Introduction
Selvom genetisk udveksling mellem to celler er den centrale begivenhed i seksuel reproduktion, den bygger på en kæde af begivenheder, der fremmer celle differentiering, tillader partner valg, udføre celle-celle fusion og opretholde genomisk stabilitet. Således seksuelle livscyklus præsenterer sig selv som et modelsystem til at studere en række biologiske spørgsmål vedrørende udviklingsmæssige kontakter, reaktion på ydre stimuli, plasmamembranen fusion, kromosom adskillelse osv Exploring fission gær seksuelle cyklus for at studere disse fænomener bringer fordelene ved model systemets kraftfulde genetik, veletableret high-throughput tilgange og sofistikeret mikroskopi. Sex in fission gær er en heterotypisk begivenhed mellem en P-celle og en M-celle af distinkte parringstyper. De to celletyper differentielt udtrykker en række gener, 1,2 inklusive dem til produktion af det udskilte P- og M-feromoner, feromon-receptorer Map3 og Mam2 samt feromon-proteases Sxa1 og Sxa2. Homothallic stammer, såsom den almindeligt anvendte H90-stamme, bære den genetiske information for begge samvirkende typer i samme genom og celler undergår et komplekst mønster af parring typeskift hele mitotiske livscyklus (gennemgået i Ref. 3). Flere isolater af heterothallic fission gær, der sjældent eller aldrig skifte parring type er også almindeligt anvendt 4, mest fremtrædende h + N (P-type) og h -S (M-type) stammer.
I fission gær, indtræden i seksuelle livscyklus er under streng ernæringsmæssige regulering. Kun nitrogen-hungrende fission gærceller arrestere mitotisk reproduktion og producere diffunderbare feromoner at signalere tilstedeværelsen af en parring partner og fremme yderligere trin i den seksuelle cyklus (revideret i ref. 5). Nitrogen afsavn de-undertrykker den centrale transkriptionel regulator af parring Ste11 der fungerer som en udviklingsmæssig switch og fremmer eXPRESSION af parring specifikke gener, herunder feromon receptoren og feromon produktionsanlæg gener 6,7. Pheromone-receptor engagement aktiverer receptor-koblede protein G-alfa og nedstrøms MAPK signalering, som yderligere forbedrer Ste11 transkriptionel aktivitet 8-10, og dermed øge feromon produktion i en positiv feedback mellem parring partnere. Feromon niveauer er afgørende for at fremkalde forskellige celle polarisering tilstande ved at regulere mester arrangør af cellepolaritet, Rho-familien GTPase Cdc42 11. Ved udsættelse for lave koncentrationer feromon, er aktiv Cdc42 visualiseret i dynamiske patches udforske cellens periferi, og der ikke observeres cellevækst på dette tidspunkt. Øgede feromon niveauer fremmer stabiliseringen af Cdc42 aktivitet til en enkelt zone og vækst af en polariseret projektion, betegnet shmoo, som bringer partner celler i kontakt. Efterfølgende de to haploide samvirkende parter fusionerer til dannelse af en diploid zygote. Nyere arbejde afslører the eksistensen af en ny actin struktur afgørende for fusion, der er samlet ved parring-induceret formin FUS1 12. Denne fusion fokus koncentrerer type V myosin afhængige processer og positionerer cellevæggen nedbrydning maskiner, hvilket således tillader ombygning af cellevæggen at tillade plasmamembran kontakt uden cellelysis 12. Ved celle-cellefusion, kernerne kommer i kontakt og undergår karyogamy. En fremtrædende dynein-afhængig back-og-tilbage bevægelse af kernen inde i zygote (hesten-halebevægelse) fremmer derefter parringen af kromosom homologer 13,14, som efterfølges af meiose. Endelig er de fire produkter af meiose emballeret i individuelle sporer under sporedannelse.
På grund af sin kompleksitet og de mange trin involveret, har detaljeret overvågning af parring været udfordrende. To bemærkelsesværdige vanskeligheder er, at hele processen tager godt over femten timer, og at celler er vanskelige at synkronisere. Disse difficulties omgås ved encellede mikroskopi tilgange. Her en generel protokol til at undersøge den seksuelle livscyklus i fission gær præsenteres. Med mindre justeringer, denne protokol tillader undersøgelse af alle de forskellige trin i processen, nemlig induktion af parring genproduktet, celle polarisering og parring mellem søster-celler efter parring typen skift og mellem ikke-søster partnere, celle-celle fusion, og efter fusion horse-tail bevægelse, meiose og sporulering. Denne metode gør det muligt at 1) let visualisere fluorescens mærkede proteiner over tid præ-, under og post-fusion; 2) diskriminerer opførslen af celler med modsat parringstype; og 3) måle og kvantificere parametre som shmooing, parring, fusion eller sporedannelse effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mikroskopi analyse af fission gær seksuel reproduktion
1. Medier Forberedelse
- Forbered Minimum sporulationsmedium (MSL-N) 15 ved at blande følgende komponenter: Glucose: 10 g / l, KH 2 PO 4: 1 g / l, NaCl: 0,1 g / l, MgSO4 · 7H 2 O: 0,2 g / L. Tilføj sporstoffer (10.000 X): 100 pl / L, Vitamin (1.000 x): 1 ml / l og 0,1 M CaCl 2 ml / L. Filter-sterilisere anvendelse af et 0,22 um porestørrelse og opbevares ved stuetemperatur (RT).
- Brug følgende Vitaminer (1.000 x) lager: pantothenat: 1 g / l, nikotinsyre: 10 g / l, Inositol: 10 g / l, Biotin: 10 mg / l. Filter-sterilisere anvendelse af et 0,22 um porestørrelse og opbevares ved 4 ° C.
- Brug følgende Sporstoffer (10.000 x) lager: borsyre: 5 g / l, MnSO4: 4 g / L, ZnSO4 · 7H 2 O: 4 g / l, FeCl 2 · 6H 2 O: 2 g / l , MoO 3: 0,4 g / l, KI: 1 g / l, CuSO4· 5H 2 O: 0,4 g / l, Citric Acid: 10 g / l. Filter-sterilisere anvendelse af et 0,22 um porestørrelse og opbevares ved 4 ° C.
- Forbered MSL-N Agarose 2% (anvendt til at fremstille agarose pad kamre) ved at kombinere 10 ml MSL-N med 0,2 g agarose. Smelt for ~ 2 minutter ved høj effekt i en mikrobølgeovn, indtil agarose opløser og alikvote 0,5 ml i mikrocentrifugerør. Opbevar ved stuetemperatur.
- Forbered Minimum sporulationsmedium med nitrogen (MSL + N) fra MSL-N ved tilsætning (NH4) 2SO 4: 1 g / l, leucin: 0,225 g / l, adenin: 0,225 g / l, uracil: 0,225 g / l . Filter-sterilisere anvendelse af et 0,22 um porestørrelse. Opbevar ved stuetemperatur.
Bemærk: Leucin, adenin og uracil tilsættes til dette medium for at tillade vækst af auxotrofe stammer. Yderligere aminosyrer supplement bør indgå, hvis anvendte stamme bærer en særskilt auxotrofi (f.eks his3Δ). Bemærk også, at arbejdet med fuldt prototroph stammer anbefales, da kunsådanne stammer vil tillade høj parring effektivitet. - Forbered 200 ml VALAP for kammer forsegling. I et bægerglas tilsættes lige store vægte af Lanolin, vaseline (eller anden vaselin) og paraffin. Heat blanding ved lav temperatur og rør en gang imellem indtil grundigt blandet. Alikvot blandingen i flere små petriskåle. Opbevar ved stuetemperatur.
2. Dyrkning Fission gærstammer til parring eksperimenter (figur 1).
- Dag 1, Aften:
Podes frisk stribede stammer fra faste medier i kultur rør indeholdende 3 ml MSL + N. Brug fladbundede rør med ca. 2,5 cm i diameter. Brug andre kultur rør eller kolber med tilpasset kultur volumen. Inkuber natten over (O / N) under omrystning ved 25 ° C, 200 rpm. Hvis du arbejder med heterothallic stammer, pode separat.- Fortynd cellesuspensioner i medierne den følgende morgen at sikre, at kulturer har optisk densitet målt ved 600 nm (OD600) af 0,4-0,8 om aftenen.
Note:OD 600 målinger som en proxy for celle koncentration for fission gær er lineære i området på ca. 0,1-1,0. Til vores spektrofotometer OD600 = 0,1 svarer til 1,4 x 10 6 celler pr. Således, hvis indledende OD600 læser er uden for dette område prøver skal fortyndes / koncentreret for pålidelige målinger.
- Fortynd cellesuspensioner i medierne den følgende morgen at sikre, at kulturer har optisk densitet målt ved 600 nm (OD600) af 0,4-0,8 om aftenen.
- Dag 2, Aften:
Fortynd celler i 20 ml MSL + N medier til OD600 = 0,025 i 100 ml kolber. Inkuber stammer O / N ved 30 ° C, 200 rpm.
Bemærk: Wild-type cellekulturer bør nå OD600 ~ 0,8 den følgende morgen (15 timer senere). Hvis du arbejder med stammer med længere generationstid justere fortynding i overensstemmelse hermed. - Dag 3, Formiddag:
Mål OD 600 for at verificere, at kulturer har celledensitet på OD600 ~ 0,8. Hvis du arbejder med heterothallic stammer, bland lige mange partnerlande celler. Pellet celler på 1000 xg og overføres til en 1,5 mlrør. Vask cellerne tre gange i 1 ml MSL-N-medium. Resuspender celler i 3 ml MSL-N-medium og fortyndes cellerne til OD600 = 1,5.- For at overvåge parring mellem søster celler direkte montere celler til billeddannelse (se protokol afsnit 2.4). Brug homothallic H90 stammer, hvor parring typen skift vil finde sted i løbet af de mitotiske divisioner opstår efter kvælstof afsavn. Øjeblikkelig montering af celler på agarose pad sikrer, at efter celledeling, forbliver søster-celler ved siden af hinanden.
- Til overvågning cellepolarisering (sonderende dynamik og shmooing) inkubere 1-3 ml cellekultur ved 30 ° C, 200 rpm i 3-4 timer før montering celler til billeddannelse. Inden disse 3-4 timer, vil den sidste mitotiske division har fundet sted. Enkelte celler vil have igangsat polarisering, men de fleste vil bare starte deres sonderende polarisering dynamik.
- Til overvågning celle-cellefusion inkubere 1-3 ml cellekultur ved 30 ° C, 200 rpm i 4-6 timer prieller til montering celler til billeddannelse.
- At overvåge efter fusion events inkuber 1-3 ml cellekulturer ved 30 ° C, 200 rpm i 8 timer før montering celler til billeddannelse.
- At overvåge reaktionen på en særlig feromon koncentration (kun for heterothallic stammer) inkubere 3 ml cellekultur ved 30 ° C, 200 rpm i 3-4 timer før montering celler til billeddannelse.
- Fjern MSL-N-holdige mikrocentrifugerør fra 95 ° C varme blok (se protokol afsnit 2.4.1. Nedenfor). Tilføj P-faktor eller M-faktor i den ønskede koncentration direkte i smeltede MSL-N agarose. Vortexes grundigt før øjeblikkelig pad forberedelse.
- Efter celle montering, inkuber puden i 15-30 min ved 25 ° C forud for billeddannelse. P-faktor og M-faktor feromoner blev anvendt fra en stamopløsning af 1 mg / ml i methanol.
Bemærk: Hvis arbejde med mutantstammer inkubationstider kan variere. Sammenklumpning af celler kan forekomme efter langvarig inkubation i flydende medier og kan være særlig stærk i nogle mutantstammer. Sammenklumpede celler kan ikke spottet på agarose puder i et enkelt lag og er således vanskelige at autofokus og image. I tilfælde af omfattende celle sammenklumpning montere celler på agarose puder umiddelbart efter vask og resuspension i kvælstof-mangel medier (som i protokollen afsnit 2.3.1.) Og inkubere dem ved 30 ° C før billeddannelse.
- Montering Celler til Imaging:
- Forbered MSL-N agarose puder 16 ved smeltning af en portion i en 95 ° C varme-blok i 10-15 min og tilsætning af 200 pi mellem to objektglas der er adskilt af afstandsstykker (figur 1B). Brug afstandsstykker med en tykkelse på ~ 0,5 mm. For at gøre afstandsstykker, betjene strimler skåret ud af pap, som den, der leveres med restriktionsenzymer.
- Pellet 100 ul celler ved 1.000 xg i 1 min, supernatanten fjernes og re-suspendere celler i resterende 2-4 pi medium. IKKE re-suspendere frisk medium, som det forsinkerparring.
- Efter 2-3 min forsigtigt fjerne afstandsstykker og den øverste glasplade. Hvis flere stammer er skal monteres, forberede cellen koncentrerer før udarbejdelsen af agarose pad.
- Tilsæt 1 ul celler til puden og vente, indtil dråben begynder tørring (~ 1 min) før tildækning med dækglas og forsegling med VALAP.
- Lad puden sidde i mindst 30 minutter før billeddannelse ved 25 ° C eller stuetemperatur.
- At opnå en blanding af celler i forskellige stadier af parring, lave en pude umiddelbart efter vask i MSL-N (se afsnit 2.3.), Og der inkuberes ved 18 ° CO / N (~ 15 timer). Denne fremgangsmåde er nyttig til billeddannelse af celler ved forskellige samvirkende faser med høj tidsmæssig opløsning eller prøver med svagt signal.
3. Levende-celle Imaging af Parring gærceller
- Juster Image Acquisition indstillinger.
Bemærk: Billede erhvervelse indstillinger præsenteres her blev optimeret til DeltaVision platform bestående af en tilpasset Olympus IX-71inverteret mikroskop med Plan Apo 60X / 1,42 NA eller U-Plan Apo 100X / 1.4 NA mål, en CoolSNAP HQ2 kamera og en Insight SSI 7 farver kombineret enhed illuminator. Hardwaren styres af softWoRx v4.1.2, der også giver mulighed for digital autofokusering.- Sørg for, at autofokus intervaller ikke overstiger 15 minutter, da Z-drift i længere tid, kan overgå kapaciteten af softwaren autofokus systemet. Hvis du bruger en hardware-baseret autofokussystem, anvende større intervaller.
- Juster billeddannelse interval. Tage billeder hver 10 min i ~ 15 timer som udgangspunkt, når man arbejder med en fluorescens mærkede protein for første gang. Dette interval giver et godt overblik over hele parring processen uden omfattende blegning.
- Billede med 5 min intervaller eller kortere til mere præcist gang begivenheder såsom fusion. Kortere intervaller kræver stærke fluoroforer muliggør tider lave eksponering og lidt blegning. For billeddannelse med intervaller under 1 min undgå O / N mikroskopiog i stedet udarbejde en blanding af alle parring faser som beskrevet i protokol afsnit 2.4.6.
- Juster billede eksponeringstid. Test eksponering gange mellem 50 og 300 ms. Til formål at finde en balance mellem det signal-støj-forholdet og fotoblegning for at opnå et stort antal tidspunkter med en mærkbar signal (typisk over 100).
- Juster Z-sektionering. Sektioner hver 0,3 um, der dækker 5 um giver en god billedbehandling dybde. Bemærk, at Z-sektionering yderligere stigninger foto-skader, der kan minimeres ved hjælp af OAI (optiske akse integration - en enkelt sweep overtagelse af den samlede prøve dybde). God autofokus-system reducerer behovet for mange Z-sektioner og anbefales.
- Tips til at studere Parring Type-specifikke adfærd:
- For heterothallic stammer, bruge H- og h + celler, der udtrykker forskellige fluorophorer, således at de to celletyper kan skelnes. Brug en genetisk kodet fluorophore udtrykt som et cytosol version eller fusion til et endogent protein, selvom vi har haft god succes med sfGFP, en hurtigt folde variant af GFP 17. Endogene proteiner sædvanligvis mærket ved deres endogene genomiske locus ved homolog rekombination 14.
- For homothallic stammer, udtrykker en genetisk kodet cytosolisk fluorescerende protein under kontrol af parring typespecifikke promotorer, som de i feromon-receptor gener map3 og mam2 at drive udtryk i P og M celler. Initiativtagerne til map3 og mam2 er inaktive under vegetativ vækst og fremkaldes ved kvælstof sult 18,19. Konstrukter driver ekspressionen af cytosoliske GFP eller mCherry under kontrol af disse promotorer er typisk integreret på et genomisk locus (ura4, leu1), som ikke forstyrrer den normale progression af den seksuelle livscyklus 12.
4. Kvantificering af parring og Fusion Efficiencies
- For at kvantificere parring og fusion effektiviteter 11,12, spot-celler direkte efter MSL-N vaske på MSL-N agarose puder, som i trin 2.3.1 ovenfor, og efter henstand i 24 timer ved 25 ° C forud for billeddannelse (figur 1A). Brug af denne protokol en homothallic vildtypestamme parring effektivitet når ~ 60% og fusion effektivitet 99%. For at teste, om en reduktion i disse værdier observeret i mutante stammer afspejler en terminal fænotype eller en forsinkelse, gentage eksperimentet med en 36 timers inkubationstid.
- Beregn parring effektivitet
Parring par inkluderer zygoter, Ascl og ikke-fusionerede celle par identificeret fraderes position og vækst i retning hinandens. - Beregn fusion effektivitet
Bemærk: Kondenserede hinanden passende par identificeres ved deres evne til at danne sporer, hvis det vides, at mutanten under undersøgelse ikke påvirker sporulering. Hvis sporedannelse ikke kan anvendes som udlæsning, er fusion bestemmes ved at observere omdeling af en cytosolisk markør udtrykt i kun én parring partner i begge parter.
Parring par inkluderer zygoter, Ascl og ikke-fusionerede celle par identificeret fraderes position og vækst i retning hinandens. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fission Gær Vækst og Parring Dynamics ved fjernelse af en Nitrogen Source
Nitrogen sult er en forudsætning for initiering af seksuel reproduktion i fission gær, blev vildtype homothallic H90-stamme overvåges ved skift fra nitrogenrige til nitrogen-berøvet medium (figur 2), ifølge protokollen skitseret i figur 1. Kort fortalt celler blev dyrket O / N til eksponentiel fase (OD600 = 0,5) i MSL + N-medium, opsamles, vaskes og resuspenderes i MSL-N flydende medium til endelige OD600 = 1,5. Hver 2 time celledelprøver var Calcofluor-farves og afbildes (figur 2A - D).
Calcofluor farvning (figur 2A) viste, at i nitrogen-rigt medium ~ 21% af cellerne blev septating (n> 300, figur 2B), og at den gennemsnitlige celle længde ved divisionen var 15,2 ± 1,4 um (n = 50, figur 2C). Ikke-delende celler viste en bred fordeling af celle- længder (8-14 um, n> 200, figur 2D). Men to timer efter skiftet til MSL-N medium var der, en drastisk ændring i fordelingen af ikke-delende celler længde, med over 60% af cellerne bliver kortere end 9 um (n> 200, figur 2D). Celle septumdannelse blev også påvist ved den reducerede længde på 9,8 ± 0,8 um (n = 50, figur 2A, 2C). En yderligere reduktion i længden af både ikke-delende og dividere celler blev også observeret, som tiden i MSL-N steget. Ja, efter 8 timer i septumdannelse indeks af kulturen faldt under 2% (n> 300) og over 85% af cellerne er standset deres cellecyklus ved længder kortere end 7 um (n> 200, figur 2D).
Celler begyndte at dannes parring par fire timer efter skift til flydende MSL-Nmedium (<1%, figur 2A). Efterfølgende antallet af sammenpassende par hurtigt vokset og 8 timer efter skiftet 10% af celler involveret en dertil passende partner (n> 200, figur 2B).
At overvåge parring dynamik, 6 timer efter udsultning induktion, en alikvot af celler blev også monteret på MSL-N agarose pad til billeddannelse. Celler undergik shmooing, fusion og sporulering (figur 2E, 2F) i den efterfølgende 21 timer uden nogen tilsyneladende synkront (Film S1). Parringen effektivitet afhang af den relative position og tæthed af celler i en given synsfelt, med over 60% af cellerne ansat en partner, når placeret tæt på et monolag (figur 2G og Movie S1).
De vildtype heterothallic H + og H fission gærstammer blev også udsat for den samme protokol med enn yderligere trin at blande h + og H-celler i en en-til-en-forhold på tidspunktet for kvælstoffjernelse. Lignende sult og parring dynamik blev observeret, men parring effektiviteten var lidt lavere (figur 2G, Film S2).
Overvågning Dynamics of fluorescens-mærkede proteiner i Parring Fission gærceller
At overvåge dynamikken af type-V myosin Myo52 (Ref 20) i parring celler, eksponentielt dyrkede H- celler, der udtrykker Myo52-3GFP fra det native locus blev blandet med H + celler på tilsvarende måde udtrykker Myo52-tdTomato samt cytosolisk GFP fra P celle-specifik map3 promotor. Cellesuspensionen blev vasket, fortyndet i MSL-N-medium og inkuberet i 6 timer ved 30 * C, 200 rpm før montering celler på MSL-N agarose puder til O / N billeddannelse ved 10 minutters intervaller.
Som tidligere rapporteret 11,12 Myo52 oprindeligt dannede dynamiske zoner i hele cellens cortex (figur 3A, pilespidser og Movie S3). Myo52 signal blev derefter stabiliseret (figur 3A, pile og Movie S3) i en enkelt fokus lige før fusionen begivenhed, som blev visualiseret ved overførslen af den cytosoliske GFP signal fra H + i den H- celle (figur 3A og Movie S3) . Den Myo52-tdTomato signal kunne også observeres ved fusion halsen under sin ekspansion, men ingen mærkbar signal var tydelig, da zygote fortsatte med at sporedannelse (figur 3A og Movie S3).
Overvågning adfærd Heterothallic Fission gærceller Udsat for eksterne Feromoner
Heterothallic H-celler, der mangler den Sxa2 protease, som nedbryder P-faktor til desensibilisering let svare syntetisk P-faktor. en h- sxa2Δ stamme, der udtrykker Scd2-GFP som markør for aktiv Cdc42 11 blev dyrket i MSL + N-medium, således at den beskrevne protokol. Celler blev vasket i MSL-N-medium og inkuberet i 4 timer ved 30 * C. MSL-N agarose puder indeholdende methanol (data ikke vist), 0,1 ug / ml (lav feromon, figur 3B) eller 1 ug / ml (høj feromon, figur 3C) blev P-faktor fremstillet, skåret og anbragt på et nyt dias at generere mini-puder indeholdende forskellige feromon beløb. 0,5 pi cellesuspension blev monteret på hvert mini-pads for O / N billeddannelse ved 5 minutters intervaller.
I konkordans med publicerede resultater 11, lav P-faktor niveauer fremmet dannelsen af dynamiske Scd2 zoner uden vækst (figur 3B, Movie S4), mens høje niveauer af P-faktor stabiliseret en enkelt Scd2 zone, og dermed fremkalde shmoo forlængelse fra en celle pol (Figur 3C, Film S5).
Figur 1:.. Skematisk repræsentation af protokollen (A) Skematisk beskrivelse af de protokoller, der anvendes til at overvåge fission gær seksuel livscyklus og (B) for at forberede fission gær prøver for langsigtet imaging Klik her for at se en større version af dette tal .
Figur 2:. Vækst og Parring Dynamics of fission gærceller flyttet fra MSL + N til MSL-N Media (A) epifluorescens mikrografier af Calcofluor-farvede celler skiftede til MSL-N medier for de angivne tidsperioder. (B) Procentaf septating (mørkeblå linje, n> 300 pr tidspunkterne) og parring (lyseblå linje, n> 300 pr tidspunkterne) celler skiftede til MSL-N medier for de angivne tidsperioder. (C) Gennemsnitlig længde septating celler skiftede til MSL-N medier for de angivne tidsperioder (n = 50 pr tidspunkterne bortset 8 timer tidspunkterne hvor n = 20). (D) Længde distribution af ikke-delende celler skiftede til MSL-N-medium for de angivne tidsperioder (n> 200 per tidspunkterne). (E) Gennemsnitlig fraktion af ikke-fusioneret (mørkeblå linje), kondenseret (lyseblå linje) og sporedannende (sort linie) celler i en population af H90 vildtype gær flyttet til MSL-N medier for de angivne tidsrum og monteret på en agar pad på tidspunkterne 6 timer (n> 900 celler pr tidspunkterne fra tre forskellige timelapses). Cellerne blev anset smeltet når ingen refraktiv cellevæg mellem partnerne var synlig i DIC micrographs og dannelse af spore cellevæg blev brugt til at score til sporulating celler. (F) DIC mikrografier af samvirkende celler skiftede til MSL-N medier for de angivne tidsperioder. (G) Parring effektivitet som en funktion af celledensitet på agarose puder til H90 (mørk-blå prikker) og h + / H- (lyseblå prikker) celler skiftede til MSL-N medier i 24 timer. Den mest passende tæthed af celler til langsigtet billedbehandling opnås ved ca. 25.000 celler / mm 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Dynamisk Lokalisering af fluorescerende proteiner under fission gærparringstype (A) udfoldede enkelt z-planet epifluorescens mikrografier af celler med de indikerede genotyper flyttet fra MSL + N til MSL-N medier i 6 timer og monteret påMSL-N agarose pad for den angivne tid. Pilespidser indikerer dynamiske Myo52-3GFP zoner og pilen påpeger Myo52 lokalisering ved fusion fokus. (B), (C) udfoldede enkelt z-plane epifluorescens mikrografier af celler med angivne genotyper flyttet fra MSL + N til MSL-N medier i 4 timer og monteret på MSL-N agarose mini-puder indeholdende 0,1 ug / ml (B) eller 1 pg / ml (C) af P-faktor for den angivne tid. Pilespidser indikerer dynamisk (B) eller stabile (C) Scd2-GFP zoner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Movie 1: DIC timelapse af vildtype H90 fission gær ce LLS der var kvælstof-sultet i 6 timer før billeddannelse. (Højreklik for at downloade).
Supplerende Movie 2: . DIC timelapse af vildtype h + og H-fission gærceller, der blev blandet og kvælstof-sultet i 6 timer forud for billeddannelse (Højreklik for at downloade).
"> Supplerende Movie 3: udfoldede enkelt z-planet epifluorescens og DIC timelapse H- celler, der udtrykker Myo52-3GFP fra det native locus blandet med h + celler, der udtrykker Myo52-tdTomato fra det native locus og cytosolisk GFP fra P-celle-specifik promotor map3 . Celler blev dyrket i MSL-N medium i 6 timer ved 30 ºC før billeddannelse. Overførsel af cytosolisk GFP ind i h celle definerer fusion tid. (Højreklik for at downloade).
Supplerende Movie 4: udfoldede enkelt z-planet epifluorescens og DIC timelapse H- sxa2 celler expressing Scd2-GFP fra dets native promotor behandlet med 0,1 ug / ml P-faktor. Celler blev dyrket i MSL-N-medium i 4 timer ved 30 ºC før billeddannelse. (Højreklik for at downloade).
Supplerende Movie 5: . Udfoldede enkelt z-planet epifluorescens og DIC timelapse H- sxa2 celler, der udtrykker Scd2-GFP fra dets native promotor behandlet med 1 ug / ml P-faktor Celler blev dyrket i MSL-N-medium i 4 timer ved 30 ºC før billeddannelse. (Højreklik for at downloade).
| YSM995 | h- vægt |
| YSM1371 | h + wt |
| YSM 1396 | H90 vægt |
| YSM2534 | h- myo52-3GFP :: kanMX |
| YSM2730 | h + myo52-tdTomato :: natMX Pmap3: GFP :: Ura4 + @ ura4locus |
| YSM2731 | h- scd2-GFP :: natMX sxa2Δ :: kanMX |
Tabel S1: Stammer anvendt i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miljøforhold og næringsstoffer tilgængelighed i særdeleshed stærkt påvirke fission gær fysiologi. Nitrogenudsultning er nødvendig for engagement i seksuel reproduktion og indledningsvist fører til markante ændringer i den mitotiske cellecyklusprogression (ref. 21 og figur 2). Ved nitrogen fjernelse fra eksponentielt voksende befolkning, cellestørrelse på division hurtigt aftager (figur 2C), og størstedelen af celler standse mitotisk progression kortere end længden af nyfødte eksponentielt dyrkede celler (ref. 21 og fig 2D). Da cellerne i modsatte parring typer anholde mitotisk progression de udøver parring partnere og fortsæt til at danne zygoter og danne sporer (figur 2B, 2E, 2F). I tilfælde af en todimensional monolag af vildtypeceller, over tres procent af H90 celler vil gå i indgreb partner, og næsten alle vil undergå cellefusion (figur 2G (figur 2G). En af de mest kritiske aspekter ved protokollen at opnå høje parring virkningsgrader er at sikre, at cellerne holdes inden for de angivne tætheder hele. Overvågning af celle størrelse og parring effektivitet parametre som vist i Figur 2 giver så en simpel kontrol, som cellerne er på vej ind seksuel reproduktion effektivt.
Vi bemærker, at, da parring medium mangel enhver kvælstof kilde (selv små mængder af aminosyrer og nitrogenbaser er udelukket), høje parring virkningsgrader som dem, der præsenteres i figur 2E og 2G kun opnås med fuldt prototrofe stammer. Auxotrofe stammer kan bruges, men kræver yderligere omhu for at sikre, at celler er til alle tider holdes inden for celledensiteter angivet i protokollen. Selv med omhu, kunlavere parring effektivitet vil blive observeret. Parring effektivitet påvirkes også af temperaturen, med lavere effektivitet observeret ved forhøjet temperatur, som kan begrænse brugen af temperaturfølsomme mutant alleler under parring proces.
Metoden præsenteres her bruges primært til langsigtet billeddannelse af fluorescerende reportere. Fordi billeddannelsen udføres over længere tidsrum, vellykket billeddannelse af fission gær parring er meget afhængig af mikroskopi setup rådighed. Til dette, stabilitet mikroskopopstilling, dens følsomhed og adgang til en autofokus-system er kritiske. Enten softwarebaseret eller indbyggede hardware autofokus systemer er mulige. Endvidere at øge gennemløbet, et motoriseret trin muliggør erhvervelse multipoint er en anden vigtig kvalitet.
Billedkvalitet er begrænset af egenskaberne af fluoroforen af interesse. De forskellige inkubationstider i flydende MSL-N medium beskrevet i Protocol afsnit 2.3 er rettet mod optimering af fluorescens på feromon-induceret mærkede proteiner og minimere unødvendig blegning af imaging kun parring stadier af interesse. Mens rigelige eller meget focalized fluorescens mærkede proteiner tillader køb af hundredvis af tidspunkter i løbet af hele seksuelle livscyklus (Film S3), andre proteiner er udfordrende at billedet over så lange tider på grund af foto-blegning. Billedkvaliteten afhænger også af den valgte fluorophor, typisk et GFP-derivat. Vi gentagne gange observeret, at sfGFP 17 (superfolder GFP), der kan foldes med hurtige kinetik, forudsat overlegen signal under parring proces, muligvis fordi stærke autofagi inducerer hurtig protein omsætning. Vigtigere er det, vi ikke overvåger tilgængeligheden af ilt er nødvendig for fluorescerende protein modning 17,22. Således anbefales det at være forsigtig med at bruge fluorescens målinger til at kvantificere niveauet af proteiner udtrykt efter celler er Mounted på dias, eller at anvende alternative oxygenpermeable mikrofluidiksystemer enheder til at gennemføre sådanne eksperimenter. Desuden agarose puder spottet med celler i aften og holdt ved 18 ºC O / N har været meget nyttigt at billedet svage journalister som sådanne puder indeholde en blanding af celler i alle faser af seksuel reproduktion.
Parring i fission gær udviser ikke synkroni og celler kan let ses initierende shmooing sammen med andre celler, der allerede sporedannende (film S1, S2). Sådanne populationsdynamik gør klassiske, bulk biokemiske teknikker vanskeligt at bruge, hvilket gør enkelt celle mikroskopi beskrives her en fremgangsmåde til valg. Alle mikroskopi tilgange kan i princippet anvendes på celler fremstillet med protokollen beskrevet her. Vigtigt er det, kan disse tilgange overvåge processer, der udviser parring typespecifikke dynamik såsom celle-celle fusion beskrevet af Dudin og kolleger 12. For at overvåge asymmetri, parring typen reporterehar været særligt nyttig (figur 3A). Differentiering mellem de to parring typer opnås nemt, når der arbejdes med heterothallic stammer ved at ansætte forskellige fluoroforer at mærke proteiner i H- og h + celler. Dette er imidlertid ikke muligt for homothallic stammer. En tilgang udviklet til at skelne den sammenpassende type H90 celler er at udtrykke cytosoliske fluorescerende proteiner under kontrol af parring typespecifikke promotorer. Især blev initiativtagerne til de feromon-receptor gener map3 og mam2 bruges til at drive ekspressionen af GFP eller mCherry proteiner i P og M-celler hhv. Endvidere disse markører tilladt, præcis timing af celle-celle-fusion, visualiseret som overførsel af fluorescerende signal fra én partner celle til den anden.
Parring feromoner er afgørende determinanter for forløber gennem forskellige faser af seksuel reproduktion i gær 11,23. Forskellige syntetisk feromon fører til forskellige celle polarisering stater i fission gær (figur 3B, 3C og Ref. 11). Protokollen nævnt ovenfor giver en vurdering af, hvordan forskellige eksogene feromon niveauer påvirker celle fysiologi. Fordi feromon protease Sxa2 nedbrydes hurtigt P-faktor, en heterothallic mutantstamme hvor proteasen blev slettet blev anvendt til opnåelse reproducerbare resultater. Men i blandinger af celler af modstående samvirkende typer, ikke kun niveauer, men også den rumlige fordeling af feromoner, der udsendes af en dertil passende partner vil sandsynligvis være vigtige. Analysere virkningerne af feromon rumlig fordeling på celle respons vil kræve udvikling af mere avancerede opsætninger såsom mikrofluidiksystemer enheder ansat på spirende gær 24,25.
Sammenfattende præsenterer vi en grundlæggende metode til langsigtet mikroskopi af den seksuelle livscyklus fission gær. Mindre tilpasninger af denne protokol tillader research fokusere på cellulære reaktioner på forskellige stadier af seksuelle livscyklus. Kombinere denne tilgang med enkelt celle biokemi værktøjer og mikrofluidiksystemer enheder vil yderligere fremme fission gær seksuel reproduktion som en kraftfuld model system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
AV blev støttet af en EMBO langsigtede postdoc stipendium. Forskning i Martin laboratoriet er finansieret af et ERC Starting Grant (GeometryCellCycle) og en schweizisk National Science Foundation tilskud (31003A_155944) til SGM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
