Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

فحوصات النوعية والكمية للكشف وتوصيف مضادات الميكروبات البروتين

doi: 10.3791/53819 Published: April 10, 2016

Protocol

1. إعداد البكتيرية وببتيدوغليكان ركائز

ملاحظة: يتم استخدام خلية كاملة ركائز البكتيرية وببتيدوجليكان النقاء بمثابة ركائز الإنزيم في كل من فحص نشر شريحة مجهرية والفحص صبغ الافراج عنهم. وتتطلب هذه ركائز إعداد مسبق لإجراء ردود الفعل الانزيم. يصف بروتوكول التالية إعدادها.

  1. كلها البكتيرية الركيزة خلية
    1. إنتاج الركيزة الخلية البكتيرية، فحقن 500 مل من المرق المغذي مع 2 مل الثقافة بين عشية وضحاها من العصوية الرقيقة 168 (مجموعة ثقافة النوع الأمريكية؛ آي تي سي سي 23857). احتضان عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز (125 دورة في الدقيقة) حتى تصل ثقافة مرحلة الأسي للنمو، الذي يعرف بأنه مرحلة النمو السريع مما أدى إلى مضاعفة ثقافة البكتيرية. لزراعة subsp السالمونيلا الملهبة. الملهبة (آي تي سي سي 10708)، استخدام المرق المغذي كوسيلة النمو عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (125 دورة في الدقيقة). الحرارة تقتل كل ثقافة من التعقيم لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية تحت 3 أجهزة الصراف الآلي من الضغط.
    2. حصاد الركيزة قتل حرارة البكتيرية بواسطة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 5000 ز س. يغسل بيليه ثلاث مرات مع نوع 1 المياه واعادة تعليق في كمية ضئيلة من المياه. في هذه الدراسة، تعليق ركائز في 1200 ميكرولتر.
    3. قسامة 300 ميكرولتر من ركائز الخلية البكتيرية إلى 1.5 مل أنابيب microfuge وتخزينها في 20 درجة مئوية.
  2. الركيزة ببتيدوغليكان النقاء
    1. تنقية ببتيدوغليكان من البكتيريا الركيزة الهدف 7-10 أو الحصول من بائع (انظر المواد والمعدات الجدول). تنقية الاستعدادات ببتيدوغليكان الخام من الإكسسوارات البوليمرات جدار الخلية.

2. النوعي شريحة مجهرية انتشار الفحص [معدلة من Lachica، وآخرون. 11]

ملاحظة: فحص شريحة مجهرية نشر هوطريقة النوعي للكشف عن وجود إنزيم مضاد للميكروبات في عينة. كما ينشر الإنزيم من خلال مصفوفة تحتوي على الركيزة الأغاروس، منطقة المقاصة تطور كما الانزيم hydrolyzes الركيزة. يصف بروتوكول التالية إعداد وأداء فحص شريحة مجهرية نشر للكشف عن نوعيا وجود مضادات الميكروبات البروتين.

