هو الحدث المركزي في التكاثر الجنسي، فإنه يعتمد على سلسلة من الفعاليات التي تعزز تمايز الخلايا، والسماح للاختيار الشريك، والقيام الانصهار خلية خلية والحفاظ على الاستقرار الجيني. وهكذا تقدم دورة الحياة الجنسية نفسها كنظام نموذج لدراسة عدد من المسائل الحيوية المتعلقة مفاتيح التنموية، والاستجابة للمؤثرات خارجي، والانصهار غشاء البلازما والعزل الصبغي، الخ استكشاف الانشطار الخميرة دورة الجنسية لدراسة هذه الظواهر يجلب فوائد لل علم الوراثة قوية نظام النموذج، راسخة النهج الإنتاجية العالية والفحص المجهري متطورة. الجنس في الخميرة الانشطار هو حدث مغاير بين P-خلية وM-خلية من أنواع التزاوج متميزة. أنواع الخلايا اثنين من التعبير عن تفاضلي عدد من الجينات 1،2 بما في ذلك لإنتاج P- يفرز وM-الفيرومونات، فرمون مستقبلات Map3 وMam2 وكذلك فرمون-بروتيإس إي إس Sxa1 وSxa2. سلالات Homothallic، مثل سلالة H90 شيوعا، وتحمل المعلومات الوراثية لكلا النوعين التزاوج في الجينوم واحد والخلايا الخضوع لنمط معقد من نوع التزاوج التبديل طوال دورة حياة الإنقسامية (إعادة النظر في المرجع 3). كما تستخدم عزلة متعددة من الخميرة الانشطار heterothallic التي نادرا أو أبدا تبديل نوع التزاوج عادة 4، أبرزها ح + N (P-نوع) وح -S (M-نوع) السلالات.
في الخميرة الانشطار، دخول دورة حياة جنسية قيد التنظيم الغذائي الصارم. فقط خلايا الخميرة الانشطار المتعطشة النيتروجين تعتقل الاستنساخ الإنقسامية وتنتج الفيرومونات إنتشاري للإشارة إلى وجود شريك التزاوج وتشجيع المزيد من الخطوات للدورة الجنسية (إعادة النظر في المرجع 5). الحرمان من النيتروجين دي يقمع المنظم النسخي رئيسيا من Ste11 التزاوج الذي يعمل بمثابة مفتاح التنمية ويعزز هxpression من التزاوج جينات معينة بما في ذلك مستقبلات فرمون وفرمون جينات إنتاج 6،7. مشاركة فرمون مستقبلات ينشط يقترن مستقبلات البروتين G-ألفا والمصب إشارات MAPK الذي يعزز ذلك من Ste11 النشاط النسخي 8-10، وبالتالي زيادة إنتاج فرمون في ردود الفعل الإيجابية بين شركاء التزاوج. مستويات فرمون حاسمة للحث على مختلف الدول خلية الاستقطاب من خلال تنظيم منظم سيد قطبية الخلية، رو-عائلة GTPase Cdc42 11. عند التعرض لتركيزات منخفضة فرمون، هو تصور نشط Cdc42 في بقع حيوية استكشاف محيط الخلية، ويلاحظ أي نمو الخلايا في هذه المرحلة. زيادة مستويات فرمون تعزيز استقرار النشاط Cdc42 إلى منطقة واحدة ونمو إسقاط الاستقطاب، ووصف shmoo، الذي يجمع خلايا شريك في الاتصال. وفي وقت لاحق، وهما شركاء التزاوج فرداني تلتحم لتشكل البيضة الملقحة مضاعفا. العمل الأخير يكشف عشرالبريد جود هيكل الأكتين رواية ضروري لالانصهار التي يتم تجميعها من قبل formin الناجم عن التزاوج Fus1 12. هذا التركيز الانصهار يركز العمليات تعتمد نوع-V الميوسين ومواقف آلية تدهور جدار الخلية، مما يتيح إعادة تشكيل جدار الخلية للسماح البلازما غشاء الاتصال دون خلية تحلل 12. على الانصهار خلية خلية، ونوى تأتي في اتصال وتخضع تزاوج نووي. والتي تعتمد على داينين بارزة حركة ذهابا وإيابا للنواة داخل البيضة الملقحة (حركة ذيل حصان) ثم يشجع على المزاوجة بين homologs كروموسوم 13،14، والتي تبعتها الانقسام الاختزالي. وأخيرا، يتم تعبئتها المنتجات أربعة من الانقسام الاختزالي إلى جراثيم الفردية خلال تبوغ.
بسبب تعقيدها والخطوات العديدة المشاركة، ورصد تفصيلي من التزاوج تم تحديا. اثنين من الصعوبات البارزة هي أن العملية برمتها تستغرق ما يزيد على خمس عشرة ساعة وأن الخلايا هي صعبة لمزامنة. هذه دالالتفاف ifficulties بنهج المجهر وحيدة الخلية. هنا بروتوكول العام للتحقيق وتقديم دورة حياة الجنسية في الخميرة الانشطار. مع تعديلات طفيفة، يسمح هذا البروتوكول دراسة جميع الخطوات المختلفة لهذه العملية، وهي تحريض منتج الجين التزاوج، الاستقطاب الخلية والاقتران بين خلايا شقيقته بعد نوع التزاوج التحويل وبين شركاء غير شقيقة، والانصهار خلية خلية، وبعد الانصهار الحصان ذيل الحركة، الانقسام الاختزالي والتجرثم. يسمح هذا الأسلوب ل1) بسهولة الموسومة تصور fluorescently البروتينات مع مرور الوقت ما قبل وأثناء وبعد الانصهار. 2) تميز سلوك خلايا المعاكس نوع التزاوج. و3) قياس وتحديد المعايير مثل shmooing، التزاوج، والانصهار أو كفاءة تبوغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
التحليل المجهري التكاثر الجنسي الانشطار الخميرة
1. إعداد وسائل الإعلام
- إعداد الدنيا تبوغ المتوسطة (MSL-N) 15 عن طريق خلط المكونات التالية: الجلوكوز: 10 جم / لتر، KH 2 PO 4: 1 جم / لتر، كلوريد الصوديوم: 0.1 جرام / لتر، MgSO 4 · 7H 2 O: 0.2 غرام / L. إضافة عناصر تتبع (10،000x): 100 ميكرولتر / L، فيتامينات (1،000x): 1 مل / لتر، و 0.1 M CaCl 2 مل / لتر. فلتر تعقيم باستخدام حجم مرشح 0.22 ميكرون المسام وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT).
- استخدام الفيتامينات التالية (1،000x) الأسهم: بانتوثينات: 1 جم / لتر، حمض النيكوتينيك: 10 جم / لتر، إينوسيتول: 10 جم / لتر، البيوتين: 10 ملغم / لتر. فلتر تعقيم باستخدام حجم مرشح 0.22 ميكرون المسام وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- استخدام عناصر تتبع التالية (10،000x) الأسهم: حمض البوريك: 5 جم / لتر، MnSO 4: 4 جم / لتر، ZnSO 4 · 7H 2 O: 4 جم / لتر، FeCl 2 · 6H 2 O: 2 ز / L ، زارة النفط 3: 0.4 جرام / لتر، KI: 1 جم / لتر، كبريتات النحاس 4· 5H 2 O: 0.4 جرام / لتر، حمض الستريك: 10 جم / لتر. فلتر تعقيم باستخدام حجم مرشح 0.22 ميكرون المسام وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد MSL-N الاغاروز 2٪ (التي تستخدم لجعل الدوائر وحة agarose) عن طريق الجمع بين 10 مل من MSL-N مع 0.2 غرام من الاغاروز. تذوب ب ~ 2 دقيقة في الطاقة العالية في فرن الميكروويف حتى يذوب الاغاروز وقسامة 0.5 مل في أنابيب microcentrifuge. تخزين في RT.
- إعداد المتوسطة الدنيا تبوغ مع النيتروجين (MSL + N) من MSL-N بإضافة (NH 4) 2 SO 4: 1 جم / لتر، لوسين: 0.225 غرام / لتر، أدينين: 0.225 غرام / لتر، يوراسيل: 0.225 غرام / لتر . فلتر تعقيم باستخدام 0.22 ميكرون مرشح حجم المسام. تخزين في RT.
ملاحظة: يتم إضافة يسين، الأدينين واليوراسيل إلى هذه الوسيلة للسماح للنمو سلالات بعامل نمائي. وينبغي أن تدرج الملحق الأحماض الأمينية إضافية إذا السلالة المستخدمة يحمل auxotrophy متميز (على سبيل المثال his3Δ). يرجى أيضا ملاحظة أن العمل مع سلالات أنموذجي التغذي بشكل كامل ويوصى، وفقطوهذه السلالات تسمح كفاءة عالية التزاوج. - إعداد 200 مل VALAP لختم الغرفة. في كوب إضافة أوزان متساوية من اللانولين، الفازلين (أو غيرها من الفازلين)، والبارافين. خليط الحرارة عند درجة حرارة منخفضة ويقلب من حين لآخر حتى المخلوطة بدقة. قسامة المزيج في عدة أطباق بتري الصغيرة. تخزين في RT.
2. زراعة الانشطار سلالات الخميرة للتجارب التزاوج (الشكل 1).
- يوم 1، مساء:
تطعيم سلالات يشوبه حديثا من وسائل الاعلام الصلبة في أنابيب الثقافة التي تحتوي على 3 مل من MSL + N. استخدام أنابيب أسفل شقة من حوالي 2.5 سم القطر. استخدام أنابيب ثقافة أخرى أو قوارير مع حجم ثقافة تكييفها. احتضان بين عشية وضحاها (O / N) مع اهتزاز عند 25 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة. إذا كان يعمل مع سلالات heterothallic، تطعيم على حدة.- تمييع تعليق خلية في وسائل الإعلام صباح اليوم التالي للتأكد من أن الثقافات والكثافة الضوئية قياس في 600 نانومتر (OD 600) من 0.4-0.8 في المساء.
ملاحظة:OD 600 القياسات كوكيل للتركيز خلية الخميرة الانشطار هي الخطية في مجموعة من حوالي 0،1-1،0. لدينا OD معمل 600 = 0.1 يتوافق مع 1.4 × 10 6 خلايا لكل مل. وبالتالي، إذا يقرأ OD الأولي 600 هي خارج هذا النطاق تحتاج إلى أن تضعف / تركزت على قياسات موثوقة العينات.
- تمييع تعليق خلية في وسائل الإعلام صباح اليوم التالي للتأكد من أن الثقافات والكثافة الضوئية قياس في 600 نانومتر (OD 600) من 0.4-0.8 في المساء.
- يوم 2، مساء:
تمييع الخلايا في 20 مل من وسائل الاعلام MSL + N لOD 600 = 0.025 في 100 مل القوارير. احتضان سلالات O / N عند 30 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: يجب مزارع الخلايا من النوع البري تصل إلى OD 600 ~ 0.8 في صباح اليوم التالي (بعد 15 ساعة). إذا كان يعمل مع سلالات مع وقتا أطول الجيل ضبط تخفيف وفقا لذلك. - يوم 3، صباح:
قياس OD 600 للتحقق من الثقافات لديها كثافة الخلايا من OD 600 ~ 0.8. إذا كان يعمل مع سلالات heterothallic، مزيج أعداد متساوية من خلايا شريك. بيليه الخلايا في 1000 x ج ونقل إلى 1.5 ملأنبوب. غسل الخلايا ثلاث مرات في 1 مل من MSL-N المتوسطة. اعادة تعليق الخلايا في 3 مل من MSL-N المتوسطة وتمييع الخلايا لOD 600 = 1.5.- لمراقبة التزاوج بين الخلايا شقيقة تحميل مباشرة خلايا للتصوير (انظر القسم بروتوكول 2.4). استخدام سلالات H90 homothallic، في أي نوع التزاوج التبديل ستجري خلال الانقسامات الإنقسامية التي تحدث بعد الحرمان النيتروجين. تركيب فوري للخلايا على لوحة الأغاروس يضمن أنه بعد انقسام الخلايا، لا تزال خلايا الشقيقة بجانب بعضها البعض.
- لمراقبة الاستقطاب الخلية (ديناميات الاستكشافية وshmooing) احتضان 1-3 مل من زراعة الخلايا عند 30 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 3-4 ساعة قبل خلايا المتزايدة للتصوير. في هذه ساعة 3-4، وتقسيم الإنقسامية الماضي حدثت. سيكون قد بدأ عدد قليل من خلايا الاستقطاب، ولكن معظم سوف يكون مجرد تبدأ ديناميات الاستقطاب الاستكشافية الخاصة بهم.
- لمراقبة الانصهار خلية خلية احتضان 1-3 مل من زراعة الخلايا عند 30 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 4-6 ساعة الحزب الثوري المؤسسيأو لتركيب خلايا للتصوير.
- لمراقبة أحداث ما بعد الانصهار احتضان 1-3 مل من مزارع الخلايا عند 30 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 8 ساعة قبل تركيب خلايا للتصوير.
- لمراقبة استجابة لتركيز فرمون معين (فقط للسلالات heterothallic) احتضان 3 مل من زراعة الخلايا عند 30 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 3-4 ساعة قبل تركيب خلايا للتصوير.
- إزالة أنبوب microcentrifuge MSL-N-يحتوي من كتلة C الحرارة 95 درجة (انظر القسم بروتوكول 2.4.1. أدناه). إضافة P-عامل أو M-عامل في التركيز المطلوب مباشرة في الاغاروز MSL-N ذاب. مزيج جيد من قبل vortexing قبل إعداد لوحة فوري.
- بعد تصاعد الخلية، واحتضان لوحة ل15-30 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية قبل التصوير. استخدمت ف عامل و M-عامل الفيرومونات من حل سهم 1 ملغ / مل في الميثانول.
ملاحظة: إذا كان يعمل مع متحولة سلالات قد تتباين فترات الحضانة. قد يحدث تراكمها من الخلايا بعد الحضانة لفترات طويلة في م السائلالقانونين ويمكن أن تكون قوية بشكل خاص في بعض سلالات متحولة. الخلايا تجمعت لا يمكن رصدها على منصات الأغاروس في طبقة واحدة، وبالتالي من الصعب ضبط تلقائي للصورة وصورة. في حالة تكتل خلية واسعة جبل الخلايا على منصات الأغاروس مباشرة بعد غسيل وإعادة تعليق في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى النيتروجين (كما في القسم بروتوكول 2.3.1.)، واحتضان لهم عند 30 درجة مئوية قبل التصوير.
- تركيب خلايا التصوير:
- إعداد MSL-N منصات الأغاروس 16 ذوبان قسامة في 95 ° C الحرارة كتلة لمدة 10-15 دقيقة، وإضافة 200 ميكرولتر بين اثنين من الشرائح الزجاجية مفصولة الفواصل (الشكل 1B). استخدام الفواصل مع سمك ~ 0.5 مم. لجعل الفواصل، قطع شرائط استخدام للخروج من الورق المقوى، مثل التي سلمت مع الانزيمات قيود.
- بيليه 100 ميكرولتر من الخلايا في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في المتبقي المتوسطة 2-4 ميكرولتر. لا اعادة تعليق في المتوسط الطازجة لأنها تؤخرالتزاوج.
- بعد 2-3 دقائق إزالة بعناية الفواصل وأعلى شريحة زجاجية. إذا عدة سلالات هي لتركيبها، وإعداد الخلية تركز قبل إعداد لوحة الاغاروز.
- إضافة 1 ميكرولتر من الخلايا لوحة والانتظار حتى يبدأ انخفاض التجفيف (~ 1 دقيقة) قبل تغطي مع انزلاق الغطاء وختم مع VALAP.
- السماح لوحة الجلوس لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التصوير عند 25 درجة مئوية أو RT.
- للحصول على مزيج من الخلايا في مراحل مختلفة من التزاوج، وجعل وسادة على الفور بعد يغسل في MSL-N (انظر القسم 2.3.)، واحتضان عند 18 درجة CO / N (~ 15 ساعة). هذا النهج هو مفيد لتصوير الخلايا في مراحل التزاوج متميزة لقرار زمنية عالية أو العينات مع إشارة ضعيفة.
التصوير 3. تعيش خلية من خلايا الخميرة التزاوج
- ضبط إعدادات الحصول على الصور.
تم ضبط إعدادات الحصول على الصور المعروضة هنا لمنصة DeltaVision تتألف من تخصيص أوليمبوس IX-71: ملاحظةالمجهر المقلوب مع خطة آبو 60X / 1.42 NA أو U-خطة آبو 100X / 1.4 أهداف NA، كاميرا CoolSNAP HQ2 والبصيرة مباحث أمن الدولة 7 لون وحدة مجتمعة إضاءة. يتم التحكم في الأجهزة عن طريق softWoRx v4.1.2 تمكن أيضا autofocusing الرقمي.- تأكد من أن فترات autofocusing لا تتجاوز 15 دقيقة منذ Z-الانجراف مع مرور الوقت الطويل يمكن ان تتجاوز قدرة نظام البرمجيات autofocusing. في حالة استخدام نظام autofocusing الأجهزة القائمة على استخدام فترات أكبر.
- ضبط الفاصل الزمني التصوير. التقاط صور كل 10 دقيقة لمدة 15 ساعة ~ كنقطة انطلاق عند العمل مع الموسومة fluorescently البروتين لأول مرة. يوفر هذا الفاصل الزمني لمحة جيدة عن عملية التزاوج بأكملها دون تبيض واسعة النطاق.
- صورة مع 5 فترات دقيقة أو أقصر لأحداث الساعة أكثر تحديدا مثل الانصهار. تتطلب فترات أقصر fluorophores قوية تمكن مرات التعرض المنخفضة وتبيض قليلا. للتصوير مع فترات أقل من 1 دقيقة تجنب O / N المجهروبدلا من ذلك إعداد خليط من جميع مراحل التزاوج على النحو المفصل في القسم بروتوكول 2.4.6.
- ضبط الصورة التعرض الوقت. مرات التعرض الاختبار ما بين 50 و 300 مللي ثانية. تهدف إلى تحقيق التوازن بين نسبة الإشارة إلى الضوضاء وphotobleaching من أجل تحقيق عدد كبير من وقت نقاط مع إشارة ملحوظ (عادة أكثر من 100).
- ضبط Z-باجتزاء. أقسام توفر كل 0.3 ميكرون تغطي 5 ميكرون عمق التصوير جيد. لاحظ أن-باجتزاء Z مزيد من الزيادات الصور الضرر، والتي يمكن التقليل من استخدام OAI (بصري محور التكامل - حملة اقتناء واحد من مجموع عمق العينة). حسن نظام التركيز التلقائي يقلل من الحاجة إلى العديد من Z-أقسام ويوصى بشدة.
- نصائح لدراسة سلوك التزاوج نوع محددة:
- لسلالات heterothallic، استخدم ح- والخلايا ح + يعبرون عن fluorophores متميزة، بحيث يمكن تمييز أنواع الخلايا اثنين. استخدام أي fluoropho المشفرة وراثياإعادة أعرب كإصدار عصاري خلوي أو الانصهار إلى البروتين الذاتية، على الرغم من أننا قد حققت نجاحا جيدا مع sfGFP، وهو البديل للطي سريع من GFP 17. وعادة ما تكون الموسومة البروتينات الذاتية في موضع الجيني الذاتية من خلال إعادة التركيب مثلي 14.
- لسلالات homothallic، والتعبير عن بروتين فلوري عصاري خلوي المشفرة وراثيا تحت سيطرة من نوع التزاوج المروجين محددة مثل تلك التي map3 جينات مستقبلات فرمون وmam2 لدفع التعبير في الخلايا P و M، على التوالي. دعاة map3 وmam2 غير نشطة أثناء النمو الخضري وحفز على النيتروجين المجاعة 18،19. تتكامل بنيات القيادة التعبير عن GFP عصاري خلوي أو mCherry تحت سيطرة هؤلاء مروجي عادة في مكان الجيني (ura4، leu1) لا تتداخل مع تطور طبيعي من دورة الحياة الجنسية 12.
4. الكمي من التزاوج والانصهار الكفاءة
- لتحديد التزاوج والانصهار الكفاءة 11،12، خلايا البقعة مباشرة بعد MSL-N يغسل على منصات الأغاروس MSL-N، كما في الخطوة 2.3.1 أعلاه، ويترك لمدة 24 ساعة على 25 درجة مئوية قبل التصوير (الشكل 1A). باستخدام هذا البروتوكول على homothallic من النوع البري كفاءة سلالة التزاوج تصل ~ 60٪ وكفاءة الانصهار 99٪. لاختبار ما إذا كان أي انخفاض في هذه القيم التي لوحظت في سلالات متحولة تعكس النمط الظاهري محطة أو تأخير، وتكرار التجربة مع فترة حضانة 36 ساعة.
- حساب الكفاءة التزاوج كما
وتشمل التزاوج أزواج بيضات ملقحة، زقاق، وأزواج خلية غير مدمجة تم التعرف عليها منموقف ونموها نحو بعضها البعض. - حساب كفاءة الانصهار كما
ملاحظة: يتم تحديد تنصهر أزواج التزاوج من خلال قدرتها على تشكيل أبواغ إذا فمن المعروف أن متحولة قيد الدراسة لا تؤثر على تكاثر. إذا تبوغ لا يمكن استخدامها للقراءة خارج، يتم تحديد الانصهار من خلال مراقبة انتشار علامة عصاري خلوي المعبر عنها في شريك التزاوج واحد فقط في كل من الشركاء.
وتشمل التزاوج أزواج بيضات ملقحة، زقاق، وأزواج خلية غير مدمجة تم التعرف عليها منموقف ونموها نحو بعضها البعض. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الانشطار نمو الخميرة والتزاوج حيوية عند إزالة مصدر النيتروجين
كما النيتروجين التجويع هو شرط أساسي لبدء التكاثر الجنسي في الخميرة الانشطار، تم رصد نوع السلالة البرية H90 homothallic على التحول من النيتروجين الغنية والمتوسطة الذين حرموا من النيتروجين (الشكل 2)، بعد بروتوكول المبينة في الشكل رقم 1 لفترة وجيزة، والخلايا كانت تزرع O / N إلى مرحلة الأسي (OD 600 = 0.5) في MSL + N المتوسطة، التي تم جمعها، وغسلها وإعادة علقت في MSL-N المتوسطة السائل إلى OD النهائي 600 = 1.5. وكانت كل 2 قسامات ساعة من خلايا calcofluor الملطخة وتصوير (الشكل 2A - D).
كشفت Calcofluor تلطيخ (الشكل 2A) أنه في المتوسط الغنية بالنتروجين ~ 21٪ من خلايا تم septating (ن> 300، الشكل 2B) وأن متوسط طول الخلية في ديفيوكان سيون 15.2 ± 1.4 ميكرومتر (ن = 50، الشكل 2C). أظهرت عدم تقسيم خلايا التوزيع الواسع لأطوال خلية (8-14 ميكرون، ن> 200، الشكل 2D). ومع ذلك، بعد ساعتين من التحول إلى MSL-N المتوسطة كان هناك تغيير جذري في توزيع طول الخلايا غير تقسيم، مع أكثر من 60٪ من خلايا كونه أقصر من 9 ميكرون (ن> 200، الشكل 2D). تم الكشف عن خلية تحوجز أيضا في تقليص طول 9.8 ± 0.8 ميكرومتر (ن = 50، الشكل 2A، 2C). ولوحظ أيضا انخفاض آخر في طول كل من غير فاصل وتقسيم الخلايا، مع مرور الوقت في زيادة MSL-N. في الواقع، بعد 8 ساعات و انخفض الرقم القياسي تحوجز للثقافة أقل من 2٪ (ن> 300)، وأكثر من 85٪ من خلايا القبض على دورة الخلية الخاصة بهم في أطوال أقصر من 7 ميكرون (ن> 200، الشكل 2D).
بدأت الخلايا لتشكيل التزاوج أزواج بعد التحول إلى السائل MSL-N أربع ساعاتمتوسطة (<1٪، 2A الشكل). وفي وقت لاحق عدد من أزواج التزاوج زيادة سريعة و 8 ساعة بعد تحول 10٪ من خلايا تعمل شريك التزاوج (ن> 200، الشكل 2B).
لمراقبة ديناميات التزاوج، 6 ساعات بعد تحريض المجاعة، وقد شنت قسامة من الخلايا أيضا على MSL-N وحة agarose للتصوير. خضعت خلايا shmooing، والانصهار وتبوغ (الشكل 2E، 2F) في 21 ساعة اللاحقة دون أي التزامن واضح (فيلم S1). كفاءة التزاوج يتوقف على الوضع النسبي وكثافة الخلايا في مجال معين للعرض، مع أكثر من 60٪ من الخلايا تعمل شريك عند وضعه المكتظة في أحادي الطبقة (الشكل 2G والسينما S1).
تعرض السلالات البرية من نوع heterothallic ح + وح- الخميرة الانشطار أيضا إلى نفس البروتوكول معخطوة إضافية ن خلط ح + والخلايا ح- في نسبة واحد الى واحد في وقت إزالة النيتروجين. وقد لوحظت مماثلة الجوع والتزاوج ديناميكية، ولكن كفاءة التزاوج أقل قليلا (الشكل 2G، فيلم S2).
ديناميات الموسومة fluorescently البروتينات الرصد في خلايا الخميرة التزاوج الانشطار
كانت مختلطة خلايا ح- لمراقبة ديناميات نوع-V الميوسين Myo52 (المرجع 20) في التزاوج الخلايا، ونمت بشكل كبير معربا عن Myo52-3GFP من موضع الأصلي مع h + الخلايا معربا بالمثل Myo52-tdTomato، فضلا عن GFP عصاري خلوي من P -cell المروج map3 محددة. وجرفت تعليق الخلية، مخففة في MSL-N المتوسطة والمحتضنة لمدة 6 ساعات في 30 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة قبل خلايا متزايدة على منصات MSL-N الأغاروس لO / N التصوير في 10 دقيقة فترات.
كما ذكرت سابقا 11،12 Myo52 مناطق حيوية في البداية شكلت في جميع أنحاء قشرة الخلية (الشكل 3A، رؤوس سهام وفيلم S3). وقد Myo52 إشارة ثم استقر (الشكل 3A، والسهام وفيلم S3) في التركيز واحدة فقط قبل الحدث الانصهار، الذي تصور عن طريق نقل إشارة GFP عصاري خلوي من ح + في الخلية ح- (الشكل 3A وفيلم S3) . ويمكن أيضا أن لاحظ إشارة Myo52-tdTomato في الرقبة الانصهار خلال توسعها ولكن لم يكن هناك إشارة ملحوظ واضحا كما شرع البيضة الملقحة إلى تبوغ (الشكل 3A وفيلم S3).
مراقبة سلوك الخلايا الخميرة Heterothallic الانشطار تتعرض لالفيرومونات الخارجية
خلايا ح- Heterothallic تفتقر إلى البروتيني Sxa2 التي تحط ف عامل الحساسية تستجيب بسهولة إلى الاصطناعية P-عامل. وح- sxa2Δ سلالة، معربا عن Scd2-GFP كعلامة لالنشط Cdc42 11، كانت تزرع في MSL + N المتوسطة، وفقا لبروتوكول صفها. تم غسلها الخلايا في MSL-N المتوسطة والمحتضنة لمدة 4 ساعات في 30 درجة مئوية. MSL-N منصات الأغاروس تحتوي على الميثانول (لا تظهر البيانات)، 0.1 ميكروغرام / مل (منخفض فرمون، الشكل 3B) أو 1 ميكروغرام / مل (فرمون عالية، الشكل 3C) من P-عامل تم إعداد، وقطع ووضع على شريحة جديدة لتوليد منصات صغيرة تحتوي على كميات فرمون مختلفة. وقد شنت 0.5 ميكرولتر من تعليق خلية في كل صغيرة ومنصات لO / N التصوير في 5 فترات دقيقة.
في التوافق مع النتائج المنشورة 11، شجعت انخفاض مستويات P-عامل تشكيل مناطق Scd2 ديناميكية دون النمو (الشكل 3B، الفيلم S4)، في حين استقرت مستويات عالية من P-عامل منطقة Scd2 واحدة، وبالتالي يحفز shmoo استطالة من القطب خلية واحدة (Figure 3C، فيلم S5).
الشكل 1:.. التمثيل التخطيطي من البروتوكول (أ) وصف تخطيطي من البروتوكولات المستخدمة لمراقبة دورة حياة جنسية الانشطار الخميرة و (ب) لإعداد عينات الانشطار الخميرة للتصوير على المدى الطويل الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .
الشكل 2: نمو والتزاوج ديناميات خلايا الخميرة الانشطار تحولت من MSL + N لMSL-N وسائل الإعلام الميكروسكوب (A) Epifluorescence الخلايا ملطخة calcofluor تحولت إلى MSL-N وسائل الإعلام لفترات أشار من الزمن. (ب) في المئةتحولت من septating (خط أزرق غامق، ن> 300 في timepoint) والتزاوج (خط أزرق فاتح، ن> 300 في timepoint) الخلايا لMSL-N وسائل الإعلام لفترات أشار من الزمن. (C) متوسط طول الخلايا septating تحول إلى MSL-N وسائل الإعلام لفترات أشار في وقت (ن = 50 في timepoint باستثناء 8 ساعة timepoint حيث n = 20). (د) توزيع طول الخلايا غير تقسيم تحول إلى MSL-N المتوسطة لفترات أشار في وقت (ن> 200 في timepoint). (E) متوسط جزء من غير مدمجة (خط أزرق غامق)، تنصهر (أزرق فاتح خط) وsporulating (خط أسود) الخلايا في عدد سكانها H90 البرية من نوع الخميرة تحول إلى MSL-N وسائل الإعلام لفترات أشار الوقت و شنت على وسادة أجار في timepoint 6 ساعات (ن> 900 خلية لكل timepoint من ثلاثة timelapses مختلفة). واعتبرت الخلايا تنصهر عندما لم يكن جدار الخلية الانكسار بين الشركاء مرئية في الميكروسكوب مدينة دبي للإنترنت وتشكيل جدار الخلية بوغ كانت تستخدم لصالح فريق ليرة سوريةorulating الخلايا. الميكروسكوب (F) DIC الخلايا التزاوج تحولت إلى MSL-N وسائل الإعلام لفترات أشار من الزمن. (G) كفاءة التزاوج بوصفها وظيفة من كثافة الخلايا على منصات الأغاروس لH90 (النقاط ذات لون أزرق داكن) وح + / ح- (نقطة ضوء أزرق) الخلايا تحولت إلى MSL-N وسائل الاعلام لمدة 24 ساعة. ويتم تحقيق كثافة أكثر ملائمة للخلايا للتصوير على المدى الطويل في ما يقرب من 25000 خلية / مم 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): دينامية توطين البروتينات الفلورية خلال التزاوج الانشطار الخميرة (A) Deconvolved الميكروسكوب epifluorescence ض طائرة واحدة من الخلايا التي تحتوي على المورثات أشار تحولت من MSL + N لMSL-N وسائل الاعلام عن 6 ساعات وشنت علىMSL-N وحة agarose للمرة المشار إليه. النصال تشير مناطق Myo52-3GFP ديناميكية ويشير السهم من Myo52 التعريب في التركيز الانصهار. (ب)، (ج) Deconvolved واحدة ض الطائرة الميكروسكوب epifluorescence من الخلايا مع المورثات أشار تحولت من MSL + N لMSL-N وسائل الإعلام لمدة 4 ساعة والتي شنت على الأغاروس منصات مصغرة MSL-N تحتوي على 0.1 ميكروغرام / مل (ب) أو 1 ميكروغرام / مل (C) من P-عامل الوقت المشار إليه. النصال تشير الحيوي (B) أو مستقرة مناطق (C) Scd2-GFP. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم التكميلي 1: لقطات متتابعة مدينة دبي للإنترنت البرية من نوع H90 الانشطار الخميرة م LLS التي كانت النيتروجين المتعطشة لل6 ساعات قبل التصوير. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
التكميلي فيلم 2: . قطات متتابعة مدينة دبي للإنترنت البرية من نوع ح + وخلايا الخميرة الانشطار ح- التي كانت مختلطة والنيتروجين في حاجة ماسة إلى 6 ساعات قبل التصوير (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
"> فيلم التكميلي 3: Deconvolved epifluorescence واحدة ض الطائرة ومدينة دبي للإنترنت لقطات متتابعة من خلايا ح- معربا عن Myo52-3GFP من موضع الأصلي مختلطة مع h + الخلايا معربا عن Myo52-tdTomato من موضع الأصلي وGFP عصاري خلوي من P-خلية المروج map3 محدد . كانت تزرع الخلايا في MSL-N متوسطة لمدة 6 ساعة على 30 درجة مئوية قبل التصوير. نقل GFP عصاري خلوي في الخلية ح- يحدد وقت الانصهار. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
الفيلم التكميلي 4: Deconvolved epifluorescence واحدة ض الطائرة ومدينة دبي للإنترنت لقطات متتابعة من ح- إكسب خلايا sxa2 ressing Scd2-GFP من المروج لها الأصلي تعامل مع 0.1 ميكروغرام / مل ف عامل. وقد نمت الخلايا في MSL-N متوسطة لمدة 4 ساعة عند 30 درجة مئوية قبل التصوير. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
: فيلم التكميلي 5 كانت تزرع Deconvolved epifluorescence واحدة ض الطائرة ومدينة دبي للإنترنت لقطات متتابعة من خلايا sxa2 ح- معربا عن Scd2-GFP من المروج الأصلي لها تعامل مع 1 ميكروغرام / مل ف عامل الخلايا في MSL-N متوسطة لمدة 4 ساعة عند 30 درجة مئوية. قبل التصوير. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
| YSM995 | ح- بالوزن |
| YSM1371 | ح + بالوزن |
| YSM 1396 | H90 بالوزن |
| YSM2534 | ح- myo52-3GFP :: kanMX |
| YSM2730 | ح + myo52-tdTomato :: natMX Pmap3: GFP :: ura4 + @ ura4locus |
| YSM2731 | ح- scd2-GFP :: natMX sxa2Δ :: kanMX |
الجدول S1: السلالات المستخدمة في هذه الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الظروف البيئية، وتوافر المواد الغذائية على وجه الخصوص، تؤثر بقوة على علم وظائف الأعضاء الانشطار الخميرة. النيتروجين المجاعة ضروري للالتزام التكاثر الجنسي ويؤدي إلى ضرب التغيرات في الإنقسامية تقدم دورة الخلية (المرجع 21) والشكل (2) في البداية. على إزالة النيتروجين من النمو أضعافا مضاعفة عدد السكان وحجم الخلية في الانقسام يتناقص بسرعة (الشكل 2C) وغالبية خلايا اعتقال التقدم الإنقسامية أقصر من طول المولود حديثا الخلايا المزروعة أضعافا مضاعفة (المرجع 21) والشكل (2D). كما خلايا من أنواع التزاوج المعاكس تعتقل التقدم الإنقسامية ينخرطون شركاء التزاوج، والشروع في تشكيل بيضات ملقحة وsporulate (الشكل 2B، 2E، 2F). في حالة وجود أحادي الطبقة ثنائية الأبعاد من الخلايا wildtype، أكثر من ستين في المئة من خلايا H90 سوف تشارك شريك، وتقريبا كل سيخضع انصهار الخلية (الشكل 2G (الشكل 2G). واحدة من أهم جوانب بروتوكول للحصول على كفاءة عالية التزاوج هو التأكد من أن الخلايا يتم الاحتفاظ داخل الكثافة المشار إليها طوال الوقت. رصد حجم الخلية والكفاءة التزاوج المعلمات كما هو مبين في الشكل 2 ثم يوفر تحكم بسيطة أن الخلايا تدخل التكاثر الجنسي بكفاءة.
ونلاحظ أنه منذ التزاوج عدم المتوسط أي مصدر النيتروجين (حتى كميات قليلة من الأحماض الأمينية والقواعد النيتروجينية مستبعدة)، ويتم الحصول على الكفاءات التزاوج العالية مثل تلك التي عرضت في الشكل 2E و 2G فقط مع سلالات أنموذجية التغذي بشكل كامل. سلالات العوز الغذائي يمكن استخدامها، ولكن تحتاج إلى عناية إضافية للتأكد من أن الخلايا في جميع الأوقات تظل ضمن كثافة الخلية جاء في البروتوكول. حتى مع الرعاية، فقطوسيراعى أقل كفاءة التزاوج. ويتأثر كفاءة التزاوج أيضا في درجة الحرارة، مع كفاءات أقل لوحظ في درجة حرارة مرتفعة، مما قد يحد من استخدام أليل متحولة حساسة للحرارة أثناء عملية التزاوج.
يتم استخدام الطريقة المعروضة هنا في المقام الأول للتصوير على المدى الطويل من الصحفيين الفلورسنت. لأنه يتم تنفيذ التصوير على مدى فترة طويلة من الزمن، والتصوير الناجح من الانشطار الخميرة التزاوج يعتمد بشكل كبير على الإعداد المجهر المتاحة. لهذا، واستقرار المجهر انشاء، والحساسية، والوصول إلى نظام ضبط تلقائي للصورة حاسمة. إما البرامج أو المستندة إلى أنظمة ضبط تلقائي للصورة الأجهزة المدمج في ممكنة. وبالإضافة إلى ذلك، لزيادة الإنتاجية، مرحلة الآلية تمكين اكتساب عدة نقاط هي نوعية هامة أخرى.
جودة التصوير محدودة بسبب خصائص fluorophore من الفائدة. الأوقات حضانة متميزة في السائل MSL-N المتوسطة المفصل في Protocoوتهدف ل القسم 2.3 في تحسين مضان على البروتينات الموسومة التي يسببها فرمون وتقليل تبيض لزوم لها عن طريق التصوير مراحل فقط التزاوج من الفائدة. بينما البروتينات وفيرة أو مبؤرة غاية الموسومة fluorescently تسمح الاستحواذ على مئات من الزمن نقاط على مدار دورة حياة جنسية كاملة (فيلم S3)، والبروتينات الأخرى تشكل تحديا لصورة على مثل هذه الأوقات طويلة بسبب الصور التبييض. يعتمد جودة الصورة أيضا على fluorophore المختار، عادة ما يكون مشتق GFP. لاحظنا مرارا وتكرارا أن sfGFP 17 (superfolder GFP)، التي تطوي مع حركية السريعة، شريطة الإشارة فائقة أثناء عملية التزاوج، ربما لأن الالتهام الذاتي قوي يدفع دوران البروتين السريع. الأهم من ذلك، ونحن لم مراقبة توافر الأكسجين اللازم للبروتين فلوري نضوج 17،22. وبالتالي، فمن المستحسن أن يكون حذرا في استخدام القياسات مضان لقياس مستويات البروتينات وأعرب بعد الخلايا هي mounteد على الشرائح، أو لاستخدام الأكسجين الأجهزة على microfluidics نفاذية بديلة لإجراء مثل هذه التجارب. وبالإضافة إلى ذلك، ومنصات الاغاروز رصدت مع الخلايا في المساء، وأبقت على 18 درجة مئوية O / N أن يكون مفيدا جدا لصورة صحفيين ضعيفة كما تحتوي هذه منصات خليط من الخلايا في جميع مراحل التكاثر الجنسي.
التزاوج في الخميرة الانشطار لا يحمل التزامن والخلايا يمكن أن ينظر بسهولة بدء shmooing جنبا إلى جنب مع غيرها من الخلايا sporulating بالفعل (أفلام S1، S2). هذه الديناميات السكانية يجعل الكلاسيكية والتقنيات الحيوية بكميات كبيرة من الصعب استخدام، مما يجعل المجهر خلية واحدة وصفت هنا طريقة الاختيار. كل النهج القائم على الفحص المجهري يمكن من حيث المبدأ أن تطبق على خلايا أعدت مع بروتوكول صفها هنا. الأهم من ذلك، أن هذه النهج مراقبة العمليات التي تظهر التزاوج نوع معين ديناميات مثل الانصهار خلية خلية وصفها دودين وزملاؤه 12. لمراقبة عدم التماثل، نوع التزاوج للصحفيينوكانت مفيدة بشكل خاص (الشكل 3A). التفريق بين أنواع التزاوج اثنين يتحقق بسهولة عند العمل مع سلالات heterothallic من خلال توظيف fluorophores متميزة لوضع علامة البروتينات في ح- وح + الخلايا. ومع ذلك، لم يكن ذلك ممكنا لسلالات homothallic. نهج وضعت للتمييز بين نوع التزاوج الخلايا H90 هو للتعبير عن البروتينات الفلورية عصاري خلوي تحت سيطرة من نوع التزاوج المروجين محددة. على وجه الخصوص، تم استخدام المروجين للفرمون مستقبلات الجينات map3 وmam2 لدفع التعبير عن GFP أو mCherry البروتينات في خلايا P و M على التوالي. وعلاوة على ذلك، سمحت هذه العلامات توقيت دقيق للاندماج خلية خلية، تصور كما نقل إشارة الفلورسنت من الخلايا شريك واحد على الآخر.
الفيرومونات التزاوج هي عوامل حاسمة للتقدم عبر مراحل متميزة من التكاثر الجنسي في الخميرة 11،23 مستويات مختلفة من فرمون الرصاص الاصطناعية للدول خلية الاستقطاب متميزة في الخميرة الانشطار (الشكل 3B، 3C والرقم 11). البروتوكول تضمن أعلى يسمح تقييم كيفية تأثير متميزة مستويات فرمون الخارجية فسيولوجيا الخلية. لأن الأنزيم البروتيني فرمون Sxa2 يتحلل بسرعة P-عامل، سلالة متحولة heterothallic حيث تم حذف البروتيني كانت تستخدم للحصول على نتائج قابلة للتكرار. ومع ذلك، في خليط من خلايا أنواع التزاوج المعاكس، وليس فقط ولكن أيضا مستويات التوزيع المكاني للالفيرومونات المنبعث من شريك التزاوج من المحتمل أن تكون مهمة. وتحليل آثار التوزيع المكاني فرمون على استجابة الخلايا تتطلب تطوير الاجهزة أكثر تطورا مثل الأجهزة على microfluidics العاملين في مهدها الخميرة 24،25.
وباختصار، فإننا نقدم وسيلة أساسية للفحص المجهري على المدى الطويل من دورة حياة الجنسية من الخميرة الانشطار. تعديلات طفيفة على هذا البروتوكول تسمح الباحثينالفصل التركيز على الاستجابات الخلوية في مراحل متميزة من مراحل دورة حياة الجنسية. ويجمع هذا النهج مع أدوات الخلية والكيمياء الحيوية واحدة والأجهزة على microfluidics مواصلة تعزيز الانشطار الخميرة التكاثر الجنسي كنظام نموذج قوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد AV من قبل EMBO على المدى الطويل زمالة ما بعد الدكتوراه. ويتم تمويل البحوث في مختبر مارتن من منحة ERC البداية (GeometryCellCycle) ومنحة مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_155944) إلى SGM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
