Introduction
Hoewel genetische uitwisseling tussen twee cellen is de centrale gebeurtenis in geslachtelijke voortplanting, beroept zij zich op een keten van gebeurtenissen die celdifferentiatie te bevorderen, zorgen voor partnerkeuze, het uitvoeren van cel-cel fusie en genomische stabiliteit te handhaven. Aldus presenteert de seksuele levenscyclus zich als een modelsysteem om een aantal vragen omtrent ontwikkelingsstoornissen schakelaars bestuderen reactie op extrinsieke stimuli, plasma membraanfusie, chromosoomsegregatie, enz Exploring the splijtgist seksuele cyclus van deze fenomenen te bestuderen brengt de voordelen van de de modelsysteem krachtige genetica, gevestigde high-throughput benaderingen en geavanceerde microscopie. Sex in kernsplijting gist is een heterotypic evenement tussen een P-cel en een M-cel van verschillende soorten paring. De twee celtypen verschillend drukken een aantal genen waaronder die 1,2 voor de productie van de uitgescheiden P- en M-feromonen, feromoon-receptoren map3 en Mam2 en feromoon-proteases Sxa1 en Sxa2. Homothallic stammen, zoals de gebruikte stam H90, dragen de genetische informatie voor beide paren in een genoom en cellen ondergaan een complex patroon van paringstype schakelen gedurende de mitotische levenscyclus (besproken in ref. 3). Meerdere isolaten van heterothallisch splijtgist die zelden of nooit schakel mating type worden ook vaak gebruikt 4, het meest opvallend h + N (P-type) en h -S (M-type) stammen.
In kernsplijting gist, de toegang tot de seksuele levenscyclus is onder strikte nutritionele regelgeving. Alleen stikstof verhongerde splijtingsproducten gistcellen arresteren mitotische voortplanting en produceren diffundeerbare feromonen om de aanwezigheid van een seksuele partner te signaleren en de verdere stappen van de seksuele cyclus (beoordeeld in ref. 5) te promoten. Stikstof ontbering de-onderdrukt de sleutel transcriptionele regulator van de paring Ste11 die fungeert als een ontwikkelings-switch en bevordert eXpression van paring specifieke genen met inbegrip van het feromoon receptor en de feromoonproductie genen 6,7. Feromoon-receptor betrokkenheid activeert de receptor gekoppelde eiwit G-alfa en downstream MAPK signalering die verder verbetert Ste11 transcriptionele activiteit 8-10, waardoor de feromonen productie in een positieve terugkoppeling tussen de paring partners. Pheromone niveaus zijn cruciaal voor andere cel polarisatie toestanden te induceren door het reguleren van de meester organisator van de cel polariteit, de Rho-familie GTPase Cdc42 11. Bij blootstelling aan lage concentraties feromoon wordt actief Cdc42 gevisualiseerd dynamische pleisters verkennen van de cel periferie en geen celgroei waargenomen in dit stadium. Verhoogde feromoon niveaus bevorderen van de stabilisering van de Cdc42 activiteit aan één zone en de groei van een gepolariseerde projectie, aangeduid als de Shmoo, welke partner cellen in contact brengt. Vervolgens worden de twee haploïde parende partners fuseren van een diploïde zygote te vormen. Recent werk onthult the bestaan van een nieuwe actine structuur essentieel voor fusie die is samengesteld door de paring geïnduceerd formin FUS1 12. Deze fusie aandacht concentreert type V myosine afhankelijke processen en positioneert het celwandafbraak machines, waardoor remodelleren van de celwand plasmamembraan contact zonder cellyse 12 mogelijk. Bij het cel-cel fusie, de kernen in contact komen en ondergaan karyogamie. Een prominente dynein afhankelijke heen en weer bewegen van de kern in de zygote (paard-tail beweging) bevordert vervolgens de koppeling van chromosoom homologen 13,14, gevolgd door meiose. Tenslotte de vier producten van meiose worden verpakt in afzonderlijke sporen tijdens sporulatie.
Vanwege de complexiteit en de vele stappen die betrokken zijn, heeft gedetailleerde monitoring van de paring is uitdagend. Twee opmerkelijke problemen zijn dat het hele proces duurt meer dan vijftien uur en dat cellen moeilijk te synchroniseren. deze difficulties worden omzeild door eencellige microscopie benaderingen. Hier wordt een algemeen protocol om te onderzoeken van de seksuele levenscyclus in kernsplijting gist wordt gepresenteerd. Met kleine aanpassingen Dit protocol maakt het bestuderen van de verschillende stappen van het proces, namelijk de inductie van paring genproduct celpolarisatie en paring tussen zuster-cellen na mating type schakel- en tussen niet-zuster partners, cel-celfusie en post-fusie horse-tail beweging, meiose en sporulatie. Deze methode maakt het mogelijk om 1) gemakkelijk te visualiseren fluorescent gelabelde eiwitten in de tijd vóór, tijdens en na de fusie; 2) discriminatie het gedrag van cellen van tegengestelde mating; en 3) het meten en kwantificeren van parameters zoals shmooing, paring, fusie of sporulatie efficiency.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Microscopie analyse van kernsplijting gist geslachtelijke voortplanting
1. Mediavoorbereiding
- Bereid Minimum Sporulatie medium (MSL-N) 15 door mengen van de volgende componenten: Glucose: 10 g / l, KH 2PO 4: 1 g / l, NaCl: 0,1 g / l MgSO4 · 7H 2 O: 0,2 g / L. Voeg Sporenelementen (10.000x): 100 ul / L, vitaminen (1000x): 1 ml / l en 0,1 M CaCl2 ml / L. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 pm poriegrootte filter en bewaar bij kamertemperatuur (RT).
- Gebruik de volgende Vitamins (1000x) voorraad: Pantothenaat: 1 g / l, nicotinezuur: 10 g / l, Inositol: 10 g / l, biotine: 10 mg / l. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 um poriegrootte filter en bewaar bij 4 ° C.
- Gebruik de volgende sporenelementen (10.000 x) voorraad: Boorzuur: 5 g / l, MnSO 4: 4 g / l, ZnSO 4 · 7H 2 O: 4 g / l, FeCl2 · 6H 2 O: 2 g / l , MoO 3: 0,4 g / l, KI: 1 g / l, CuSO4· 5H 2 O: 0,4 g / l, citroenzuur: 10 g / l. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 um poriegrootte filter en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid MSL-N Agarose 2% (gebruikt voor de agarose pad kamers te maken) door het combineren van 10 ml van MSL-N met 0,2 g agarose. Smelten ~ 2 minuten bij hoog vermogen in een microgolfoven, tot agarose oplost en aliquot 0,5 ml in microcentrifugebuizen. Bewaar bij kamertemperatuur.
- Bereid Minimum Sporulatie medium met stikstof (MSL + N) van MSL-N door toevoeging van (NH4) 2 SO 4: 1 g / l, Leucine: 0,225 g / l, Adenine: 0,225 g / l, uracil: 0,225 g / l . Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 um poriegrootte filter. Bewaar bij kamertemperatuur.
Opmerking: leucine, adenine en uracil zijn aan dit medium toegevoegd om de groei van auxotrofe stammen. Extra aminozuur supplement moeten worden opgenomen als de gebruikte stam draagt een duidelijke auxotrofie (bijvoorbeeld his3Δ). Houd er ook rekening mee dat het werk met volledig prototroph stammen wordt aanbevolen, omdat alleendergelijke stammen zal hoog paring efficiency mogelijk te maken. - Bereid 200 ml valap voor Kamer afdichting. In een bekerglas gelijke gewichten van lanoline, vaseline (of andere vaseline) en paraffine. Heat mengsel bij lage temperatuur en roer af en toe tot het goed gemengd. Aliquot de mix in meerdere kleine petrischaaltjes. Bewaar bij kamertemperatuur.
2. Het kweken kernsplijting giststammen voor Mating Experimenten (figuur 1).
- Dag 1, 's avonds:
Inoculeer vers weggeschoten stammen uit vaste media in de cultuur buisjes met 3 ml van MSL + N. Gebruik vlakke bodem buizen van ongeveer 2,5 cm diameter. Gebruik andere cultuur buizen of flessen met aangepaste cultuur volume. Incubeer overnacht (O / N) onder schudden bij 25 ° C, 200 rpm. Als het werken met heterothallisch stammen, te enten afzonderlijk.- Verdunde celsuspensies media de volgende ochtend zodat culturen optische dichtheid gemeten bij 600 nm (OD 600) van 0,4-0,8 in de avond.
Notitie:OD 600 metingen als benadering van celconcentratie van splijtgist lineair in het bereik van ongeveer 0,1-1,0. Voor onze spectrofotometer OD 600 = 0,1 komt overeen met 1,4 x 10 6 cellen per ml. Dus, als de initiële OD 600 leest zijn buiten dit bereik monsters moeten worden verdund / geconcentreerd zijn om betrouwbare metingen.
- Verdunde celsuspensies media de volgende ochtend zodat culturen optische dichtheid gemeten bij 600 nm (OD 600) van 0,4-0,8 in de avond.
- Dag 2, 's avonds:
Verdun de cellen in 20 ml N + MSL media OD 600 = 0,025 in 100 ml kolven. Incubeer stammen O / N bij 30 ° C, 200 rpm.
Let op: Wild-type celculturen moet OD te bereiken 600 ~ 0.8 de volgende ochtend (15 uur later). Als het werken met stammen met langer generatie aan te passen verdunning dienovereenkomstig. - Dag 3 Ochtend:
Meet de OD 600 om te controleren of culturen hebben cel dichtheid van OD 600 ~ 0.8. Als het werken met heterothallisch stammen, meng gelijke aantallen partner cellen. Pellet cellen bij 1000 xg en transfer naar een 1,5 mlbuis. Was de cellen drie keer in 1 ml N MSL-medium. Resuspendeer cellen in 3 ml N MSL-medium en verdund cellen OD 600 = 1,5.- De paring tussen zus cellen te controleren cellen direct mount voor beeldvorming (zie protocol paragraaf 2.4). Gebruik homothallic H90 stammen, in welk type paring omschakeling plaats tijdens de mitotische divisies die zich na stikstof ontbering zal nemen. Directe montage van cellen op de agarose pad waarborgt dat na celdeling, zuster-cellen blijven naast elkaar.
- Naar cel polarisatie (verkennend dynamiek en shmooing) toezicht broeden 1-3 ml van de celcultuur bij 30 ° C, 200 rpm gedurende 3-4 uur voorafgaand aan de montage van cellen voor beeldvorming. Binnen deze 3-4 uur, zal de laatste mitotische deling hebben voorgedaan. Een paar cellen zullen geïnitieerd hebben polarisatie, maar de meeste zullen alleen worden beginnen hun verkennend polarisatie dynamiek.
- Monitoren cel-celfusie incubeer 1-3 ml celkweek bij 30 ° C, 200 rpm gedurende 4-6 uur priof de montage cellen voor beeldvorming.
- om toezicht te houden na fusiegebeurtenissen incubeer 1-3 ml celculturen bij 30 ° C, 200 rpm gedurende 8 uur vóór montage cellen voor beeldvorming.
- Om op speciaal feromoon concentratie (alleen voor heterothallisch stammen) controleren incubeer 3 ml celkweek bij 30 ° C, 200 rpm gedurende 3-4 uur vóór montage cellen voor beeldvorming.
- Verwijder de MSL-N-bevattende microcentrifugebuis uit de 95 ° C warmte-blok (zie Protocol paragraaf 2.4.1. Hieronder). Add P-factor of M-factor op de gewenste concentratie direct in de gesmolten MSL-N agarose. Meng goed door vortexen voor onmiddellijke pad voorbereiding.
- Na montage van de meetcellen, incubeer de pad 15-30 min bij 25 ° C voorafgaand aan beeldvorming. P-factor en M-factor feromonen werden uit een voorraadoplossing van 1 mg / ml in methanol.
Opmerking: Als het werken met gemuteerde stammen incubatietijd kan variëren. Samenklontering van cellen kunnen optreden na langdurige incubatie in vloeibare media en kunnen met name sterk in sommige gemuteerde stammen zijn. Samengeklonterd cellen niet worden gespot op agarose pads in een enkele laag en dus moeilijk autofocus en beeld. Bij intensief cel klonteren monteren cellen op agarose pads direct na wassen en resuspensie in stikstof ontbreekt media (zoals in het protocol 2.3.1.) En incubeer ze op 30 ° C voorafgaand aan beeldvorming.
- Montage Cellen voor Imaging:
- Bereid MSL-N agarose pads 16 door het smelten van een monster in een 95 ° C warmte-blok voor 10-15 min en het toevoegen van 200 pl tussen twee glasplaatjes gescheiden door afstandhouders (Figuur 1B). Gebruik spacers met een dikte van ~ 0,5 mm. Afstandhouders maken gebruik stroken gesneden uit karton, zoals geleverd met restrictie-enzymen.
- Pellet 100 pl cellen bij 1000 g gedurende 1 min, verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in residuele 2-4 pl medium. Niet opnieuw te schorten in vers medium als het vertraagtparing.
- Na 2-3 min verwijder voorzichtig afstandhouders en de top glasplaatje. Als er meerdere stammen moeten worden gemonteerd, de voorbereiding van de cel concentreert voor de voorbereiding van de agarose pad.
- Voeg 1 ul van de cellen aan de pad en wacht tot de daling begint drogen (~ 1 min), voordat ze met een deksel slip en afdichten met valap.
- Laat de pad zitten gedurende ten minste 30 minuten voor de beeldvorming bij 25 ° C of RT.
- Aan een mengsel van cellen in verschillende stadia van het koppelen krijgen, moet een pad direct na wassingen in MSL-N (zie paragraaf 2.3.) En incubeer bij 18 ° CO / N (= 15 uur). Deze benadering is nuttig voor de beeldvorming van cellen op verschillende stadia paring met een hoge tijdsresolutie of monsters met een zwak signaal.
3. live-cell imaging van het Koppelen van gistcellen
- Pas Image Acquisition-instellingen.
Opmerking: Afbeelding overname hier gepresenteerde werden geoptimaliseerd voor de DeltaVision platform bestaat uit een op maat Olympus IX-71omgekeerde microscoop met Plan Apo 60X / 1.42 NA of U-Plan Apo 100X / 1.4 NA doelstellingen, een CoolSNAP HQ2 camera en een Insight SSI 7 kleuren gecombineerd unit verlichting. De hardware wordt gecontroleerd door softWoRx v4.1.2 dat maakt het ook mogelijk de digitale autofocus.- Waarborgen dat de autofocusserende frequentie niet hoger zijn dan 15 min aangezien de Z-drift over langere tijd de capaciteit van de software autofocussysteem kunnen overtreffen. Bij gebruik van een hardware-gebaseerde autofocus-systeem, gebruik maken van grotere tussenpozen.
- Passen beeldvorming interval. Neem beelden elke 10 min gedurende ~ 15 uur als uitgangspunt bij het werken met een fluorescent gelabeld eiwit voor de eerste keer. Dit interval geeft een goed overzicht van het gehele paring proces zonder uitgebreide bleken.
- Afbeelding met intervallen van 5 min of korter nauwkeuriger time events, zoals fusie. Kortere intervallen vereisen sterke fluoroforen waardoor lage belichtingstijden en weinig bleken. Voor beeldvorming met tussenpozen van minder dan 1 min vermijden O / N microscopieen in plaats daarvan voor te bereiden een mengsel van alle paring fasen zoals beschreven in paragraaf 2.4.6 Protocol.
- Pas de afbeelding belichtingstijd. exposure testtijden tussen de 50 en 300 msec. Proberen een evenwicht tussen de signaal-ruisverhouding en photobleaching slaan als een groot aantal tijdstippen bereiken met een waarneembaar signaal (normaal meer dan 100).
- Pas Z-snijden. Secties elk 0,3 pm die 5 urn zorgen voor een goede beeldvorming diepte. NB-Z snijden verdere toename foto-schade kan worden geminimaliseerd door de OAI (optische as integratie - een enkele slag verkrijging van het totale monster diepte). Goede auto-focus systeem vermindert de noodzaak voor vele Z-profielen en wordt sterk aanbevolen.
- Tips om Mating Typespecifieke Gedrag Studie:
- Voor heterothallisch stammen gebruikt h- en h + cellen die verschillende fluoroforen, zodat de twee celtypen te onderscheiden. Gebruik een genetisch gecodeerde fluorophoopnieuw uitgedrukt als cytosolische versie of fusie met een endogeen eiwit, hoewel we goed succes met sfGFP, snel opvouwbaar variant van GFP 17 hebben. Endogene eiwitten zijn meestal gelabeld op hun endogene genomische locus door middel van homologe recombinatie 14.
- Voor homothallic stammen, drukken een genetisch gecodeerde cytosolisch fluorescent eiwit onder de controle van paringstype promoters zoals die van het feromoon receptor genen map3 en mam2 de expressie rijden P en M cellen. De promotors van map3 en mam2 zijn niet actief tijdens de vegetatieve groei en worden geïnduceerd op stikstof uithongering 18,19. Constructen de expressie van cytosolische GFP of mCherry onder de controle van deze promoters worden typisch geïntegreerd in een genomische locus (Ura4, Leu1) die niet interfereert met de normale progressie van de seksuele levenscyclus 12.
4. Kwantificering van het Koppelen en Fusion Efficiëntieverbeteringen
- Paring en fusie efficiëntie 11,12, vlek cellen kwantificeren direct na MSL-N wassen op MSL-N agarose pads, zoals in stap 2.3.1 hierboven, en laat gedurende 24 uur bij 25 ° C voorafgaand aan beeldvorming (Figuur 1A). Met dit protocol een homothallic wildtype mating efficiëntie bereikt -60% en fusie-efficiëntie 99%. Om te testen of een eventuele verlaging van deze waarden waargenomen in mutant stammen weerspiegelen een terminal fenotype of een vertraging, herhaal het experiment met een 36 uur incubatie tijd.
- Bereken paring efficiëntie
Mating paren omvatten zygotes, ASCI en gefuseerde cel paren geïdentificeerd vanhun positie en groei naar elkaar. - Bereken fusion efficiëntie
Opmerking: Gesmolten koppelen paren worden geïdentificeerd door hun vermogen om sporen te vormen indien bekend is dat de mutant onderzochte sporulatie niet beïnvloedt. Als sporulatie niet kan worden gebruikt als uitlezing wordt fusion bepaald door het observeren van de verspreiding van een cytosolische merker uitgedrukt in één seksuele partner naar beide partners.
Mating paren omvatten zygotes, ASCI en gefuseerde cel paren geïdentificeerd vanhun positie en groei naar elkaar. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kernsplijting Gist Groei en Mating Dynamics bij verwijdering van een stikstofbron
Stikstof honger is een voorwaarde voor de aanvang van de seksuele voortplanting in kernsplijting gist, werd wild-type homothallic H90 stam gecontroleerd op verschuiving van stikstofrijke aan stikstof beroofd medium (figuur 2), naar aanleiding van de in figuur 1 protocol. In het kort, cellen werden gegroeid O / N exponentiële fase (OD600 = 0,5) in MSL + N medium, verzameld, gewassen en opnieuw gesuspendeerd in N-MSL vloeibaar medium tot uiteindelijke OD 600 = 1,5. Elke 2 uur monsters van cellen calcofluor gekleurd en afgebeeld (Figuur 2A - D).
Calcofluor kleuring (Figuur 2A) onthulde dat stikstofrijke medium ~ 21% van de cellen septating (n> 300, figuur 2B) en gemiddelde celgrootte lengte bij diviSion was 15,2 ± 1,4 micrometer (n = 50, figuur 2C). Non-delende cellen toonde een brede spreiding van de cel lengtes (8-14 micrometer; n> 200, figuur 2D). Echter, twee uur na de verschuiving naar MSL-N medium was er een drastische verandering in de lengteverdeling van niet-delende cellen, met meer dan 60% van de cellen korter is dan 9 um (n> 200, figuur 2D). Cel septatie werd ook gedetecteerd in de gereduceerde lengte van 9,8 ± 0,8 um (n = 50, figuur 2A, 2C). Een verdere vermindering van de lengte van zowel niet-delende en delende cellen werd ook waargenomen, zoals tijd MSL-N verhoogd. Immers, na 8 uur de septation index van de kweek onder verminderde 2% (n> 300) en meer dan 85% van de cellen gearresteerd de celcyclus in lengte korter dan 7 urn (n> 200, figuur 2D).
Cellen begon te vormen paren paren vier uur na de verschuiving naar vloeibare MSL-Nmedium (<1%, Figuur 2A). Vervolgens wordt het aantal paren paren snel gestegen en 8 uur na de verschuiving 10% van de cellen die zich bezighouden een paring partner (n> 200, Figuur 2B).
De paring dynamiek te bewaken, 6 uur na de hongerdood inductie, een monster van cellen werd ook gemonteerd op MSL-N agarose pad voor de beeldvorming. Cellen onderging shmooing, fusion en sporulatie (figuur 2E, 2F) in de daaropvolgende 21 uur zonder duidelijke synchroniciteit (Movie S1). De paring rendement afhankelijk van de relatieve positie en de dichtheid van cellen in een gegeven gezichtsveld, meer dan 60% van de cellen betrokken bij een partner dicht gelegen in een monolaag (figuur 2G en Movie S1).
De stammen wild-type heterothallisch h + en H- kernsplijting gist werden ook onderworpen aan hetzelfde protocol met eenn extra stap van het mengen en h + H cellen in een één-op-één verhouding bij de stikstofverwijdering. Vergelijkbare honger en paring dynamiek werden waargenomen, maar de dekking efficiency was iets lager (figuur 2G, Movie S2).
Monitoring Dynamiek van fluorescent gemerkte eiwitten in Mating Fission gistcellen
De dynamiek van het type V-myosine Myo52 (Ref 20) in paren cellen volgen, exponentieel gegroeid h- cellen die Myo52-3GFP van de natieve locus werden gemengd met h + cellen vergelijkbare expressie Myo52-tdTomato, en cytosolische GFP van de P -cel specifieke map3 promotor. De celsuspensie werd gewassen, verdund in MSL-N medium en gedurende 6 uur bij 30 ° C, 200 rpm vóór montage cellen op MSL-N agarose pads voor O / N beeldvorming bij 10 minuten intervallen.
Zoals eerder gemeld 11,12 Myo52 aanvankelijk gevormde dynamische zones in de hele cel cortex (figuur 3A, pijlpunten en Movie S3). Myo52 signaal werd vervolgens gestabiliseerd (Figuur 3A, pijlen en film S3) in één brandpunt net voor de samensmelting, die werd gevisualiseerd met de overdracht van de cytosolische GFP signaal van de h + in de h- cel (Figuur 3A en Movie S3) . De Myo52-tdTomato signaal kan ook worden waargenomen bij de fusie nek tijdens zijn expansie, maar geen waarneembare signaal was duidelijk als de zygote overgegaan tot sporulatie (figuur 3A en Movie S3).
Toezicht op het gedrag van heterothallisch Fission Yeast cellen blootgesteld aan externe Feromonen
Heterothallisch h- cellen die de Sxa2 protease dat P-factor voor de desensibilisatie degradeert snel reageren op synthetische P-factor. een h- sxa2Δ stam expressie SCD2-GFP als marker voor actieve Cdc42 11, werd gekweekt in medium MSL + N bijgevolg de beschreven protocol. De cellen werden gewassen in MSL-N medium en gedurende 4 uur bij 30 ° C. MSL-N agarose pads met methanol (gegevens niet getoond), 0,1 ug / ml (laag feromoon, figuur 3B) of 1 ug / ml (hoge feromoon figuur 3C) van P-factor bereid, gesneden en geplaatst op een nieuwe dia naar mini-pads met verschillende feromonen bedragen te genereren. 0,5 pl celsuspensie werd aangebracht op elke mini-pads voor O / N beeldvorming op 5 min intervallen.
In overeenstemming met gepubliceerde resultaten 11, lage P-factor niveaus bevorderde de vorming van dynamische SCD2 zones zonder groei (Figuur 3B, Movie S4), terwijl een hoog niveau van P-factor gestabiliseerd één SCD2 zone, waardoor het induceren Shmoo verlenging van de ene cel pole (FIGUUR 3C, Film S5).
Figuur 1:.. Schematische weergave van het Protocol (A) Schematische beschrijving van de protocollen die worden gebruikt om toezicht te houden kernsplijting gist seksuele lifecycle en (B) naar kernsplijting gist monsters voor te bereiden op de lange termijn imaging Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .
Figuur 2:. Groei en Mating Dynamica van kernsplijting gistcellen verschoven van MSL + N om MSL-N Media (A) epi-fluorescent microfoto van calcofluor gekleurde cellen verschoven naar MSL-N media voor de aangegeven tijd. (B) Procentvan septating (donkerblauwe lijn, n> 300 per tijdstip) en paring (lichtblauwe lijn, n> 300 per tijdstip) cellen verschoven naar MSL-N media voor de aangegeven tijd. (C) Gemiddelde lengte van septating cellen verschoven naar MSL-N media voor de aangegeven perioden (n = 50 per tijdstip behalve 8 uur tijdspunt waarbij n = 20). (D) lengteverdeling van niet-delende cellen verschoven naar MSL-N medium gedurende de aangegeven perioden (n> 200 per tijdstip). (E) Gemiddeld fractie van gefuseerde (donker blauwe lijn), gefuseerd (lichtblauwe lijn) en sporulerende (zwarte lijn) cellen in een populatie van H90 wild-type gist verschoven naar MSL-N media voor de aangegeven perioden en gemonteerd op een agar pad op tijdstip 6 uur (n> 900 cellen per tijdstip uit drie verschillende timelapses). De cellen werden gefuseerd beschouwd indien geen refractieve celwand tussen partners was zichtbaar in de microfoto DIC en de vorming van spore celwand werd gebruikt om te scoren voor sporulating cellen. (F) DIC microfoto paring cellen verschoven naar MSL-N media gedurende de aangegeven tijdsperioden. (G) Koppelen efficiëntie als functie van celdichtheid op agarose pads H90 (donkerblauwe stippen) en h + / h- (lichtblauwe stippen) cellen verschoven naar MSL-N media voor 24 uur. De meest geschikte dichtheid van cellen voor de lange termijn beeldvorming wordt bereikt bij ongeveer 25.000 cellen / mm 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Dynamische lokalisatie van fluorescerende eiwitten tijdens Fission Yeast Mating (A) deconvolved enkele z-vlak epifluorescentie microfoto van cellen met de aangegeven genotypes verschoven van MSL + N om MSL-N media gedurende 6 uur en gemonteerd opMSL-N agarose pad voor de aangegeven tijd. Pijlpunten geven dynamische Myo52-3GFP zones en de pijl wijst Myo52 lokalisatie bij de fusie focus. (B), (C) deconvolved enkele z-vlak epifluorescentie microfoto van cellen met aangegeven genotypes verschoven van MSL + N voor MSL-N media gedurende 4 uur en gemonteerd op MSL-N agarose mini-pads bevattende 0,1 ug / ml (B) of 1 ug / ml (C) van P-factor voor de aangegeven tijd. Pijlpunten geven aan dynamische (B) of stabiele (C) SCD2-GFP zones. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende Movie 1: DIC timelapse van wild-type H90 kernsplijting gist ce LLS dat stikstof-uitgehongerd voor 6 uur voorafgaand aan de beeldvorming waren. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullende Movie 2: . DIC timelapse van wild-type h + en H- splijtingsproducten gistcellen die gemengd en stikstof uitgehongerd gedurende 6 uur voorafgaand aan de beeldvorming waren (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
"> Aanvullende Movie 3: deconvolved enkele z-vlak epifluorescentie en DIC timelapse van h-cellen die Myo52-3GFP van de inheemse locus gemengd met h + cellen die Myo52-tdTomato van de inheemse locus en cytosolische GFP uit de P-cel specifieke map3 promoter . de cellen werden in MSL-N medium gekweekt gedurende 6 uur bij 30 ° C voorafgaand aan de beeldvorming. Overdracht van cytosolische GFP in de h- cel bepaalt de fusie tijd. (klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullende Movie 4: deconvolved enkele z-vlak epifluorescentie en DIC timelapse van H- sxa2 cellen expRessing SCD2-GFP uit zijn natieve promoter behandeld met 0,1 ug / ml P-factor. De cellen werden in MSL-N medium gekweekt gedurende 4 uur bij 30 ºC voor de beeldvorming. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Bijkomende Film 5: . Deconvolved enkele z-vlak epifluorescentie en DIC timelapse H- sxa2 cellen die GFP-SCD2 van zijn natieve promotor behandeld met 1 ug / ml P-factor Cellen werden gekweekt in MSL-N medium voor 4 uur bij 30 ° C voor de beeldvorming. (klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
| YSM995 | h- gew |
| YSM1371 | h + wt |
| YSM 1396 | H90 gew |
| YSM2534 | h- myo52-3GFP :: kanMX |
| YSM2730 | h + myo52-tdTomato :: natMX Pmap3: GFP :: Ura4 + @ ura4locus |
| YSM2731 | h- SCD2-GFP :: natMX sxa2Δ :: kanMX |
Tabel S1: Stammen gebruikt in deze studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eisen aan de omgeving, en de beschikbaarheid van voedingsstoffen in het bijzonder, sterk van invloed op de kernsplijting gist fysiologie. Stikstoftekort is noodzakelijk inzet voor de geslachtelijke voortplanting en aanvankelijk leidt tot opvallende veranderingen in de mitotische celcyclus (Ref. 21 en figuur 2). Na stikstofverwijdering uit exponentieel groeiende bevolking, celgrootte bij deling snel af (figuur 2C) en de meerderheid van de cellen arrestatie mitotische progressie korter dan de lengte van pasgeboren exponentieel gegroeid cellen (Ref. 21 en figuur 2D). Als cellen van tegengestelde voortplantingstypes arresteren progressie van de mitose zij zich bezighouden paring partners en ga aan zygoten en sporuleren (Figuur 2B, 2E, 2F) te vormen. Bij een tweedimensionale monolaag van wildtype cellen dan zestig procent van H90 cellen partner aangrijpen, en bijna alle zullen celfusie (figuur 2G ondergaan (figuur 2G). Een van de belangrijkste aspecten van het protocol tot hoge rendementen paring verkrijgen zodat cellen in de aangegeven dichtheden gehele gehouden. Monitoring van celgrootte en paren efficiëntieparameters zoals getoond in figuur 2 verschaft vervolgens een eenvoudige controle cellen die efficiënt betreden geslachtelijke voortplanting.
Wij merken op dat, aangezien de paring medium gebrek elke stikstofbron (zelfs kleine hoeveelheden van aminozuren en stikstof basen zijn uitgesloten), hoge paring efficiëntie, zoals die weergegeven in figuur 2E en 2G worden alleen verkregen met een volledig prototrofe stammen. Auxotrofe stammen kunnen worden gebruikt, maar vereisen extra zorg aan cellen te allen tijde binnen celdichtheden vermeld in het protocol gehouden. Zelfs met zorg, alleenlagere paring efficiëntie zal worden waargenomen. Paring efficiëntie wordt ook beïnvloed door de temperatuur, lagere efficiënties waargenomen bij verhoogde temperatuur, die het gebruik van temperatuurgevoelige mutant allelen tijdens de paring proces kan beperken.
De hier gepresenteerde methode wordt vooral gebruikt voor lange termijn beeldvorming van fluorescente reporters. Omdat beeldvorming wordt uitgevoerd over een lange tijdsperiode, succesvolle beeldvorming van splijtgist paring sterk afhankelijk van de microscopie setup beschikbaar. Hiervoor moet de stabiliteit van de microscoop opstelling, de gevoeligheid en toegang tot een autofocussysteem kritisch. Ofwel software-gebaseerde of ingebouwde hardware autofocus systemen zijn mogelijk. Bovendien, om de doorvoer te verhogen, een gemotoriseerde fase, waarin multipoint overname is een belangrijke eigenschap.
Beeldkwaliteit wordt beperkt door de eigenschappen van de fluorofoor plaats. De verschillende incubatietijden in vloeibare MSL-N medium beschreven in protocol paragraaf 2.3 zijn gericht op het optimaliseren van fluorescentie op feromoon geïnduceerde gemerkte eiwitten en het minimaliseren van onnodige bleken door beeldvorming alleen paring stadia van belang. Terwijl overvloedige of sterk fluorescent gefocaliseerd gelabelde eiwitten mogelijk overname van honderden tijdstippen in de loop van de gehele levenscyclus van seksuele (Film S3), andere eiwitten zijn een uitdaging om het over zo'n lange tijd als gevolg van foto-bleken. Beeldkwaliteit is ook afhankelijk van de gekozen fluorofoor, typisch een GFP-derivaat. We herhaaldelijk opgemerkt dat sfGFP 17 (superfolder GFP), die plooien met een snelle kinetiek, op voorwaarde dat een superieure signaaloverdracht tijdens de paring proces, mogelijk omdat sterke autofagie induceert snelle omzet eiwit. Belangrijk is, hebben we niet de beschikbaarheid van zuurstof nodig is voor fluorescerend eiwit rijping 17,22 bewaken. Derhalve wordt aanbevolen voorzichtig via fluorescentiemetingen het gehalte eiwitten aanwezig na cellen kwantificeren Mounte zijnd op dia's, of om alternatieve zuurstof doorlaatbare microfluidics apparaten gebruiken om dergelijke experimenten uit te voeren. Bovendien agarose pads gespot met cellen in de avond en bewaard bij 18 ° C O / N zijn zeer nuttig voor het zwakke reporters zijn als zodanig pads bevatten een mengsel van cellen in elke fase van geslachtelijke voortplanting.
Paring in splijtgist niet vertoont synchroniteit en cellen is goed te zien inleiding shmooing naast andere cellen reeds sporulerende (films S1, S2). Dergelijke populatiedynamiek maakt klassieke, bulk biochemische technieken moeilijk te gebruiken, waardoor één cel microscopie hier beschreven werkwijze van keuze. Alle microscopie gebaseerde benaderingen kunnen in principe worden toegepast op cellen die zijn bereid met de hier beschreven protocol. Belangrijker is dat deze benaderingen processen vertonen paring typespecifieke dynamiek zoals cel-celfusie beschreven Dudin en collega 12 volgen. Asymmetrie, mating type verslaggevers controlerenbijzonder bruikbaar (figuur 3A) zijn. Differentiëren tussen beide paren wordt eenvoudig bereikt bij het werken met heterothallisch stammen door gebruik verschillende fluoroforen eiwitten in de h- en h + cellen taggen. Dit is echter niet haalbaar homothallic stammen. Een aanpak voor de differentiëring de mating type H90 cellen te cytosolische fluorescerende eiwitten tot expressie onder controle van mating type promotoren. In het bijzonder werden de promoters van het feromoon receptor genen map3 en mam2 gebruikt om de expressie van GFP of mCherry eiwitten in cellen P en M voor respectievelijk. Bovendien zijn deze merkers toegestaan precieze timing van de cel-celfusie, gevisualiseerd de overdracht van fluorescentiesignaal per partner cel naar de andere.
Mating feromonen zijn cruciaal determinanten voor het doorlopen van verschillende stadia van seksuele voortplanting in gist 11,23. Verschillende niveaus van synthetische feromonen leiden tot verschillende cel polarisatie toestanden in kernsplijting gist (Figuur 3B, 3C en Ref. 11). Het protocol opgenomen bovenstaande kunt evalueren hoe verschillende exogene feromoon niveaus beïnvloeden cel fysiologie. Omdat het feromoon protease Sxa2 snel wordt afgebroken P-factor, een heterothallisch mutante stam waarbij de protease werd verwijderd werd gebruikt om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. In mengsels van cellen van tegengesteld mating, niet alleen het niveau maar ook de ruimtelijke verspreiding van feromonen uitgezonden door een seksuele partner waarschijnlijk belangrijk. Het analyseren van de effecten van feromoon ruimtelijke verdeling op cel respons zal de ontwikkeling van meer geavanceerde opstellingen zoals microfluidics apparaten werkzaam zijn op gist 24,25 nodig.
Samenvattend presenteren we een algemene werkwijze voor langdurige microscopie van seksuele levenscyclus van splijtgist. Kleine aanpassingen aan dit protocol laten research richten op cellulaire reacties in verschillende stadia van de seksuele levenscyclus. De combinatie van deze benadering met enkele cel biochemie gereedschappen en microfluidics apparaten zullen verder bevorderen kernsplijting gist geslachtelijke voortplanting als een krachtige modelsysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
AV werd ondersteund door een EMBO lange termijn postdoctoraal fellowship. Onderzoek in het Martin lab wordt gefinancierd door een ERC Starting Grant (GeometryCellCycle) en een Zwitserse National Science Foundation subsidie (31003A_155944) naar SGM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
