Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Инкапсуляция цитохрома Published: March 1, 2016 doi: 10.3791/53802
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, Fairfield University

Summary

Эта процедура описывает , как инкапсулировать цитохром с (цит. В) в двуокиси кремния (SiO 2) золь-гели, процесс эти гели с образованием bioaerogels, и использовать эти bioaerogels быстро распознать оксид азота (NO) посредством реакции в газовой фазе. Этот тип протокола может помочь в будущем развитии биосенсоров или других биоаналитических устройств.

Abstract

Приложения, такие как датчики, батареи и топливные элементы были улучшены за счет использования высокопористых аэрогелей, когда функциональные соединения инкапсулируются в аэрогеля. Тем не менее, несколько отчетов о инкапсулирования белков в золь-гели, которые обрабатываются с образованием аэрогелей существуют. Процедура инкапсулирования цитохром с (цит. С) в диоксид кремния (SiO 2) золь-гели, которые суперкритически обработаны с образованием bioaerogels с газовой фазой активности для оксида азота (NO) представлен. Цитохром. C добавляют к смешанному золь кремнезема при контролируемой концентрации белка и буфера условий прочности. Золь смесь затем загущенное и жидкости, заполняющей поры гель заменен через серию растворителей обмена с жидким диоксидом углерода. Двуокись углерода доводится до критической точки и вентилируемые от с образованием сухих -аэрогели с цитохрома. C инкапсулированные внутри. Эти bioaerogels характеризуются УФ-видимой спектроскопии А.Н.d круговой дихроизм спектроскопии и могут быть использованы для обнаружения присутствия оксида в газовой фазе азота. Успех этой процедуры зависит от регулирования концентрации с цит. И концентрации буфера , и не требует других компонентов , таких как наночастицы металла. Это может быть возможным, чтобы инкапсулировать другие белки, используя подобный подход делает эту процедуру важным для возможного будущего развития биоаналитический устройства.

Introduction

Цитохром с (цит. С) является одним из ключевых белков переноса электронов участвует в реакциях клеточного дыхания организма. Было показано, участвует в апоптозе, контролируемой форме гибели клеток, и он может обнаружить такие малые токсичные молекулы как оксид азота и окиси углерода 1-3. Оксид азота (NO) играет важную роль в различных физиологических процессах, происходящих в нервной, сердечно-сосудистой системы и иммунной системы. В то время как цит. C , как правило , требует водной среды забуференный до значений рН-нейтральный , чтобы оставаться структурно нетронутыми и активным, исследование показало , что цит. C может сохранить свою структуру и функции в твердых материалов , известных как аэрогеля при определенных условиях 4-9.

Аэрогеля являются весьма пористые материалы, часто образованные путем синтеза оксидов золь-гель металл (В то время как на основе оксидов металлов аэрогель очень распространены, углерод и другие типы аэрогелей были синтезированы. Одним из примеров является InP Aerogels) 10 и сушку этих золь-гели таким образом , что пористая твердая матрица остается без изменений 11-14. Все поры в твердых аэрогелям приводить к большой доступной площади поверхности делает аэрогелям чрезвычайно полезным для любых применений, где поверхностные реакции имеют важное значение. Когда химические или биохимические функциональные возможности собрана в пределах аэрогеля nanoarchitecture, было показано , что физическая пористость и повысить площадь поверхности аэрогеля помогают улучшить датчики, а также электроды для батареи, топливные элементы и суперконденсатор приложения 11,15-23 , Для того, чтобы высушить -аэрогели таким способом, который выходит из пористой твердой матрицы без изменений, что характерно для удаления растворителя, который остается в порах после синтеза золь-гель с помощью сверхкритической экстракции растворителем. Любой коллапс пор, что может быть вызвано силы поверхностного натяжения, как растворитель испаряется из геля сведены к минимуму, так как в сверхкритической сушки, интерфейс жидкость-пар никогда не образует.

с инкапсулируется в золь-гели , которые были сохранены влажными или которые были высушены ambiently 24-30. Доклады заключающих биомолекул в золь-гелей, которые затем сушат суперкритически с образованием аэрогеля являются более редкими из-за необходимости обработки, что может быть вредным для структуры многих белков. В случае цит. С, определенные условия позволяют сохранить способность цит. C для обнаружения и реагирования на них оксида газофазного азота в пределах аэрогеля. После стабилизации в аэрогель, высококачественная пористая структура аэрогеля способствует реакции между цит. С и оксида азота 4,8,9. Цитохром. С может быть заключен внутри аэрогеля сначала связывая его в несколько слоев вокруг наночастиц золота или серебра в растворе 4-8. Эти многослойные суперструктуры служат для защиты белка в матрице аэрогеля. В самом последнем approacч , что мы разработали, когда концентрация белка и буфера силы управляются наряду с другими синтетическими условиями, цит. C сохраняет целостность в пределах аэрогеля даже без металлических наночастиц начальной ассоциации 9.

Синтез начинается, как много аэрогеля синтезы начинают смешением кремнезема золь-гель предшественники в течение заданного периода времени. Это после того, как набор время смешивания , что цит. C добавляют в качестве буферного раствора в смесь. Гелеобразование затем происходит с образованием пористой твердой кварцевую структуру, в которой поры заполнены водой, метанолом, оставшихся реагентов и побочных продуктов. Эта жидкость, которая заполняет поры могут быть смыты с различными растворителями через серию обменов растворителей, последние обмены с происходит жидкий диоксид углерода в аппарате критической точки сушки выдерживают при низкой температуре. Приведение гелей выше критической температуры (31,1 ° C), диоксида углерода способствует образованию в качествеupercritical жидкости внутри аппарата под давлением, которая может быть снабжена вентиляционными отверстиями для образования сухой, высокопористых аэрогелей. Относительно низкая температура, необходимая для диоксида углерода с образованием сверхкритической текучей среды является преимуществом по сравнению с другими растворителями, так как он держит белок ниже температуры, при которой она может денатурации.

Наш металл наночастицами свободный подход к герметизирующего цит. С в аэрогеля является предпочтительным , потому что это простая процедура , которая может привести к развитию в более общем плане, применимого протокола для инкапсулирования других белков , а также. Многие белки могут не взаимодействовать с металлическими наночастицами таким же образом , что цит. C делает и синтез наночастиц металла или приобретение добавляет дополнительное время и затраты на процедуры. Несколько отчетов о инкапсулирования белков в аэрогелям делают разработку этой процедуры значительный шаг вперед, чтобы найти более общую процедуру для инкапсуляции других белков в аэрогеля, которые могут помочь Iп потенциальных будущих Биоаналитическая устройств.

В разделе Протокол этой рукописи описывает , как синтезировать кремнезема золь-гели, инкапсулировать цит. С в этих золь-гели, высушить эти композитные золь-гели для формирования аэрогеля, характеризуют эти bioaerogels с помощью УФ-видимого и кругового дихроизма спектроскопии и обнаружения присутствия газофазного оксида азота с этими bioaerogels. Цитохром. C был успешно воплощен в аэрогелей , когда сначала растворяют в 4,4 до 70 мМ водных растворах фосфатного буфера. Тем не менее, оптимизированная структура белка в аэрогелям было обнаружено , что в результате , когда инкапсулирования 40 мМ фосфатом растворы цитохрома. C производства заряженное аэрогеля цит. Концентрации С в диапазоне от 5 до 15 мкМ 9. Таким образом, протокол , приведенная ниже , чтобы синтезировать аэрогеля с использованием 40 мМ фосфатом растворы цит. С результатом в загруженном цитохрома. Концентрация с в аэрогелям 15 мкм. </ Р>

Protocol

Защитные очки или очки, лабораторный халат, а также лабораторные перчатки следует носить в любое время во время процедуры. Никогда не используйте устройство критической точки сушки без защитных очков или очки. Все растворы, содержащие тетраметоксисилан, метанол, этанол, ацетон и аммиак должны быть обработаны в вытяжном шкафу.

1. Сделайте буфер и цит. Гр Решения

  1. Для того, чтобы ~ 750 мл рН 7, 40 мМ калий-фосфатного буфера, сначала готовят 500 мл 0,04 М одноосновного фосфата калия путем взвешивания 2,72 г одноосновного фосфата калия и растворения в воде с использованием 500 мл мерную колбу.
  2. Приготовьте 500 мл 0,04 М двухосновного фосфата калия путем взвешивания 3,48 г двухосновного фосфата калия и растворения в воде с использованием 500 мл мерную колбу.
  3. Налейте двухосновных раствор соли в большой химический стакан с мешалкой и начать перемешивание раствора на мешалке.
  4. Медленно добавляют порциями одноосновной соли sспособность по к двухосновной солевого раствора при контроле рН с рН-электродом и метр до тех пор, пока рН не является 7,00. будет использовано приблизительно 250-300 мл одноосновной солевого раствора.
  5. Взвесить приблизительно 0,023 г цит. С и место в стеклянный сцинтилляционный флакон. Добавьте 2000 мкл приготовленного калий - фосфатного буфера с помощью микропипетки , а затем осторожно взболтать раствор смешивать до тех пор , все твердое вещество, красный цитохрома. C растворяется в растворе и не твердых частиц остается.
  6. Возьмите 20 мкл приготовленного цит. Гр раствора и добавляют к 1 см длины пути пластиковую кювету. Добавьте 3 мл приготовленного буфера.
  7. Возьмем UV-VIS спектр от 300-700 нм с использованием буфера в эталонной ячейке. Используйте цит. Гр абсорбцию (А) при 409 нм, коэффициент экстинкции 31 (ε) от 106,100 М -1 см -1, длина кювета пути (л), а закон Ламберта-Бера для определения концентрации (с) раствора (А = εlc),
  8. Назад вычислить концентрацию исходного приготовленного раствора. В 2 мл готовили цит. С раствором обычно составляет от 0,7 до 0,9 мМ в концентрации.
  9. Развести оригинальный подготовленный цит. Гр решение 800 мкл 0,105 мМ пипеткой 117 мкл 0,72 мМ готовили цит. С раствора в сцинтилляционный флакон. Затем добавьте оставшуюся 800 мкл (683 мкл в данном случае) подготовленного буфера. Вихревой перемешать. Точные объемы будут меняться в зависимости от точной концентрации исходного приготовленного цитохрома. : Раствор в виде объема цитохрома. C до пипетка рассчитывается как (800 мкл * 0,105 мМ) / (оригинал цит. C концентрация в мМ).
  10. Храните оригинальный подготовленный и разведенный цит. Гр растворов при температуре 2-8 ° С в холодильнике , пока готов к использованию в течение двух недель.

2. Synthesize диоксид кремния (SiO 2) Соль

  1. Добавьте одноразовый стаканчик полипропилена емкостью 50 мл 'BeAker А '. Поместите мензурку на чашку весов аналитического баланса и использовать стеклянную пипетку Пастера, чтобы добавить 1,88 г тетраметоксисилан в стакан. Нулевой баланс, а затем пипеткой 2,88 г метанола в 'Beaker А'.
  2. Футляре 'Beaker А' парафильмом.
  3. Этикетка одноразового использования 50 мл полипропиленовый лабораторный стакан 'Beaker B'. Добавьте магнитную мешалку и место на сковороду аналитического баланса. Используйте стеклянную пипетку, чтобы добавить 0,75 г воды и 3,00 г метанола.
  4. Футляре 'Beaker B' парафильмом.
  5. Начните перемешивании содержимого 'Beaker B' на мешалке внутри вытяжного шкафа, а затем использовать шприц, чтобы вставить 5 мкл 28.0-30.0% -ного раствора гидроксида аммония через Parafilm покрытия в смесь при перемешивании.
  6. Как только шаг 2.5 завершено, добавьте содержимое 'Beaker А' до 'B' кубков. Размешайте смесь в течение 20 минут, пока покрыты парафильмом.

3. Подготовить гель Пресс-формы

Примечание: Тамвремя для подготовки геля формы в то время как золь смесь диоксида кремния перемешивания на стадии 2.6.

  1. Приобретать 8-9 полипропиленовых сцинтилляционных ампул (16 мм х 57 мм, размер объем 6,5 мл, с днищ отрезала) и соответствующих колпачков. Положите пластиковую обертку над крышкой конца флакона, чтобы создать плоскую поверхность для гель, чтобы сформировать и поместить на крышку над ней, убедившись, что пластмассовая обертка остается неповрежденной внутри крышки.
  2. Выстроить флаконах с колпачком-концом вниз на скамье и открыл днища вверх.

4. Подготовить цит. С -silica Соль-гели

  1. После завершения золь смешивания (шаг 2,6), добавляют 3 мл золя смеси в чистую располагаемого стакане 50 мл полипропилена.
  2. Используйте стекло пипетки Пастера медленно понижаться 500 мкл 0,105 мМ разбавляли цит. : Раствор (сделанный на стадии 1.9) к золь смеси 3 мл на протяжении ~ 1 мин. Убедитесь в том , чтобы аккуратно взболтать смесь при добавлении цит. С , чтобы избежать образования большогокрасные сгустки. Если предположить , что объемы являются аддитивными, путем разбавления 500 мкл раствора 0,105 гр мМ цит. До 3500 мкл, в цит. С Концентрация сейчас в золь, в теории, 15 мкМ.
  3. Пипеткой 0,5 мл полученного цит. С золя оксида кремния в каждую подготовленную пресс - форму. Также пипеткой 0,5 мл остающегося 'просто' золя оксида кремния в одну или две пресс-формы для использования в качестве контрольных образцов в течение процесса сушки при сверхкритической температуре.
  4. Покрытие лицевой стороной вверх отверстия пресс-форм с парафильмом и положить в холодильник (~ 2-8 ° C) в течение ночи или в течение по крайней мере 12 ч для получения золь-гели.
  5. Возьмите формочки из холодильника. Удалите парафином из верхней части одной пресс - формы , содержащей CYT гр золь-гель. Также снимите крышку и пластиковую упаковку со дна.
  6. После добавления некоторое количество этанола из промывочной бутылки в пресс-форму, использовать конец круговой диск шприца плунжера, чтобы осторожно толкать гель из формы и в чистую 20 мл стеклянный сцинтилляционный флакон продAining приблизительно 5 мл этанола.
  7. Повторите эту процедуру удаления геля (шаги 4.5 и 4.6) , пока все цитохрома. C гели добавляют во флакон , и все силикагели добавляют в отдельном флаконе. Если более чем одна концентрация геля цит гр. Было сделано, обязательно хранить как гели вместе в отдельных ампулах. Затем заполните чаш к вершине с этанолом, крышкой и хранить между 2-8 ° C.
  8. Через каждые четыре часа в течение дня, удалите гели из холодильника, сливают этанол выключения гелей и заменить свежим этанолом.
  9. В течение еще трех дней, погрузить влажные золь гель в ацетоне, декантацией и добавление свежего ацетона три раза в день.

5. суперкритически Dry цитохрома. С -silica Соль-гели

  1. Охлаждают критической точки устройства для сушки (см рисунок 1) до 10 ° C, установив температуру прикрепленной циркулятора до 8 ° C.
  2. После того, как аппарат имеет гeached 10 ° C, выполнить испытание на герметичность, на аппарате путем заполнения перемещение лодки с ацетоном и герметизировать его внутрь аппарата.
    1. Открыть наполнительный клапан устройства и добавить диоксид углерода до тех пор, пока аппарат наполовину полон.
    2. Закройте наполнительный клапан и слушать внимательно шипение у дверей и клапанов, где уплотнительные кольца или уплотнения могут ухудшаться.
    3. Замените все уплотнительные кольца или уплотнения, если утечка найдена.
  3. После завершения проверки на утечку, откройте сливной клапан, чтобы выпустить ацетон и углекислый газ в стоком вытяжкой. Затем удалите передаточную лодку из устройства.
  4. После того, как обеспечить, чтобы аппарат без утечек, тщательно вылейте влажные гели из сцинтилляционных флаконах, наряду с большинством из ацетона, на три длинные секции раздаточной лодки (образец корзины или крышками марлевых не нужны). Деликатно толкать и перемещать гели внутри лодки с щипцами, чтобы гарантировать, что все гели полностью погружены Iп ацетон. Добавьте больше ацетона при необходимости перед пломбированием лодку внутри аппарата.
  5. Открыть наполнительный клапан устройства для добавления диоксида углерода, а затем открыть выпускной клапан для спуска ацетона в течение пяти минут, как только наблюдается ацетон смешивание с диоксидом углерода, чтобы быть опускаясь на дно аппарата через окно аппарата. Это просачивающейся из ацетона на дно будет происходить до того, как устройство будет полностью заполнен углекислым газом, так что наполнительный клапан должен оставаться открытым до степени, необходимой в процессе дренирования так что устройство будет продолжать заполнять даже в то время как слив открыт.
  6. Закройте сливной клапан. Держите наполнительный клапан раскрывалась слегка.
  7. Через пять минут, откройте сливной клапан в течение пяти минут снова и отрегулируйте наполнительный клапан должен быть открыт достаточно, чтобы аппарат остается полном объеме в течение всего времени стекания. Закройте сливной клапан, держать наполнительный клапан раскрывалась, затем повторите этот шаг Слив еще раз пятьминут спустя.
  8. После первых трех этапов дренажа, откройте стечь в течение 5 мин, в то время, приблизительно каждые 40 мин в течение промежутка по крайней мере, шесть часов, чтобы обеспечить полную замену ацетона жидкого диоксида углерода в пределах гелей. Всегда регулировать наполнительный клапан, чтобы быть открытым достаточно во время каждого сливом так, чтобы уровень жидкости в аппарате никогда не опускается ниже верхней части лодки во время слива.
  9. После того, как осушение шаги будут завершены, закройте наполнительный клапан, и слейте жидкость углекислый газ, так что уровень остается видимым только над зубцами на лодке, глядя через окно устройства.
  10. Установите температуру аппарата прикрепленной циркулятора до 40 ° С , чтобы гарантировать , что жидкость поднимается диоксида углерода , превышающих его критической температуры и давления (T c = 31 ° C; Рс = 7,4 МПа).
  11. Примерно через 15 мин, наблюдается переход из жидкого состояния в сверхкритической текучей среды через окно аппарат в виде жидкого meniscмы над штырьков лодки исчезает. Позвольте по крайней мере 15 минут времени для уравновешивания, затем откройте выпускной клапан небольшое количество, чтобы начать выпускать жидкость в сверхкритическом состоянии.
  12. В течение примерно 45 мин, продолжают постепенно открыть выпускной клапан все шире и шире, так что устойчивый, но очень низкое шипение рилизинг жидкости может быть услышан и манометр наблюдается медленно уменьшается до нуля.
  13. После того, как давление аппарата пошел к нулю, откройте дверцу аппарата, снимите лодку, и использовать пинцет, чтобы поместить недавно высушенные аэрогеля в чистые стеклянные сцинтилляционные флаконы.

6. Охарактеризовать цитохрома. С -silica Aerogels с УФ-видимой и кругового дихроизма (КД) Спектроскопия

  1. Подготовьте картонную платформу для хранения аэрогеля монолиты на пути луча УФ-спектрофотометр или CD-спектрометра.
    1. Вырежьте 2,5 см х 2,5 см кусок легкого картона (например, картон из коробки Laboторией ткани), сложите его пополам, вырезать на полпути вверх на складку, а затем сложить два крылышка, созданных путем разрезания, обратно.
    2. Вырежьте 5 см х 5 см кусок легкого картона, с 1,5 см х 1,5 см квадратное отверстие в середине. Затем используйте черную изоленту, чтобы уменьшить размер удержания до 0,5 см х 0,5 см.
    3. Лента закрылки сложенного и разрезают картона против 5 см х 5 см кусок картона так, чтобы небольшая согнуты поверхность создается для аэрогеля монолита , чтобы сидеть на непосредственно перед 0,5 см х 0,5 см отверстие (см рисунок 2) , Затем лента заднюю часть картона к УФ-спектрофотометр, так что отверстие находится в линии с пути луча.
  2. Измерьте толщину гелей, которые будут использоваться для длины пути, с помощью микрометра.
  3. Поместите один гель на картоне платформе и измерить спектр от 300-800 нм с воздухом в опорном отсеке УФ-спектрофотометр.
  4. Установить полином А = А п, к области длин волн (λ) , где оптическая плотность (А), в основном , из - за фонового рассеяния, ~ 700-800 нм. Коэффициент , как правило , подходит к ряду между ~ 1 × 10 8 и 1 х 10 6 и п коэффициент , как правило , подходит к ряду между ~ 2 и 3.
  5. Вычислить разброс на других длинах волн, используя коэффициенты, а и п, полученные из подгонки.
  6. Вычтите этот рассчитанный разброс фонового поглощения от исходного спектра, чтобы получить разброс исправлен спектра.
  7. Установить Разброс вычитают спектр с кривой Гаусса в области 370 до 490 нм с использованием соответствующего программного обеспечения (GRAMS / AI 8.0) для определения высоты пика, пика-центр, а ширина пика пика Соре аэрогеля.
  8. Применить закон Ламберта-Бера с использованием измеренного толщины геля для длины пути (л), коэффициент экстинкции 31 (е) от 106,100 М -1 см -1 с в аэрогель (A = εlc).
  9. Сравните расчетную цит. Концентрацию С до концентрации теоретически в геле (15 мкМ) , чтобы установить жизнеспособность цит. C в пределах аэрогеля. Типичные viabilities процентов близка к 100%, но следует отметить , что эти viabilities являются лишь оценками , так как вычисление на основе коэффициента экстинкции цит. C в растворе 31 , которое , как предполагают, немного отличается от коэффициента экстинкции цитохрома. с в аэрогеля, не известно.
  10. Запуск азота в CD инструмента, по крайней мере за 5 минут до включения лампы с.
  11. Лента держатель картона на CD-спектрометре поэтому отверстие в соответствии с пути луча.
  12. Измерьте непрерывную длину волны пустой спектр с ничего в держателе картона от 350-500 нм при 100 нм / мин, принимая в среднем три сканирования,
  13. Поместите один гель (толщина ранее измеренное на шаге 6.2) на картонную платформу и измерить спектр от 350-500 нм при 100 нм / мин, беря среднее из трех сканирований.
  14. Повторить измерения УФ-видимой и CD для всех аэрогеля монолитов интерес.

7. Определить наличие оксида азота (NO) газ с цитохрома. Гр -silica аэрогелям

ВНИМАНИЕ: Работа с NO опасно и все газ не должны быть обработаны в вытяжном шкафу или исчерпаны в вытяжной шкаф. Поступательный воздействие NO токсичен для тканей, очень ядовитый диоксид азота и / или четырехокись азота будет образовываться, когда NO вступает в контакт с воздухом. Тепло и коррозионные газы также образуются, когда NO вступает в контакт с водой.

  1. Поместите 8 л оксида азота цилиндр (10% оксида азота, 90% азота) в хорошо вентилируемом вытяжном шкафу и отрегулировать давление до 4 фунтов на квадратный дюйм.
  2. Подключение трубки и к оксида азота цилиндра и цилиндр азота (давление, установленным в 6 псI) и соединить концы трубки к Т-образным клапаном (см рисунок 3 , а ).
  3. Выберите аэрогелем монолит для эксперимента и измерения толщины (или длина пути) с помощью микрометра.
  4. Поместите аэрогеля (~ 3 мм толщиной) в одноразовой кювете с пластиковой крышкой и поставить кювету в спектрофотометре. слегка Обрежьте аэрогель, если это необходимо, чтобы вписаться в кювете.
  5. Вставьте две иглы шприца в пластмассовый колпачок кюветы, один из которых подключен к выходу Т-образного клапана, и один из которых подключен к трубке , чтобы служить в качестве выбросы вредных веществ в вытяжном шкафу (см рисунок 3б). Используйте парафином, чтобы запечатать иглы с трубкой и крышкой в ​​кювету.
  6. Поместите пустой одноразовый кюветой в эталонной ячейке.
  7. Отрегулируйте положение кювет аэрогелем, чтобы гарантировать, что аэрогель лежит на пути луча перед началом эксперимента.
  8. Возьмем начальный спектр от 800 до 300 нм.
  9. Монитор разницу между оптической плотности при 414 нм и поглощение при 408 нм при повороте Т-образный клапан для переключения между азотом и оксида азота / смеси азота с интервалами времени, установленного для убедившись, что ни в какое время является скорость потока азота или окиси азота / смеси азота настолько высоки, что аэрогель перемещается в кювете.
  10. Возьмите окончательный спектр от 800 до 300 нм, после того, как циклы экспозиции закончены.
  11. Повторите эту процедуру с трех до четырех монолитов для получения среднего ответа зондирования.

Representative Results

Описанные результаты процедуры в аэрогеля , содержащих жизнеспособный цит. Гр. Как указано в конце введения, цит. C может быть воплощен из водных буферных растворов , которые варьируются от 4,4 до 70 мМ фосфата. Примеры цитохрома. C -silica (цит. C -SiO 2) аэрогелям сделаны из растворов , содержащих различные концентрации буфера, показаны на рисунке 4. Все гели являются относительно прозрачные, с гели , сделанные из 70 мМ буфера наиболее непрозрачным.

Сравнение спектроскопии цит. С при различных условиях показана на рисунке 5. Типичный спектр (рис 5в) показывает большой Сорэ пик около 408 нм для цитохрома. Гр -SiO 2 аэрогеля и очень похож на спектр цитохрома . с в растворе (рис 5а). Кроме того, спектр цитохрома.с инкапсулируются в аэрогеля с металлическими наночастицами также показано (рис 5б) и цит. с -SiO 2 аэрогель спектр подобен этому спектру , а также. Когда цит. С -SiO 2 аэрогель подвергается воздействию окиси азота, типичное смещение пика Соре наблюдается (рис 5г).

УФ-спектры для Vis гелей , изготовленных из цитохрома. C растворов в различных концентрациях буферных показаны на рисунке 6. Все эти гели показывают характерный УФ-видимой спектроскопические особенности указывает , что цит. C не находится в денатурированной состоянии в гелях. Тем не менее, уменьшилась транслюцентность гелей сделаны из 70 мМ буфера результатов в более низком отношении сигнал-шум для этих спектров.

Спектры КД цитохрома. С -SiO 2 аэрогель похожи на спектры цитохрома. С С в буферном растворе (рис 7).

На рисунке 8 показан типичный азотную мониторирования Оксид для цитохрома. C -SiO 2 аэрогель и соответствующие аэрогель , которые также содержат наночастицы металла в дополнение к цит. С. Разница между оптической плотности при 414 нм, и что при 408 нм наблюдается увеличение, а затем уменьшается, когда гели подвергаются окиси азота, а затем азот соответственно последовательно.

Если диоксид углерода в сверхкритическом не высвобождается при достаточно медленном темпе, жизнеспособности цитохрома. С в пределах сформированных аэрогеля будут поставлены под угрозу. Это проявляется путем сравнения полученного УФ-видимой спектров после формирования гелей, отпустив диоксида углерода при различныхцену (рисунок 9).

Рисунок 1
Рисунок 1: Критическая точка сушилки Критическая точка устройство сушки показано от (А) спереди и (б) обратно с дверью передачи лодки и устройство , показанное рядом с задней части аппарата..

фигура 2
Рисунок 2: Картонная платформа Собранный картон платформа для проведения аэрогель на пути луча не давал инструмента..

Рисунок 3
Рисунок 3: Окись азота Чувствительный настройка оксида азота зондирования настройка, включающая в себя : (а) вытяжкой заключенной 10% окиси азота., 90% баллоном с азотом, НКТ, и Т-образный клапан, и (В) , кювета с вставленными иглами.

Рисунок 4
Рисунок 4:.. Образец цит C -SiO 2 аэрогель аэрогелям инкапсулирования 15 мкм CYT с в 4,4 мМ, 40 мМ и 70 мМ калий - фосфатного буфера, приведены в сравнении с монетку слева направо.. Эти аэрогель приблизительно 0,2-0,5-см высотой. Печатается с разрешения 9.

Рисунок 5
Рисунок 5:. Цитохром C -SiO 2 аэрогель спектроскопия Видимая спектры 15 мкМ цитохром с на стадии (а) в 50 мМ фосфатного буфера золе.социологическое загрязнение; (Б) Аи (5 нм) ~ цит с -SiO 2 аэрогель. (С) цит с -SiO 2 аэрогель (выдержке на воздухе). (D) цит. С -SiO 2 аэрогель (подвергаются воздействию окиси азота в течение 3,5 мин). Эти спектры представитель каждого типа геля сдвинуты для наглядности, а пунктирная линия обозначает положение пика Соре из цит. С в буфере. В то время как каждый спектр имеет 15 мкМ цит. С, гель толщина (или высот) , являются лишь 0,2-0,5 см по сравнению с кювету раствора 1 см , что приводит к более высокой оптической плотности раствора. Печатается с разрешения 9.

Рисунок 6
Рисунок 6: аэрогель спектроскопии в виде инкапсулированных концентрации буфера изменяется Усредненные УФ-видимой спектральной оптической плотности аэрогеля , разделенное на гель длины пути для гелей , заключающих 15 _.6; M цит с в 70 мМ (черный) ( в среднем 4 спектров), 40 мМ (красный, пунктирная) ( в среднем 8 спектров), и 4,4 мМ (зеленый, пунктир) ( в среднем 9 спектров) фосфата калия буфером. , Печатается с разрешения 9.

