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Bioengineering

encapsulando citocromo Published: March 1, 2016 doi: 10.3791/53802
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, Fairfield University

Summary

Este procedimento descreve como encapsular citocromo C (cyt. C) em sílica (SiO2) de sol-gel, processos esses géis para formar bioaerogels, e utilizar estes bioaerogels reconhecer rapidamente óxido nítrico (NO) por meio de uma reacção em fase gasosa. Este tipo de protocolo pode ajudar no futuro desenvolvimento de biossensores ou outros dispositivos bioanalíticos.

Abstract

As aplicações, tais como sensores, baterias e pilhas de combustível foram melhoradas através da utilização de aerogeles altamente porosos compostos funcionais quando são encapsulados dentro dos aerogeles. No entanto, poucos relatos sobre encapsular proteínas dentro de sol-gel que são processados ​​para formar aerogéis de existir. Um processo para a encapsulação de citocromo C (cyt. C) em sílica (SiO2) de sol-geles que são super-criticamente processados ​​para formar bioaerogels com actividade de fase gasosa para o óxido nítrico (NO) é apresentada. Cit. C é adicionado a uma solução coloidal de sílica misturado sob a concentração de proteína e tampão controlada condições de resistência. A mistura é, então, gelificada Sol e o líquido de enchimento dos poros do gel é substituído por uma série de intercâmbios de solventes com dióxido de carbono líquido. O dióxido de carbono é levado ao seu ponto crítico e ventilado fora para formar aerogels secos com cit. C encapsulado dentro. Estes bioaerogels são caracterizados com uma espectroscopia de UV-visíveld espectroscopia de dicroísmo circular e pode ser usado para detectar a presença de óxido nítrico na fase gasosa. O sucesso deste procedimento depende da regulação da concentração de C cit. E a concentração de tampão e não necessita de outros componentes, tais como as nanopartículas metálicas. Pode ser possível encapsular outras proteínas utilizando uma abordagem semelhante tornando este procedimento importante para o futuro desenvolvimento potencial dispositivo bioanalítico.

Introduction

Citocromo C (cyt. C) é uma proteína de transferência de electrões chave envolvida em reacções de respiração celular do organismo. Tem sido demonstrado estar envolvida na apoptose, uma forma controlada de morte celular, e ele pode detectar pequenas moléculas tais como tóxicos de óxido nítrico e de monóxido de carbono 1-3. O óxido nítrico (NO) desempenha um papel numa variedade de processos fisiológicos que ocorrem nos sistemas nervosos, cardiovasculares e imunes. Enquanto cit. C normalmente requer um ambiente aquoso tamponado a valores de pH neutro para permanecer estruturalmente intacta e ativa, a pesquisa mostrou que cit. C pode manter a sua estrutura e função em materiais sólidos conhecidos como aerogels sob certas condições 4-9.

Os aerogéis são materiais altamente porosos, muitas vezes formadas por óxidos metálicos sintetizar sol-gel (Enquanto os aerogéis de óxido de metal são muito comuns, o carbono e outros tipos de aerogel foram sintetizados. Um exemplo é InP aerogels) 10 e a secagem destas sol-gel, de tal forma que a matriz sólida porosa é deixado inalterado 11-14. Todos os poros aerogels sólidos resultar em muito aerogels disponíveis área de superfície tornando extremamente útil para todas as aplicações onde as reações de superfície são importantes. Quando química ou bioquímica funcionalidade é montado dentro do nanoarquitetura aerogel, demonstrou-se que a porosidade e área de superfície física melhorada dos aerogeles ajudar a melhorar sensores, bem como eléctrodos para baterias, células de combustível, e aplicações supercapacitores 11,15-23 . A fim de secar aerogéis de um modo que deixa a matriz sólida porosa inalterada, é típico para remover o solvente que permanece nos poros após a síntese de sol-gel através de extracção com solvente supercrítico. Qualquer colapso de poros que pode ser causado por forças de tensão superficial como um solvente se evapora a partir do gel são minimizadas por causa de secagem supercrítica, uma interface líquido-vapor nunca formas.

c sendo encapsulada em sol-gel que foram mantidos molhados ou que foram secas ambientalmente 24-30. Relatórios de encapsular biomoléculas em sol-geles que são depois secos super-criticamente para formar aerogeles são mais raros devido ao processamento necessário que pode ser prejudicial para a estrutura de muitas proteínas. No caso de cit. C, certas condições tornam possível manter a capacidade de cit. C para detectar e responder a óxido nítrico na fase gasosa dentro de aerogéis. Uma vez estabilizado, no aerogel, a estrutura de poros de elevada qualidade do aerogel facilita a reacção entre cit. C 4,8,9 e óxido nítrico. Cit. C pode ser encapsulado dentro de aerogeles pela primeira associando-o em várias camadas à volta de nanopartículas de prata ou de ouro na solução de 4-8. Estes superestruturas de várias camadas servem para proteger a proteína na matriz de aerogel. No Approac mais recenteh que nós desenvolvemos, quando a concentração de proteína e tampão de força são controlados juntamente com outras condições sintéticas, cit. c mantém integridade dentro dos aerogéis mesmo sem metal de nanopartículas associação inicial 9.

A síntese começa como muitas sínteses de aerogel começar pela mistura de precursores de sílica sol-gel por um determinado período de tempo. É depois de um tempo definido que cit. C é adicionado como uma solução tamponada na mistura de mistura. A gelificação ocorre, em seguida, de modo a formar uma estrutura de sílica sólido poroso em que os poros são cheios com água, metanol, restantes reagentes e subprodutos. Este líquido que preenche os poros podem ser enxaguadas com vários solventes através de uma série de intercâmbios de solventes, as últimas trocas com dióxido de carbono líquido que ocorre dentro de um aparelho de ponto crítico de secagem mantidos a baixa temperatura. Unindo os géis acima da temperatura crítica (31,1 ° C) do dióxido de carbono facilita a formação de quantoupercritical fluido pressurizado no interior do aparelho que pode ser ventilado de modo a formar, aerogéis altamente porosos secos. A temperatura relativamente baixa requerida para o dióxido de carbono para formar um fluido supercrítico é vantajosa em relação a outros solventes, pois mantém a proteína abaixo de uma temperatura à qual pode desnaturar.

A nossa abordagem livre de nanopartículas de metal para encapsular cit. C em aerogéis é vantajoso, porque é um processo simples que pode levar ao desenvolvimento de um protocolo mais geralmente aplicável para a encapsulação de outras proteínas bem. Muitas proteínas podem não interagir com nanopartículas de metal, da mesma forma que CYT. C faz a síntese de metal e de nanopartículas ou compra acrescenta tempo e custos adicionais ao processo. Os poucos relatos sobre encapsular proteínas em aerogéis de tornar o desenvolvimento deste processo um passo significativo para a frente para encontrar um procedimento mais geral para encapsular outras proteínas no aerogels que podem ajudar in potenciais futuros dispositivos bioanalíticos.

A seção de protocolo deste manuscrito descreve como sintetizar sol de sílica-gel, encapsular cit. C para estas sol-gel, secar estas sol-gel compostas para formar aerogeles, caracterizar estas bioaerogels usando espectroscopia UV-visível e circular dicroísmo e detectar a presença de óxido nítrico na fase gasosa com estes bioaerogels. Cit. C foi encapsulada com sucesso em aerogéis quando primeiro dissolvido em 4,4 a 70 mM de soluções aquosas de tampão de fosfato. No entanto, a estrutura da proteína optimizado em aerogéis foi encontrada para resultar quando da encapsulação de 40 mM de fosfato de soluções tamponadas de cit. Cit c produzindo aerogel carregado. C concentrações na gama de 5 a 15 ^ M 9. Portanto, o protocolo é dada a seguir para sintetizar os aerogéis utilizando soluções tamponadas de fosfato 40 mM de cit. C, resultando numa cit carregado. Concentração c nos aerogéis de 15 uM. </ P>

Protocol

óculos de segurança ou óculos de protecção, bata de laboratório e luvas de laboratório deve ser usado em todos os momentos durante o procedimento. Nunca utilize o aparelho de ponto de secagem crítica sem óculos de segurança ou óculos de proteção. Todas as soluções contendo tetrametoxissilano, metanol, etanol, acetona, e amónia deve ser processado dentro de uma hotte.

1. Certifique-Tampão e Cit. C Solutions

  1. Para tornar ~ 750 ml de pH 7, tampão fosfato de potássio 40 mM, primeiro preparar 500 ml de 0,04 M de fosfato de potássio monobásico por pesagem de 2,72 g de fosfato monobásico de potássio e dissolução em água, utilizando um balão volumétrico de 500 ml.
  2. Prepare a 500 ml de 0,04 M de fosfato de potássio dibásico por pesagem de 3,48 g de fosfato dibásico de potássio e dissolução em água, utilizando um balão volumétrico de 500 ml.
  3. Verter a solução de sal dibásico numa proveta grande com uma barra de agitação e comece a agitar a solução sobre uma placa de agitação.
  4. Lentamente, adicionar porções do sal monobásico sOlution para a solução de sal dibásico enquanto se monitorizava o pH com um eléctrodo de pH e medidor até o pH ser 7.00. será usada Aproximadamente 250-300 ml da solução de sal monobásico.
  5. Pesar cerca de 0,023 g de cit. C e coloque no frasco de cintilação de vidro. Adicionar 2000 mL de tampão fosfato de potássio preparado utilizando uma micropipeta e, em seguida, agite suavemente a solução para misturar até todo o sólido cit, vermelho. C tenha dissolvido na solução e não de partículas mantém-se.
  6. Tomar 20 ul da solução de citocromo C preparado. E adicionar a um 1 cm de comprimento de percurso cuvete de plástico. Adicionar 3 ml de tampão preparado.
  7. Aqui UV-vis espectro 300-700 nm utilizando tampão na célula de referência. Utilizar a cit. C absorvância (A) a 409 nm, o coeficiente de extinção 31 (ε) de 106100 M-1 cm-1, o comprimento do percurso cuvete (L), e a lei de Beer-Lambert para determinar a concentração (C) da solução (a = εlc).
  8. Voltar calcular a concentração da solução preparada originais. Os 2 ml preparado cit. Solução C é tipicamente entre 0,7 a 0,9 mM em concentração.
  9. Dilui-se a solução original C preparado cit. Para 800 ul de 0,105 mM, por pipetagem de 117 ul de 0,72 mM preparado cit. Solução C num frasco de cintilação. Em seguida, adicione o equilíbrio das 800 ul (683 ul neste caso) de tampão preparado. Agite para misturar. Os volumes exactos podem variar, dependendo da concentração exacta do original é preparado cit. Solução C como o volume de cit. C a pipeta é calculado como (800 ul * 0,105 mM) / (cyt originais. C concentração em mM).
  10. Armazenar cit preparada e diluída originais. Soluções c de 2-8 ° C no frigorífico até estar pronto para usar por até duas semanas.

2. Sintetizar Sílica (SiO2) Sol

  1. Rotular um descartável copo de 50 ml de polipropileno 'SejaAker A '. Coloque copo no pan de uma balança analítica e usar uma pipeta Pasteur de vidro para adicionar 1,88 g tetrametoxissilano para o copo. Zero o equilíbrio e depois pipeta 2,88 g de metanol em "Copo A '.
  2. Cover 'Copo A' com Parafilm.
  3. Rotular um descartável copo de 50 ml de polipropileno 'taça B'. Adicionar uma barra de agitação magnética e coloque sobre a panela de uma balança analítica. Use uma pipeta de vidro para adicionar 0,75 g de água e 3,00 g de metanol.
  4. Cover 'taça B' com Parafilm.
  5. Comece a agitação do conteúdo de 'taça B' numa placa de agitação dentro de um extractor de fumo, em seguida, utilizar uma seringa para inserir 5 ul de uma solução de hidróxido de amónio 28,0-30,0% através do Parafilm cobrir na mistura, enquanto se agitava.
  6. Assim que passo 2.5 estiver concluída, adicionar o conteúdo da "Taça A 'a' taça B '. Agita-se a mistura durante 20 min, enquanto se coberto de Parafilm.

3. Prepare Gel Moldes

Nota: Nãoé o tempo para preparar os moldes de gel enquanto a mistura de sol de sílica é de agitação no passo 2.6.

  1. Adquirir 8-9 frascos de polipropileno de cintilação (16 mm x 57 mm, dimensão de volume de 6,5 ml, com fundos cortada) e tampas correspondentes. Coloque filme plástico sobre a extremidade da tampa do frasco para criar uma superfície plana para o gel para formar sobre e coloque a tampa sobre ele certificando-se que o invólucro de plástico permanece intacta dentro da tampa.
  2. Alinhar os frascos com tampa-end para baixo na bancada e abriu fundo voltado para cima.

4. Prepare Cit. C -silica Sol-gel

  1. Após a conclusão do Sol de mistura (passo 2.6), adicionar 3 ml da mistura de sol para uma proveta descartável de 50 ml de polipropileno limpo.
  2. Usar uma pipeta de Pasteur de vidro para soltar-se lentamente 500 ul de 0,105 mM a diluída. Cit solução C (feito no passo 1.9) à mistura 3 ml de Sol ao longo de ~ 1 min. Certifique-se de homogeneizar suavemente a mistura ao adicionar o cit. C para evitar a formação de grandesaglomerados vermelhas. Assumindo que os volumes são aditivos, diluindo 500 ul de solução C a 0,105 mM cit. A 3500 ul, a concentração c cit. Agora no sol é, em teoria, 15 uM.
  3. Pipeta de 0,5 ml da resultante cit. C sol de sílica em cada molde preparado. Também pipetar 0,5 ml de sol de sílica restante "liso" em um ou dois moldes para utilizar como amostras de controlo durante o processo de secagem supercrítico.
  4. Cubra as aberturas viradas para cima dos moldes com Parafilm e coloque na geladeira (~ 2-8 ° C) durante a noite ou por pelo menos 12 horas para produzir sol-gel.
  5. Tome os moldes fora da geladeira. Remover o Parafilm a partir do topo de um molde que contem um cit c sol-gel.; também remover a tampa e película de plástico a partir do fundo.
  6. Após a adição de um pouco de etanol a partir de uma garrafa de lavagem para dentro do molde, utilizar a extremidade circular de disco de um êmbolo da seringa para empurrar cuidadosamente o gel para fora do molde e para dentro de 20 ml de cintilação de vidro cont frasco limpoaining aproximadamente 5 ml de etanol.
  7. Repetir este procedimento de remoção de gel (passos 4,5 e 4,6) até que todo o cit. C géis são adicionados ao frasco e todos os geles de sílica são adicionados a um frasco separado. Se mais de uma concentração de gel c cit. Foi feito, não se esqueça de armazenar como géis juntos dentro frascos separados. Em seguida, encher os frascos até o topo com etanol, tampa e armazenar entre 2-8 ° C.
  8. De quatro em quatro horas ao longo do dia, retirar os geles do frigorífico, decanta-se o etanol fora os géis e substituir com etanol fresco.
  9. Durante um período adicional de três dias, submergir os géis Sol molhado em acetona, e adição de acetona decantação fresco três vezes por dia.

5. super-criticamente seco Cit. C -silica Sol-gel

  1. Arrefece-se uma aparelho de ponto crítico de secagem (ver Figura 1) a 10 ° C por ajuste da temperatura de um circulador ligado a 8 ° C.
  2. Uma vez que o aparelho tem reached 10 ° C, realizar um ensaio de fugas sobre o aparelho de enchimento de um barco de transferência com acetona e selando-o no interior do aparelho.
    1. Abrir a válvula de enchimento do aparelho e adicionar o dióxido de carbono até que o aparelho é meio-cheio.
    2. Feche a válvula de enchimento e ouvir atentamente para sibilando para as portas e válvulas, onde o-rings ou selos podem ser deterioradas.
    3. Substitua quaisquer O-rings ou selos se um vazamento é encontrado.
  3. Depois de concluir o teste de vazamento, abra a válvula de drenagem para liberar a acetona e dióxido de carbono para a drenagem de um exaustor. Em seguida, retire o barco transferência do aparelho.
  4. Depois de garantir que o aparelho está livre de vazamentos, despeje cuidadosamente o gel molhado dos frascos de cintilação, juntamente com a maior parte da acetona, em três seções longo do barco de transferência (cestas de amostra ou tampas de gaze não são necessárias). Delicadamente empurrar e mover os geles dentro do barco com uma pinça para assegurar que todos os géis são completamente submerso iN acetona. Adicionar mais acetona, se necessário antes de selar o barco interior do aparelho.
  5. Abrir a válvula de enchimento do aparelho para adicionar dióxido de carbono, em seguida, abrir a válvula de descarga para libertar acetona durante cinco minutos, logo que a mistura de acetona com o dióxido de carbono é observada a afundar para o fundo do aparelho através da janela do aparelho. Esta infiltração da acetona para a parte inferior irá ocorrer antes do aparelho ser completamente cheio com dióxido de carbono, de modo que a válvula de enchimento deve permanecer aberto à medida do necessário durante o escoamento de modo a que o aparelho vai continuar a encher, mesmo quando a descarga está aberta.
  6. Feche a válvula de drenagem. Mantenha a válvula de enchimento abriu ligeiramente.
  7. Cinco minutos mais tarde, abrir a válvula de drenagem durante cinco minutos novamente e ajustar a válvula de enchimento para ser aberto suficiente para que o aparelho permanece cheio durante todo o tempo de drenagem. Feche a válvula de drenagem, mantenha a válvula de enchimento abriu, em seguida, repita este passo drenando mais uma vez de cincominutos depois.
  8. Seguindo estes três primeiros passos de drenagem, abrir o dreno durante 5 minutos a uma hora aproximadamente a cada 40 min durante o período de pelo menos seis horas para garantir que a substituição completa da acetona por dióxido de carbono líquido no interior dos géis. Sempre ajustar a válvula de enchimento de ser suficientemente aberta durante cada drenagem de modo a que o nível do líquido no aparelho nunca cai abaixo do topo do barco durante a drenagem.
  9. passos, uma vez que drenam estiverem concluídos, feche a válvula de enchimento e drenar o dióxido de carbono líquido para que o nível permanece visível logo acima dos dentes da embarcação, olhando através da janela do aparelho.
  10. Ajustar a temperatura do aparelho ligado ao circulador de 40 ° C para assegurar que os aumentos de dióxido de carbono líquido acima da sua temperatura e pressão crítica (T C = 31 ° C; P C = 7,4 MPa).
  11. Após aproximadamente 15 min, observar a transição do estado líquido para o fluido supercrítico através da janela do aparelho tal como o menisco líquido-nos acima dos pinos do barco desaparece. Permitir que pelo menos 15 min de tempo de equilíbrio, em seguida, abra a válvula de ventilação uma pequena quantia para começar a liberar o fluido supercrítico.
  12. Ao longo de aproximadamente 45 min, continuar a abrir gradualmente a válvula de descarga maior e mais ampla de modo que um silvo estável, mas muito baixa do fluido libertando pode ser ouvido e o indicador de pressão é observado para diminuir lentamente a zero.
  13. Depois de a pressão do aparelho passou a zero, abrir a porta do aparelho, remover o barco, e utilizar uma pinça para colocar os aerogéis recém secas em frascos de cintilação de vidro limpo.

6. Caracterizar Cit. C -silica Aerogels com UV-visível e Dicroísmo Circular (CD) Espectroscopia

  1. Prepare uma plataforma de papelão para manter os monólitos de aerogel no caminho do feixe do espectrofotômetro ou CD espectrômetro de UV-Visível.
    1. Corte um pedaço 2,5 centímetros x 2,5 centímetros de papelão leve (tal como o cartão de uma caixa de labotecido respiratória), dobre ao meio, corte a meio caminho na dobra, em seguida, dobre as duas abas, criadas por corte, para trás.
    2. Cortar a 5 cm x 5 cm pedaço de papelão leve, com um 1,5 cm x 1,5 cm buraco quadrado no meio. Em seguida, use fita isolante preta para diminuir o tamanho do porão para 0,5 cm x 0,5 cm.
    3. Tape as abas de papelão dobrado e corte de encontro a 5 cm x 5 cm pedaço de papelão para que uma pequena superfície curvada é criado para um monolito aerogel para sentar-se em frente do 0,5 cm x 0,5 cm furo (ver Figura 2) . Em seguida, tape a parte de trás de papelão para o espectrofotômetro UV-visível para o buraco está em linha com o caminho do feixe.
  2. Medir a espessura dos géis, os quais irão ser utilizados para os comprimentos de caminho, com um micrómetro.
  3. Coloque um gel sobre a plataforma de papelão e medir um espectro 300-800 nm com ar no compartimento de referência do espectrofotómetro de UV-visível.
  4. Encaixar um polinômio, A = a N, a região do comprimento de onda (λ), onde a absorvância (A) é principalmente devido ao espalhamento fundo, ~ 700-800 nm. O coeficiente é tipicamente em forma de um número entre 1 x 10 ~ 8 e 1 x 10 6 e o coeficiente n é tipicamente em forma de um número entre 2 e 3 ~.
  5. Calcula-se a dispersão a outros comprimentos de onda, utilizando os coeficientes, um e n, obtido a partir do ajuste.
  6. Subtrair esse absorção fundo dispersão calculada a partir do espectro bruto para obter uma dispersão corrigido espectro.
  7. Montar o espectro de dispersão subtraído com uma curva de Gauss na região de 370-490 nm, utilizando software apropriado (GRAMAS / AI 8,0) para determinar a altura do pico, pico de centro, e a largura de pico a pico de Soret do aerogel.
  8. Aplicar a Lei de Lambert-Beer utilizando a espessura medida do gel para o comprimento do percurso (L), o coeficiente de extinção 31 (ε) de 106,100 M-1cm-1 c no aerogel (A = εlc).
  9. Comparar o cit calculado. C concentração para a concentração teoricamente no gel (15 uM) para determinar a viabilidade de cit. C dentro do aerogel. Por cento viabilidades típicas encontram-se perto de 100%, mas deve notar-se que estes viabilidades são apenas estimativas porque o cálculo é baseado no coeficiente de extinção de cit. C em solução 31, que se presume ser ligeiramente diferente do que o coeficiente de extinção de cit. c em que os aerogéis não é conhecido.
  10. azoto executar no instrumento CD, pelo menos, 5 minutos antes de ligar a lâmpada.
  11. Tape o titular do cartão para o CD espectrômetro de modo que o buraco está em linha com o caminho do feixe.
  12. Medir um comprimento de onda do espectro em branco contínuo com nada no suporte de papelão 350-500 nm a 100 nm / min, tendo uma média de três scans.
  13. Coloque um gel (espessura medido anteriormente no passo 6.2) na plataforma de papelão e medir um espectro 350-500 nm a 100 nm / min, tendo uma média de três varreduras.
  14. Repita as medições de UV-Visível e CD para todos os monólitos de aerogel de interesse.

7. detectar a presença de óxido nítrico Gás (NO) com Cit. C -silica Aerogels

CUIDADO: Trabalhando com NÃO é perigoso e todos NO gás deve ser tratado em um exaustor ou esgotados em uma coifa. a exposição contínua ao NO é tóxico para os tecidos, como o dióxido de azoto altamente venenosas e / ou tetróxido de azoto formam quando NÃO vem em contacto com o ar. De calor e fumos corrosivos são também produzidos quando NÃO vem em contacto com a água.

  1. Coloque um cilindro de 8 L de óxido nítrico (o óxido nítrico a 10%, 90% de azoto) numa hotte bem ventilada e ajustar a pressão a 4 psi.
  2. Ligar a tubagem para tanto o cilindro de óxido nítrico e de um cilindro de azoto (pressão ajustada a 6 psi) e ligar as extremidades dos tubos a uma t-válvula (ver Figura 3a).
  3. Escolha um monolito aerogel para o experimento e medir a espessura (ou comprimento do caminho) com um micrómetro.
  4. Coloque o aerogel (~ 3 mm de espessura) em uma tina descartável com tampa de plástico e colocar a cuvete no espectrofotômetro. Corte o aerogel um pouco se necessário para caber na célula.
  5. Inserir duas agulhas de seringa no interior da tampa de plástico da cuvete, uma ligada à saída do t-válvula, e uma ligada a um tubo para servir de escape para dentro da coifa (ver Figura 3b). Use Parafilm para selar as agulhas para a tubagem e a tampa da cuvete.
  6. Coloque um cuvete descartável vazia na célula de referência.
  7. Ajustar a posição cuvete aerogel para assegurar que o aerogel se encontra no caminho do raio antes de se iniciar o experimento.
  8. Tomar um espectro inicial 800-300 nm.
  9. Monitorar a diferença entre a absorvância a 414 nm e a absorvância a 408 nm, enquanto roda o t-válvula para alternar entre o azoto e a mistura de óxido de / azoto nítrico, a intervalos de tempo definidos certificando-se que em nenhum momento é a taxa de fluxo de azoto ou misturas de óxido de / azoto nítrico tão alta que aerogel se move em torno da cuba.
  10. Tome um espectro final a partir de 800 a 300 nm, uma vez que os ciclos de exposição terminar.
  11. Repetir o processo com três a quatro monólitos para obter uma resposta média de detecção.

Representative Results

O procedimento descrito em resultados aerogeles que contêm cit viável. C. Conforme especificado no fim da introdução, cit. C podem ser encapsuladas a partir de soluções aquosas tampão que variam de 4,4 a 70 mM de fosfato. Exemplos de cit. -silica C (cyt. C -SiO 2) aerogéis feita a partir de soluções contendo diferentes concentrações de tampão são mostrados na Figura 4. Todos os géis são relativamente translúcido, com os géis produzidos a partir de 70 mM de tampão mais opaca.

Uma comparação da espectroscopia de cit. C sob condições diferentes é mostrada na Figura 5. Um espectro típico (Figura 5c) mostra o pico grande Soret cerca de 408 nm para cit. C -SiO 2 aerogéis e é muito semelhante ao do espectro de cit . C em solução (Figura 5a). Além disso, um espectro de cit.c encapsulado dentro de aerogeles com nanopartículas metálicas também é mostrado (Figura 5b) e a cit. C espectro -SiO 2 aerogel é semelhante a este espectro também. Quando o cit. C -SiO 2 aerogel é exposta ao óxido nítrico, um deslocamento de pico típico do Soret é observado (Figura 5D).

Os espectros de UV-vis para géis feitos a partir de cit. C soluções em concentrações de tampão de variação são mostrados na Figura 6. Todos estes géis mostram característica espectroscópica de UV-visível, indicando que apresenta cit. C não se encontra num estado desnaturado dentro dos geles. Contudo, a translucidez diminuição dos géis feitos a partir de 70 mM de tampão resultados numa proporção inferior de sinal-para-ruído para estes espectros.

Os espectros de CD de cit. C -SiO 2 aerogéis são semelhantes aos espectros de cit. C C em solução tamponada (Figura 7).

A Figura 8 mostra uma resposta de monitorização de óxido nítrico típico para cit. C -SiO 2 aerogéis e aerogeles correspondentes que também contêm nanopartículas metálicas para além cit. C. A diferença entre a absorvância a 414 nm e em 408 nm que é visto para aumentar e, em seguida, diminuem quando os geles são expostos ao óxido nítrico e, em seguida, de azoto, respectivamente, em sucessão.

Se o dióxido de carbono supercrítico não é libertado a uma taxa lenta o suficiente, a viabilidade do cit. C dentro dos aerogéis formados será comprometida. Isto é revelado, comparando os espectros de UV-visível resultante após a formação de geles, libertando o dióxido de carbono a diferentestaxas (Figura 9).

figura 1
Figura 1: aparelho de ponto crítico de secagem O aparelho de ponto crítico de secagem mostrado a partir da (A) da frente e (B) de volta com a porta do barco e aparelho de transferência mostrado ao lado da parte de trás do aparelho..

Figura 2
Figura 2: plataforma de papelão A plataforma de papelão montado para a realização de um aerogel no caminho do feixe de um instrumento..

Figura 3
Figura 3: nítrico detecção óxido de set-up O nítrico detecção óxido de set-up é mostrado incluindo (A) a coifa fechada óxido nítrico 10%., 90% cilindro de azoto, tubos, e T-válvula, e (B) a cuvete com agulhas inseridas.

Figura 4
Figura 4:.. Cit amostra C -SiO 2 aerogéis aerogéis encapsular 15 uM cit c em 4,4 mM, 40 mM, e tampão de fosfato de potássio 70 mM são mostradas em comparação com uma moeda da esquerda para a direita.. Estes aerogeles são de aproximadamente 0,2-0,5 cm de altura. Reproduzido com permissão 9.

Figura 5
Figura 5:. Cit c -SiO 2 aerogel espectros espectroscopia visível de 15 uM de citocromo c em (a), 50 mM de tampão de fosfato de solenóide.ution; (B) Au (5 nm) ~ cit c -SiO 2 aerogel.; (C) cit c -SiO 2 aerogel (exposta ao ar).; (D) cit. C -SiO 2 aerogel (exposto a óxido nítrico durante 3,5 min). Estes espectros representativas de cada tipo de gel são compensados ​​por razões de clareza, e a linha a tracejado indica a posição do pico Soret de cit. C em tampão. Enquanto cada espectro é de 15 uM cit. C, a espessura do gel (ou alturas) são apenas 0,2-0,5 cm comparação com a solução de 1 cm cuvete resultando em uma maior absorvência solução. Reproduzido com permissão 9.

Figura 6
Figura 6: espectroscopia de aerogel como concentração do tampão encapsulado é variada Média de UV-visível absorvância espectral de aerogeles, dividido pelo comprimento do caminho de gel para géis encapsulando 15 _.6; M cit c em 70 mM (preto) (média de 4 espectros), 40 mM (vermelho, pontilhada) (média de 8 espectros), e 4,4 mM (verde, pontilhada) (média de 9 espectros) tampão fosfato de potássio. . Reproduzido com permissão 9.

Figura 7
Figura 7:... O aerogel espectroscopia de dicroísmo circular espectros de dicroismo circular de citocromo C em solução tamponada com fosfato de sódio (sólido), ambos os espectros representativos da cit c -SiO 2 aerogéis (a tracejado), e dois espectros representante de Au (5 nm) ~ cit. c SiO- 2 aerogels (pontilhadas). Reproduzido com permissão 9.

Figura 8
Figura 8: Detecção de óxido nítrico com cit c -SiO 2. . sub> aerogéis de Acompanhamento do turno (Aa = A 414 nm - A 408 nm). na intensidade Soret de cit c (vermelho sólido) e Au ~ cit c (azul tracejada) encapsulado em SiO nanoarquiteturas aerogel 2 compósitos como o fluxo de gás. é alternado entre azoto (onde Soret pico máximo é em ~ 408 nm) e óxido nítrico (onde Soret pico máximo é em ~ 414 nm). Cada curva é uma média de 3-4 ensaios, com dois do cit c -SiO 2 ensaios monitorados pelo Aa = A 414 nm -. A 407 nm desde o pico máximo inicial Soret estava em 407 nm para estes ensaios. Reproduzido com permissão 9.

Figura 9
Figura 9:. Efeito do tempo de liberação de fluido supercrítico Média de absorção espectral UV-visível dividido pelo comprimento do caminho gel para cit c -SiO 2 aerogels enca.psulating 10 uM cit. C em 50 mM de tampão de fosfato em que os aerogéis super-criticamente secos foram feitas por qualquer libertação de dióxido de carbono supercrítico ao longo de 45 min (sólido, preto (média de 9 espectros)) ou 7 min (tracejado, vermelho (média de quatro Os espectros)). Reproduzido com permissão 9.

Discussion

Como descrito, este procedimento produziu consistentemente cit viável. C encapsulado dentro aerogels. A concentração de cit. C dentro dos aerogeles podem ser variou de 5 a 15 ^ M e a concentração da solução tampão c inicial cit. Encapsulado dentro dos aerogeles podem ser variadas entre 4,4 e 70 mM de fosfato sem graves efeitos prejudiciais na viabilidade proteína. No entanto, o centro de pico e largura do pico do cit característica. C Soret pico em aerogéis são mais próximo do que eles são para cit. C na solução quando cit. C é encapsulado em aerogéis de soluções de 40 mM tampão 9.

A síntese do cit. C -SiO 2 aerogéis é afectada pela idade de alguns dos reagentes de partida. Metanol, tetrametoxissilano, e solução de hidróxido de amónio são higroscópicos e deve ser substituído cada mês de um-para-dois. O aumento da água que se acumula noestes reagentes ao longo do tempo afecta as características estruturais de gel e o tempo de transição sol-a-gel.

Ao realizar a secagem supercrítica, barco transferência do aparelho de secagem ponto crítico do pode conter até dezoito 0,5 cm de espessura, 1 géis cm de diâmetro. Conforme descrito na seção de protocolo, um enchimento específica e procedimento de drenagem deve ser seguido para transferir dióxido de carbono em processo sol-gel. É importante notar que, no início do protocolo de drenagem, a mistura a drenagem do dióxido de carbono e acetona flui a uma taxa tão elevada que o tubo de drenagem congela rígida com a humidade de condensação de gelo no lado de fora. A mistura contém a drenagem para fora um pouco de água uma vez que a acetona não é anidro e esta água pode, ocasionalmente, congelar a um ponto em que o tubo de drenagem, na verdade, bloqueia. É necessário prestar atenção para essas obstruções e para ouvir uma interrupção do fluxo. A válvula de drenagem devem ser fechados por alguns minutos de forma a obstrução vai derreter se uma obstrução for detectado. Dentroo pior cenário, se a válvula de drenagem não está fechada, uma obstrução pode causar tanta pressão para construir que o tubo de drenagem com força aparece fora do aparelho. Após os primeiros períodos de drenagem, a maior parte da acetona terá sido lavado para fora do aparelho, e a ocorrência de pedaços de gelo molhado irá diminuir dramaticamente. A descarga será semelhante progressivamente gelo seco como o protocolo de drenagem continua com qualquer evidência residual da presença de acetona (como perfume) tornando-se indetectável no final do processo de drenagem.

Depois de o dióxido de carbono no aparelho tem a transição do estado líquido para o fluido supercrítico e o processo de ventilação tiver começado, é necessário para libertar o fluido a uma taxa lenta durante pelo menos 45 min, tal como indicado no processo 9. Um aumento da taxa de libertação pode diminuir a viabilidade de cit. C (como mostrado na Figura 9) dentro dos aerogéis e os aerogéis podem-se realmente se separam como the fluido corre para escapar dos géis. Em geral, mesmo quando os aerogéis permanecer intacto depois de abrir a porta do aparelho, é importante para segurá-los cuidadosamente e suavemente como eles são quebradiços e podem romper facilmente.

Os géis de controlo de sílica que se precipitam ao lado do citocromo c. -SiO 2 géis são utilizados após secagem super-critica para determinar se a transferência de dióxido de carbono nos géis foi bem-sucedida. Por vezes, a cit. C -SiO 2 géis podem aparecer turva e é importante para determinar se este é devido à transferência incompleta solvente ou se pode ter a ver com a concentração de a cit. C ou tampão encapsulado dentro dos geles. Se os géis de sílica, sem cit. C parecem ter uma aparência homogénea e translúcida todo, esta pode ser tomada como evidência de que a transferência de solvente ocorrido completamente, mesmo se o cit. C -SiO 2 géis têm alguma turvação a eles. Turvação nos geles de sílicasem cit. C, após secagem indica que um pouco de acetona permaneceu dentro dos geles durante a ventilação.

Como indicado na seção de protocolo, as precauções de segurança importantes precisam ser tomadas quando se trabalha com o óxido nítrico (NO). Para detectar NÃO usando os aerogeles, é necessário vedar a cuvete muito bem e para descarregar o gás que flui ao longo dos aerogéis num exaustor de fumos. Em alternativa, todo o espectrofotómetro pode ser movido para um exaustor de fumos, juntamente com o cilindro de gás de NO como precaução adicional para limitar a exposição ao gás de. Em contato com o ar NO irá imediatamente produzir o dióxido de azoto, tetróxido de nitrogênio altamente venenosas ou ambos. NO também pode reagir com água para produzir calor e corrosivos fumos. Portanto, a exposição sustentada para o NO pode resultar em toxicidade direta dos tecidos.

Quando se utiliza o cit. C -SiO 2 aerogéis para detectar a presença do óxido nítrico, a banda Soret será inicialmente em ~ 408 nm e vai deslocara ~ 414 nm na presença de óxido nítrico. Depois de voltar para azoto, a banda Soret deve reverter de volta a estar centrado em ~ 408 nm. Pode também ser possível usar o cit. C -SiO 2 aerogéis para detectar a presença de outros ligandos, tais como o monóxido de carbono 27.

Diferentes processos publicados incluir um passo adicional de combinação de nanopartículas de ouro ou prata com cit. C em solução antes de se misturar com o Sol e super-criticamente a secagem para formar aerogeles 4-8. Comparando-se a espectroscopia de UV-visível de cit. C encapsulado em aerogeles com nanopartículas metálicas para que de cit. C encapsulado em aerogéis sem nanopartículas metálicas mostra que estes dois tipos de técnicas de encapsulação produzir cit. C de viabilidade semelhante dentro dos aerogéis (Figura 5) . No entanto, o cit. C encapsulado com nanopartículas metálicas é um pouco mais estável do que cit. C encapsulard sem nanopartículas metálicas dentro dos aerogéis 9. Os espectros de CD de ambos os tipos de citocromo c. Aerogéis também são semelhantes, embora ambos diferem do espectro de cit. C em tampão indicando algum desdobramento de cit. C dentro dos aerogéis (Figura 7). Os anteriores relatórios sobre cit. C encapsulados em aerogéis sugerem que a espectroscopia de dicroísmo circular é mais provável avaliar a camada mais externa da proteína, desdobrado em contacto com o gel de sílica, dentro de um ou outro metal cit várias camadas nanopartícula-nucleada. Estruturas c ou estruturas fracamente organizadas que formam quando não nanopartículas metálicas estão presentes em aerogéis de 4,9. A maioria do cit. C dentro de um ou outro tipo de estrutura de auto-organizados dentro dos aerogéis permanece dobrado, tal como medido por espectroscopia de UV-visível, embora. A vantagem do protocolo descrito aqui sans nanopartículas é que compra cara ou síntese demorado de metaisnanopartículas não é necessário. As proteínas não têm sido encapsulados com sucesso dentro de aerogeles, e de modo que este procedimento é importante na medida em que podem levar ao desenvolvimento de um método para a encapsulação de mais geral outras proteínas com significância no aerogéis potencial para futuros dispositivos bioanaliticas.

Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

O suporte para este trabalho e / ou publicação foi fornecido pelo Instituto de Ciências da Faculdade de Artes da Universidade de Fairfield e Ciências, Faculdade Research Grant da Universidade de Fairfield, um Prêmio de Ciência Cottrell Colégio da Corporação de Pesquisa para a Ciência Avanço da Faculdade de Artes e Ciências da Universidade de Fairfield e Química & Bioquímica Departamento da Universidade de Fairfield. Agradecemos Jean Marie Wallace para a introspecção muito útil e aconselhamento no que diz respeito a esta área geral de pesquisa. Além disso, estendemos um agradecimento muito especial a todos passados, atuais e futuros pesquisadores de graduação da Harper-Leatherman Research Lab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate, monobasic Fisher Scientific P285-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific P288-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)
Water Millipore Direct-Q 18 MΩ cm
pH meter and electrode Denver Instrument UB-10
Cytochrome c from equine heart Sigma Aldrich C7752-100MG  ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20 °C
Glass scintillation vials Wheaton 03-341-25J 20 ml, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm
Disposable cuvette Fisher Scientific 14-955-126 methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm
Ultraviolet Visible Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 Uses UVProbe v 2.33 software
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) JASCO J-810
Isotemp Laboratory Refrigerator Fisher Scientific
Polypropylene disposable beakers Fisher Scientific 01-291-10 50 ml
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) Sigma Aldrich 218472-500G 98% purity
Methanol Fisher Scientific A457-4 GC Resolv grade
Ammonium hydroxide solution Sigma Aldrich 221228-25ML-A ACS reagent, 28.0%-30.0%
General purpose polypropylene scintillation vials Sigma Aldrich Z376825-1PAK 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 ml, slice off bottom with sharp knife or razor
generic plastic wrap various
Parafilm M laboratory wrapping film Fisher Scientific S37440
Plastic syringe plunger various use syringe plunger from 3 ml syringe
Ethyl alcohol Acros 61509-0040 Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent
Acetone Fisher Scientific A949-4 HPLC grade
Critical point drying apparatus Quorum Technologies E3000 Series
Circulator Fisher Scientific Isotemp 3016
Carbon dioxide cylinder Tech Air siphon tube
Micrometer Central Tool Company
GRAMS/AI 8.0 software Thermo Electron Corporation
Nitrogen cylinder Tech Air Another inert gas could be substituted
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder Airgas
Tygon tubing various
T-switch valve various
syringe needles various

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References

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Bioengenharia Edição 109 citocromo sol-gel aerogéis aerogéis de sílica Ultravioleta-visível o óxido nítrico
encapsulando citocromo<em&gt; C</em&gt; Em Silica Aerogel nanoarquiteturas sem metal nanopartículas, mantendo bioatividade em fase gasosa
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Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E.… More

Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E. R., Kosciuszek, N. D. Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity. J. Vis. Exp. (109), e53802, doi:10.3791/53802 (2016).

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