  1. تحديد تركيز انزيم المضادة للميكروبات التي يتم تقييمها باستخدام أدوات حمض Bicinchoninic (BCA) الفحص البروتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. الاستفادة من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بمثابة عازل الانزيم. ومع ذلك، تحديد تجريبيا المناسب عازلة للانزيم معين.
  3. إجراء التخفيف المتسلسل لإنزيم مضاد للميكروبات باستخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) كمنطقة عازلة رد فعل. والتخفيف المتسلسل المستخدمة في هذه المقايسات نشر شريحة مجهرية تنتج الجماهير البروتين فحص النهائية لل0 خريج، 10 خريج و 100 خريج، 1 نانوغرام، 10 نانوغرام، 100 نانوغرام، 1 ميكروغرام، و 10 ميكروغرام لكل حجم رد الفعل.
  4. الاستغناء عن الجماهير البروتين في أنابيب microfuge الفردية وضبط كميات البروتين إلى 20 ميكرولتر باستخدام برنامج تلفزيوني تمهيدا لبالإضافة إلى شريحة مجهرية آبار رد فعل.
  5. جعل الاغاروز حل 0.5٪ عن طريق إذابة 0.25 غرام من الاغاروز في 50 مل من برنامج تلفزيوني. تسخين حل ليغلي حتى يذوب تماما agarose. تحديد المياه المفقودة أثناء عملية انصهار من حيث الوزن وإضافة إلى حل.
  6. إضافة 50 ميكرولتر من 10٪ أزيد الصوديوم في المياه إلى حل الاغاروز وضبط درجة الحرارة من الحل إلى 50 درجة مئوية في حمام مائي. وأضاف أزيد الصوديوم لمنع تلويث نمو البكتيريا خلال حضانة فحص شريحة مجهرية نشرها. إذا تم استخدام خلايا قابلة للحياة كما الركيزة، بحذف أزيد الصوديوم من الحل الاغاروز.
  7. ذوبان الجليد الركيزة قتلوا الحرارة البكتيرية على الجليد.
  8. اعادة تعليق الركيزة البكتيرية في 12 مل من محلول الاغاروز إلى ما يقرب من مطابقة التعكر من ألف قدم مكعب 2.0arland معادلتها معيار (انظر المواد الجدول). مقارنة turbidities من الحلول من خلال وضع تصور خط أسود على خلفية بيضاء من خلال الحلول، مضيفا الركيزة البكتيرية إلى الاغاروز حتى يتم تحقيق تعكر تقريبي.
  9. على الفور الماصة 3 مل من محلول الاغاروز الركيزة لكل شريحة مجهرية (25 × 75 × 1 مم 3).
  10. بعد ترسيخ الشرائح، لكمة ثلاثة آبار في طبقة الاغاروز الركيزة لكل شريحة مجهرية باستخدام حفار الفلين (4.8 مم). إضافة 20 ميكرولتر من كل من البروتين المعدل التخفيف المتسلسل إلى الآبار الخاصة بها.
  11. استخدام برنامج تلفزيوني (20 ميكرولتر) أو ألبومين المصل البقري (5 ميكروغرام في 20 ميكرولتر PBS) في السيطرة السلبية أيضا. استخدام الانزيمات جرثوم المعروف المناسبة لالركيزة، مثل الليزوزيم، كما تحكم إيجابية.
  12. احتضان الشريحة في غرفة الرطوبة عند 37 درجة مئوية أو درجة الحرارة النشاط الأمثل للانزيم. طول الحضانة يعتمد على التركيز والنشاط المحدد للإنزيم مضاد للميكروبات. زمن رد الفعل النموذجي هو بين عشية وضحاها (حوالي 16 ساعة).
  13. بعد مرور فترة الحضانة، ومراقبة الشرائح تحت الصور الضوء والتقاط غير المباشرة للمقايسة تطوير باستخدام كاميرا عاكسة مفردة العدسة الرقمية مع عدسة 60 ملم في المسافة البؤرية من حوالي 30 سم.
    ملاحظة: النشاط الانزيمي للمضادات الميكروبات البروتين لالركيزة معين يرتبط مع تطوير منطقة واضحة من التحلل، والتي تشكل في جميع أنحاء كذلك ينتشر هذا الإنزيم في الاغاروز.
  14. في التأهل النشاط الأنزيمي، ومراقبة أحجام المناطق التي تشكل حول كل بئر. النشاط الأنزيمي ارتفاع يتعلق نوعيا إلى منطقة أكبر، بينما انخفاض النشاط الأنزيمي يتعلق نوعيا إلى منطقة أصغر.

3. الركيزة وصفها - Remazol الزرقاء الرائعة R صبغ وصفها [معدلة من تشو 12]

ملاحظة: في الفحص صبغ الإصدار، الركيزة تساهميا لينكهد لRemazol الأزرق اللامع R صبغ. يصف بروتوكول التالية إعداد ركائز انزيم مصبوغ.

  1. تقديم 250 ملي هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) حل عن طريق إذابة 1 غرام هيدروكسيد الصوديوم في 99 مل من نوع الماء الذي لاستخدامها لصنع 200 ملي الرائعة Remazol حل الأزرق R صبغ (RBB).
  2. جعل حل 200 ملم RBB عن طريق إذابة 1.25 ز RBB في 98.75 مل ± 1 مل من 250 ملي حل هيدروكسيد الصوديوم النقي (الخطوة 3.1).
  3. اعادة تعليق الخلايا البكتيرية قتلوا الحرارة عند تركيز 0.5 غرام من الوزن الرطب في 30 مل من محلول RBB. لببتيدوغليكان تنقيتها، وإعادة تعليق ببتيدوغليكان بتركيز 0.3 غرام من الوزن الرطب في 30 مل من محلول RBB.
  4. احتضان خليط التفاعل في دورق مخروطي على منصة دوارة لمدة 6 ساعة على 37 درجة مئوية مع الخلط لطيف.
  5. نقل خليط التفاعل إلى 4 درجات مئوية الحاضنة، واحتضان لمدة 12 ساعة إضافية مع خلط لطيف.
  6. بعد الحضانة، وحصاد الركيزة مصبوغ بواسطة الطرد المركزي في 3000 x جلمدة 30 دقيقة. صب محلول الصبغة من بيليه الركيزة.
  7. إزالة مرتبطة غير تساهمي صبغ للذوبان من ركائز عن طريق غسل الخلايا المسمى صبغ أو ببتيدوغليكان مرارا وتكرارا (حوالي 3-5 يغسل) مع الماء النوع الأول تليها الطرد المركزي. مع كل إضافة المياه، وإعادة تعليق بيليه بدقة.
    ملاحظة: عند غير منضم، صبغ للذوبان لم يعد مرئيا في الماء يغسل بعد الطرد المركزي. وينبغي إيلاء الركيزة غسل واحد إضافي. لاحظ أن الركيزة ستبقى الأزرق، في حين أن طاف من غسل الماضي ستكون واضحة.
  8. تخزين ركائز مصبوغ مع وقف التنفيذ في الحد الأدنى من المياه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

4. الكمية صبغ الإفراج الفحص

ملاحظة: أثناء الفحص صبغ الإفراج عنهم، والتحلل من الركيزة مصبوغ RBB في الإصدارات رد فعل الأنزيمية مصبوغ المنتجات في طاف رد فعل. قياس اللونية لكمية من الصبغة صدر يشير إلى عموالاتحاد الوطني للعمال من النشاط الأنزيمي الحالي ضمن العينة لانزيم معين. يسمح الأسلوب الكمي مقارنة الإنزيمات المختلفة عبر ركائز ويسمح لتباين الظروف البيئية التي تؤثر على رد الفعل الأنزيمية (على سبيل المثال، درجة الحرارة، الملوحة، ودرجة الحموضة). يصف بروتوكول التالية إعداد وأداء الفحص صبغ الافراج عن كشف كميا النشاط الأنزيمي من مضادات البروتين.