Рисунок 7
Рисунок 7:... Аэрогель круговой дихроизм спектроскопии кругового дихроизма спектры цит С в растворе с фосфатным буфером натрия (твердое вещество), два представителя спектры цитохрома C -SiO 2 аэрогель (пунктир), а также два представителя спектры Аи (5 нм) ~ цит. с SiO- 2 аэрогель (пунктирные). Печатается с разрешения 9.

Рисунок 8
Рисунок 8: Азотная обнаружения оксида с цитохрома с -SiO 2. . к югу> аэрогель Мониторинг сдвига (ΔA = A 414 нм - А 408 нм). интенсивности Соре от цитохрома с (твердый красный) и Аи ~ цит с (пунктирная синяя) , инкапсулированный в SiO 2 композитных аэрогеля nanoarchitectures как поток газа. переключается между азотом (где максимальный пик Соре находится на ~ 408 нм) и оксида азота (где максимальный пик Сорэ при ~ 414 нм). Каждая кривая представляет собой среднее из 3-4 испытаний, с двумя из цитохрома с -SiO 2 испытания отслеживаемые на ΔA = A 414 нм -. 407 нм , так как начальный максимальный пик Соре был на 407 нм для этих испытаний. Печатается с разрешения 9.

Рисунок 9
Рис . 9: Влияние сверхкритической времени выпуска жидкости Усредненные УФ-видимой спектральной оптической плотности , деленная на длину пути гель для цитохрома C -SiO 2 аэрогель ENCA.psulating 10 мкМ цит. с в 50 мМ фосфатного буфера , в котором были сделаны суперкритически высушенные аэрогель либо рилизинг сверхкритическим диоксидом углерода в течение 45 мин (твердый, черный ( в среднем 9 спектров)) или 7 мин (пунктирная, красный ( в среднем 4 спектры)). Печатается с разрешения 9.

Discussion

Как описано выше, эта процедура последовательно производится жизнеспособную цит. С инкапсулируются в аэрогеля. Концентрация цит. C в пределах аэрогеля может изменяться в диапазоне от 5 до 15 мкм и концентрации буферного исходного раствора цит гр. Инкапсулированный в аэрогеля может изменяться в диапазоне от 4,4 до 70 мМ фосфата без серьезного вредного воздействия на жизнеспособность белка. Тем не менее, пик центр и ширина пика характерного цитохрома. С Соре пик в аэрогелям ближе всего к тому , что они для цит. С в растворе , когда цит. С воплощен в аэрогеля из растворов 40 мМ буфера 9.

Синтез цитохрома. Гр -SiO 2 аэрогель зависит от возраста некоторых исходных реагентов. Метанол, тетраметоксисилан, и раствор гидроксида аммония все гигроскопичен и должны быть заменены каждые один на два месяца. Увеличенная вода, которая накапливается вэти реагенты с течением времени влияет на гелевые структурные характеристики и время перехода золь-к-гель.

При выполнении сверхкритической сушки, перемещение лодки точки сушильный аппарат критического может вместить до восемнадцати толщиной 0,5 см, 1 см в диаметре гелей. Как указано в разделе протокола, конкретного наполнения и слива процедуру следует выполнить для переноса углекислого газа в золь-гелей. Важно отметить, что в начале протокола водоотборе осушение смесь углекислого газа и ацетона протекает при такой высокой скоростью, что сливная труба замерзает жесткой влагой конденсацию на лед на внешней стороне. Смесь отхлынули содержит некоторое количество воды, так как ацетон не безводной и эта вода может иногда замерзнуть до такой степени, что сливная трубка фактически закупоривает. Необходимо следить за таких засоров и слушать для остановки потока. Сливной клапан должен быть закрыт в течение нескольких минут, так что засор будет плавиться, если забивают обнаружен. Вв худшем случае, если выпускной клапан не закрыт, наличие засорения может вызвать такое большое давление, чтобы создать, что дренажная трубка сильно выскакивает из устройства. После первых нескольких периодов сливных, большинство ацетона будет смывают из устройства, а также возникновение мокрых куски льда будет значительно уменьшить. Разряд будет постепенно походить на сухой лед, как протокол дренирование продолжается с любым остаточным доказательства наличия ацетона (например, запах) становится невозможно обнаружить к концу процесса стекания.

После того, как диоксид углерода , в аппарате имеет перешли из жидкого состояния в сверхкритической текучей среды и процесс выпуска воздуха началось, необходимо выпустить текучую среду с низкой скоростью в течение по крайней мере , 45 мин , как указано в процедуре 9. Более высокая скорость высвобождения может снизить жизнеспособность цитохрома. С (как показано на рисунке 9) в пределах аэрогеля и аэрогели могут сами фактически распадаться , как гое жидкость устремляется вырваться из гелей. В общем, даже когда аэрогель остаются нетронутыми после открывания дверцы аппарата, важно тщательно и аккуратно обращаться с ними, поскольку они являются хрупкими и могут легко ломаться.

Гели контроль двуокиси кремния, которые переливают вместе с цитохрома. С -SiO 2 гели используются после сверхкритической сушки , чтобы определить , является ли перенос диоксида углерода в гелях был успешным. Иногда цит. C -SiO 2 Гели могут появиться облачно и важно , чтобы определить , является ли это из - за переноса неполным растворителем или , если это возможно , придется делать с концентрацией цит. C или буфере , инкапсулируются в гелях. Если с появляются силикагели без цитохрома. Иметь однородный, прозрачный внешний вид по всему, это может быть принято в качестве доказательства того, что передача растворителя произошло полностью , даже если цит. С -SiO 2 гели имеют некоторые помутнение к ним. В пределах Облачность силикагелейбез цит. C после сушки указывает на то, что некоторые ацетон оставались внутри гелей во время вентилирования.

Как указано в разделе протокола, важные меры предосторожности необходимо соблюдать осторожность при работе с оксидом азота (NO). Для обнаружения NO с помощью аэрогеля, необходимо, чтобы запечатать кювету очень хорошо и исчерпать газ, протекающий через аэрогеля в вытяжной шкаф. В качестве альтернативы, вся спектрофотометр может быть перемещен в вытяжном шкафу вместе с NO газового баллона в качестве дополнительной меры предосторожности, чтобы ограничить воздействие NO газа. При контакте с воздухом NO сразу же производить ядовитое диоксид азота, осмия азота или обоих. ОТСУТСТВИЕ также могут вступать в реакцию с водой для получения тепла и едких паров. Поэтому, устойчивое воздействие NO может привести к токсичности прямой ткани.

При использовании цит. Гр -SiO 2 -аэрогели для обнаружения присутствия оксида азота, полоса Соре будет сначала при ~ 408 нм и сместитдо ~ 414 нм в присутствии оксида азота. После переключения обратно в азот, полоса Соре следует обратить вспять обратно центрирования при ~ 408 нм. Он также может быть возможным использовать цит. C -SiO 2 аэрогель , чтобы обнаружить присутствие других лигандов , таких как окись углерода 27.

Различные опубликованные процедуры включают в себя дополнительный этап объединения золота или наночастицы серебра с цит. С в растворе перед смешиванием с золь и сверхкритической сушки с образованием -аэрогели 4-8. Сравнивая УФ-видимой спектроскопии цитохрома. С воплощен в аэрогеля с металлическими наночастицами к тому из цитохрома. С воплощен в аэрогелям без металлических наночастиц показывает , что эти два типа методов капсулирования производят цит. С аналогичной жизнеспособности в пределах аэрогеля (Рисунок 5) , Тем не менее, цит. С инкапсулируется металлических наночастиц является несколько более стабильным , чем цитохрома. C инкапсулироватьd без металлических наночастиц в пределах аэрогеля 9. Спектры КД обоих типов цит. Гр аэрогеля также схожи, хотя и отличается от спектра цит. С в буфере , указывающей некоторое раскрытие цит. С в течение аэрогеля (рис 7). Предыдущие отчеты о цитохрома. C , инкапсулированные в аэрогелям предполагают , что круговой дихроизм спектроскопии, скорее всего , оценивает внешний слой белка, развернутый при контакте с силикагелем, в любой из металлических наночастиц-зародышеобразователями многослойным цитохрома. Гр структуры или свободно организованными структурами , которые образуют когда никакие металлические наночастицы не присутствуют в аэрогелям 4,9. Большинство цит. C в течение любого типа самоорганизующейся структуры внутри аэрогеля остается в нетронутом , как измерено с помощью УФ-видимой спектроскопии , хотя. Преимущество протокола, описанного здесь Sans наночастиц является то, что дорогие покупки или отнимает много времени синтеза металлананочастицы не является необходимым. Белки не часто успешно инкапсулированы в аэрогелей, и поэтому эта процедура важна тем, что она может привести к развитию более общего метода для инкапсулирования других белков в аэрогелям с потенциальной значимости для будущих биоаналитических устройств.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Поддержка этой работы и / или публикации была предоставлена ​​Научным институтом Колледжа Fairfield университета искусств и наук, факультет исследовательский грант Fairfield университета, науки премии Коттрелл колледжа из исследовательской корпорации по науке улучшению, колледж Fairfield университета искусств и наук и Отдел Fairfield университета химии и биохимии. Мы выражаем глубокую признательность Жан-Мари Уоллес за очень полезный анализ и консультации относительно этой общей области исследований. Кроме того, мы выражаем особую благодарность вам всем прошлым, тока и будущих студентов исследователей исследовательской лаборатории Harper-Leatherman.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate, monobasic Fisher Scientific P285-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific P288-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)
Water Millipore Direct-Q 18 MΩ cm
pH meter and electrode Denver Instrument UB-10
Cytochrome c from equine heart Sigma Aldrich C7752-100MG  ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20 °C
Glass scintillation vials Wheaton 03-341-25J 20 ml, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm
Disposable cuvette Fisher Scientific 14-955-126 methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm
Ultraviolet Visible Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 Uses UVProbe v 2.33 software
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) JASCO J-810
Isotemp Laboratory Refrigerator Fisher Scientific
Polypropylene disposable beakers Fisher Scientific 01-291-10 50 ml
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) Sigma Aldrich 218472-500G 98% purity
Methanol Fisher Scientific A457-4 GC Resolv grade
Ammonium hydroxide solution Sigma Aldrich 221228-25ML-A ACS reagent, 28.0%-30.0%
General purpose polypropylene scintillation vials Sigma Aldrich Z376825-1PAK 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 ml, slice off bottom with sharp knife or razor
generic plastic wrap various
Parafilm M laboratory wrapping film Fisher Scientific S37440
Plastic syringe plunger various use syringe plunger from 3 ml syringe
Ethyl alcohol Acros 61509-0040 Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent
Acetone Fisher Scientific A949-4 HPLC grade
Critical point drying apparatus Quorum Technologies E3000 Series
Circulator Fisher Scientific Isotemp 3016
Carbon dioxide cylinder Tech Air siphon tube
Micrometer Central Tool Company
GRAMS/AI 8.0 software Thermo Electron Corporation
Nitrogen cylinder Tech Air Another inert gas could be substituted
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder Airgas
Tygon tubing various
T-switch valve various
syringe needles various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pettigrew, G. W., Moore, G. R. Cytochromes c. Biological Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1987).
  2. Moore, G. R., Pettigrew, G. W. Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. , SpringerVerlag. Berlin. (1990).
  3. Scott, R. A., Mauk, A. G. Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach. , University Science Books. Sausalito, CA. (1996).
  4. Wallace, J. M., Rice, J. K., Pietron, J. J., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silica nanoarchitectures incorporating self-organized protein superstructures with gas-phase bioactivity. Nano Lett. 3 (10), 1463-1467 (2003).
  5. Wallace, J. M., Dening, B. M., Eden, K. B., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silver-colloid-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. Langmuir. 20 (21), 9276-9281 (2004).
  6. Wallace, J. M., Stroud, R. M., Pietron, J. J., Long, J. W., Rolison, D. R. The effect of particle size and protein content on nanoparticle-gold-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. J.Non-Cryst. Solids. 350, 31-38 (2004).
  7. US Patent. Rolison, D. R., Wallace, J. M., Pietron, J. J., Rice, J. K., Stroud, R. M. U. S. , 7,238,729 U.S. Patent 6,824,776 (2004) (2007).
  8. Harper-Leatherman, A. S., Wallace, J. M., Rolison, D. R. Cytochrome c. stabilization and immobilization in aerogels. Enzyme Stabilization and Immobilization: Methods and Protocols. Minteer, S. D. 679, Springer. New York, NY. 193-205 (2011).
  9. Harper-Leatherman, A. S., et al. Simplified procedure for encapsulating cytochrome c. in silica aerogel nanoarchitectures while retaining gas-phase bioactivity. Langmuir. 28 (41), 14756-14765 (2012).
  10. Hitihami-Mudiyanselage, A., Senevirathne, K., Brock, S. L. Assembly of phosphide nanocrystals into porous networks: Formation of InP gels and aerogels. ACS Nano. 7 (2), 1163-1170 (2013).
  11. Fricke, J. Aerogels. , Springer-Verlag. Berlin. (1986).
  12. Hüsing, N., Schubert, U. Aerogels-airy materials: chemistry, structure, and properties. Angew. Chem. Int. Edit. 37 (1-2), 22-45 (1998).
  13. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. (2011).
  14. Kazuyoshi, K. Recent progress in aerogel science and technology. Adv. Porous Mater. 1 (2), 147-163 (2013).
  15. Leventis, N., Elder, I. A., Anderson, M. L., Rolison, D. R., Merzbacher, C. I. Durable modification of silica aerogel monoliths with fluorescent 2,7-diazapyrenium moieties. Sensing oxygen near the speed of open-air diffusion. Chem. Mater. 11 (10), 2837-2845 (1999).
  16. Plata, D. L., et al. Aerogel-platform optical sensors for oxygen gas. J. Non-Cryst. Solids. 350, 326-335 (2004).
  17. Rolison, D. R., Pietron, J. J., Long, J. W. Controlling the sensitivity, specificity, and time signature of sensors through architectural design on the nanoscale. ECS Trans. 19 (6), 171-179 (2009).
  18. Carroll, M. K., Anderson, A. M. Aerogels as platforms for chemical sensors. Aerogels Handbook. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. , Springer. New York, NY. 637-650 (2011).
  19. Rolison, D. R. Catalytic nanoarchitectures-The importance of nothing and the unimportance of periodicity. Science. 299 (5613), 1698-1701 (2003).
  20. Pietron, J. J., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Using three dimensions in catalytic mesoporous nanoarchitectures. Nano Lett. 2 (5), 545-549 (2002).
  21. Anderson, M. L., Morris, C. A., Stroud, R. M., Merzbacher, C. I., Rolison, D. R. Colloidal gold aerogels: Preparation, properties, and characterization. Langmuir. 15 (3), 674-681 (1999).
  22. Anderson, M. L., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Enhancing the activity of fuel-cell reactions by designing three-dimensional nanostructured architectures: Catalyst-modified carbon-silica composite aerogels. Nano Lett. 3 (9), 1321 (2003).
  23. Chervin, C. N., et al. Defective by design: vanadium-substituted iron oxide nanoarchitectures as cation-insertion hosts for electrochemical charge storage. J. Mater. Chem. A. 3 (22), 12059-12068 (2015).
  24. Ellerby, L. M., et al. Encapsulation of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method. Science. 255 (5048), 1113-1115 (1992).
  25. Massari, A. M., Finkelstein, I. J., Fayer, M. D. Dynamics of proteins encapsulated in silica sol-gel glasses studied with IR vibrational echo spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 128 (12), 3990-3997 (2006).
  26. Ray, A., Feng, M., Tachikawa, H. Direct electrochemistry and Raman spectroscopy of sol-gel-encapsulated myoglobin. Langmuir. 21 (16), 7456-7460 (2005).
  27. Blyth, D. J., Aylott, J. W., Richardson, D. J., Russell, D. A. Sol-gel encapsulation of metalloproteins for the development of optical biosensors for nitrogen-monoxide and carbon-monoxide. Analyst. 120 (11), 2725-2730 (1995).
  28. Lan, E. H., Dave, B. C., Fukuto, J. M., Dunn, B., Zink, J. I., Valentine, J. S. Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties. J. Mater. Chem. 9 (1), 45-53 (1999).
  29. Miller, J. M., Dunn, B., Valentine, J. S., Zink, J. I. Synthesis conditions for encapsulating cytochrome c. and catalase in SiO2 sol-gel materials. J. Non-Cryst. Solids. 202 (3), 279-289 (1996).
  30. Ronda, L., Bruno, S., Faggiano, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Oxygen binding to heme proteins in solution, encapsulated in silica gels, and in the crystalline state. Methods in Enzymology. Poole, R. K. 437, Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 311-328 (2008).
  31. Margoliash, E., Frohwirt, N. Spectrum of Horse-Heart Cytochrome c. Biochem. J. 71 (3), 570-572 (1959).

Tags

Биоинженерия выпуск 109 цитохром золь-гели аэрогели диоксид кремния аэрогель Ультрафиолетовый Видимый оксид азота
Инкапсуляция цитохрома<em&gt; с</em&gt; Кремнеземом Aerogel Nanoarchitectures без металлических наночастицах при сохранении газофазных отпорности
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E.… More

Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E. R., Kosciuszek, N. D. Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity. J. Vis. Exp. (109), e53802, doi:10.3791/53802 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter