Introduction
İki hücre arasındaki genetik değişim eşeyli üreme merkezi olay olmasına rağmen, hücre farklılaşmasını teşvik ortağı seçimi için izin hücre-hücre füzyonu yürütmek ve genomik istikrarı korumak olaylar zincirinin dayanmaktadır. Böylece cinsel yaşam döngüsü gelişimsel anahtarları ile ilgili biyolojik bir dizi soru incelemek için bir model sistem olarak kendini göstermektedir, fisyon maya bu olguları incelemek için cinsel döngüsü keşfetmek vb dışsal uyaranlara, plazma membran füzyon, kromozom ayrımı, yanıt faydalarını getirir Model sisteminin güçlü genetik, yüksek verimli yaklaşımları ve sofistike mikroskopi köklü. fisyon maya Sex P-hücre ve farklı çiftleşme tipleri M-hücre arasında bir heterotypic olaydır. İki hücre tipleri farklı olarak salgılanan P- üretim ve M-feromonlar, feromon-reseptörleri map3 ve Mam2 yanı sıra feromon-protea için olanlar da dahil olmak üzere genlerin 1,2 bir dizi ifadeses Sxa1 ve Sxa2. Bu yaygın olarak kullanılan H90 suşu olarak Homothallic suşlar, tek genomunda her iki geçme tip genetik bilgi taşıyan ve hücreler (Ref. 3 gözden) mitotik yaşam döngüsü boyunca birleşme tipi anahtarlama karmaşık bir desen geçer. Nadiren veya hiç çiftleşme türünü değiştirmek heterothallic fisyon maya Çoklu izolatlar da yaygın en belirgin, h + N (P-tipi) ve h -S (M-tipi) suşları 4 kullanılmaktadır.
fizyon maya, cinsel yaşam döngüsü içine giriş katı besin yönetmelik altındadır. Sadece azot hasret fisyon maya hücreleri mitotik üreme tutuklama ve bir çiftleşme partneri varlığına işaret ve (Ref. 5 gözden) cinsel döngünün ilave adımlar teşvik etmek yayılabilir feromonlar üretir. Azot yoksunluk gelişimsel anahtarı olarak görev yapar ve e-teşvik çiftleşme Ste11 anahtar transkripsiyonel regülatör de-bastıranferomon reseptörü ve Ferromon üretim genleri 6,7 dahil olmak üzere belirli genleri çiftleşme XPression. Feromon-reseptör nişan ayrıca böylece çiftleşme ortakları arasında pozitif geribildirim feromon üretimin artırılması, Ste11 transkripsiyonel aktivitesini 8-10 artırır reseptör-birleştiğinde protein G-alfa ve aşağı MAPK sinyallerini harekete geçirir. Feromon seviyeleri hücre polarite, Rho-aile GTPaz Cdc42 11 master organizatörü düzenleyerek farklı hücre polarizasyon durumları ikna etmek için çok önemlidir. Düşük feromon konsantrasyonlarına maruz kaldıktan sonra, aktif Cdc42 hücre kenarına keşfetmek dinamik yamalar görüntülenmiştir, ve hücre büyümesi, bu aşamada görülmektedir. Artan feromon düzeyleri tek bölge ve polarize projeksiyon büyümesine Cdc42 aktivitesinin istikrar teşvik temas ortak hücrelerini getiren Shmoo olarak adlandırılan. Daha sonra, iki haploid çiftleşme ortakları diploid zigot oluşturmak için sigorta. Son çalışmalar th ortayaçiftleşme kaynaklı formin FUR1 12 tarafından monte edilir füzyon için gerekli yeni bir aktin yapısının e varlığı. Bu füzyon odak böylece hücre lizizi 12 olmadan plazma zarı temasa izin hücre duvarının biçimlenme sağlayan tip V miyosin sürece bağlı olarak, konsantre ve hücre duvarı bozunma amaçlı konumlandırır. Hücre-hücre füzyon üzerine, çekirdekler temas ve karyogamy geçer. Zigot (at kuyruğu hareket) içindeki çekirdeğin önde gelen bir dynein bağımlı ve geri ileri hareketi daha sonra mayoz tarafından takip edilir kromozom homologlarının 13,14, eşleştirme teşvik etmektedir. Son olarak, mayoz dört ürün sporlanma sırasında bireysel sporların içine paketlenir.
Çünkü onun karmaşıklığı ve ilgili sayısız adımlar, çiftleşme detaylı izleme zorlu olmuştur. İki önemli zorluklar tüm süreci iyi on beş saatten fazla sürdüğünü ve hücrelerin senkronize etmek zor olmasıdır. bu difficulties tek hücreli mikroskopi yaklaşımlarla hile vardır. İşte genel bir protokol fisyon maya cinsel yaşam döngüsü sunulmaktadır araştırmak. küçük ayarlamalar ile, bu protokol sürecinin tüm farklı aşamalarında, çiftleşme gen ürünü olmayan kardeş ortakları çiftleşme tipi anahtarlama sonra kardeş hücreler arasında ve hücre kutuplaşma ve eşleştirme, hücre-hücre füzyon yani indüksiyon çalışmasına izin verir, ve post-füzyon at kuyruğu hareket, mayoz ve sporulasyon. Bu yöntem kolayca görselleştirmek floresan sırasında ve sonrasında füzyon, zaman önceden üzerinde etiketli proteinlerin) 1 olanak sağlar; 2) karşıt çiftleşme Çeşidi hücrelerin davranışını ayırt; ve 3) ölçü ve shmooing, çiftleşme, füzyon ya da sporlaşma verimliliği gibi parametreleri ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
fizyon maya eşeyli üreme Mikroskopi analizi
1. Medya Hazırlık
- Glukoz: 10 g / L, KH 2 PO 4: 1 g / L, NaCl: birbirine karıştırılmasıyla az sporlaşma ortamının (MSL-H) 15 Hazırlama 0.1 g / L, MgSO 4 · 7H 2 A: 0.2 g / L. Ekleme Eser elementler (10,000X): 100 ul / L, vitaminler (1,000x): 1 ml / l ve 0.1 M CaCl2 mL / L. oda sıcaklığında (RT) 0.22 mikron gözenek boyutu filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize.
- Aşağıdaki Vitaminler kullanarak (1,000x) hazır: Pantotenat: 1 g / L nikotinik asit: 10 g / L, inozitol: 10 g / L, Biyotin: 10 mg / l. 4 ° C de 0.22 mikron gözenek boyutlu filtre ve mağaza kullanılarak filtre-sterilize edin.
- Borik Asit: 5 g / L, MnSO 4: 4 g / L, ZnSO 4 · 7H 2 O: 4 g / L, FeCl 2 · 6H 2 O: 2 g / L aşağıdaki İz elementler (10,000X) stok kullanın MoO 3: 0.4 g / L, ki: 1 g / L, CuSO 4· 5H 2 A: 0.4 g / L, Sitrik asit: 10 g / L. 4 ° C de 0.22 mikron gözenek boyutlu filtre ve mağaza kullanılarak filtre-sterilize edin.
- Agaroz 0.2 g MSL-10 ml N birleştirerek MSL-N agaroz (agaroz pedi odaları yapmak için kullanılan)% 2 hazırlayın. mikrosantrifüj tüpleri içinde agaroz çözünene ve kısım 0.5 ml kadar mikrodalga fırında yüksek güçte yaklaşık 2 dakika boyunca eritin. Oda sıcaklığında saklayın.
- 1 g / L, Lösin: 0.225 g / L adenin: 0.225 g / L, urasil: (NH4) 2 SO4 eklenerek nitrojen MSL-N (MSL + H) En az sporlaşma ortamının hazırlanması 0.225 g / l . 0.22 mikron gözenek boyutu filtre kullanarak filtre sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayın.
Not: Lösin, adenin ve urasil oksotropik türlerinin büyümesini sağlamak için bu ortama eklenir. Kullanılan soy (örneğin his3Δ için) ayrı bir oksotrofi taşıyan, ek amino asit takviyesi dahil edilmelidir. Ayrıca tamamen Prototrofuna suşları ile bu işi lütfen unutmayın yalnızca, tavsiye edilirBu tür suşlar yüksek çiftleşme verimlilik sağlayacaktır. - kamara sızdırmazlık için 200 ml valap hazırlayın. beher Lanolin, vazelin (ya da diğer vazelin) ve Parafin eşit ağırlık eklemek. İyice karışana kadar ısı, düşük sıcaklıkta Karışım ara sıra karıştırıldı. Birkaç kültür kaplarına karışımı kısım. Oda sıcaklığında saklayın.
Çiftleşme Deney 2. Kültürleme Fizyon maya cinsleri (Şekil 1).
- 1. Gün, Akşam:
MSL + N 3 ml içeren kültür tüplerine katı ortamdan taze çizgili suşları aşılamak. yaklaşık 2.5 cm çapında düz tabanlı tüpler kullanın. adapte kültür hacmi ile diğer kültür tüpleri veya şişeleri kullanın. gece boyunca inkübe (O / N), 25 ° C, 200 rpm'de çalkalayarak. heterothallic suşları ile çalışıyorsanız, ayrı ayrı aşılamak.- Kültürler optik yoğunluk akşam 0.4-0.8 600 nm (OD 600) ölçülen sahip olmasını sağlamak için ertesi sabah medyada hücre süspansiyonları sulandırmak.
Not:OD fisyon maya hücre konsantrasyonunun bir vekil olarak 600 ölçümleri yaklaşık 0.1-1.0 aralığında doğrusaldır. Bizim spektrofotometre OD 600 = 0.1 ml başına 1.4 x 10 6 hücre karşılık gelir. İlk OD 600 okur Böylece, eğer numuneler güvenilir ölçümler için konsantre / seyreltilmiş gereken bu aralığın dışında bulunmaktadır.
- Kültürler optik yoğunluk akşam 0.4-0.8 600 nm (OD 600) ölçülen sahip olmasını sağlamak için ertesi sabah medyada hücre süspansiyonları sulandırmak.
- 2. Gün, Akşam:
100 ml'lik şişelere 600 = 0.025 OD MSL + N ortam, 20 ml hücreleri seyreltilir. 30 ° C, 200 rpm'de suşları O / N inkübe edin.
Not: Yabani tip hücre kültürleri, OD 600 -0.8 Ertesi sabah (15 saat sonra) ulaşması gerekir. uzun nesil zamanla suşları ile çalışma buna göre seyreltme ayarlayın. - 3. Gün, Sabah:
Kültürler OD 600 ~ 0.8 hücre yoğunluğuna sahip olduğunu doğrulamak için OD 600 ölçün. heterothallic suşları ile çalışıyorsanız, ortak hücrelerinin eşit sayıda karıştırın. 1.5 ml 1.000 xg ve transferi de Pelet hücreleritüp. MSL-N, 1 ml aracı hücreleri üç kez yıkayın. MSL-N orta 3 ml hücreleri yeniden askıya ve = 1.5 OD 600 hücreleri sulandırmak.- doğrudan görüntüleme için hücreler monte kardeş hücreler arasındaki çiftleşme izlemek (Protokol bakın Bölüm 2.4). Çiftleşme tipi anahtarlama azot yoksunluğu sonra meydana gelen mitoz bölünmeler sırasında gerçekleşecek olan homothallic H90 suşları kullanın. agaroz pad üzerinde hücrelerin acil montaj hücre bölünmesi sonrası, kardeş-hücreleri yanyana kalır sağlar.
- Hücre polarizasyon (keşif dinamikleri ve shmooing) monitör 30 ° C, görüntüleme için önceden monte hücrelere 3-4 saat boyunca 200 rpm'de hücre kültürü 1-3 ml kuluçkalanması. Bu 3-4 saat içinde, son mitoz bölünme gerçekleşmiş olacak. Birkaç hücreler kutuplaşma başlatmış, ancak sadece kendi keşif polarizasyon dinamiklerini başlangıç olacaktır çoğu.
- Hücre-hücre füzyon 30 ° C'de hücre kültürü 1-3 ml inkübe izlemek için, 200 rpm'de 4-6 saat PRI içinveya görüntüleme için hücrelerin montaj.
- Ekran Füzyon sonrası olaylar, 30 ° C 'de hücre kültürleri 1-3 ml önce görüntüleme için hücrelerin montaj 8 saat 200 rpm'de inkübe edin.
- (Sadece heterothallic suşlar için) belirli bir feromon konsantrasyonuna yanıtını izlemek için 30 ° C'de hücre kültürü 3 ml inkübe 200 rpm'de 3-4 st için görüntüleme için hücrelerin montaj öncesinde.
- 95 ° C ısıya blok MSL-N-içeren ependorf tüp çıkarın (Protokol bölüm 2.4.1 bakın. Aşağıda). eritilmiş MSL-N agaroz doğrudan istenilen konsantrasyonda P-faktörü veya M-faktörü ekleyin. acil ped hazırlanmasından önce vorteks ile iyice karıştırın.
- Hücre monte edildikten sonra, önce görüntüleme 25 ° C'de 15-30 dakika boyunca pedi inkübe edin. P-faktörü ve M faktörü feromon metanol içinde 1 mg / ml'lik bir stok çözeltisinden kullanılmıştır.
Not: mutant ile çalışan kuluçka süreleri değişebilir suşları edin. hücrelerin Topaklanma sıvı m uzun süreli kuluçkadan sonra ortaya çıkabiliredya ve bazı mutant özellikle güçlü olabilir. Clumped hücreler tek bir katmanda agaroz pabuçlarına gördü ve böylece otofokus ve görüntü zordur edilemez. Kapsamlı hücre topaklanma durumunda hemen yıkamadan sonra agaroz pedleri hücreleri monte ve yeniden süspansiyon azot eksik medya (Protokol Bölüm 2.3.1 gibi.) ve önceki görüntüleme 30 ° C'de inkübe.
- Görüntüleme Hücreleri Montaj:
- 10-15 dakika boyunca 95 ° C ısıya-blok bir kısım eritilmesi ve aralama (Şekil 1B) ile ayrılmış iki cam slaytlar arasında 200 ul ilave edilerek MSL-N- agaroz pedleri 16 hazırlayın. ~ 0.5 mm bir kalınlığı olan tutucular kullanın. ara parçalar yapmak için, kullanım şeritleri gibi kısıtlama enzimleri ile teslim edilene, karton kesip.
- 1 dakika boyunca 1.000 xg'de hücrelerin 100 ul Pelet süpernatant kaldırmak ve artık 2-4 ul ortamda hücrelerin yeniden askıya. o gecikmeler olarak yapmayın taze ortamda yeniden askıyaçiftleşme.
- 2-3 dakika sonra dikkatlice spacers ve üst cam slayt kaldırmak. birçok suşu monte edilecek ise, hücre agaroz pedi hazırlamadan önce konsantre hazırlanır.
- pad Hücrelerin 1 ul ekleyin ve açılan kapak kayma ile kaplama ve valap ile sızdırmazlık önce (~ 1 dk) kurutma başlayana kadar bekleyin.
- ped 25 ° C veya oda sıcaklığında görüntüleme önce en az 30 dakika bekletin.
- Çiftleşme çeşitli aşamalarında bir hücre karışımı elde edilir, MSL-N- (Bölüm 2.3.) 'de yıkamadan sonra hemen ped yapmak ve 18 ° CO / N (~ 15 saat) inkübe edilir. Bu yaklaşım zayıf sinyal ile yüksek temporal çözünürlük veya örnekleri ile farklı çiftleşme aşamalarında görüntüleme hücreleri için yararlıdır.
Çiftleşme Maya Hücreleri 3. Canlı hücre Görüntüleme
- Resim Alma Ayarları ayarlayın.
Not: Burada sunulan görüntü alma ayarları özelleştirilmiş Olympus IX-71 oluşan DeltaVision platformu için optimize edildiPlanı Apo 60X / 1.42 NA veya U-Planı Apo 100X / 1.4 NA hedefleri, bir CoolSnap HQ2 kamera ve bir Insight SSI 7 renk kombine ünite aydınlatıcı ile inverted mikroskop. Donanım aynı zamanda dijital otofokus sağlayan softWoRx v4.1.2 tarafından kontrol edilir.- uzun süre boyunca Z-sürüklenme yazılım otomatik odaklama sisteminin kapasitesini aşacak beri otomatik netleme aralıkları 15 dakika aşmamasını emin olun. Bir donanım tabanlı otomatik netleme sistemi kullanıyorsanız, büyük aralıkları kullanın.
- Görüntüleme aralığını ayarlayın. floresan ilk kez protein etiketlenmiş bir ile çalışırken bir başlangıç noktası olarak 15 saat ~ için görüntüleri her 10 dakika sürer. Bu aralık geniş beyazlatma olmadan tüm çiftleşme sürecinin iyi bir bakış sağlar.
- Böyle füzyon olarak daha doğrusu zaman olaylara 5 dk aralıklarla veya daha kısa Image. Kısa aralıklarla düşük pozlama süreleri ve küçük ağartma sağlayan güçlü fluorophores gerektirir. 1 dk önlemek O / N mikroskobu altında aralıklarla görüntülemeProtokol, Bölüm 2.4.6 ayrıntılı olarak ve bunun yerine tüm birleşme aşamalarının bir karışım hazırlanması.
- görüntü pozlama süresini ayarlayın. 50 ile 300 milisaniye arasında test poz süreleri. (Tipik olarak 100'ün üzerinde) bir ayırt sinyali ile zaman noktalarında çok sayıda elde etmek için sinyal-gürültü oranı ve photobleaching arasında bir denge amaçlamaktadır.
- Z-bölümlendirilmeleri ayarlayın. Bölümler her 0,3 mikron kapsayan 5 mikron iyi bir görüntüleme derinliği sağlamak. (- Toplam örnek derinliğinin tek süpürme toplama optik eksen entegrasyonu) OAI kullanılarak minimize edilebilir Z-kesit daha da artar foto-hasar, unutmayın. İyi otomatik odaklama sistemi birçok Z-bölümleri ihtiyacını azaltır ve şiddetle tavsiye edilir.
- İpuçları Çiftleşme Tipi özgü Davranışları Eğitim için:
- Heterothallic suşlar için, H-kullanımı ve iki hücre türünün ayırt edilebilir şekilde, H + hücreleri, tat florofor ifade. herhangi bir genetik olarak kodlanmış fluoropho kullanınBiz sfGFP, GFP 17 hızlı bir katlama varyantı ile iyi bir başarı elde ettiler ama, bir endojen protein sitozolik sürümü veya füzyon olarak ifade yeniden. Endojen proteinler genellikle homolog rekombinasyon 14 kendi endojen genomik loküsündeki etiketlenir.
- Homothallic suşlar için sırasıyla P ve M hücrelerinde ekspresyonu hızlandırmak için bu feromon reseptör genleri MAP3 ve mam2 olanlar gibi birleşme tipi özel promotörlerin kontrolü altında bir genetik olarak kodlanmış sitosolik floresan proteini ifade eder. Map3 ve mam2 destekleyicileri vejetatif büyüme sırasında etkin değildir ve azot açlık 18,19 üzerine uyarılmaktadır. Bu promoterlerin kontrolü altında sitosolik GFP veya mCherry ekspresyonunu yapılar genel olarak cinsel ömrü 12 normal ilerlemesine müdahale etmeyen genomik lokus (ura4, leu1) entegre edilir.
Çiftleşme ve Fusion Efficiencies 4. sayısallaştırılması
- Yukarıda adım 2.3.1 deki gibi, MSL-N agaroz pabuçlarına yıkama doğrudan MSL-N sonra çiftleşme ve füzyon verimliliği 11,12, nokta hücrelerini ölçmek ve 25 ° C öncesinde görüntüleme (Şekil 1A) 24 saat bırakın. Bu homothallic vahşi tip suşu birleşme etkinliği ulaşır protokolü ~% 60 füzyon etkinliğini% 99 kullanılması. mutant gözlenen bu değerlerde herhangi bir azalma bir terminal fenotip veya gecikme yansıtmak olmadığını test etmek için bir 36 saat inkübasyon süresi ile deneyi tekrar.
- olarak çiftleşme verimliliğini hesaplamak
Çiftleşme çiftleri identifiye zigot, asci, ve kaynaşmamış hücre çiftleri içerirHer başkalarına karşı kendi konumunu ve büyüme. - gibi füzyon etkinliğini hesaplayın
Not: bitişik eşleşme çiftleri çalışma altında mutant sporulasyonunu etkilemediğini biliniyorsa spor oluşturmayan kabiliyetleri ile tanımlanır. sporülasyon okuma olarak kullanılamaz ise füzyon her iki partner içine sadece bir birleşme ortağı ile ifade sitozolik markör yayılmasını gözlemleyerek belirlenmiştir.
Çiftleşme çiftleri identifiye zigot, asci, ve kaynaşmamış hücre çiftleri içerirHer başkalarına karşı kendi konumunu ve büyüme. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir Azot Kaynak çıkarması üzerine Fisyon Maya Büyüme ve Çiftleşme Dinamikleri
Azot açlık füzyon maya cinsel üreme başlatılması için bir ön koşul olarak, vahşi tip homothallic H90 suşu, Şekil 1 'de tarif edilen protokol izlenerek, azot bakımından zengin azot yoksun ortama (Şekil 2) kayması üzerine izlenmiştir. Kısaca açıklamak gerekirse hücreler MSL + N ortam içerisinde üstel faz (OD = 0.5 600) O / N yetiştirilen toplandı, yıkandı ve son OD 600 = 1.5 MSL-N, sıvı bir ortam içinde yeniden süspansiyon haline edildi. Hücrelerin her 2 saat alikotları lekeli kalkoflor-ve (- D Şekil 2A) görüntülendi idi.
Kalkofluor boyama (Şekil 2A), azot bakımından zengin bir ortam içinde ~ hücrelerin% 21 septating olduğunu ortaya koymuştur (n> 300, Şekil 2B) ve Divi ortalama hücre boyuyon 15.2 ± 1.4 um (n = 50, Şekil 2C) idi. Bölünmeyen hücrelerin geniş bir hücre uzunluklarının dağılımı (n> 200, Şekil 2D 8-14 um) göstermektedir. Ancak, iki saat MSL-N ortamına vardiyadan sonra daha kısa 9 mm (n> 200 Şekil 2B) olan hücrelerin% 60'ın üzerinde olmayan bölünen hücrelerin uzunluğu dağılımında bir köklü değişiklik vardı. Hücre septum oluşumu aynı zamanda 9.8 ± 0.8 mikron (n = 50, Şekil 2A, 2C) boyu tespit edildi. MSL-N artış olarak bölünmeyen ve bölünen hücreleri hem de uzunluk olarak bir başka azalma zaman olarak gözlenmiştir. Nitekim, 8 saat sonra kültür septum oluşumu endeksi% 2 (n> 300) altına düşmüştür ve hücrelerin% 85'inden fazlası uzunlukları daha kısa 7 mikron (n> 200 Şekil 2B) kendi hücre döngüsünü tutuklandı.
Hücreler sıvı MSL-N vardiyadan sonra eşleyen dört saat çiftleşme oluşmaya başladıortamı (<% 1, Şekil 2A). Daha sonra (n> 200, Şekil 2B) çiftleşme çifti sayısı hızla artmış ve hücrelerin vardiya% 10 sonra 8 saat bir çiftleşme ortağı meşgul.
eşleşme dinamikleri izlemek için, 6 saat açlıktan indüksiyondan sonra, hücrelerin bir tümböleni, aynı zamanda görüntüleme için MSL-N agaroz ped üzerine monte edilmiştir. Hücreler görünürde herhangi bir senkronizasyonu (Film S1) olmadan sonraki 21 saat içinde shmooing, füzyon ve sporulasyon (Şekil 2E, 2F) uygulandı. Bir tek tabakalı (Şekil 2G ve Film S1) yoğun yerleştirildiğinde hücrelerinin% 60'ın üzerinde olan görüş belirli bir alanda göreli konumunu ve hücrelerin yoğunluğuna bağlı çiftleşme verimlilik, bir ortak meşgul.
Vahşi tip heterothallic H + ve H bölünmüş maya suşları da aynı protokole tabi tutulduAzot giderme esnasında bir bire bir oranında H + ve H hücreleri karıştırılarak n ek bir adım. Benzer açlık ve çiftleşme dinamikleri gözlenmiştir, ancak çiftleşme verimlilik (Şekil 2G, Film S2) biraz daha düşük oldu.
Çiftleşme Fission Maya Hücreleri Floresan Takip edilen Proteinler Dinamikleri Kontrolü
Yerel lokusundan Myo52-3GFP ifade eden hücrelerin çiftleşme tip V miyozin Myo52 (Ref 20) dinamiklerini izlemek için, katlanarak büyüyen h- hücreler H + hücreleri Benzer P Myo52-tdTomato, hem de sitosolik GFP ifade ile karıştırılmıştır belirli map3 destekleyicisi cell. Hücre süspansiyonu MSL-N ortamı içinde seyreltilmiş ve 30 ° C 'de 6 saat süre ile inkübe edildi, yıkandı, montaj hücrelere 200 rpm'de önce 10 dakika aralıklarla O / N görüntüleme için MSL-N agaroz pabuçlarına.
Daha önce 11,1 raporHücre korteks boyunca 2 Myo52 başlangıçta oluşan dinamik bölgeleri (Şekil 3A, ok uçları ve Film S3). Myo52 sinyal daha sonra sadece h + h hücreye sitozolik GFP sinyal transferi ile görüntülendi füzyon olayı, daha önce tek bir odakta (Şekil 3A, oklar ve Film S3) stabilize edildi (Şekil 3A ve Film S3) . Myo52-tdTomato sinyali de kendi genişleme sırasında füzyon boynunda görülebiliyor fakat zigot sporlanma (Şekil 3A ve Film S3) için ilerledi olarak hiçbir fark sinyal açıktı.
Dış Feromonlar maruz kalan Heterothallic Fisyon Maya Hücreleri Davranışı İzleme
Duyarsızlaştırma P-faktörü alçaltır Sxa2 proteaz eksik Heterothallic h- hücreleri kolayca sentetik P-faktörüne yanıt. bir h- 11 için bir marker olarak Scd2-GFP ifade sxa2Δ soyu, buna göre tarif edilen protokole, MSL + N ortamı içinde büyütülmüştür. Hücreler, MSL-N ortamında yıkanır ve 30 ° C 'de 4 saat süre ile inkübe edildi. Metanol (gösterilmemiştir verileri), 0.1 ug / ml (düşük feromon, Şekil 3B) ya da 1 ug / ml ihtiva eden MSL-N agaroz pedleri (yüksek feromon, Şekil 3C) p-faktörü kesme hazırlanmış ve yeni bir slayt üzerinde konumlandırılmış farklı feromon miktarlarda içeren mini pedleri oluşturmak için. Hücre süspansiyonu, 0.5 ul 5 dakika aralıklarla O / N görüntüleme için her bir mini yastıkları üzerine monte edilmiştir.
P-faktörü yüksek düzeyde böylece bir hücre direğe yerden Shmoo uzama uyaran, tek bir Scd2 bölge stabilize ederken yayınlanan sonuçlarla 11 ile uyumlu olarak, düşük P-faktör düzeyleri, büyüme (Şekil 3B, Film S4) olmadan dinamik Scd2 bölgelerinin oluşumunu teşvik (FŞEKIL 3C, Film S5).
Şekil 1:.. Protokolün şematik Temsil (A) uzun vadeli görüntüleme için fisyon maya örnekleri hazırlamak için fisyon maya cinsel yaşam döngüsü ve (B) izlemek için kullanılan protokoller şematik açıklaması bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız .
Şekil 2:. MSL-N Media MSL + N Shifted Fisyon Maya hücrelerinin büyüme ve Çiftleşme Dinamikleri kalkoflor lekeli hücrelerin (A) Epifloresans mikrograflar zaman belirtilen süreler için MSL-N medya kaymıştır. (B) Yüzdeseptating (koyu mavi çizgi, n timepoint başına> 300) ve çiftleşme (açık mavi çizgi, n timepoint başına> 300) hücreleri zaman belirtilen süreler için MSL-N medya kaymıştır. Septating hücrelerinin (C) ortalama uzunluğu zaman belirtilen süreler (n = timepoint 50 saatlik zaman, n = 20 8 hariç) için MSL-N ortam kaydı. Bölünmeyen hücreler (D) uzunluğu dağılımı zaman belirtilen süre (zaman noktası başına> 200) MSL-N ortamına kaydı. (E) sigortasız (koyu mavi çizgi) Ortalama fraksiyonu, erimiş (açık mavi çizgi) ve H90 vahşi tip maya nüfusu hücreleri (siyah çizgi) sporlanan zaman belirtilen süreler için MSL-N medya kaymıştır ve zaman noktası 6 saat (üç farklı zaman atlamalarını gelen bir zaman noktasında başına> 900 hücre) bir agar ped üzerine monte edilir. Hücreler ortaklar arasında hiçbir kırılma hücre duvarı sp adına skoru kullanıldı DIC mikrograflar ve spor hücre duvarının oluşumunda gözle görülür iken sigortalı kabul edildihücrelerin orulating. Eşleşme hücreleri (F) DIC mikrograflar zaman belirtilen süreler boyunca MSL-N ortam kaydı. H90 (koyu mavi noktalar) agaroz pedleri hücre yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak (G) karşı etkinliği ve H + / H- (açık mavi noktalar) hücreler 24 saat boyunca MSL-N ortam kaydı. Uzun vadeli görüntüleme için hücrelerin en uygun yoğunluk / mm2 yaklaşık 25.000 hücreleri elde edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Belirtilen genotipli hücrelerinin floresan proteinleri dinamik lokalizasyonu Fizyon Mayası çiftleşme sırasında (A) deconvolved tek bir z düzlemi epifloresans mikrografları 6 saat MSL-N ortamına MSL + N kaymıştır ve üzerine monteBelirtilen süre MSL-N agaroz ped. Ok uçları, dinamik Myo52-3GFP bölgeleri gösterir ve ok füzyon odakta Myo52 yerelleştirme işaret etmektedir. (B) belirtilen genotip hücrelerin (C) deconvolved tek bir z-düzlemi epifloresans mikrograflan (B), 4 saat MSL-N ortamına MSL + N kaymıştır ve 0.1 ug / ml ihtiva eden MSL-N agaroz mini yastıkları üzerine monte ya da 1 ug belirtilen zaman için P-faktörü / ml (C). Ok uçları dinamik (B) veya stabil (C) Scd2-GFP bölgelerini gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Film 1: yabani tip H90 fisyon maya ce DIC timelapse rf azot hasret önce görüntüleme 6 saat boyunca olduğunu. (Sağ indirmek için tıklayın).
Ek Film 2: . Karma ve azot hasret önce görüntüleme 6 saat vardı yabani tip h + ve h fisyon maya hücrelerinin DIC timelapse (Sağ indirmek için tıklayın).
"> Ek Film 3: h + hücreler P-hücre spesifik map3 promotör yerli lokus ve sitozolik GFP gelen Myo52-tdTomato ifade ile karışık deconvolved tek z-düzlemi Epifloresans ve yerli mahainden Myo52-3GFP ifade h- hücrelerin DIC timelapse Hücreler 30 ° C'de 6 saat MSL-N ortamında büyütülmüştür. görüntüleme önce. h- hücreye sitozolik GFP transferi füzyon süresini belirler. (Sağ indirmek için tıklayın).
Ek Film 4: deconvolved tek z-düzlemi Epifloresans ve h sxa2 hücreleri exp DIC timelapsedoğal promotöründen basım ile Scd2-GFP 0.1 ug / ml p-faktörü ile muamele edilmiştir. Hücreler, görüntüleme önce 30 ° C 'de 4 saat MSL-N ortamı içinde büyütülmüştür. (sağ indirmek için tıklayın).
Ek Film 5: . Deconvolved tek bir z düzlemi epifloresans ve 1 ug / ml p-faktörlü hücre ile tedavi, kendi yerli destekçisi arasında Scd2-GFP ifade H- sxa2 hücrelerin DIC zaman atlama 30 ° C'de 4 saat MSL-N ortamında büyütülmüştür görüntüleme önce. (Sağ indirmek için tıklayın).
| YSM995 | h- ağırlık |
| YSM1371 | h + ağırlıkla |
| YSM 1396 | H90 ağırlıkça |
| YSM2534 | h- myo52-3GFP :: KanMX |
| YSM2730 | h + myo52-tdTomato :: natMX Pmap3 GFP :: ura4 + 'ura4locus |
| YSM2731 | H scd2-GFP :: natMX sxa2Δ :: KanMX |
Tablo S1: Bu Çalışmasında Kullanılan suşlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çevresel koşullar, ve besin kullanılabilirlik, özellikle güçlü fisyon maya fizyolojisini etkiler. Azot açlık eşeyli üreme bağlılık için gerekli olan ve başlangıçta mitoz hücre döngüsü ilerlemesinde çarpıcı değişiklikler (Ref. 21 ve Şekil 2) yol açar. Katlanarak büyüyen nüfus azot giderimi üzerine, bölünme sırasında hücre boyutu hızla (Şekil 2C) azalır ve hücrelerin çoğunluğu yeni doğmuş katlanarak büyüdü hücreleri (Ref. 21 ve Şekil 2B) uzunluğundan daha kısa mitotik ilerlemesi tutuklama. Ters çiftleşme tipleri hücreleri mitotik ilerlemesi tutuklama onlar ortakları çiftleşme meşgul ve zigot ve sporlanmalanna (Şekil 2B, 2E, 2F) oluşturmak için devam edin. H90 hücrelerinin yüzde altmış üzerinde vahşi tipli hücreler iki boyutlu bir tek tabaka durumunda, hücre füzyonu (Şekil 2G geçmesi neredeyse tüm bir ortak meşgul olacak ve (Şekil 2G) bağlıdır. yüksek çiftleşme verimi elde etmek için protokolün en kritik yönlerinden biri hücreleri boyunca belirtilen yoğunlukları içinde tutulmasını sağlamaktır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, hücre boyutu ve çiftleşme verimlilik parametreleri izlenmesi, daha sonra hücreleri verimli seksüel reprodüksiyon girerken basit bir kontrol sağlar.
Biz Şekil 2E ve 2G sunulan olanlar gibi yüksek çiftleşme verimliliği sadece tam prototrofik suşlar ile elde edilir, orta eksikliği herhangi bir azot kaynağı çiftleşme beri (amino asitler ve bazlar azot bile düşük miktarda hariç), unutmayın. Oksotropik türleri kullanılabilir, fakat hücre protokolde belirtilen hücre yoğunlukları içinde tutulur, her zaman olduğundan emin olmak için özel dikkat gerektirir edilebilir. Hatta dikkatli, sadeceAlt çiftleşme verimleri görülecektir. Çiftleşme verimliliği de birleşme işlemi sırasında ısıya duyarlı bir mutant alleli kullanımını kısıtlayabilir yüksek sıcaklıkta görülen düşük verim ile, sıcaklık etkilenir.
Burada sunulan yöntem, öncelikle floresan gazetecilere uzun vadeli görüntüleme için kullanılır. görüntüleme uzun bir süre boyunca yapıldığından, fisyon maya çiftleşme başarılı görüntüleme mevcut mikroskopi kurulum son derece bağlıdır. Bunun için, bir otofokus sistemine mikroskop set-up, duyarlılığı ve erişim istikrar çok önemlidir. Ya yazılım tabanlı veya yerleşik donanım otofokus sistemi mümkündür. Buna ek olarak, çoklu satın alma sağlayan bir motorlu sahne başka önemli kalite, verimi arttırmak için.
Görüntüleme kalitesi ilgi fluorofor özellikleri ile sınırlıdır. Protoco ayrıntılı sıvı MSL-N ortam içinde ayrı bir inkübasyon süreleril Bölüm 2.3 feromon kaynaklı etiketli proteinler üzerinde floresan optimize ve ilgi sadece çiftleşme aşamaları görüntüleme gereksiz ağartma en aza indirmeyi hedeflemektedir. Bol ya da çok floresan odaklanmış ve etiketli proteinler tüm cinsel yaşam döngüsü (Film S3) boyunca zaman noktalarında yüzlerce edinimi izin verirken, diğer proteinler nedeniyle foto-ağartma böyle uzun süre boyunca görüntü zorlu. Görüntü kalitesi de seçilen fluorofor, tipik bir GFP türevi bağlıdır. Biz defalarca hızlı kinetik ile kıvrımlarının sfGFP 17 (superfolder GFP), güçlü otofaji hızlı protein ciro neden olur muhtemelen çünkü çiftleşme sürecinde üstün bir sinyal sağladığı görülmektedir. Daha da önemlisi, biz floresan protein olgunlaşması 17,22 için gerekli oksijen kullanılabilirliğini izlemek vermedi. Bu nedenle, Mounte olan hücreler daha sonra ifade edilen proteinlerin seviyelerini ölçmek için floresans ölçümleri kullanılarak dikkatli olması tavsiye edilirSlaytlarınıza d, ya da bu tür deneyler için alternatif oksijen geçirgen Mikroakiskan cihazları kullanmak için. Buna ek olarak, agaroz pedleri akşam hücrelerle tespit ve pedler, cinsel üreme tüm aşamalarında hücreleri bir karışımını ihtiva gibi görüntü zayıf gazetecilere çok yararlı olmuştur 18 ° C O / N tutulur.
Fisyon mayada Çiftleşme senkron sergilemeyen ve hücreler hali hazırda başka hücrelerin önceden (filmler S1, S2) sporlanan birlikte shmooing başlatılması görülebilir. Böyle bir populasyon dinamiği seçim yöntemi burada açıklanan tek hücre mikroskopi yapma, kullanmak için klasik, toplu biyokimyasal teknikler güçleştirmektedir. Tüm mikroskopi bazlı yaklaşımlar, ilke olarak burada tarif edilen protokol ile hazırlanan hücrelere uygulanabilir. Önemli olarak, bu yaklaşımlar, Dudin ve arkadaşları 12 tarafından tarif edilen hücre-hücre füzyon olarak tip spesifik dinamikleri çiftleşme sergileyen işlemleri izleyebilir. asimetri, çiftleşme tipi gazetecilere izlemek içinözellikle yararlı (Şekil 3A) olmuştur. H- proteinleri ve H + hücreleri etiketlemek için tat florofor kullanılarak heterothallic suşlar ile çalışırken, iki eş türleri arasındaki ayırt kolayca elde edilir. Bununla birlikte, bu homothallic suşlarına mümkün değildir. H90 hücrelerinin eş türünü ayırt etmek için geliştirilmiş bir yaklaşım, birleşme tipi özel promotörlerin kontrolü altında sitozolik floresan proteinleri ifade etmektir. Özellikle, feromon reseptör genleri MAP3 ve mam2 promoterleri, sırasıyla P GFP ya MCherry proteinleri ve M hücrelerinde ekspresyonunu tahrik etmek için kullanıldı. Bundan başka, bu belirteçler diğer bir ortak hücreden flüoresan sinyal verme olarak görüntülenmiştir, hücre-hücre füzyon kesin zamanlama, evcil.
Çiftleşme feromonlar, maya 11 eşeyli üreme farklı aşamalardan ilerliyor için çok önemli belirleyiciler23. Fisyon maya belirgin hücre polarizasyon devletler (Şekil 3B, 3C ve Ref. 11) sentetik feromon kurşun Farklı düzeylerde. Yukarıdaki protokol dahil farklı eksojen feromon düzeyleri hücre fizyolojisini nasıl etkilediğini değerlendirmek sağlar. feromon proteaz Sxa2 hızlı p-faktörü, proteaz yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için kullanılmıştır silinen bir heterothallic mutant suşu düşürür. Bununla birlikte, tersi birleşme tipleri, sadece seviyeleri, aynı zamanda bir birleşme ortağı ile yayılan feromonlar uzaysal dağılımının hücre karışımları önemli olması muhtemeldir. Hücre yanıtı üzerine feromon mekansal dağılımının etkilerini analiz etmek; maya 24,25 tomurcuklanan istihdam Mikroakiskan cihazları gibi daha karmaşık kurulumları geliştirilmesini gerektirecektir.
Özet olarak, füzyon maya cinsel ömrü uzun süreli mikroskopi için temel bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokole küçük ayarlamalar resear izinch cinsel yaşam döngüsünün farklı aşamalarında hücresel yanıtları odaklanmak. Tek hücre biyokimya araçları ve Mikroakiskan cihazları ile bu yaklaşımı birleştiren daha güçlü bir model sistem olarak fisyon maya cinsel üreme teşvik edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
AV bir EMBO uzun vadeli doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir. Martin laboratuarda araştırma bir ERC Başlangıç hibe (GeometryCellCycle) ve SGM bir İsviçre Ulusal Bilim Vakfı hibe (31003A_155944) tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