  1. التحضير لفحص صبغ الإفراج
    1. السماح الركيزة مصبوغ المجمدة للعودة إلى درجة حرارة الغرفة وغسل مرتين مع العازلة الفحص (PBS)، والتي يتم تحديدها تجريبيا للانزيم معين.
    2. حساب حجم تعليق الركيزة التي يحتاجها مضاعفة حجم رد الفعل 200 ميكرولتر من قبل عدد من المقايسات صبغ الإفراج التي يتعين القيام بها.
    3. إعداد تعليق الركيزة عن طريق إضافة الركيزة مصبوغ لحجم المخزن المؤقت فحص، قرر في 4.1.2، حتى الكثافة البصرية (ويتحقق OD) من 2.0 في 595 نانومتر باستخدام مطياف. أن تبقى في حدود الوظيفية للمعمل، وقياس 2.0 OD 595 كما 1.0 ل1: التخفيف 1 من محلول مركز. استخدام عازلة الفحص باعتبارها فارغة.
      ملاحظة: يمكن رفع العكارة الركيزة للتفاعل وراء 2.0 لتتناسب مع مستويات نشاط الانزيمات ذات كفاءة عالية.
    4. تعليق مضادات الميكروبات البروتين التي يتم تقييمها في المخزن فحص بتركيز يقدر من 1 ملغ / مل.
    5. باستخدام فحص صفيحة من كيت الفحص BCA البروتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، وتحديد تركيز الفعلي للعينة البروتين إلى أن يعاير. ضبط تركيز تعليق الأسهم إلى 1 ملغ / مل باستخدام عازلة الفحص.
  2. باستخدام الفحص صبغ الإفراج تحديد شروط الحضانة الأمثل لبروتين مضادات الميكروبات
    1. تمييع البروتين الأسهم تعليق مضادات الميكروبات إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر. هذا التركيز يعطي بالعربيةإينال كتلة التفاعل من 1 ميكروغرام من البروتين لكل وحدة التخزين (10 ميكرولتر) تضاف إلى رد فعل الفحص.
    2. تحديد نطاق الحراري إلى تقييم للبروتين للجراثيم. وشمل نطاق الحرارية في هذه المقايسات 5 درجات مئوية، 15 درجة مئوية و 25 درجة مئوية، 35 درجة مئوية، 45 درجة مئوية، 55 درجة مئوية، و 65 درجة مئوية.
    3. إجراء فحوصات رد فعل في 0.5 مل أنابيب microfuge. لكل حالة الحرارية، إضافة 10 ميكرولتر من البروتين الأسهم إلى 200 ميكرولتر من تعليق الركيزة استعداد.
    4. احتضان في cycler الحرارية لمدة 8 ساعة مع خلط من قبل انعكاس مرة كل ساعة.
    5. بعد الحضانة، وإلقاء القبض على ردود الفعل من خلال إضافة 25 ميكرولتر من الايثانول.
    6. إزالة عسر الهضم، الركيزة غير قابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 2 دقيقة، ونقل 150 ميكرولتر من طاف رد فعل لكل خليط التفاعل لصفيحة 96-جيدا أسفل شقة، مع الحرص على عدم عرقلة بيليه الركيزة عسر الهضم.
    7. قياس النشاط الأنزيمي للantimicrob البروتينالاتحاد العالمي للتعليم للالركيزة التي قدمها تحديد كمية من الصبغة RBB للذوبان فصلها عن الركيزة بعد الإنزيمية. لقياس النشاط الأنزيمي، وقياس الامتصاصية من طاف في 595 نانومتر باستخدام مطياف صفيحة. زيادة الامتصاص من قبل صبغ للذوبان التي تطلق في طاف من الركيزة المسمى هو قياس الكمي النشاط الأنزيمي.
      ملاحظة: ويمثل التغير في الامتصاصية من قبل وحدات النشاط (AU)، حيث 1 نتائج الاتحاد الافريقي في زيادة 0.01 في الكثافة الضوئية للتفاعل طاف صبغ الإصدار في 595 نانومتر. رد فعل فارغ، حضنت مع جميع المكونات رد فعل إلا الإنزيم، ويستخدم لطرح أي صبغة التي تطلق من الركيزة المسمى RBB-ويرجع ذلك إلى الحضانة. توفر درجات الحرارة المثلى الأنزيمية وحدة قياس النشاط الذروة.
    8. كرر الخطوات من 4.2.1 خلال 4.2.7 باستخدام مختلف مخازن الحضانة، لتحديد الظروف المثلى عازلة للأنزيم مضاد للميكروبات. في تيفحوصات ذات المناظر، واستخدام برنامج تلفزيوني.
  3. باستخدام الفحص صبغ إطلاق سراح لتحديد تركيز نشط الحد الأدنى في درجة الحرارة المثلى الحضانة لبروتين مضادات الميكروبات
    1. إجراء التخفيف المتسلسل للسهم تعليق البروتين باستخدام مضادات الميكروبات عازلة الفحص. مستويات سلسلة تخفيف تختلف مع نشاط أنزيم مضاد للميكروبات. والتخفيف المتسلسل المستخدمة في هذه المقايسات تنتج كميات البروتين فحص النهائية لل0 خريج، 10 خريج و 100 خريج، 1 نانوغرام، 10 نانوغرام، 100 نانوغرام، 1 ميكروغرام، و 10 ميكروغرام.
    2. تنفيذ كل فحص رد فعل في صفيحة مسطحة القاع 48-جيدا. لكل حالة الفحص، إضافة 10 ميكرولتر من تعليق البروتين منها إلى 200 ميكرولتر من تعليق الركيزة استعداد. ضبط أي اختلاف في حجم محلول البروتين إضافة إلى رد الفعل إلى 10 ميكرولتر باستخدام العازلة رد فعل.
    3. ختم صفيحة مع فيلم لوحة الختم لتجنب تباين حجم بسبب التبخر. احتضان في حاضنة شاكر في الأمثل العزم فيدرجة الحرارة cubation لبروتين معين المضادة للجراثيم لمدة 16 ساعة مع اهتزاز.
    4. بعد الحضانة، وإلقاء القبض على رد فعل من خلال إضافة 25 ميكرولتر من الإيثانول إلى كل بئر وإزالة الركيزة عسر الهضم بواسطة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 2 دقيقة.
    5. نقل 150 ميكرولتر من طاف رد فعل لكل خليط التفاعل لصفيحة 96-جيدا مسطحة القاع، مع الحرص على عدم عرقلة بيليه الركيزة عسر الهضم.
    6. لقياس النشاط الأنزيمي، وقياس الامتصاصية من طاف في 595 نانومتر باستخدام مطياف صفيحة. رد فعل فارغ، حضنت مع جميع المكونات رد فعل إلا الإنزيم، ويستخدم لطرح أي صبغة التي تطلق من الركيزة المسمى RBB-ويرجع ذلك إلى الحضانة. زيادة الامتصاص من قبل صبغ للذوبان التي تطلق في طاف من الركيزة المسمى يوفر مقياس كمي للنشاط الأنزيمي.
      ملاحظة: التغيير في الامتصاصية يمثله وحدات النشاط (AU)، حيث 1 نتائج الاتحاد الافريقي فيزيادة 0.01 في الكثافة الضوئية للتفاعل طاف صبغ الإصدار في 595 نانومتر.

Representative Results

فحص شريحة مجهرية نشر والكمي فحص صبغ الافراج عن طرق فعالة لفحص وقياس التحقيقات الأولية من مضادات البروتين جديدة. كل فحص لديها مزايا وقيود. ومع ذلك، عندما يقوم بالاشتراك، فهي تسمح الفحص الأولي السريع والتوصيف الأساسي لمضادات الميكروبات.

نشر فحص شريحة مجهرية تسمح بكفاءة للفحص السريع للمكتبات الميكروبية، وتنتج مضادات الميكروبات البروتين. عند مستويات تركيز الانزيم هي مصدر قلق، والحساسية من القيود الكشف قد تحد من الفحص، التي تتطلب قدرا أكبر من انزيم لتضاف إلى رد فعل جيد من الفحص صبغ الافراج عنهم. كما هو موضح في الشكل رقم 1، والخصائص النوعية لفحص تسمح للمراقب لمقارنة كميات انزيم النسبية موجودة داخل كل بئر.

together.within الصفحات = "1"> في منطقة تطوير من تحلل، هو موضح في الشكل 1A (25 ميكروغرام من انزيم)، على حافة الرائدة في منطقة يعرض تحلل عكر أو غير كاملة الركيزة، في حين أن المنطقة الأقرب إلى البئر يعرض تحلل الركيزة أكثر اكتمالا. هذه الظاهرة، هو نتاج للتركيز تناقص الانزيم نشرها في طليعة، تعقيد قياس دقيق لقطر منطقة. كما الآبار ب (15 ميكروغرام)، C (10 ميكروغرام)، D (5 ميكروغرام)، E (1.0 ميكروغرام)، و F (0.1 ميكروغرام) ويلاحظ في الشكل 1، وقطر من منطقة تحلل كامل تبدد إلى الانقراض ربط إلى انخفاض كمية الانزيم. لحالة F (0.1 ميكروغرام)، وتركيز الانزيم في الاغاروز أقل من الحد الذي سيسمح للانزيم نشرها أن تصور وهي تتحرك من خلال الاغاروز، hydrolyzing الركيزة. تم تشغيل فحص شريحة مجهرية نشر أيضا باستخدام تنقيته العصوية الرقيقة peptidoglycan كما الركيزة (الشكل 2). في حين أن المنطقة هي أقل تحديدا من تلك التي لوحظت مع خلية كاملة السالمونيلا الملهبة بسبب إحجام ببتيدوغليكان تعليق بالتساوي في الاغاروز، والتحلل من ببتيدوغليكان بواسطة انزيم المضادة للجراثيم معروف هو واضح.

الفحص صبغ الإصدار هو فحص أكثر حساسية وتنوعا من فحص شريحة مجهرية نشر، والسماح لأقل حد الكشف والاختلاف من العوامل البيئية التي تؤثر على رد فعل الانزيم. في المقايسات التمثيلية، قد تختلف درجة الحرارة لتحديد درجة الحرارة المثلى لإنزيم مضاد للميكروبات، والعزم على أن تكون 35 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني (الشكل 3). ويعتبر هذا الأمثل بوضوح في supernatants رد فعل كما كميات متزايدة من اللون الأزرق (الشكل 3B)، وكذلك ممثلة في وحدة النشاط المستمدة من قياسات الامتصاصية في 595 نانومتر (الشكل 3A). البراعة الفحص صبغ الإفراج يسمح للباحث تختلف ليس فقط في درجات الحرارة ولكن أيضا رد فعل العازلة ومكونات عازلة لتحديد الأوضاع بسرعة الحضانة المثلى لإنزيم معين.

تم قياس مستوى نشاط إنزيم غير معروف مضادات الميكروبات (الشكل 4) وانزيم ضبط α كيموتربسين (الشكل 5) في تحديد درجة حرارة الحضانة المثلى من 35 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني ضد المسمى RBB-العصوية الرقيقة الركيزة قتلوا الحرارة. مقارنة النتائج من الشكل (4) والشكل (5) إلى أن إنزيم مضاد للميكروبات غير معروف لديها ما يقرب من ضعف تقارب لB. الرقيقة الركيزة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن سيطرة α-كيموتربسين لا تهضم تماما قتلوا الحرارة B. الرقيقة الركيزة داخل البئر (لا تظهر البيانات). النشاط من ضبط α كيموتربسين يبدأ في لوحةالاتحاد الافريقي حول 0.3 ميكروغرام بالمقارنة مع الارتفاع المستمر في وحدات النشاط عبر جميع المبالغ انزيم لإنزيم مضاد للميكروبات غير معروف (الشكل 4 والشكل 5). قد يشير هذا إلى أن إنزيم غير معروف لديه النشاط المتواصل أكبر أو أن هناك عدد أكبر من انشقاق المواقع المتاحة للانزيم داخل B. الرقيقة الركيزة.

الشكل 1
الشكل 1: نشاط انزيم ضد السالمونيلا الملهبة كامل الركيزة خلية تم استخدام فحص شريحة مجهرية نشر لتقييم نوعية النشاط لمضادات الميكروبات بروتين غير معروف ضد قتل حرارة السالمونيلا الملهبة للsubsp الملهبة (آي تي سي سي 10708). الجماهير البروتين من مضادات الميكروبات غير معروف معلقة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تمت إضافتها إلى الآبار كل منوتضمنت الشرائح 25 ميكروغرام (جيد أ)، 15 ميكروغرام (جيد B)، و 10 ميكروغرام (جيد C)، و 5 ميكروغرام (جيد D)، 1 ميكروغرام (جيد E)، و 0.1 ميكروغرام (جيد F). برنامج تلفزيوني كان يستخدم وحده لعناصر السلبية للفحوصات. تم تصوير مناطق تحلل بعد الحضانة 6 ساعات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: نشاط انزيم ضد العصوية الرقيقة خلية ببتيدوغليكان ستريت واستخدم فحص شريحة مجهرية نشر لتقييم نوعية النشاط لمضادات الميكروبات بروتين غير معروف ضد ببتيدوغليكان من العصوية الرقيقة 168. علقت في 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، 10 ميكروغرام من مضادات الميكروبات غير معروف أضيفت إلى ما ألف من microslides. برنامج تلفزيوني وحدها كانت تستخدم كقاعدة للسلبيةالسيطرة للمقايسة (جيد B). تم تصوير منطقة تحلل بعد حضانة لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: الأمثل درجة الحرارة رد فعل لالبروتين الميكروبي براعة الفحص صبغ الإفراج يسمح الاختلاف من المعلمات الفيزيائية والكيميائية، مثل درجات حرارة الحضانة ومخازن، لتحديد تأثيرها على نشاط انزيم من الفائدة 6. كما هو موضح في هذا الشكل، تم تقييم النشاط من البروتين مضادات الميكروبات غير معروف (1 ميكروغرام) في برنامج تلفزيوني ضد العصوية الرقيقة قتلوا الحرارة المسمى RBB تحت مجموعة من درجات الحرارة الحضانة. عرض وحدات النشاط (AU) في الفقرة (أ)، وامتصاص RBB-بس اوند المنتجات تطلق في طاف بعد تم قياس التحلل في 595 نانومتر باستخدام مطياف صفيحة. في كل حالة درجة الحرارة، واستخدمت ردود الفعل مع عدم وجود إنزيم إضافة إلى طرح آثار أي صبغة الإفراج التي نتجت عن حضانة في مختلف درجات الحرارة. تم تصوير وsupernatants رد فعل المقابلة لكل درجة حرارة الحضانة قبل قياس الامتصاصية (B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: نطاق آخر لالبروتين الميكروبي تم قياس مستويات النشاط لمضادات الميكروبات بروتين غير معروف وحدات النشاط بعد حضانات بين عشية وضحاها 0، 100، 200، 300، 400، 500، 600، 700، 800، 900، و 1،000 نانوغرام ، مقاسا بروت BCAعين فحص (A). لهذه التفاعلات، وB. المسمى RBB- وزادت الرقيقة مستوى الركيزة لتعطي كثافة ضوئية من 5.0 في 595 نانومتر للتأكد من أن رد فعل وفقا لأعلى كمية الانزيم (1000 نانوغرام) لم يتحلل تماما عن الركيزة المتاحة ضمن فترة رد فعل الحضانة. واستخدمت ردود الفعل السيطرة مع عدم وجود إنزيم إضافة إلى طرح آثار أي صبغة صدر الناجمة عن الحضانة وحدها. تم تصوير وsupernatants رد فعل المقابلة لكل كمية الإنزيم مسبق لقياسات الامتصاصية (B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
وقد تم قياس مدى آخر لα-كيموتربسين نطاق النشاط لα-كيموتربسين كما أكتيف: الرقم 5.وحدات إيتي بعد حضانات بين عشية وضحاها 0، 100، 200، 300، 400، 500، 600، 700، 800، 900، و 1،000 نانوغرام من انزيم (A). لهذه التفاعلات، وB. المسمى RBB- وزادت الرقيقة مستوى الركيزة لتعطي كثافة ضوئية من 5.0 في 595 نانومتر للتأكد من أن رد فعل وفقا لأعلى كمية الانزيم (1000 نانوغرام) لم يتحلل تماما عن الركيزة المتاحة ضمن فترة رد فعل الحضانة. واستخدمت ردود الفعل السيطرة مع عدم وجود إنزيم إضافة إلى طرح آثار أي صبغة صدر الناجمة عن الحضانة وحدها. تم تصوير وsupernatants رد فعل المقابلة لكل كمية الإنزيم مسبق لقياسات الامتصاصية (B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

فحص شريحة مجهرية نشر والفحص صبغ الإفراج توفر مزايا للكشف عن وتميز مضادات الميكروبات البروتين مجهولة سابقا. هذه الطرق السريعة والحساسة تسمح فحص عالية الإنتاجية من المكتبات مصدر الكائن الحي للتعرف على الانزيمات التي تهم سابقة للاستثمار موارد البحث أكبر. كما يتم تحديد الانزيمات هدف رفيعة، والاختلافات من فحوصات الكشف يمكن استخدامها للكشف بسرعة الانزيم أو لتحديد الخصائص الكيميائية الحيوية للانزيم. على سبيل المثال، خلال خطة تنقية البروتين متعددة الخطوات، يمكن فحص شريحة مجهرية نشر كشف بسرعة الكسور التي تحتوي على انزيم من الفائدة. وبالإضافة إلى ذلك، رد فعل أوبتيما للانزيم يمكن تحديده من خلال تغيير مخازن رد فعل ودرجات الحرارة حضانة في الفحص صبغ الافراج عنهم.

مجموعة من كتلة انزيم اللازمة للكشف في فحص شريحة مجهرية نشر هو وظيفة من characteri انزيمعصي. تتطلب القيود كشف الفحص عموما استخدام كميات أكبر من انزيم من الفحص صبغ الافراج عنهم. في هذه الدراسة، أوضحت المقارنة من حدود الكشف عن مقايسة شريحة مجهرية نشر (الشكل 1) إلى صبغ الإفراج فحص (الشكل 4) أن فحص شريحة مجهرية نشر هو أسلوب أقل حساسية من فحص صبغ الافراج عنهم. عندما تركيز انزيم ليست مصدر قلق، وفحص شريحة مجهرية يسمح للفحص الأولي السريع للمكتبات لإنتاج مضادات الميكروبات البروتين ضد ركائز الهدف مع مطالب العمال والمعدات منخفضة. على الرغم من أن تتطلب المزيد من الجهد والمعدات، وفحص صبغ الإصدار هو أكثر حساسية وقابلة للتكرار، مما أسفر عن النتائج الكمية التي تسمح بالمقارنة بين المقايسات صبغ الإفراج عن نفس أو مختلفة الانزيمات لركيزة معينة. يتم تنفيذ الطريقتين بسهولة في معظم المختبرات الميكروبيولوجية دون الحاجة إلى أجهزة متخصصة للغاية. في الممثلين،المقايسات التوالي، فيما انزيم السيطرة، ألفا-كيموتربسين، تم الكشف على كميات منخفضة تصل إلى 100 ​​نانوغرام (الشكل 5) باستخدام الفحص صبغ الإفراج عنهم، في حين أن الحد الأدنى الكشف في فحص شريحة مجهرية نشر 1 ميكروغرام (لا تظهر البيانات).

توفير المرافق كما فحص الكشف النوعي للأنزيمات المضادة للميكروبات، تم الإبلاغ عن عدد من الاختلافات مقايسة نشر 11،13. وعند استعراض هذه المقايسات، تم تطوير فحص شريحة مجهرية نشر لحساسية عالية نسبيا باعتبارها شاشة الأولي ولسهولة الاحتفال رد فعل. تعديل من عمل Lachica وآخرون. 11، التي استخدمت فيها تراكب الاغاروز للكشف عن إنتاج nucleases من سلالات المكورات العنقودية الذهبية، ونشر فحص شريحة مجهرية تعمل بطريقة مشابهة لطريقة المناعي شعاعي 14 كما ينشر البروتين من البئر في الاغاروز تحتوي على الركيزة. وimmunodiffu شعاعييوقف طريقة سيون التوسع في منطقة مناعي عندما يصل نظام توازن تشكيل المعقد بين المستضد نشرها والأجسام المضادة داخل الاغاروز. في المقابل، فإن الركيزة مقايسة شريحة مجهرية نشر يهضم في البداية من قبل نشرها مضادات الميكروبات البروتين في منطقة التوسع المستمر للتحلل المحيطة أيضا. يستمر قطر المتزايدة للمنطقة حتى يفقد الإنزيم النشاط أو تم استنفاد الركيزة. وتسارع معدل إنتاج المنطقة من تحلل كما نقاء، وبالتالي فإن نشاط معين من الأنزيمات أو تركيز الانزيم تضاف إلى الزيادة أيضا.

لتقييم كمي النشاط الأنزيمي من مضادات البروتين ضد قتل حرارة B. الرقيقة، وقد تم اختيار الفحص صبغ الافراج عنهم. المقايسات اللونية باستخدام Remazol الأزرق اللامع R صبغ (RBB) -labeled ركائز تسمح تقييم تنوعا وحساسة من البروتين activi مضادات الميكروباتتاي. الإنزيمية النتائج الركيزة المسمى RBB في الإفراج عن المنتجات الزرقاء القابلة للذوبان التي يمكن قياسها بسهولة من قبل معمل في 595 نانومتر. العديد من الاختلافات من RBB صبغ الافراج عن الفحص، وضعت لتوصيف البروتين الانزيمات المضادة للميكروبات أخرى، تظهر مرونة هذا الاختبار للتطبيق مع ركائز أخرى. على سبيل المثال، في تحديد آثار يزوستافين النشاط للجراثيم، تشو، وآخرون. وذكرت فحص صبغ الإفراج باستخدام الخلايا العنقودية مصبوغ RBB والمكورة العنقودية ببتيدوغليكان بمثابة ركائز 12. في تعديل لتطبيق هذا RBB صبغ الافراج عن الفحص، واقترح المسمى RBB-ميكروكوكس luteus الركيزة لاستخدامها كوسيلة سريعة وحساسة للتشخيص وشاشة لأمراض مثل عدوى بكتيرية وجود سرطان خبيث، والتي يمكن أن تكون مرتبطة إلى مستويات التعبير الليزوزيم الإنسان في مصل الدم (15). وبالإضافة إلى ذلك، وصفت RBB ركائز الخلية البكتيرية لديهايسوتو استخدمت في طريقة zymogram للكشف عن الليزوزيم (16).

علينا أن نبرهن على حد خفضت الكشف، والراحة، واستنساخ للفحص صبغ الإفراج، مما يسمح للفحص مكتبة السريع لانتاج الانزيم. التعديلات للمقايسة تسمح المصب فحوصات توصيف البيوكيميائية الكمية، بما في ذلك آثار درجات الحرارة، ودرجة الحموضة، والملوحة، وكذلك آثار من الإنزيمات المحللة للبروتين أخرى على نشاط البروتينات المضادة للميكروبات 6. وبالإضافة إلى ذلك، فإن كمية الصبغة الإفراج الفحص يمكن استخدامها لمقارنة أنشطة الإنزيمات متعددة لالركيزة معين. وقد أفاد RBB صبغ الإفراج فحص أداة لأنزيمات مع النشاط ضد السكريات بالإضافة إلى توصيف والكشف عن بروتين العوامل المضادة للجراثيم. وذكرت بيترسون واريكسون مقايسة للكشف عن النشاط endoglycanase استخدام غير متبلور، والخرز السكاريد مصبوغ RBB من السليلوز، الزيلان، المنان، وشيتفي 17. في التوسع في هذه النتائج، وقد تم تطوير طريقة حساسة للكشف عن الانزيمات التي تنتجها كيتيناز اردة في BT-107 باستخدام كيتين الغروية المسمى مع RBB 18. من هذه الدراسات وغيرها، وظهرت المصادر المتاحة تجاريا من ركائز مصبوغ RBB لاستخدامها في الكشف عن النشاط حال السكر، بما في ذلك ضد الكيراتين، الأميلوبكتين، الأميلوز، الجليكوجين، امينارين، د-الزيلان، جلوكان آزو الشعير، والنشا.

في هذه الدراسة، ونحن لشرح فائدة الفحص صبغ الافراج عنه في شكل صفيحة، والحد من حجم الركيزة المسمى RBB وانزيم اللازمة لإنتاج نتيجة اللونية. كما هو موضح في الشكل (4) والشكل (5)، ويوفر صفيحة صبغ الإفراج فحص حد اكتشاف أقل من فحص نشر شريحة مجهرية للكشف عن النشاط الأنزيمي. وفيما يتعلق باستخدام السريع، والحفاظ على اليد العاملة، وسهولة التفسير، وهيئة التصنيع العسكرييوفر roslide نشر فحص فائدة في شاشات عالية الإنتاجية الأولية لوجود نشاط مضادات الميكروبات فضلا عن الإشارة إلى وجود بروتين مضاد للميكروبات في عزل البروتين وتنقية الخطوات اللاحقة. الجمع بين هذه المقايسات اثنين يكمل كل منهما الآخر في الفرز الأولي وتوصيف النهائي لمضادات الميكروبات البروتين جديدة

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة. شركة ميتري هي شركة غير هادفة للربح تعمل عدة مراكز البحث والتطوير الممولة اتحاديا (FFRDCs).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid Becton Dickinson 3078
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) Corning, Inc. 3595
agarose Fisher Scientific BP162-100
α-chymotrypsin MP Biomedicals 215227205
Bacillus subtilis 168 American Type Culture Collection 23857
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad
cork borer Humboldt H-9661
lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
McFarland equivalence standard (2.0) Fisher Scientific R20412
microslides Fisher Scientific 22-38-103
nutrient broth Fisher Scientific S25959B
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 Sigma-Aldrich 69554-10MG-F
phosphate-buffered saline (1x) Teknova P0200
Pierce BCA Protein Assay Kit Life Technologies 23227
Synergy HT microplate spectrophotometer BioTek Instruments, Inc.
Remazol brilliant blue R dye (RBB) Sigma-Aldrich R8001
Salmonella enterica subsp. enterica American Type Culture Collection 10708
sodium azide Fisher Scientific S227-100
sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318-500
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film Diversified Biotechnology T-TOPS-50
UltraPure distilled water Invitrogen 10977-015
Name Company Catalog Number Comments
Solution
agarose solution
50 ml PBS
0.25 g agarose
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution
nutrient broth medium
4 g nutrient broth
500 ml Type I water
250 mM sodium hydroxide (NaOH) solution
1 g NaOH
99 ml Type I water
200 mM Remazol brilliant blue R dye (RBB)
1.25 g RBB
98.75 ml 250 mM NaOH solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anand, T. P., et al. Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India. Microbiol Res. 161, 252-262 (2006).
  2. Tagg, J. R., Dajani, A. S., Wannamaker, L. W. Bacteriocins of gram-positive bacteria. Bacteriol Rev. 40, 722-756 (1976).
  3. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
  4. Riley, M. A., Gordon, D. M. The ecological role of bacteriocins in bacterial competition. Trends Microbiol. 7, 129-133 (1999).
  5. Tenover, F. C. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. Am J Med. 119, S3-S10 (2006).
  6. Farris, M. H., Steinberg, A. D. Mitrecin A, an endolysin-like bacteriolytic enzyme from a newly isolated soil streptomycete. Lett Appl Microbiol. 58, 493-502 (2014).
  7. Dehart, H. P., Heath, H. E., Heath, L. S., Leblanc, P. A., Sloan, G. L. The Lysostaphin Endopeptidase Resistance Gene (epr) Specifies Modification of Peptidoglycan Cross Bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol. 61, 2811 (1995).
  8. Srivastava, K. K., Siddique, I. H. Quantitative chemical composition of peptidoglycan of Listeria monocytogenes. Infect Immun. 7, 700-703 (1973).
  9. Heilmann, H. D. On the peptidoglycan of the cell walls of Pseudomonas aeruginosa. Eur J Biochem. 31, 456-463 (1972).
  10. Schumann, P. Taxonomy of Prokaryotes. Rainey, F., Oren, A. 38, Academic Press. (2011).
  11. Lachica, R. V., Genigeorgis, C., Hoeprich, P. D. Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity. Appl Microbiol. 21, 585-587 (1971).
  12. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Anal Biochem. 171, 141-144 (1988).
  13. Osserman, E. F., Lawlor, D. P. Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia. J Exp Med. 124, 921-952 (1966).
  14. Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans, J. F. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry. 2, 235-254 (1965).
  15. Ito, Y., Yamada, H., Imoto, T. Colorimetric assay for lysozyme using Micrococcus luteus labeled with a blue dye, Remazol brilliant blue R, as a substrate. Chem Pharm Bull. (Tokyo). 40, 1523-1526 (1992).
  16. Hardt, M., Guo, Y., Henderson, G., Laine, R. A. Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions. Anal Biochem. 312, 73-76 (2003).
  17. Pettersson, B., Eriksson, K. E. A standardized spectrophotometric assay of endoglycanase activities using dyed, amorphous polysaccharides. Anal Biochem. 285, 220-224 (2000).
  18. Gomez Ramirez, M., Rojas Avelizapa, L. I., Rojas Avelizapa, N. G., Cruz Camarillo, R. Colloidal chitin stained with Remazol Brilliant Blue R, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms and to evaluate chitinases. J Microbiol Methods. 56, 213-219 (2004).
فحوصات النوعية والكمية للكشف وتوصيف مضادات الميكروبات البروتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials. J. Vis. Exp. (110), e53819, doi:10.3791/53819 (2016).More

Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials. J. Vis. Exp. (110), e53819, doi:10.3791/53819 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter