Introduction
Bien que l'échange génétique entre deux cellules est l'événement central dans la reproduction sexuée, elle repose sur une chaîne d'événements qui favorisent la différenciation des cellules, permettent le choix du partenaire, réalisent la fusion cellule-cellule et de maintenir la stabilité du génome. Ainsi , le cycle de vie sexuelle se présente comme un système modèle pour étudier un certain nombre de questions biologiques en ce qui concerne les commutateurs de développement, réponse à des stimuli extrinsèques, la fusion de la membrane plasmique, la ségrégation des chromosomes, etc. Exploring la levure de fission de cycle sexuel pour étudier ces phénomènes apporte les avantages de la génétique puissant système de modèle, bien établi des approches à haut débit et la microscopie sophistiquée. Le sexe dans la levure de fission est un événement hétérotypique entre un P-cellulaire et un M-cellulaire des types d'accouplement distincts. Les deux types de cellules expriment différemment un certain nombre de gènes 1,2 , y compris ceux pour la production du P- sécrétée et M-phéromones, phéromone-récepteurs Carte3 et Mam2 ainsi que phéromone-proteaSES Sxa1 et Sxa2. Homothalliques souches telles que la souche H90 couramment utilisée, portent l'information génétique pour les deux types d'accouplement en un seul génome et les cellules subissent un schéma complexe de commutation de type conjugaison au long du cycle mitotique (passé en revue dans réf. 3). Isolats multiples de hétérothallique levure de fission que rarement ou jamais changer le type d'accouplement sont également couramment utilisés 4, le plus en évidence le h + N (type P) et h -S (type M) souches.
Dans la levure de fission, l'entrée dans le cycle de vie sexuelle est sous la réglementation nutritionnelle stricte. Seules les cellules de levure fission azote affamés arrêtent la reproduction mitotique et produisent des phéromones diffusibles pour signaler la présence d'un partenaire d'accouplement et de promouvoir d' autres étapes du cycle sexuel (revu en. Ref 5). Privation d'azote de-refoule le régulateur transcriptionnel clé de Ste11 accouplement qui agit comme un commutateur et favorise le développement eXpression d'accouplement des gènes spécifiques , y compris le récepteur de phéromone et la phéromone des gènes de production 6,7. L' engagement phéromone-récepteur active la protéine du récepteur couplé à G-alpha et la signalisation MAPK aval qui améliore encore l' activité transcriptionnelle Ste11 8-10, augmentant ainsi la production de phéromone dans une rétroaction positive entre les partenaires d'accouplement. Les niveaux de phéromone sont cruciales pour induire différents états de polarisation de la cellule en régulant l'organisateur principal de la polarité cellulaire, la Rho-famille GTPase Cdc42 11. Lors de l'exposition à de faibles concentrations de phéromone, Cdc42 actif est visualisé dans les patchs dynamiques explorant la périphérie de la cellule, et pas de croissance cellulaire est observé à ce stade. niveaux de phéromone accrus favorisent la stabilisation de l'activité Cdc42 à une seule zone et à la croissance d'une projection polarisée, dite shmoo, qui apporte des cellules partenaires en contact. Par la suite, les deux partenaires d'accouplement haploïdes fusionnent pour former un zygote diploïde. Des travaux récents révèle the l' existence d'une nouvelle structure essentielle pour la fusion de l' actine qui est assemblé par la Formin induite par l' accouplement-FUS1 12. Cette mise au point de fusion se concentre processus dépendants de type V myosine et positionne le mécanisme de dégradation de la paroi cellulaire, permettant ainsi le remodelage de la paroi cellulaire pour permettre plasma contact membrane sans lyse cellulaire 12. Lors de la fusion cellule-cellule, les noyaux entrent en contact et subissent caryogamie. Un mouvement important va-et-vient dynein dépendant du noyau à l' intérieur du zygote (le mouvement de queue de cheval) favorise alors l'appariement des chromosomes homologues de 13,14, qui est suivie par la méiose. Enfin, les quatre produits de la méiose sont emballés dans des spores individuelles pendant la sporulation.
En raison de sa complexité et les nombreuses étapes, un suivi détaillé de l'accouplement a été difficile. Deux difficultés notables sont que l'ensemble du processus prend bien plus de quinze heures, et que les cellules sont difficiles à synchroniser. Ces difficulties sont contournées par des approches de microscopie à cellule unique. Voici un protocole général pour enquêter sur le cycle de vie sexuelle dans la levure de fission est présenté. Avec quelques ajustements mineurs, ce protocole permet l'étude de toutes les différentes étapes du processus, à savoir l'induction du produit du gène d'accouplement, la polarisation de la cellule et l'appariement entre les sœurs cellules après commutation du type d'accouplement et entre les partenaires non-soeur, fusion cellule-cellule, et post-fusion queue de cheval mouvement, la méiose et la sporulation. Cette méthode permet de 1) facilement visualiser les protéines marquées par fluorescence dans le temps avant, pendant et après la fusion; 2) discriminer le comportement des cellules du type opposé de l'accouplement; et 3) mesurer et quantifier les paramètres tels que shmooing, l'accouplement, la fusion ou de l'efficacité de la sporulation.
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Protocol
analyse de Microscopie de la reproduction sexuée fission de levure
1. Préparation des médias
- Préparer le milieu de sporulation minimum (MSL-N) 15 en mélangeant les composants suivants: glucose: 10 g / l, KH 2 PO 4: 1 g / l, NaCl: 0,1 g / l, MgSO 4 · 7H 2 O: 0,2 g / L. Ajouter oligo - éléments (10.000 fois ): 100 pi / L, vitamines (1,000x): 1 ml / L, et 0,1 M CaCl 2 ml / L. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de taille de 0,22 um des pores et conserver à température ambiante (RT).
- Utilisez les vitamines suivantes (1,000x) stock: pantothénate: 1 g / L, acide nicotinique: 10 g / L, inositol: 10 g / L, biotine: 10 mg / L. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de taille de 0,22 um des pores et conserver à 4 ° C.
- Utilisez les oligo - éléments suivants (10.000 fois ) stock: Acide borique: 5 g / L, MnSO 4: 4 g / L, ZnSO 4 · 7H 2 O: 4 g / L, FeCl 2 · 6H 2 O: 2 g / L MoO 3: 0,4 g / L, KI: 1 g / l, CuSO4· 5H 2 O: 0,4 g / L, acide citrique: 10 g / l. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de taille de 0,22 um des pores et conserver à 4 ° C.
- Préparer MSL-N Agarose 2% (utilisé pour fabriquer des chambres de pad agarose) en combinant 10 ml de MSL-N avec 0,2 g d'agarose. Faire fondre pour ~ 2 min à puissance élevée dans un four à micro-ondes jusqu'à dissolution d'agarose et aliquotes de 0,5 ml dans des tubes à centrifuger. Stocker à température ambiante.
- Préparer le milieu de sporulation minimum avec de l' azote (MSL + N) à partir MSL-N par addition de (NH 4) 2 SO 4: 1 g / l Leucine: 0,225 g / l, adenine: 0,225 g / l, uracile: 0,225 g / l . Filtre stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um de taille des pores. Stocker à température ambiante.
Nota: Leucine, de l'adénine et l'uracile sont ajoutés à ce milieu pour permettre la croissance des souches auxotrophes. Supplément amino-acide supplémentaire devrait être inclus si la souche utilisée porte une auxotrophie distincte (par exemple his3Δ). S'il vous plaît noter également que le travail avec des souches entièrement prototrophe est recommandée, car seulementces souches permettront une grande efficacité de l'accouplement. - Préparer 200 ml valap pour la chambre d'étanchéité. Dans un bécher ajouter des poids égaux de la lanoline, de la vaseline (ou autre vaseline) et de paraffine. Chauffer le mélange à basse température et remuer de temps en temps jusqu'à ce que bien mélangé. Aliquoter le mélange dans plusieurs petites boîtes de Pétri. Stocker à température ambiante.
2. La culture Fission souches de levure pour les expériences de Mating (figure 1).
- Jour 1, Soirée:
Inoculer souches fraîchement striées de milieux solides dans des tubes de culture contenant 3 ml de MSL + N. Utiliser des tubes à fond plat d'environ 2,5 cm de diamètre. Utilisez d'autres tubes de culture ou flacons avec un volume de culture adapté. Incuber une nuit (O / N) avec agitation à 25 ° C, 200 rpm. Si vous travaillez avec des souches hétérothallique, inoculer séparément.- Diluer suspensions cellulaires dans les médias le lendemain matin pour faire en sorte que les cultures ont une densité optique mesurée à 600 nm (DO600) de 0,4-0,8 dans la soirée.
Remarque:OD 600 mesures comme un proxy de concentration cellulaire pour la levure de fission sont linéaires dans la gamme d'environ 0,1-1,0. Pour notre DO 600 = 0,1 spectrophotomètre correspond à 1,4 x 10 6 cellules par ml. Ainsi, si OD initial 600 lit sont en dehors de cette plage échantillons doivent être dilués / concentré pour des mesures fiables.
- Diluer suspensions cellulaires dans les médias le lendemain matin pour faire en sorte que les cultures ont une densité optique mesurée à 600 nm (DO600) de 0,4-0,8 dans la soirée.
- Jour 2, Soirée:
Diluer cellules dans 20 ml de MSL + N médias à OD 600 = 0,025 dans 100 ml flacons. Incuber souches O / N à 30 ° C, 200 rpm.
Note: les cultures de cellules de type sauvage devrait atteindre 600 OD ~ 0,8 le lendemain matin (15 heures plus tard). Si vous travaillez avec des souches avec plus de temps de génération de régler la dilution en conséquence. - Jour 3, Matin:
Mesurer la DO 600 pour vérifier que les cultures ont une densité de cellules de OD 600 ~ 0,8. Si vous travaillez avec des souches hétérothallique, mélanger un nombre égal de cellules partenaires. cellules à granules à 1000 xg et le transfert à un 1,5 mltube. Laver les cellules à trois reprises dans 1 ml de milieu MSL-N. Resuspendre les cellules dans 3 ml de milieu MSL-N et on dilue les cellules jusqu'à DO600 = 1,5.- Pour surveiller l'accouplement entre les cellules sœurs directement monter des cellules pour l'imagerie (voir Protocole Section 2.4). Utiliser des souches H90 homothalliques, dans lequel la commutation de type sexuel aura lieu au cours des divisions mitotiques survenant après la privation d'azote. Montage immédiate de cellules sur le pad agarose assure que, après la division cellulaire, les cellules-soeur restent à côté de l'autre.
- Pour surveiller la polarisation des cellules (la dynamique d'exploration et shmooing) incuber 1-3 ml de culture de cellules à 30 ° C, 200 rpm pendant 3-4 heures avant les cellules de montage pour l'imagerie. Au sein de ces 3-4 heures, la dernière division mitotique aura eu lieu. Quelques cellules auront lancé la polarisation, mais la plupart seront simplement à partir de leur dynamique de polarisation exploratoires.
- Pour surveiller la fusion cellule-cellule incuber 1-3 ml de culture de cellules à 30 ° C, 200 rpm pendant 4-6 heures priou à des cellules de montage pour l'imagerie.
- Surveiller les événements post-fusion incubent 1-3 ml de cultures de cellules à 30 ° C, 200 rpm pendant 8 heures avant les cellules de montage pour l'imagerie.
- Pour surveiller la réponse à une concentration de phéromone spécifique (uniquement pour les souches hétérothalliques) incuber pendant 3 ml de culture cellulaire à 30 ° C, 200 tpm pendant 3 à 4 heures avant la fixation des cellules pour l'imagerie.
- Retirez le tube de microcentrifugation MSL-N contenant du bloc C de chaleur de 95 ° (voir la section 2.4.1 Protocole. Ci-dessous). Ajouter P-facteur ou facteur M à la concentration désirée directement dans la NMM N-agarose fondu. Bien mélanger par tourbillonnement avant la préparation de pad immédiat.
- Après le montage cellulaire, incuber le pad pendant 15-30 min à 25 ° C avant l'imagerie. P-facteur et le facteur M, les phéromones ont été utilisés à partir d'une solution mère de 1 mg / ml dans le méthanol.
Remarque: Si vous travaillez avec des souches mutantes des temps d'incubation peuvent varier. Agglomérante de cellules peut se produire après une incubation prolongée de liquide media et peut être particulièrement forte dans certaines souches mutantes. les cellules agglomérées ne peuvent pas être déposées sur des tampons d'agarose en une seule couche et sont donc difficiles à autofocus et de l'image. En cas de grande agglutination cellulaire monter des cellules sur des tampons d'agarose immédiatement après lavages et remise en suspension dans un milieu dépourvu d'azote (comme dans le Protocole Section 2.3.1.) Et les incuber à 30 ° C avant l'imagerie.
- Cellules pour l'imagerie de montage:
- Préparer MSL-N tampons d' agarose 16 par fusion d' une partie aliquote dans un bloc thermique à 95 ° C pendant 10 à 15 minutes et en ajoutant 200 pi entre deux lames de verre séparées par des entretoises (figure 1B). Utiliser des entretoises ayant une épaisseur de 0,5 mm ~. Pour effectuer des entretoises, utiliser des bandes découpées dans du carton, tel que celui fourni avec des enzymes de restriction.
- Pellet 100 pi de cellules à 1000 g pendant 1 min, retirer le surnageant et les cellules dans résiduelle moyenne 2-4 pi remettre en suspension. Ne pas remettre en suspension dans un milieu frais comme il retardeaccouplement.
- Après 2-3 min retirer soigneusement les entretoises et la lame de verre supérieure. Si plusieurs souches doivent être montés, préparer la cellule se concentre avant de préparer le tampon d'agarose.
- Ajouter 1 pi de cellules au tampon et attendre jusqu'à ce que la goutte commence à sécher (~ 1 min) avant de recouvrir avec une couverture de glissement et d'étanchéité avec valap.
- Laissez le pad reposer pendant au moins 30 minutes avant l'imagerie à 25 ° C ou RT.
- Pour obtenir un mélange de cellules à différents stades de l'accouplement, faire un pad immédiatement après lavages dans MSL-N (voir la section 2.3.) Et incuber à 18 ° CO / N (~ 15 h). Cette approche est utile pour l'imagerie des cellules à des stades d'accouplement distincts avec une haute résolution temporelle ou des échantillons avec un signal faible.
Imagerie 3. cellules vivantes de Mating cellules de levure
- Ajuster l'image Réglages d'acquisition.
Remarque: les paramètres d'acquisition d'images présentées ici ont été optimisés pour la plate-forme DeltaVision composée d'une mesure Olympus IX-71microscope inversé avec le Plan Apo 60x / 1,42 NA ou U-Plan Apo 100X / 1.4 Objectifs NA, une caméra CoolSNAP HQ2 et un aperçu SSI 7 couleurs unité combinée illuminateur. Le matériel est contrôlé par Softworx v4.1.2 qui permet également une mise au point numérique.- Veiller à ce que les intervalles de mise au point automatique ne dépassent pas 15 min depuis le Z-dérive dans le temps plus long peut dépasser la capacité du système de mise au point automatique du logiciel. Si vous utilisez un système de mise au point automatique basé sur le matériel, utiliser des intervalles plus grands.
- Régler l'intervalle d'imagerie. Prenez des images toutes les 10 min pour ~ 15 heures en tant que point de départ lorsque l'on travaille avec une protéine marquée par fluorescence pour la première fois. Cet intervalle donne un bon aperçu du processus d'accouplement entier sans blanchissement.
- Image avec des intervalles de 5 minutes ou moins longues de manière plus précise les événements temporels tels que la fusion. Des intervalles plus courts nécessitent fluorophores forts permettant des temps d'exposition faible et peu de blanchiment. Pour l'imagerie avec des intervalles inférieurs à 1 min éviter O / N microscopieet au lieu de préparer un mélange de toutes les étapes d'assemblage tel que décrit dans la section 2.4.6 Protocole.
- Ajuster l'image du temps d'exposition. temps d'exposition d'essai entre 50 et 300 msec. But de trouver un équilibre entre le rapport et le photoblanchiment signal-bruit pour atteindre un grand nombre de points dans le temps avec un signal discernable (généralement plus de 100).
- Régler Z-tronçonnage. Sections toutes les 0,3 um couvrant 5 um fournissent une bonne profondeur d'imagerie. Notez que d'autres augmentations photo-dommages de Z-sectionnant, qui peut être minimisé en utilisant l'OAI (intégration de l'axe optique - une acquisition de balayage unique de la profondeur de l'échantillon total). Bon système auto-focus réduit le besoin de beaucoup de Z-sections et est fortement recommandée.
- Conseils pour l'étude Comportements Mating type spécifiques:
- Pour les souches hétérothalliques, l' utilisation h- et h , les cellules exprimant + fluorophores distincts, de sorte que les deux types de cellules peuvent être distingués. Utiliser tout fluoropho codé génétiquementre exprimée comme une version cytosolique ou la fusion d'une protéine endogène, bien que nous avons eu un bon succès avec sfGFP, une variante de pliage rapide de la GFP 17. Protéines endogènes sont généralement marqués à leur locus génomique endogène par recombinaison homologue 14.
- Pour les souches homothalliques, d' exprimer une protéine fluorescente cytosolique codé génétiquement sous le contrôle de promoteurs spécifiques d' un type d'accouplement , tels que ceux des gènes de récepteurs de phéromone et carte3 mam2 pour entraîner l'expression dans des cellules P et M, respectivement. Les promoteurs de map3 et mam2 sont inactifs pendant la croissance végétative et sont induites sur la faim d'azote 18,19. Les constructions qui contrôlent l'expression de la GFP cytosolique ou mCherry sous le contrôle de ces promoteurs sont généralement intégrés dans un locus génomique (ura4, leu1) qui ne gêne pas la progression normale du cycle de vie sexuelle 12.
4. Quantification de Mating et Fusion Efficiencies
- Pour quantifier l' accouplement et la fusion efficacité 11,12, les cellules au comptant directement après MSL-N laver sur MSL-N tampons d' agarose, comme à l' étape 2.3.1 ci - dessus, et laisser reposer pendant 24 heures à 25 ° C avant l'imagerie (figure 1A). En utilisant ce protocole de type sauvage efficacité souche d'accouplement homothallique atteint ~ 60% et la fusion d'efficacité de 99%. Pour tester si une diminution de ces valeurs observées dans les souches mutantes un phénotype reflète terminal ou un retard, répéter l'expérience avec une durée d'incubation de 36 heures.
- Calculer l'efficacité que l'accouplement
paires de Mating comprennent zygotes, asques, et des paires de cellules non fusionnées identifiées à partirleur position et leur croissance vers les uns des autres. - Calculer l'efficacité de fusion que
Nota: Les paires d'accouplement fusionnées sont identifiées par leur capacité à former des spores, si on sait que le mutant à l'étude n'a aucune influence sur la sporulation. Si sporulation ne peut pas être utilisé comme lecture, la fusion est déterminée en observant la propagation d'un marqueur cytosolique exprimé en un seul partenaire d'accouplement dans les deux partenaires.
paires de Mating comprennent zygotes, asques, et des paires de cellules non fusionnées identifiées à partirleur position et leur croissance vers les uns des autres. 
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Representative Results
Fission Yeast croissance et Mating Dynamics lors de l'enlèvement d'une source d'azote
Comme la famine d'azote est une condition préalable à l' initiation de la reproduction sexuée dans la levure de fission, de type sauvage souche h90 homothallique a été contrôlée sur passage de riche en azote à moyenne d'azote-privé (Figure 2), suivant le protocole décrit dans la figure 1. En bref, les cellules ont été cultivées O / N à la phase exponentielle (DO600 = 0,5) dans un milieu MSL + N, ont été recueillies, lavées et remises en suspension dans MSL-N milieu liquide DO finale 600 = 1,5. Tous les 2 aliquotes hr de cellules étaient calcofluor-tachée et imagée (Figure 2A - D).
Calcofluor coloration (figure 2A) a montré que dans un milieu riche en azote ~ 21% des cellules ont été septating (n> 300, figure 2B) , et que la longueur moyenne des cellules à division était de 15,2 ± 1,4 um (n = 50, la figure 2C). Les cellules ne se divisant pas montré une large distribution des longueurs de cellules (8-14 um; n> 200, figure 2D). Cependant, deux heures après le passage à moyen MSL-N il y avait un changement radical dans la distribution de longueur des cellules qui ne se divisent, avec plus de 60% des cellules étant plus courte que 9 pm (n> 200, figure 2D). Cellule septation a également été détectée à la longueur réduite de 9,8 ± 0,8 pm (n = 50, la figure 2A, 2C). Une réduction supplémentaire de la longueur des deux non-division, et la division des cellules a également été observée, comme le temps dans le MSL-N augmente. En effet, après 8 heures , l'indice de cloisonnement de la culture a diminué au- dessous de 2% (n> 300) et plus de 85% des cellules arrêté leur cycle cellulaire à des longueurs plus courtes que 7 um (n> 200, figure 2D).
Les cellules ont commencé à former des paires d'accouplement quatre heures après le passage à l'état liquide MSL-Nmoyenne (<1%, figure 2A). Ensuite , le nombre de paires d'accouplement a augmenté rapidement et 8 heures après le passage de 10% des cellules engagé un partenaire d'accouplement (n> 200, figure 2B).
Pour contrôler la dynamique d'accouplement, 6 heures après la famine induction, une aliquote de cellules a également été monté sur MSL-N pad agarose pour l'imagerie. Les cellules ont subi shmooing, la fusion et la sporulation (Figure 2E, 2F) dans la suite 21 h sans synchronie apparente (Film S1). L'efficacité de l' accouplement dépend de la position relative et la densité des cellules dans un champ de vision, avec plus de 60% des cellules engagé un partenaire lorsqu'il est positionné densément en monocouche (figure 2G et Movie S1).
Les souches de type sauvage hétérothallique h + et h- levure de fission ont également été soumis au même protocole avec unl' étape supplémentaire consistant à mélanger n H + et H- cellules dans un rapport de un à un au moment de l' élimination de l' azote. Famine et d' accouplement similaires dynamiques ont été observées, mais l'efficacité de l' accouplement était légèrement inférieure (Figure 2G, Film S2).
Surveillance dynamique des protéines par fluorescence Tagged dans Mating Fission cellules de levure
H- cellules pour contrôler la dynamique du type V Myo52 myosine (réf 20) dans l' accouplement cellules cultivées exprimant de façon exponentielle Myo52-3GFP du locus natif ont été mélangées avec des cellules exprimant h + similaire Myo52-tdTomato, ainsi que la GFP cytosolique de P -Cell promoteur map3 spécifique. La suspension cellulaire a été lavée, diluée dans du milieu MSL-N, et on a incubé pendant 6 heures à 30 ° C, 200 tours par minute avant le montage sur des cellules MSL-N tampons d'agarose pour O / N imagerie à intervalles de 10 min.
Comme indiqué précédemment 11,12 Myo52 zones dynamiques initialement formés à travers le cortex cellulaire (Figure 3A, pointes de flèches et Movie S3). Myo52 signal a été ensuite stabilisé (figure 3A, des flèches et Movie S3) dans un seul foyer juste avant l'événement de fusion, qui a été visualisée par le transfert du signal de GFP cytosolique de l'h + dans la cellule h- (figure 3A et Movie S3) . Le signal Myo52-tdTomato pourrait également être observé au niveau du col de fusion lors de son expansion , mais aucun signal discernable était évident que le zygote a procédé à la sporulation (figure 3A et Movie S3).
Surveillance du comportement des hétérothallique Fission cellules de levure Exposés à Phéromones externes
Cellules h- hétérothallique dépourvus de la protéase Sxa2 qui dégrade le facteur P pour la désensibilisation répondent facilement à la synthèse P-facteur. Un h- sxa2Δ souche exprimant SCD2-GFP comme marqueur pour l' activité Cdc42 11, a été cultivée dans du milieu MSL + N, par conséquent le protocole décrit. Les cellules ont été lavées dans du milieu MSL-N et mis à incuber pendant 4 heures à 30 ° C. MSL-N tampons d' agarose contenant du méthanol (données non présentées), 0,1 pg / ml (basse phéromone, figure 3B) ou 1 pg / ml (haute phéromone, figure 3C) du facteur P ont été préparés, coupés et positionnés sur une nouvelle diapositive pour générer des mini-tampons contenant différentes quantités de phéromone. 0,5 pi de suspension cellulaire a été montée sur chaque mini-tampons pour O / N imagerie à des intervalles de 5 min.
En concordance avec les résultats publiés 11, les niveaux P-facteur bas ont favorisé la formation de zones dynamiques SCD2 sans croissance (figure 3B, Film S4), tandis que les niveaux élevés de facteur P stabilisé une seule zone SCD2, induisant ainsi shmoo allongement de la pole position d' une cellule (Figure 3C, Film S5).
Figure 1:.. Représentation schématique du Protocole (A) description schématique des protocoles utilisés pour surveiller la levure de fission du cycle de vie sexuelle et (B) pour préparer des échantillons fission de levure pour l' imagerie à long terme S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
Figure 2:. Croissance et Mating Dynamique des cellules de levure de Fission shiftées de MSL + N à MSL-N Médias micrographies (A) épifluorescence de cellules calcofluor tachés déplacé vers MSL-N média pour les périodes indiquées. (B) Pourcentagede septating (ligne bleu foncé, n> 300 par timepoint) et l'accouplement (ligne bleu clair, n> 300 par timepoint) cellules déplacées vers MSL-N média pour les périodes indiquées. (C) Longueur moyenne des cellules septating déplacé vers MSL-N médias pour les périodes indiquées de temps (n = 50 timepoint sauf 8 h timepoint où n = 20). (D) la distribution de longueur des cellules qui ne se divisent déplacé à moyen MSL-N pour les périodes indiquées de temps (n> 200 par timepoint). (E) fraction moyenne de unfused (ligne bleu foncé), fondue (ligne bleu clair) et la sporulation (ligne noire) des cellules dans une population de h90 levure de type sauvage déplacé vers MSL-N média pour les périodes indiquées et monté sur un tampon de gélose au timepoint 6 h (n> 900 cellules par timepoint de trois timelapses différents). Les cellules ont été considérées fondue en l'absence de paroi cellulaire de réfraction entre les partenaires a été visible dans les micrographies DIC et la formation de la paroi cellulaire des spores a été utilisée pour marquer sporulating cellules. Micrographies (F) DIC de cellules d'accouplement décalés vers MSL-N média pour les périodes indiquées. (G) l' efficacité Mating en fonction de la densité des cellules sur des tampons d' agarose pour H90 (points bleu foncé) et H + / H- (points bleu clair) , les cellules déplacées vers MSL-N médias pendant 24 heures. La densité la plus appropriée de cellules pour l' imagerie à long terme est atteint à environ 25 000 cellules / mm 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Dynamic Localisation des protéines fluorescentes lors de levure Fission Mating (A) déconvoluée simples micrographies plan z épifluorescence de cellules avec les génotypes indiqués sont passés de MSL + N à MSL-N médias pendant 6 h et montés surMSL-N pad agarose pendant le temps indiqué. Arrowheads indiquent les zones de Myo52-3GFP dynamiques et la flèche souligne Myo52 localisation au foyer de fusion. (B), (C) déconvoluée unique z-avion épifluorescence micrographies de cellules avec des génotypes indiqués sont passés de MSL + N à MSL-N médias pendant 4 h et montés sur MSL-N mini-tampons d' agarose contenant 0,1 pg / ml (B) ou 1 pg / ml (C) du facteur P pendant le temps indiqué. Arrowheads indiquent dynamique (B) ou stables zones (C) SCD2-GFP. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film supplémentaire 1: timelapse DIC de type sauvage h90 levure de fission CE lls qui étaient l' azote affamé pendant 6 heures avant l'imagerie. (clic droit pour télécharger).
Film supplémentaire 2: . Timelapse DIC de type sauvage h + et les cellules de levure fission h- qui ont été mélangés et de l' azote-faim pendant 6 heures avant l'imagerie (clic pour télécharger).
"> Film supplémentaire 3: déconvoluée seul plan z épifluorescence et DIC timelapse de cellules h- exprimant Myo52-3GFP du locus natif mélangé avec h + cellules exprimant Myo52-tdTomato du locus natif et GFP cytosolique du promoteur spécifique de map3 P-cellulaire . les cellules ont été cultivées dans un milieu MSL-N pendant 6 heures à 30 ° C avant l'imagerie. Transfert de la GFP cytosolique dans la cellule h- définit le temps de fusion. (clic droit pour télécharger).
Film supplémentaire 4: déconvoluée seul plan z épifluorescence et DIC timelapse de h- cellules sxa2 expression SCD2-GFP de son promoteur natif traité avec 0,1 pg / ml P-facteur. Les cellules ont été cultivées dans un milieu MSL-N pendant 4 heures à 30 ° C avant l' imagerie. (clic droit pour télécharger).
Film supplémentaire 5: . Déconvoluée seul plan z épifluorescence et DIC timelapse des cellules sxa2 h- exprimant SCD2-GFP de son promoteur natif traité avec 1 pg / ml P-facteur cellules ont été cultivées dans un milieu MSL-N pendant 4 heures à 30 ºC avant l' imagerie. (clic pour télécharger).
| YSM995 | h- poids |
| YSM1371 | h + wt |
| YSM 1396 | h90 poids |
| YSM2534 | h- myo52-3GFP :: kanMX |
| YSM2730 | h + myo52-tdTomato :: natMX PMAP3: GFP :: ura4 + @ ura4locus |
| YSM2731 | h- SCD2-GFP :: :: natMX sxa2Δ kanMX |
Tableau S1: Souches utilisées dans cette étude.
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Discussion
Les conditions environnementales, et la disponibilité des nutriments, en particulier, affectent fortement la physiologie fission de la levure. Azote famine est nécessaire à l' engagement de la reproduction sexuée et conduit à des changements frappants dans la progression du cycle cellulaire mitotique (Réf. 21 et figure 2) au départ. Lors de l' élimination de l' azote de la population en croissance exponentielle, la taille des cellules à division diminue rapidement (figure 2C) et la majorité des cellules arrêter la progression mitotique plus courte que la longueur des cellules cultivées de manière exponentielle nouveau - nés (Réf. 21 et à la figure 2D). Comme les cellules de types sexuels opposés arrêtent la progression mitotique ils engagent des partenaires d' accouplement et de procéder pour former des zygotes et des sporuler (figure 2B, 2E, 2F). Dans le cas d'une monocouche à deux dimensions de cellules de type sauvage, plus de soixante pour cent des cellules H90 engagera un partenaire, et presque tous feront l' objet d'une fusion cellulaire (Figure 2G (figure 2G). L'un des aspects les plus critiques du protocole pour obtenir des rendements élevés d'accouplement est d'assurer que les cellules sont maintenues dans les densités indiquées tout au long. Surveillance de la taille des cellules et l' efficacité de l' accouplement des paramètres comme le montre la figure 2 fournit alors un contrôle simple que les cellules pénètrent dans la reproduction sexuelle de manière efficace.
Nous notons que, puisque l' accouplement manque moyen d' une source d'azote (même les faibles quantités d'acides aminés et des bases azotées sont exclues), les rendements élevés d'accouplement telles que celles présentées dans la figure 2E et 2G ne sont obtenus avec des souches entièrement prototrophes. souches auxotrophes peuvent être utilisés, mais nécessitent des soins supplémentaires pour assurer que les cellules sont en tout temps conservés dans les densités cellulaires indiquées dans le protocole. Même avec soin, seulementl'efficacité d'accouplement inférieurs seront observés. efficacité Mating est également influencée par la température, avec des rendements plus faibles observés à température élevée, ce qui peut limiter l'utilisation des allèles mutants sensibles à la température pendant le processus d'accouplement.
La méthode présentée ici est principalement utilisé pour l'imagerie à long terme des reporters fluorescents. Étant donné que l'imagerie est effectuée sur une longue période de temps, l'imagerie réussie de la levure à fission accouplement est fortement dépendante de la configuration de la microscopie disponible. Pour cela, la stabilité du microscope mise en place, sa sensibilité et l'accès à un système de mise au point automatique sont critiques. Soit basée sur les logiciels ou systèmes autofocus matériel intégrés sont possibles. En outre, pour augmenter le débit, une platine motorisée permettant l'acquisition multipoint est une autre qualité importante.
une qualité d'image est limitée par les propriétés du fluorophore d'intérêt. Les durées d'incubation distinctes dans un milieu liquide MSL-N détaillé dans Protocol Section 2.3 sont destinées à l'optimisation de la fluorescence sur les protéines marquées induite par la phéromone et de minimiser le blanchiment inutile par imagerie étapes que l'accouplement d'intérêt. Bien que les protéines abondantes ou très focalisés par fluorescence marqués permettent l' acquisition de centaines de points de temps au cours de l'ensemble du cycle de vie sexuelle (Film S3), d' autres protéines sont difficiles à l' image sur ces longues périodes en raison de photo-blanchiment. La qualité d'image dépend également du fluorophore choisi, typiquement un dérivé de GFP. Nous avons observé à plusieurs reprises que sfGFP 17 (superfolder GFP), qui se plie avec une cinétique rapide, à condition de signal supérieure au cours du processus d'accouplement, peut - être parce forte autophagie induit le renouvellement des protéines rapide. Surtout, nous ne contrôlons pas la disponibilité de l' oxygène nécessaire à la protéine fluorescente maturation 17,22. Ainsi, il est recommandé d'être prudent dans l'utilisation de mesures de fluorescence pour quantifier les niveaux de protéines exprimées après que les cellules sont mounteD sur des lames, ou d'utiliser des dispositifs microfluidiques perméables alternatifs d'oxygène pour mener de telles expériences. En outre, des tampons d'agarose repérés avec des cellules dans la soirée et conservés à 18 ° C O / N ont été très utiles à l'image des journalistes faibles que ces plaquettes contiennent un mélange de cellules à toutes les étapes de la reproduction sexuée.
Mating dans la levure de fission ne présente pas synchronie et cellules peut être facilement vu initier shmooing aux côtés d' autres cellules sporulantes déjà (Films S1, S2). Cette dynamique de la population rend les techniques biochimiques classiques, en vrac difficiles à utiliser, ce qui rend la microscopie cellulaire unique décrit ici une méthode de choix. Toutes les approches basées sur la microscopie-peuvent en principe être appliquées aux cellules préparées avec le protocole décrit ici. Fait important, ces approches peuvent surveiller les processus qui présentent l' accouplement dynamique spécifique de type telles que la fusion cellule-cellule décrite par Dudin et ses collègues 12. Pour surveiller l'asymétrie, les reporters de type d'accouplementont été particulièrement utiles (figure 3A). Différenciation entre les deux types d'accouplement est facile à réaliser lorsque l'on travaille avec des souches hétérothallique en employant fluorophores distincts pour marquer les protéines dans le h- et h + cellules. Cependant, ceci est impossible pour les souches homothalliques. Une approche développée pour différencier le type de cellules H90 d'accouplement est d'exprimer des protéines fluorescentes cytosolique sous le contrôle de promoteurs spécifiques de type d'accouplement. En particulier, les promoteurs des récepteurs de phéromone gènes map3 et mam2 ont été utilisés pour conduire l'expression de la GFP ou mCherry protéines dans P et les cellules M , respectivement. En outre, ces marqueurs a permis une synchronisation précise de la fusion cellule-cellule, comme visualisé le transfert du signal de fluorescence d'une cellule partenaire à l'autre.
Phéromones d'accouplement sont des déterminants cruciaux pour progresser à travers des étapes distinctes de la reproduction sexuée dans la levure 11,23. Différents niveaux de synthèse phéromone conduisent à différents états de polarisation de la cellule dans la levure de fission (figure 3B, 3C et. Réf 11). Le protocole inclus ci-dessus permet d'évaluer la façon dont les niveaux de phéromones exogènes distincts affectent la physiologie cellulaire. Étant donné que la phéromone protéase Sxa2 se dégrade rapidement le facteur P, une souche mutante hétérothallique où la protéase a été supprimé a été utilisée pour obtenir des résultats reproductibles. Toutefois, dans les mélanges de cellules de types sexuels opposés, non seulement les niveaux, mais également la distribution spatiale des phéromones émises par un partenaire d'accouplement sont susceptibles d'être importants. L' analyse des effets de la phéromone distribution spatiale sur la réponse cellulaire nécessitera le développement de configurations plus sophistiquées telles que des dispositifs microfluidiques employés sur la levure bourgeonnante 24,25.
En résumé, nous présentons une méthode de base pour la microscopie à long terme du cycle de vie sexuelle de levure de fission. Des ajustements mineurs à ce protocole permettent recherch se concentrer sur les réponses cellulaires à des stades distincts du cycle de vie sexuelle. La combinaison de cette approche avec les outils de biochimie cellulaire unique et des dispositifs microfluidiques permettra de promouvoir davantage la levure à fission reproduction sexuelle comme un système modèle puissant.
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Acknowledgments
AV a été soutenu par une bourse de recherche postdoctorale EMBO à long terme. La recherche dans le laboratoire Martin est financé par une subvention de démarrage du CER (GeometryCellCycle) et une subvention nationale suisse Science Foundation (31003A_155944) à SGM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
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