Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

indkapsling cytochrom Published: March 1, 2016 doi: 10.3791/53802
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, Fairfield University

Summary

Denne procedure beskriver, hvordan man indkapsle cytochrom c (cyt. C) i silica (SiO2) sol-geler, proces disse geler til dannelse bioaerogels, og bruge disse bioaerogels til hurtigt genkende nitrogenoxid (NO) gennem en gas-fase-reaktionen. Denne type protokol kan støtte i den fremtidige udvikling af biosensorer eller andre bioanalytiske enheder.

Abstract

Applikationer såsom sensorer, batterier og brændselsceller er blevet forbedret gennem brug af meget porøse aerogeler når funktionelle forbindelser er indkapslet inden for aerogeler. Men få rapporter om at indkapsle proteiner i sol-geler, der behandles til at danne aerogeler eksisterer. En procedure til indkapsling cytochrom c (cyt. C) i silica (SiO2) solgeler der er superkritisk forarbejdet til dannelse bioaerogels med gasfase-aktivitet for nitrogenoxid (NO) er præsenteret. CYT. C sættes til en blandet silicasol under kontrolleret proteinkoncentration og pufferstyrke betingelser. Solen Blandingen geleres og væsken fylder gel porerne erstattes gennem en række udvekslinger opløsningsmiddel med flydende carbondioxid. Carbondioxidet er bragt til dets kritiske punkt og udluftet for at danne tørre aerogeler med cyt. C indkapslet inde. Disse bioaerogels er kendetegnet med UV-synlig spektroskopi etd cirkulær dikroisme-spektroskopi og kan anvendes til at påvise tilstedeværelsen af ​​gasfase nitrogenoxid. Succesen med denne procedure er baseret på regulering af cyt c. Koncentration og bufferen koncentration og kræver ikke andre komponenter såsom metal nanopartikler. Det kan være muligt at indkapsle andre proteiner ved anvendelse af en lignende fremgangsmåde gør denne fremgangsmåde vigtigt for potentielle fremtidige udvikling bioanalytisk enhed.

Introduction

Cytochrom c (cyt. C) er et centralt elektron-transfer-protein involveret i kroppens cellulære respiration reaktioner. Det er blevet vist at være involveret i apoptose, en styret form for celledød, og det kan detektere sådanne små toksiske molekyler som nitrogenoxid og carbonmonoxid 1-3. Nitrogenoxid (NO) spiller en rolle i en række fysiologiske processer, der finder sted i nervesystemet, kardiovaskulære og immunforsvar. Mens cyt c. Typisk kræver et vandigt miljø pufret til pH-neutrale værdier forbliver strukturelt intakt og aktive, har forskningen vist, at cyt c. Kan bevare sin struktur og funktion i faste materialer kendt som aerogeler under visse betingelser 4-9.

Aerogeler er meget porøse materialer ofte dannet ved syntetisering sol-gel metaloxider (Mens metaloxidpartikler aerogeler er meget almindelige, har carbon og andre typer af aerogeler blevet syntetiseret. Et eksempel er InP aerogels) 10 og tørring disse solgeler på en sådan måde, at den porøse faste matrix er uændret 11-14. Alle porer i solide aerogeler resultere i langt tilgængelige overfladeareal gør aerogeler yderst anvendelige til alle applikationer, hvor overfladereaktioner er vigtige. Når kemisk eller biokemisk funktionalitet er samlet i aerogel nanoarchitecture, er det blevet vist, at den fysiske porøsitet og forøget overfladeareal af aerogeler bidrage til at forbedre sensorer, samt elektroder til batterier, brændselsceller og supercapacitor ansøgninger 11,15-23 . For at tørre aerogeler på en måde, der efterlader det porøse faste matrix uændret, er det typisk at fjerne opløsningsmidlet, som forbliver i porerne efter sol-gel-syntese ved ekstraktion superkritisk opløsningsmiddel. Enhver pore kollaps, der kan være forårsaget af overfladespændingskræfter Som opløsningsmiddel fordamper fra gelen minimeres, fordi i superkritisk tørring, en væske-damp-interface aldrig former.

c. er indkapslet i solgeler som er blevet opbevaret vådt eller der er blevet tørret ambiently 24-30. Samling af indkapslende biomolekyler i solgeler der derefter tørres superkritisk til dannelse aerogeler er sjældnere på grund af den nødvendige behandling, der kan være skadelige for strukturen af ​​mange proteiner. I tilfælde af cyt c., Visse betingelser gør det muligt at bevare evnen af cyt c. At påvise og svare gasfase nitrogenoxid inden aerogeler. Når stabiliseret i aerogel, letter høj kvalitet porestruktur aerogelen reaktionen mellem cyt c. Og nitrogenoxid 4,8,9. CYT. C kan indkapsles i aerogeler ved først at knytte den i flere lag omkring guld eller sølv nanopartikler i opløsning 4-8. Disse flerlaget overbygninger tjener til at beskytte proteinet i aerogel matrix. I den seneste approach, som vi har udviklet, når koncentrationen protein og buffer styrke styres sammen med andre syntetiske betingelser, cyt. c bevarer integritet inden for de aerogeler selv uden metal nanopartikel indledende association 9.

Syntesen begynder som mange aerogel synteser begynde ved at blande silica sol-gel forstadier for en fastsat periode. Det er efter et sæt blandetid at cyt c. Tilsættes som en pufret opløsning i blandingen. Gelering sker derefter til dannelse af en porøs silica fast struktur, hvor porerne er fyldt med vand, methanol, resterende reaktanter og biprodukter. Denne væske, som fylder porerne kan skylles ud med forskellige opløsningsmidler gennem en række udvekslinger opløsningsmiddel, de sidste udvekslinger med flydende carbondioxid finder sted i et kritisk punkt tørreapparat holdes ved lav temperatur. At bringe gelerne over den kritiske temperatur (31,1 ° C) af kuldioxid letter dannelsen af ​​somupercritical væske inde i tryksatte apparat, som kan udluftes til dannelse tørre, meget porøse aerogeler. Den relativt lave temperatur, der kræves for carbondioxid til dannelse af en superkritisk fluid er fordelagtig sammenlignet med andre opløsningsmidler, fordi det holder proteinet under en temperatur, ved hvilken det kunne denaturere.

Vores metalnanopartiklen-fri tilgang til indkapsling cyt c. I aerogeler er fordelagtig, fordi det er en enkel procedure, som kan føre til udviklingen af et mere generelt anvendelig protokol til indkapsling af andre proteiner også. Mange proteiner kan ikke interagere med metalnanopartikler på samme måde som cyt c. Gør, og metalnanopartiklen syntese eller køb tilføjer yderligere tid og omkostninger til fremgangsmåden. De få rapporter om at indkapsle proteiner i aerogeler gøre udviklingen af ​​denne procedure et betydeligt skridt frem til at finde en mere generel fremgangsmåde til at indkapsle andre proteiner i aerogeler, der kan hjælpe in potentielle fremtidige bioanalytiske enheder.

Protokollen afsnit af dette håndskrift skitserer, hvordan at syntetisere silica solgeler, indkapsle cyt c. I disse solgeler, tørre disse sammensatte solgeler til dannelse aerogeler, karakterisere disse bioaerogels under anvendelse af UV-synligt og cirkulær dikroisme-spektroskopi og påvise tilstedeværelsen af gasfase nitrogenoxid med disse bioaerogels. CYT. C er blevet indkapslet i aerogeler når først opløst i 4,4 til 70 mM vandige opløsninger af phosphatpuffer. Men optimeret proteinstruktur i aerogeler er fundet, at resultatet, når indkapsling 40 mM phosphatpufret opløsninger af cyt c. At producere loaded aerogel cyt c. Koncentrationer i intervallet fra 5 til 15 uM 9. Derfor protokollen nedenfor er at syntetisere aerogeler hjælp 40 mM phosphatpufret opløsninger af cyt. C resulterer i en indlæst cyt. Koncentration c i aerogeler på 15 uM. </ P>

Protocol

Sikkerhedsbriller eller beskyttelsesbriller, laboratoriekittel og laboratorie handsker skal bæres på alle tidspunkter i løbet af proceduren. Aldrig det kritiske punkt tørreapparat uden sikkerhedsbriller eller beskyttelsesbriller. Alle opløsninger indeholdende tetramethoxysilan, methanol, ethanol, acetone og ammoniak bør behandles inden for et stinkskab.

1. Lav Buffer og Cyt c. Løsninger

  1. For at gøre ~ 750 ml pH 7, 40 mM kaliumphosphatbuffer, først forberede 500 ml 0,04 M monobasisk kaliumphosphat ved at afveje 2,72 g monobasisk kaliumphosphat og opløsning i vand under anvendelse af en 500 ml målekolbe.
  2. Forbered 500 ml 0,04 M dibasisk kaliumphosphat ved at afveje 3,48 g dibasisk kaliumphosphat og opløsning i vand under anvendelse af en 500 ml målekolbe.
  3. Hæld den dibasiske saltopløsning i et stort bægerglas med en omrører og begynde omrøring af opløsningen på en omrøringsplade.
  4. Tilsæt langsomt dele af det monobasiske salt solution til den dibasiske saltopløsning under overvågning af pH med en pH-elektrode og måler indtil pH er 7,00. Ca. 250-300 ml af den monobasiske salt Løsningen skal bruges.
  5. Afvej ca. 0,023 g cyt c. Og sted i glasscintillationshætteglas. Tilføj 2.000 pi tilberedt kaliumphosphatbuffer Med en mikropipette og derefter forsigtigt hvirvel opløsningen blandes, indtil alt det faste stof, rød cyt c. Har opløst i opløsningen, og der ikke findes partikler tilbage.
  6. Tag 20 pi af den forberedte cyt c. Opløsning og tilføje til en 1-cm vejlængde plast kuvette. Tilsæt 3 ml af tilberedt puffer.
  7. Tag UV-vis spektret fra 300-700 nm ved anvendelse af buffer i referencecellen. Brug cyt c. Absorbans (A) ved 409 nm, ekstinktionskoefficienten 31 (ε) af 106.100 M -1 cm-1, kuvetten banelængde (l), og Lambert-Beers lov til at bestemme koncentrationen (c) af opløsningen (A = εlc).
  8. Tilbage beregne koncentrationen af ​​den oprindelige fremstillede opløsning. De 2 ml fremstillet cyt c. Opløsning er typisk mellem 0,7 til 0,9mM i koncentration.
  9. Fortynd den oprindelige forberedt cyt c. Opløsning til 800 pi 0,105 mM ved pipettering 117 pi 0,72 mM fremstillet cyt. C opløsning i et scintillationshætteglas. Tilsæt derefter resten af ​​de 800 pi (683 pi i dette tilfælde) af tilberedt buffer. Swirl at blande. De præcise mængder vil variere afhængigt af den nøjagtige koncentration af den oprindelige fremstillet cyt c. Opløsning som mængden af cyt c. Til pipette er beregnet som (800 pi * 0,105 mM) / (oprindelig cyt. Koncentration ci mM).
  10. Opbevar originale forberedt og fortyndet cyt c. Løsninger ved 2-8 ° C i køleskab indtil den er klar til brug i op til to uger.

2. Syntetisere Silica (SiO2) Sol

  1. Mærk en engangs 50 ml polypropylen bægerglas 'BeAker A '. Placer bæger på panden af ​​en analytisk balance og bruge et glas Pasteur-pipette for at tilføje 1,88 g tetramethoxysilan i bægerglasset. Nul balancen og derefter pipette 2,88 g methanol i 'Bæger A'.
  2. Cover 'Bæger A' med Parafilm.
  3. Mærk en engangs 50 ml polypropylen bægerglas 'Bægerglas B'. Tilføj en magnetisk omrører og sted på panden af ​​en analytisk balance. Brug en glaspipette for at tilføje 0,75 g vand og 3,00 g methanol.
  4. Cover 'Bæger B' med Parafilm.
  5. Begynd omrøring indholdet af "Bæger B 'på en røre plade inde et stinkskab, derefter bruge en sprøjte til at indsætte 5 pi 28,0-30,0% ammoniakopløsning gennem Parafilm dækker i blandingen under omrøring.
  6. Så snart trin 2.5 er færdig, tilsættes indholdet af 'Bæger A' til 'Beaker B'. Omrør blandingen i 20 minutter, mens dækket i Parafilm.

3. Forbered Gel forme

Bemærk: Derer tid til at forberede gelen forme mens sol blandingen silica omrøring i trin 2.6.

  1. Anskaf 8-9 polypropylen scintillationsglas (16 mm x 57 mm, volumen størrelse 6,5 ml, med bunde skåret væk) og tilsvarende hætter. Sæt plastikfolie over hætten ende af hætteglasset for at skabe en flad overflade for gelen at danne på og placere hætten over det at sikre, at plastikfolie forbliver intakt inde i hætten.
  2. Line up hætteglassene med cap-ende ned på bænken toppen og åbnede bunde opad.

4. Forbered Cyt. C -Silica Sol-geler

  1. Ved afslutningen af ​​sol blanding (trin 2.6), der tilsættes 3 ml sol blandingen til en ren engangsbrug 50 ml polypropylen bægerglas.
  2. Brug en glas Pasteur-pipette til langsomt falde 500 pi af 0,105 mM fortyndet cyt. C-opløsning (fremstillet i trin 1.9) til 3 ml sol blanding i løbet af ~ 1 min. Sørg for at forsigtigt at hvirvle blandingen samtidig med at tilføje cyt c. At undgå dannelse af storerøde klumper. Antages volumenerne er additive, ved fortynding 500 pi af 0,105 mM cyt c. Opløsning til 3.500 pi, cyt c. Koncentration nu i solen er i teorien, 15 uM.
  3. Pipetter 0,5 ml af den resulterende cyt c. Silicasol i hver forberedt støbeform. Også Pipettér 0,5 ml resterende "plain" silica sol i én eller to forme til at bruge som kontrolprøver under superkritisk tørringsprocessen.
  4. Dække ansigtet op åbninger formene med Parafilm og sættes i køleskab (~ 2-8 ° C) natten over eller i mindst 12 timer for at producere sol-geler.
  5. Tag formene ud af køleskabet. Fjern Parafilm fra toppen af en form indeholdende en cyt c sol-gel.; også fjerne hætten og plastikfolie fra bunden.
  6. Efter tilsætning nogle ethanol fra en vaskeflaske i formen, så brug cirkulær skive ende af et sprøjtestempel til nøje at skubbe gelen ud af formen og ind i en ren 20 ml glasscintillationshætteglas containing ca. 5 ml ethanol.
  7. Gentag denne gel fjernelse procedure (trin 4.5 og 4.6), indtil alt cyt c. Geler sættes til hætteglasset og alle de silicageler sættes til en separat hætteglas. Hvis mere end én koncentration af cyt c. Gel er foretaget, skal du sørge for at gemme som geler sammen inden separate hætteglas. Derefter fylde hætteglassene til toppen med ethanol, cap og opbevar mellem 2-8 ° C.
  8. Hvert fjerde time i løbet af dagen, skal du fjerne geler fra køleskabet, dekanter ethanol off geler og erstatte med frisk ethanol.
  9. Under yderligere tre dage, nedsænkes de våde sol geler i acetone, dekantering og tilsætning af frisk acetone tre gange om dagen.

5. superkritisk Dry Cyt c. -Silica Solgeler

  1. Afkøl en kritisk punkt tørreapparat (se figur 1) til 10 ° C ved indstilling af temperaturen af en vedhæftet cirkulationspumpen til 8 ° C.
  2. Når apparatet har reached 10 ° C, udføres en tæthedsprøvning på apparatet ved at fylde en overførsel båd med acetone og forsegling det inde i apparatet.
    1. Åbn påfyldningsventilen af ​​apparatet og tilføj carbondioxid indtil apparatet er halvt fyldt.
    2. Luk fyld ventil og lytte opmærksomt til hvæsende ved dørene og ventiler, hvor O-ringe eller pakninger kan være forværrede.
    3. Udskift O-ringe eller pakninger, hvis en lækage er fundet.
  3. Efter endt lækage test, åbne aftapningsventilen at frigive acetone og kuldioxid i afløbet af et stinkskab. Fjern derefter overførsel båd fra apparatet.
  4. Efter at have sikret, at apparatet er lækagefri, omhyggeligt hæld de våde geler fra de scintillationshætteglas sammen med de fleste af acetone, til overføringsrøret bådens tre lange sektioner (specimen kurve eller gaze dæksler er ikke nødvendigt). Fint skubbe og bevæge gelerne inden båden med pincet for at sikre, at alle geler helt neddykket in acetone. Tilsæt mere acetone hvis nødvendigt før forsegling båden inde i apparatet.
  5. Åbn påfyldningsventilen af ​​apparatet for at tilføje carbondioxid, derefter åbne aftapningsventilen at frigive acetone i fem minutter, så snart acetone blanding med carbondioxidet er observeret at være synker til bunden af ​​apparatet gennem apparatet vinduet. Denne udsivning af acetone til bunden vil forekomme inden apparatet er helt fyldt med carbondioxid, så påfyldningsventilen bør forblive åben i nødvendigt omfang under afvandingen således at apparatet fortsat vil udfylde selv mens afløbet er åben.
  6. Luk aftapningsventilen. Hold fyld ventil revnet åben lidt.
  7. Fem minutter senere, åbn aftapningsventilen i fem minutter igen og juster påfyldningsventilen at blive åbnet så meget, at apparatet forbliver fuld under hele dræning tiden. Luk aftapningsventilen, holde fyld ventil revnede, og derefter gentage denne dræning trin en gang til femminutter senere.
  8. Efter disse første tre dræning trin, åbnes afløbet i 5 minutter ad gangen cirka hver 40 min over strækning af mindst seks timer for at sikre fuldstændig udskiftning af acetone ved flydende carbondioxid inden gelerne. Juster altid påfyldningsventilen til at være åben nok under hver tømning så at væskeniveauet i apparatet falder aldrig under toppen af ​​båden under tømning.
  9. Når dræning trin er fuldført, skal du lukke fyld ventil, og tøm flydende kuldioxid således at niveauet forbliver synlig lige over tænderne på båden ved at se gennem apparatet vinduet.
  10. Indstil temperaturen af apparatet fastgjort cirkulationspumpen til 40 ° C for at sikre, at det flydende carbondioxid stiger over sin kritiske temperatur og tryk (Tc = 31 ° C; P c = 7,4 MPa).
  11. Efter ca. 15 min, observere overgangen fra væske til superkritisk fluid gennem apparatet vinduet, når den flydende meniscos over krogene af båden forsvinder. Tillad mindst 15 minutter af ligevægt tid, derefter åbne udluftningsventilen et lille beløb for at begynde at frigive superkritisk væske.
  12. I løbet af ca. 45 minutter, fortsat trinvist åbne udluftningsventilen bredere og bredere, således at en stabil, men meget lav hvæsen frigive fluid kan høres og observeres manometeret til langsomt falde til nul.
  13. Efter at trykket af apparatet er gået til nul, åbne apparatet døren, fjerne båden, og bruge pincet til at placere de nyligt tørrede aerogeler i rene glasscintillationshætteglas.

6. karakterisere Cyt. C -Silica Aerogeler med UV-synlige og cirkulær dikroisme (CD) spektroskopi

  1. Forbered en pap platform til at holde aerogelen monolitter i strålebanen af ​​UV-Visible spektrofotometer eller CD-spektrometer.
    1. Klip en 2,5 cm x 2,5 cm stykke letvægts pap (såsom pap fra en kasse med labotestinstitution væv), fold det på midten, skære halvvejs op på folden, så fold de to flapper, skabt ved at skære, tilbage.
    2. Skære en 5 cm x 5 cm stykke af letvægts pap, med en 1,5 cm x 1,5 cm kvadratisk hul i midten. Så brug sort elektrisk tape til at formindske størrelsen af ​​lastrummet til 0,5 cm x 0,5 cm.
    3. Tape flapperne på foldet og skære pap mod 5 cm x 5 cm stykke pap, således at en lille bøjet overflade er oprettet til en aerogel monolit at sidde på direkte foran hullet 0,5 cm x 0,5 cm (se figur 2) . Så tape bagsiden stykke pap til UV-synlige spektrofotometer så hullet er i tråd med strålegangen.
  2. Måle tykkelsen af ​​gelerne, som vil blive anvendt til vejlængder, med et mikrometer.
  3. Placer en gel på pappet platform og måle en spektrum fra 300-800 nm med luft i referencen rum i UV-synligt spektrofotometer.
  4. Monter et polynomium, A = en n, til bølgelængden (λ) region, hvor absorbansen (A) skyldes primært baggrund spredning, ~ 700-800 nm. Den en koefficient er typisk egnet til et tal mellem ~ 1 x 10 8 og 1 x 10 6 og n koefficienten er typisk egnet til et tal mellem ~ 2 og 3.
  5. Beregn scatter ved andre bølgelængder, ved hjælp af koefficienter, a og n, opnået fra pasform.
  6. Træk dette beregnede scatter baggrund absorbans fra den rå spektrum for at opnå en scatter korrigeret spektrum.
  7. Monter scatter subtraheret spektrum med en gaussisk kurve i området på 370 til 490 nm ved anvendelse af passende software (gram / AI 8,0) for at bestemme den maksimale højde, peak center, og peak bredde af Soret toppen af ​​aerogel.
  8. Påfør Beer-Lambert lov hjælp den målte tykkelse af gelen for vejlængde (l), ekstinktionskoefficienten 31 (ε) af 106.100 M -1 cm-1 c. i aerogel (A = εlc).
  9. Sammenlign beregnede cyt c. Koncentration til koncentrationen teoretisk i gelen (15 uM) at fastslå levedygtighed cyt c. I aerogel. Typiske procent levedygtighed er tæt på 100%, men det skal bemærkes, at disse levedygtighed er bare skøn, fordi beregningen er baseret på ekstinktionskoefficienten for cyt c. I opløsning 31, som formodes at være lidt anderledes end ekstinktionskoefficienten for cyt. ci aerogelerne som ikke er kendt.
  10. Kør kvælstof i CD instrument mindst 5 min før du tænder lampen på.
  11. Tape indehaveren af ​​pap til cd spektrometer så hullet er i tråd med strålegangen.
  12. Måle en kontinuerlig bølgelængde blank spektrum med intet i holderen pap fra 350-500 nm ved 100 nm / min, idet et gennemsnit af tre scanninger.
  13. Placer en gel (tykkelse tidligere målt i trin 6.2) på pappet platform og måle en spektrum fra 350-500 nm ved 100 nm / min, idet et gennemsnit af tre scanninger.
  14. Gentag UV-synlige og CD-målinger for alle aerogel monolitter af interesse.

7. Detect Tilstedeværelse af nitrogenoxid (NO) Gas med Cyt. C -Silica Aerogeler

ADVARSEL: Arbejde med NO er ​​farligt og alt NO-gas skal håndteres i et stinkskab eller udtømt i et stinkskab. Vedvarende udsættelse for NO er ​​giftigt for væv særdeles giftig nitrogendioxid og / eller nitrogentetroxid vil danne, når NO kommer i kontakt med luft. Varme og ætsende dampe fremstilles også når NO kommer i kontakt med vand.

  1. Placer en 8 L nitrogenoxid cylinder (10% nitrogenoxid, 90% nitrogen) i et godt ventileret stinkskab og justere trykket til 4 psi.
  2. Tilslut slangen til både nitrogenoxid cylinderen og til et nitrogenatom cylinder (tryk indstillet til 6 psi) og forbinde enderne af slangen til en T-ventil (se figur 3a).
  3. Vælg en aerogel monolit for eksperimentet og måle tykkelsen (eller sti længde) med et mikrometer.
  4. Placer aerogel (~ 3 mm tyk) i en engangscuvette med plastik hætte og sætte kuvetten ind i spektrofotometer. Skær aerogel lidt om nødvendigt til at passe i kuvetten.
  5. Sæt to injektionsnåle i plasthætten af kuvetten, én forbundet til udgangen af T-ventil, og som er tilsluttet et rør til at tjene som udstødningsgas ind i stinkskabet (se figur 3b). Brug Parafilm at forsegle nåle til at slangen og hætten til kuvetten.
  6. Placer en tom engangscuvette i henvisningen celle.
  7. Juster aerogel kuvetten stand til at sikre, at aerogelen ligger i strålegangen før start af eksperimentet.
  8. Tag en indledende spektrum fra 800 til 300 nm.
  9. Overvåg forskellen mellem absorbansen ved 414 nm og absorbansen ved 408 nm, mens du drejer T-ventil til at skifte mellem kvælstof og nitrogenoxid / kvælstof blanding ved sæt tidsintervaller at sikre, at der på intet tidspunkt er strømningshastigheden af ​​nitrogen eller nitrogenoxid / kvælstof-blanding så høj, at aerogelen bevæger sig rundt i kuvetten.
  10. Tag en endelig spektrum fra 800 til 300 nm, når cyklerne eksponering er færdig.
  11. Gentag proceduren med tre til fire monolitter at opnå en gennemsnitlig sensing respons.

Representative Results

De beskrevne fremgangsmåde resulterer i aerogeler indeholdende levedygtige cyt c.. Som angivet i slutningen af indledningen kan cyt c. Indkapsles fra vandige pufferopløsninger, der spænder fra 4.4 til 70mM phosphat. Eksempler på cyt c. -Silica (Cyt c. -SiO 2) aerogeler fremstillet fra opløsninger indeholdende forskellige bufferkoncentrationer er vist i figur 4. Alle geler er relativt gennemskinnelige, med gelerne fremstillet af 70 mM buffer mest uigennemsigtige.

En sammenligning af spektroskopi af cyt c. Under forskellige betingelser er vist i figur 5. En typisk spektrum (figur 5c) viser den store Soret top omkring 408 nm for cyt c. -SiO 2 aerogeler og er meget lig spektret af cyt c. i opløsning (figur 5a). Desuden et spektrum af cyt.c indkapslet i aerogeler med metal nanopartikler er også vist (figur 5b) og cyt. c -SiO 2 aerogel spektrum svarer til dette spektrum samt. Når cyt. C -SiO 2 aerogel er udsat for nitrogenoxid, er en typisk forskydning af Soret top observeret (figur 5d).

UV-vis spektre for geler fremstillet af cyt c. Opløsninger i varierende bufferkoncentrationer er vist i figur 6. Alle disse geler viser karakteristiske UV-synlig spektroskopiske funktioner indikerer, at cyt c. Ikke er i en denatureret tilstand inden gelerne. Imidlertid faldt gennemskinnelighed på gelerne fremstillet af 70 mM bufferopløsninger resulterer i et lavere signal-til-støj-forholdet for disse spektre.

CD spektre af cyt c. -SiO 2 aerogeler ligner spektrene af cyt c. c. i pufret opløsning (figur 7).

Figur 8 viser en typisk nitrogenoxid overvågning respons for cyt c. -SiO 2 aerogeler og tilsvarende aerogeler, der også indeholder metalnanopartikler udover cyt c.. Forskellen mellem absorbansen ved 414 nm og at i 408 nm ses at stige og derefter falde, når gelerne er udsat for nitrogenoxid og derefter nitrogen henholdsvis i rækkefølge.

Hvis superkritisk carbondioxid ikke bliver frigivet ved en langsom nok hastighed, levedygtighed cyt c. Inden de dannede aerogeler vil blive kompromitteret. Dette er afsløret ved at sammenligne resulterende UV-synlige spektre efter dannelse geler ved at frigøre carbondioxid ved forskelligesatser (Figur 9).

Figur 1
Figur 1: Kritisk punkt tørreapparat Det kritiske punkt tørreapparat vist fra (A) foran og (B) tilbage med overførsel båd og et apparat døren vises ved siden af bagsiden af apparatet..

Figur 2
Figur 2: Pap platform Det samlede pap platform til at holde en aerogel i vejen for et instruments bjælke..

Figur 3
Figur 3: Nitrogenoxid sensing set-up Den nitrogenoxid sensing set-up er vist herunder (A) stinkskabet medfølgende 10% nitrogenoxid., 90% nitrogen cylinder, slanger og T-ventil, og (B) kuvetten med indsatte kanyler.

Figur 4
Figur 4:.. Prøve cyt c -SiO 2 aerogeler aerogeler indkapsling 15 pM cyt c i 4,4 mM, 40 mM og 70 mM kaliumphosphatbuffer er vist i sammenligning med en dime fra venstre til højre.. Disse aerogeler er cirka 0,2-0,5 cm høj. Genoptrykt med tilladelse 9.

Figur 5
Figur 5:. Cyt c -SiO 2 aerogel spektroskopi synlige spektre af 15 pM cytochrom c i (a) 50 mM phosphatbuffer sol.ution; (B) Au (5-nm) ~ cyt c -SiO 2 aerogel.; (C) cyt c -SiO 2 aerogel (udsat for luft).; (D) cyt c. -SiO 2 aerogel (udsat for nitrogenoxid i 3,5 min). Disse repræsentative spektre af hver type gel er forskudt for klarhed, og den stiplede linie betegner positionen af Soret toppen af cyt c. I buffer. Mens hvert spektrum er på 15 uM cyt c., Gelen tykkelser (eller højde) er kun 0,2-0,5 cm i forhold til 1-cm-opløsning kuvette resulterer i en højere opløsning absorbans. Genoptrykt med tilladelse 9.

Figur 6
Figur 6: Aerogel spektroskopi som indkapslet buffer koncentration varieres gennemsnit af UV-synlige absorbansskala aerogeler divideret med gel banelængde for geler indkapsler 15 _.6; M cyt c i 70 mM (sort) (gennemsnit af 4 spektre), 40 mM (rød, stiplet) (gennemsnit af 8 spektre), og 4,4 mM (grøn, stiplet) (gennemsnit af 9 spektre) kaliumphosphatbuffer. . Genoptrykt med tilladelse 9.

Figur 7
Figur 7:... Aerogel cirkulær dikroisme-spektroskopi Cirkulær dichroisme-spektre af cyt c natriumindhold phosphatpufret opløsning (fast stof), to repræsentative spektre af cyt c -SiO 2 aerogeler (stiplet), og to repræsentative spektre af Au (5-nm) ~ cyt c. SIO 2 aerogeler (stiplet). Genoptrykt med tilladelse 9.

Figur 8
Figur 8: Nitrogenoxid detektion med cyt c -SiO 2. . sub> aerogeler Overvågning skiftet (Aa = En 414 nm - A 408 nm). i Soret intensiteten af cyt c (fast rød) og Au ~ cyt c (stiplet blå) indkapslet i SiO 2 sammensatte aerogel nanoarchitectures gas flow. skiftes mellem kvælstof (hvor Soret maksimal top er ved ~ 408 nm) og nitrogenoxid (hvor Soret maksimal top er på ~ 414 nm). Hver kurve er et gennemsnit af 3-4 forsøg, med to af cyt c -SiO 2 forsøg overvåges på Aa = En 414 nm -. En 407 nm, da indledende maksimum Soret toppen var på 407 nm for disse forsøg. Genoptrykt med tilladelse 9.

Figur 9
Figur 9:. Effekt af superkritisk tid væske frigivelse gennemsnit af UV-synlig absorbansskala divideret med gel banelængde for cyt c -SiO 2 aerogeler ENCA.psulating 10 uM cyt c. i 50 mM phosphatpuffer, hvor superkritisk tørrede aerogeler blev fremstillet ved enten at frigive superkritisk carbondioxid over 45 minutter (fast, sort (gennemsnit af 9 spektre)) eller 7 min (stiplet, rød (gennemsnit af 4 spektre)). Genoptrykt med tilladelse 9.

Discussion

Som beskrevet, har denne fremgangsmåde konsekvent produceret levedygtig cyt c. Indkapslet i aerogeler. Koncentrationen af cyt c. Inden for aerogeler kan varieres fra 5 til 15 um, og bufferen koncentration af den oprindelige cyt c. Opløsning indkapslet i aerogeler kan varierede fra 4,4 til 70mM phosphat uden alvorlige skadelige virkninger på levedygtighed protein. Men peak center og peak bredde den karakteristiske cyt c. Soret højdepunkt i aerogeler er tættest på, hvad de er for cyt c. I opløsning, når cyt c. Er indkapslet i aerogeler fra opløsninger med 40 mM buffer 9.

Syntesen af cyt c. -SiO 2 aerogeler påvirkes af alder nogle af udgangsreagenserne. Methanol, tetramethoxysilan, og ammoniumhydroxidopløsning er alle hygroskopiske og bør udskiftes hver en-til-to måneder. Den forøgede vand, der opbygges idisse reagenser over tid påvirker gel strukturelle karakteristika og sol-til-gel overgang tid.

Ved udførelse af superkritisk tørring, kan det kritiske punkt tørreapparater transfer båd rumme op til atten 0,5 cm tykke, 1 cm i diameter geler. Som beskrevet i protokollen sektionen, bør en bestemt fyldning og tømning procedure skal følges for at overføre kuldioxid i sol-geler. Det er vigtigt at bemærke, at i begyndelsen af ​​dræning protokollen, dræning blanding af kuldioxid og acetone flyder på et så højt sats, drænrøret fryser stiv med fugt kondenserende til is på ydersiden. Blandingen dræne ud indeholder noget vand, da acetone er ikke vandfri og dette vand kan lejlighedsvis fryse i et omfang, drænrøret faktisk træsko. Det er nødvendigt at holde øje med sådanne træsko og at lytte efter en standsning af strømning. Afløbsventilen skal være lukket for et par min så træsko vil smelte, hvis der registreres en træsko. Iværste fald, hvis aftapningsventilen ikke er lukket, kan en træsko forårsage så meget pres for at opbygge, at drænrøret kraftigt springer ud af apparatet. Efter de første få olieskift, vil størstedelen af ​​acetonen er blevet skyllet ud af apparatet, og forekomsten af ​​våd is klumper vil falde drastisk. Udledningen vil gradvist ligne tøris som afvandingen protokollen fortsætter med eventuelt resterende beviser acetone tilstedeværelse (såsom duft) bliver ikke kan påvises ved afslutningen af ​​dræning proces.

Efter carbondioxidet i apparatet har skiftet fra væske til superkritisk fluid og udluftningen er påbegyndt, er det nødvendigt at frigive fluidet ved en langsom hastighed over mindst 45 min som angivet i procedure 9. En højere hastighed for frigivelse kan nedsætte levedygtigheden af cyt c. (Som vist i figur 9) inden for aerogeler og aerogeler selv kan faktisk pause fra hinanden som the væske siv at flygte fra geler. Generelt selv når aerogeler forbliver intakte efter åbning af apparatet døren, er det vigtigt at håndtere dem omhyggeligt og skånsomt som de er skrøbelige og kan bryde nemt.

De kontrol silicageler, der hældes sammen cyt. C -SiO 2 geler anvendes efter superkritisk tørring at bestemme, om carbondioxid overførsel til gelerne var vellykket. Undertiden cyt c. -SiO 2 geler kan forekomme uklar, og det er vigtigt at bestemme, om dette skyldes overførsel ufuldstændig opløsningsmiddel eller hvis det kan have at gøre med koncentrationen af cyt c. Eller buffer indkapslet i gelerne. Hvis silicageler uden cyt. C synes at have et homogent, gennemskinnelige udseende hele vejen igennem, kan dette tages som bevis for, at opløsningsmiddel overførsel fandt sted helt selv hvis cyt. C -SiO 2 geler har nogle uklarhed for dem. Uklarhed inden for de silicageleruden cyt c. efter tørring viser, at nogle acetone forblev inde gelerne under udluftning.

Som anført i protokollen sektion, der skal tages vigtige sikkerhedsforanstaltninger ved arbejde med nitrogenoxid (NO). For at detektere NO hjælp af aerogeler, er det nødvendigt at forsegle kuvetten udmærket og at udtømme den gas, der strømmer over aerogeler i et stinkskab. Alternativt kan hele spektrofotometer blive flyttet til et stinkskab sammen med NO-gas cylinder som en ekstra sikkerhedsforanstaltning for at begrænse eksponering for NO-gas. Ved kontakt med luft NO straks vil producere den meget giftige nitrogendioxid, nitrogentetroxid eller begge dele. NO kan også reagere med vand til at producere varme og ætsende dampe. Derfor kan vedvarende udsættelse for NO resultere i direkte væv toksicitet.

Ved brug af cyt c. -SiO 2 aerogeler til at påvise tilstedeværelsen af nitrogenoxid, vil Soret-båndet indledningsvist være på ~ 408 nm og vil forskydetil ~ 414 nm i nærvær af nitrogenoxid. Efter at have skiftet tilbage til kvælstof, bør Soret bandet vende tilbage til at blive centreret på ~ 408 nm. Det kan også være muligt at anvende cyt c. -SiO 2 aerogeler til at påvise tilstedeværelsen af andre ligander såsom carbonmonoxid 27.

Forskellige offentliggjorte procedurer omfatter en ekstra trin med at kombinere guld eller sølv nanopartikler med cyt c. I opløsning før blanding med solen og superkritisk tørring til dannelse aerogeler 4-8. Sammenligning af UV-synlig spektroskopi af cyt c. Indkapslet i aerogeler med metal nanopartikler til den af cyt c. Indkapslet i aerogeler uden metalnanopartikler viser, at disse to typer af indkapslingsteknikker producere cyt c. Af tilsvarende levedygtighed inden for aerogeler (figur 5) . Imidlertid cyt c. Indkapslet med metalnanopartikler er lidt mere stabil end cyt. C indkapsled uden metalnanopartikler inden aerogelerne 9. CD-spektrene for begge typer af cyt c. Aerogeler også ligner hinanden, selv om begge er forskellige fra spektret af cyt c. I buffer der angiver en udfoldning af cyt c. Inden for aerogeler (figur 7). Tidligere rapporter om cyt. C indkapslet i aerogeler tyder på, at den cirkulære dikroisme spektroskopi er mest sandsynligt at vurdere det yderste lag af protein, udfoldet ved kontakt med silicagel inden for enten metalnanopartiklen-nukleeret flerlaget cyt c. Strukturer eller løst organiserede strukturer, der danner når der ikke metalnanopartikler er til stede i aerogeler 4,9. Størstedelen af cyt c. I begge typer af selvorganiseret struktur inde i aerogeler forbliver foldet som målt ved UV-synlig spektroskopi selv. Fordelen ved den protokol, der er beskrevet heri sans nanopartikler er, at dyre køb eller tidskrævende syntese af metalnanopartikler er ikke nødvendig. Proteiner er ikke ofte blevet indkapslet i aerogeler, og så denne procedure er vigtig, eftersom den kan føre til udvikling af en mere generel fremgangsmåde til indkapsling af andre proteiner i aerogeler med potentiel betydning for fremtidige bioanalytiske enheder.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Støtte for dette arbejde og / eller offentliggørelse blev leveret af Science Institute of Fairfield University College of Arts og Sciences, Fairfield Universitets Faculty Research Grant, en Cottrell College Science Award fra Research Corporation for videnskab Advancement, Fairfield University College of Arts & Sciences og Fairfield University Chemistry & Biokemi afdeling. Vi takker Jean Marie Wallace for meget nyttige indsigt og rådgivning i forhold til denne generelle forskningsområde. Desuden udvider vi en meget speciel tak til alle tidligere, nuværende og fremtidige bachelor forskere fra Harper-Leatherman Research Lab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate, monobasic Fisher Scientific P285-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific P288-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)
Water Millipore Direct-Q 18 MΩ cm
pH meter and electrode Denver Instrument UB-10
Cytochrome c from equine heart Sigma Aldrich C7752-100MG  ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20 °C
Glass scintillation vials Wheaton 03-341-25J 20 ml, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm
Disposable cuvette Fisher Scientific 14-955-126 methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm
Ultraviolet Visible Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 Uses UVProbe v 2.33 software
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) JASCO J-810
Isotemp Laboratory Refrigerator Fisher Scientific
Polypropylene disposable beakers Fisher Scientific 01-291-10 50 ml
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) Sigma Aldrich 218472-500G 98% purity
Methanol Fisher Scientific A457-4 GC Resolv grade
Ammonium hydroxide solution Sigma Aldrich 221228-25ML-A ACS reagent, 28.0%-30.0%
General purpose polypropylene scintillation vials Sigma Aldrich Z376825-1PAK 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 ml, slice off bottom with sharp knife or razor
generic plastic wrap various
Parafilm M laboratory wrapping film Fisher Scientific S37440
Plastic syringe plunger various use syringe plunger from 3 ml syringe
Ethyl alcohol Acros 61509-0040 Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent
Acetone Fisher Scientific A949-4 HPLC grade
Critical point drying apparatus Quorum Technologies E3000 Series
Circulator Fisher Scientific Isotemp 3016
Carbon dioxide cylinder Tech Air siphon tube
Micrometer Central Tool Company
GRAMS/AI 8.0 software Thermo Electron Corporation
Nitrogen cylinder Tech Air Another inert gas could be substituted
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder Airgas
Tygon tubing various
T-switch valve various
syringe needles various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pettigrew, G. W., Moore, G. R. Cytochromes c. Biological Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1987).
  2. Moore, G. R., Pettigrew, G. W. Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1990).
  3. Scott, R. A., Mauk, A. G. Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach. , University Science Books. Sausalito, CA. (1996).
  4. Wallace, J. M., Rice, J. K., Pietron, J. J., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silica nanoarchitectures incorporating self-organized protein superstructures with gas-phase bioactivity. Nano Lett. 3 (10), 1463-1467 (2003).
  5. Wallace, J. M., Dening, B. M., Eden, K. B., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silver-colloid-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. Langmuir. 20 (21), 9276-9281 (2004).
  6. Wallace, J. M., Stroud, R. M., Pietron, J. J., Long, J. W., Rolison, D. R. The effect of particle size and protein content on nanoparticle-gold-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. J.Non-Cryst. Solids. 350, 31-38 (2004).
  7. US Patent. Rolison, D. R., Wallace, J. M., Pietron, J. J., Rice, J. K., Stroud, R. M. U. S. , 7,238,729 U.S. Patent 6,824,776 (2004) (2007).
  8. Harper-Leatherman, A. S., Wallace, J. M., Rolison, D. R. Cytochrome c. stabilization and immobilization in aerogels. Enzyme Stabilization and Immobilization: Methods and Protocols. Minteer, S. D. 679, Springer. New York, NY. 193-205 (2011).
  9. Harper-Leatherman, A. S., et al. Simplified procedure for encapsulating cytochrome c. in silica aerogel nanoarchitectures while retaining gas-phase bioactivity. Langmuir. 28 (41), 14756-14765 (2012).
  10. Hitihami-Mudiyanselage, A., Senevirathne, K., Brock, S. L. Assembly of phosphide nanocrystals into porous networks: Formation of InP gels and aerogels. ACS Nano. 7 (2), 1163-1170 (2013).
  11. Fricke, J. Aerogels. , Springer-Verlag. Berlin. (1986).
  12. Hüsing, N., Schubert, U. Aerogels-airy materials: chemistry, structure, and properties. Angew. Chem. Int. Edit. 37 (1-2), 22-45 (1998).
  13. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. (2011).
  14. Kazuyoshi, K. Recent progress in aerogel science and technology. Adv. Porous Mater. 1 (2), 147-163 (2013).
  15. Leventis, N., Elder, I. A., Anderson, M. L., Rolison, D. R., Merzbacher, C. I. Durable modification of silica aerogel monoliths with fluorescent 2,7-diazapyrenium moieties. Sensing oxygen near the speed of open-air diffusion. Chem. Mater. 11 (10), 2837-2845 (1999).
  16. Plata, D. L., et al. Aerogel-platform optical sensors for oxygen gas. J. Non-Cryst. Solids. 350, 326-335 (2004).
  17. Rolison, D. R., Pietron, J. J., Long, J. W. Controlling the sensitivity, specificity, and time signature of sensors through architectural design on the nanoscale. ECS Trans. 19 (6), 171-179 (2009).
  18. Carroll, M. K., Anderson, A. M. Aerogels as platforms for chemical sensors. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. 637-650 (2011).
  19. Rolison, D. R. Catalytic nanoarchitectures-The importance of nothing and the unimportance of periodicity. Science. 299 (5613), 1698-1701 (2003).
  20. Pietron, J. J., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Using three dimensions in catalytic mesoporous nanoarchitectures. Nano Lett. 2 (5), 545-549 (2002).
  21. Anderson, M. L., Morris, C. A., Stroud, R. M., Merzbacher, C. I., Rolison, D. R. Colloidal gold aerogels: Preparation, properties, and characterization. Langmuir. 15 (3), 674-681 (1999).
  22. Anderson, M. L., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Enhancing the activity of fuel-cell reactions by designing three-dimensional nanostructured architectures: Catalyst-modified carbon-silica composite aerogels. Nano Lett. 3 (9), 1321 (2003).
  23. Chervin, C. N., et al. Defective by design: vanadium-substituted iron oxide nanoarchitectures as cation-insertion hosts for electrochemical charge storage. J. Mater. Chem. A. 3 (22), 12059-12068 (2015).
  24. Ellerby, L. M., et al. Encapsulation of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method. Science. 255 (5048), 1113-1115 (1992).
  25. Massari, A. M., Finkelstein, I. J., Fayer, M. D. Dynamics of proteins encapsulated in silica sol-gel glasses studied with IR vibrational echo spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 128 (12), 3990-3997 (2006).
  26. Ray, A., Feng, M., Tachikawa, H. Direct electrochemistry and Raman spectroscopy of sol-gel-encapsulated myoglobin. Langmuir. 21 (16), 7456-7460 (2005).
  27. Blyth, D. J., Aylott, J. W., Richardson, D. J., Russell, D. A. Sol-gel encapsulation of metalloproteins for the development of optical biosensors for nitrogen-monoxide and carbon-monoxide. Analyst. 120 (11), 2725-2730 (1995).
  28. Lan, E. H., Dave, B. C., Fukuto, J. M., Dunn, B., Zink, J. I., Valentine, J. S. Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties. J. Mater. Chem. 9 (1), 45-53 (1999).
  29. Miller, J. M., Dunn, B., Valentine, J. S., Zink, J. I. Synthesis conditions for encapsulating cytochrome c. and catalase in SiO2 sol-gel materials. J. Non-Cryst. Solids. 202 (3), 279-289 (1996).
  30. Ronda, L., Bruno, S., Faggiano, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Oxygen binding to heme proteins in solution, encapsulated in silica gels, and in the crystalline state. Methods in Enzymology. Poole, R. K. 437, Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 311-328 (2008).
  31. Margoliash, E., Frohwirt, N. Spectrum of Horse-Heart Cytochrome c. Biochem. J. 71 (3), 570-572 (1959).

Tags

Bioengineering Cytochrom sol-geler aerogeler silica aerogeler Ultraviolet-Synlig nitrogenoxid
indkapsling cytochrom<em&gt; c</em&gt; I Silica Aerogel Nanoarchitectures uden Metal Nanopartikler samtidig bevare Gas-fase Bioaktivitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E.… More

Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E. R., Kosciuszek, N. D. Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity. J. Vis. Exp. (109), e53802, doi:10.3791/53802 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter