Protocol
1. Udarbejdelse af bakterielle og peptidoglycan Substrater
Bemærk: helcelle bakterielle substrater og oprensede peptidoglycaner anvendes som enzymsubstrater i både mikroobjektglas diffusion assay og farvestoffet-release assay. Disse substrater kræver forberedelse forud for udførelse af enzymreaktioner. Følgende protokol beskriver deres fremstilling.
- Hele bakteriecelle Substrat
- Fremstil bakteriecelle substrat ved at inokulere 500 ml næringsvæske med en 2 ml overnatskultur af Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection, ATCC 23.857). Inkuber ved 30 ° C under omrystning (125 rpm), indtil kulturen når en eksponentiel vækstfase, defineret som en hurtig vækstfase resulterer i fordoblingen af bakteriekulturen. Til dyrkning af Salmonella enterica subsp. Enterica (ATCC 10708), brug næringsvæske som vækstmedium ved 37 ° C under omrystning (125 rpm). Heat-kill hver kultur ved autoklavering i 10 minutter ved 121 ° C under 3 atm tryk.
- Harvest varmedræbte bakterier substrat ved centrifugering i 20 min ved 5000 x g. Vask pelleten tre gange med type 1 vand og genopslæmmes i en minimal mængde vand. I denne undersøgelse, suspendere substrater 1.200 pi.
- Portion 300 pi de bakterielle celle substrater til 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved 20 ° C.
- Renset peptidoglycan Underlag
- Rense peptidoglycan fra målet substrat bakterie 7-10 eller erhverve fra en leverandør (se Materialer og udstyr tabel). Oprens rå peptidoglycan præparater fra tilbehør cellevæg polymerer.
2. Kvalitativ mikroobjektglas Diffusion Assay [Modificeret fra Lachica, et al. 11]
Bemærk: mikroobjektglas diffusion analysen eren kvalitativ metode til påvisning af tilstedeværelsen af antimikrobiel enzym i en prøve. Som enzymet diffunderer gennem en agarose matrix indeholdende underlag, en zone med clearing udvikler som enzymet hydrolyserer substratet. Følgende protokol beskriver fremstillingen og udførelsen af mikroobjektglas diffusion assay til kvalitativt at detektere tilstedeværelsen af protein antimikrobielle stoffer.
- Bestemme koncentrationen af det antimikrobielle enzym, der skal evalueres ved hjælp af en bicinchoninsyre (BCA) Protein Assay Kit ifølge producentens protokol.
- Udnytte phosphatbufret saltvand (PBS) som et enzym buffer; imidlertid empirisk bestemme buffer relevante for en given enzym.
- Udfør en seriel fortynding af det antimikrobielle enzym under anvendelse phosphatbufret saltvand (PBS) som en reaktion buffer. Det serielle fortynding anvendes i disse mikroobjektglas diffusionsprocesser assays produceret endelige assay protein masser af 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug, og 10 ug pr reaktionsvolumen.
- Dispensere protein masserne i individuelle mikrocentrifugerør og justere protein volumener til 20 pi under anvendelse af PBS som forberedelse til tilsætning til mikroobjektglas reaktionsbrønde.
- Foretag en 0,5% agarose-opløsning ved at opløse 0,25 g agarose i 50 ml PBS. Opvarm opløsningen i kog indtil agarosen er fuldstændigt opløst. Bestem vand tabt under smelteprocessen efter vægt og tilføje tilbage til opløsningen.
- Der tilsættes 50 pi 10% natriumazid i vand til agaroseopløsningen og justere temperaturen af opløsningen til 50 ° C i et vandbad. tilsættes natriumazid for at inhibere kontaminerende bakterievækst under inkubering af mikroobjektglas diffusion assay. Hvis der anvendes levedygtige celler som substrat, udelade natriumazid fra agarosen opløsningen.
- Optøs varmedræbte bakterier substrat på is.
- Resuspender den bakterielle substrat i 12 ml af agaroseopløsningen til ca. matche turbiditeten af en 2,0 MCFArland ækvivalens standard (se Materialer tabel). Sammenligne turbiditeter af opløsningerne ved at visualisere en sort streg på en hvid baggrund gennem de løsninger, tilføjer bakteriel substrat til agarosen indtil den omtrentlige turbiditet er opnået.
- Umiddelbart pipette 3 ml af agarose-substratopløsning til hver mikroobjektglas (25 x 75 x 1 mm 3).
- Efter slides størkne, punch tre brønde i agarose-substratlag af hvert mikroobjektglas anvendelse af et propbor (4,8 mm diameter). Tilsæt 20 pi af hver justerede protein seriel fortynding til deres respektive brønde.
- Brug PBS (20 pi) eller bovint serumalbumin (5 ug i 20 pi PBS) i en negativ kontrol brønd. Anvende kendte bakteriolytiske enzymer egnede til substratet, såsom lysozym, som en positiv kontrol.
- Inkubér objektglasset i et fugtigt kammer ved 37 ° C eller den optimale aktivitet temperatur af enzymet. Længden af inkubation afhænger af koncentrationen ogspecifik aktivitet af det antimikrobielle enzym. En typisk reaktionstid er natten over (ca. 16 timer).
- Efter inkubation observere dias under indirekte lys og tage billeder i udviklingslandene under anvendelse af et digitalt spejlreflekskamera med en 60 mm objektiv ved en brændvidde på ca. 30 cm.
Bemærk: Enzymatisk aktivitet af proteinet antimikrobielle for givet substrat er korreleret med udviklingen af en klar zone af hydrolyse, som danner omkring brønden som enzymet diffunderer ind i agarose. - For at kvalificere den enzymatiske aktivitet, observere størrelsen af zoner, der danner omkring hver brønd. Høj enzymatisk aktivitet kvalitativt angår en større zone, mens lav enzymaktivitet kvalitativt angår en mindre zone.
3. Substrat Mærkning - Remazol Brilliant Blue R Dye Mærkning [Modificeret fra Zhou 12]
Bemærk: I farvestoffet-release assay er substratet kovalent linked at Remazol brilliant blue R-farvestof. Følgende protokol beskriver fremstillingen af farvede enzymsubstrater.
- Foretag en 250 mM natriumhydroxid (NaOH) ved at opløse 1 g NaOH i 99 ml type I vand, der skal anvendes til fremstilling af en 200 mM Remazol brilliant blue R-farvestof (RBB) opløsning.
- Foretag en 200 mM RBB-opløsning ved at opløse 1,25 g RBB i 98,75 ml ± 1 ml af en frisk 250 mM NaOH-opløsning (trin 3.1).
- Resuspender varmedræbte bakterieceller ved en koncentration på 0,5 g vådvægt i 30 ml RBB-opløsning. For oprenset peptidoglycan, re-suspendere peptidoglycan i en koncentration på 0,3 g vådvægt i 30 ml RBB opløsning.
- Inkubere reaktionsblandingen i en Erlenmeyer-kolbe på en roterende platform i 6 timer ved 37 ° C under forsigtig blanding.
- Overfør reaktionsblandingen til en 4 ° C inkubator, og inkuberes i yderligere 12 timer med forsigtig blanding.
- Efter inkubation høste farvet substrat ved centrifugering ved 3.000 x gi 30 min. Dekanteres farveopløsningen fra substratet pellet.
- Fjerne ikke-kovalent bundet opløseligt farvestof fra substraterne ved vask af farvestofmærkede celler eller peptidoglycan gentagne gange (ca. 3-5 gange vask) med type I vand efterfulgt af centrifugering. Med hver vand kommer, re-suspendere pellet grundigt.
Bemærk: Når ubundet, opløselig farvestof er ikke længere synlig i vandet vask efter centrifugering. Substratet bør have en yderligere vask. Bemærk, at substratet vil forblive blå, mens supernatanten fra den sidste vask vil være klart. - Opbevar de farvede substrater suspenderet i en minimal mængde vand ved -20 ° C til senere brug.
4. Kvantitativ Dye-release assay
Bemærk: Under farvestof-frigivelse assay hydrolysen af RBB-farvet substrat i den enzymatiske reaktion frigiver farvet produkter i reaktionen supernatanten. Kolorimetrisk måling af frigivne mængde farvestof indikerer amoUNT af enzymatisk aktivitet til stede i prøven for et givet enzym. Den kvantitative fremgangsmåde tillader sammenligning af forskellige enzymer tværs substrater og tillader variation af miljømæssige forhold, der påvirker den enzymatiske reaktion (f.eks temperatur, saltholdighed, og pH). Følgende protokol beskriver fremstillingen og udførelsen af farvestoffet-frigivelsesassay til kvantitativ påvisning af enzymatisk aktivitet af protein antimikrobielle midler.
- Forberedelse af Dye-release assay
- Tillad den frosne farvet substrat for at vende tilbage til stuetemperatur og vaskes to gange med assaybuffer (PBS), der bestemmes empirisk for den givne enzym.
- Beregn mængden af substrat suspension, der er nødvendig ved at multiplicere 200 pi reaktionsvolumen med antallet af farvestof-frigivelse assays der skal udføres.
- Forbered substratet suspension ved tilsætning farvet substrat til volumenet af assaybuffer, bestemt i 4.1.2, indtil en optisk densitet (OD) på 2,0 er opnået ved 595 nm ved anvendelse af et spektrofotometer. For at forblive inden for de funktionelle begrænsninger spektrofotometer, måle 2,0 OD 595 som 1,0 for en 1: 1 fortynding af den koncentrerede opløsning. Brug assay buffer som en tom.
Bemærk: Substratet turbiditet til reaktionen kan hæves over 2,0 for at matche de aktivitetsniveauer af højeffektive enzymer. - Suspendere proteinet antimikrobielle skal evalueres i assaybuffer til en anslået koncentration på 1 mg / ml.
- Anvendelse af mikroplade-assay af et BCA Protein Assay Kit ifølge producentens protokol, bestemme den faktiske koncentration af proteinet prøve, der skal analyseres. Indstille koncentrationen af bestanden suspension til 1 mg / ml under anvendelse af assaypuffer.
- Brug af Dye-release Assay at bestemme den optimale Inkubation Betingelser for en Protein Antimikrobiel
- Fortynd bestanden protein antimikrobielle suspension til 100 ng / pl. Denne koncentration giver AF-ginal reaktionsmasse på 1 ug protein per volumen (10 pi) tilsat til assayet reaktionen.
- Bestem den termiske interval, der skal vurderes for den bakteriolytisk protein. Den termiske interval i disse assays omfattede 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C, og 65 ° C.
- Udfør reaktionen analyser i 0,5 ml mikrocentrifugerør. For hver termisk tilstand, tilsættes 10 pi af bestanden protein til 200 pi forberedte underlag suspension.
- Inkuber i en thermocycler i 8 timer med blanding ved inversion gang i timen.
- Efter inkubering standse reaktionerne ved tilsætning af 25 pi ethanol.
- Fjern ufordøjet, uopløseligt substrat ved centrifugering ved 3.000 x g i 2 minutter, og overføre 150 pi af reaktionen supernatanten for hver reaktionsblanding til en 96-brønds fladbundet mikroplade, pas på ikke at forstyrre pellet af ufordøjet substrat.
- Måle enzymatisk aktivitet af proteinet Antimicrobundervægter le for den givne substrat ved at bestemme mængden af opløseligt RBB farvestof adskilles fra substratet efter enzymatisk hydrolyse. At kvantificere den enzymatiske aktivitet, måle absorbansen af supernatanten ved 595 nm under anvendelse af en mikroplade-spektrofotometer. Øget absorbans ved det opløselige farvestof frigivet i supernatanten fra det mærkede substrat er en kvantitativ måling af enzymatisk aktivitet.
Bemærk: Ændringen i absorbans er repræsenteret ved aktivitetsenheder (AU), hvor 1 AU resulterer i en 0,01 stigning i optisk densitet af farvestoffet-release reaktion supernatant ved 595 nm. En blank reaktion, inkuberet med alle reaktionskomponenter undtagen enzym, anvendes til at subtrahere enhver farvestof, der frigiver fra RBB-mærkede substrat på grund af inkubationen. Den optimale enzymatiske temperatur giver den højeste aktivitet måleenhed. - Gentag trin 4.2.1 gennem 4.2.7 under anvendelse af forskellige inkubationstider buffere, for at bestemme de optimale pufferbetingelser for den antimikrobielle enzym. i tisse analyser, bruge PBS.
- Brug af Dye-release assay til Bestem Minimal Aktiv Koncentration ved Optimal Incubation Temperatur for et protein Antimikrobiel
- Udfør en seriel fortynding af bestanden antimikrobielle protein suspension ved hjælp assay buffer. Fortyndingsrækken rækkevidde vil variere med aktiviteten af det antimikrobielle enzym. Det serielle fortynding anvendes i disse assays produceret endelige assay proteinmængder af 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug og 10 ug.
- Udfør hver reaktion assay i en 48-brønds fladbundet mikroplade. For hvert assay tilstand, tilsættes 10 pi af det respektive protein suspensionen til 200 pi forberedte underlag suspension. Juster enhver variation i mængden af proteinopløsningen tilsat til reaktionsblandingen til 10 pi under anvendelse reaktionsbuffer.
- Forsegl mikropladen med pladen forseglingsfilm at undgå volumen variation som følge af fordampning. Inkuber i en rysteinkubator ved den bestemte optimale icubation temperatur for givet protein antimikrobielle i 16 timer under omrystning.
- Efter inkubering standse reaktionen ved at tilsætte 25 pi ethanol til hver brønd og fjerne ufordøjet substrat ved centrifugering ved 3.000 x g i 2 min.
- Overfør 150 ul af reaktionsblandingen supernatanten for hver reaktionsblanding til en 96-brønds fladbundet mikroplade, pas på ikke at forstyrre pellet af ufordøjet substrat.
- At kvantificere den enzymatiske aktivitet, måle absorbansen af supernatanten ved 595 nm under anvendelse af en mikroplade-spektrofotometer. En blank reaktion, inkuberet med alle reaktionskomponenter undtagen enzym, anvendes til at subtrahere enhver farvestof, der frigiver fra RBB-mærkede substrat på grund af inkubationen. Øget absorbans ved det opløselige farvestof frigivet i supernatanten fra det mærkede substrat tilvejebringer et kvantitativt mål for enzymatisk aktivitet.
Bemærk: Ændringen i absorbans er repræsenteret ved aktivitetsenheder (AU), hvor 1 AU resultater ien 0,01 stigning i optisk densitet af farvestoffet-release reaktion supernatant ved 595 nm.
Representative Results
Den mikroobjektglas diffusion assay og den kvantitative dye-release assay er effektive metoder til screening og måling indledende undersøgelser af nye protein antimikrobielle stoffer. Hvert assay har fordele og begrænsninger; men når udført sammen, de tillader hurtig indledende screening og grundlæggende karakterisering af et antimikrobielt.
Den mikroobjektglas diffusion assay effektivt muliggør hurtig screening af mikrobielle biblioteker, der producerer protein-antimikrobielle midler. Når enzymet koncentrationen er til bekymring, kan påvisningsfølsomhed problemer forhindrer assayet kræver en større mængde enzym, der skal sættes til reaktionsblandingen godt end farvestoffet-release assay. Som illustreret i figur 1 er de kvalitative egenskaber af assayet tillade observatøren at sammenligne relative enzym mængder til stede i hver brønd.
figur 1A (25 ug enzym), forkanten af zonen viser uklare eller ufuldstændige lyse af substratet, mens zonen tættest på brønden viser en mere komplet substrat lyse. Dette fænomen, et produkt fra den faldende koncentration af det spredende enzym ved forkanten, komplicerer nøjagtig måling af diameteren zone. Da brønde B (15 ug), C (10 ug), D (5 ug), E (1,0 ug), og F (0,1 ug) der observeres i figur 1 er diameteren af zonen med fuldstændig lyse forsvinder til udslettelse korrelere til den reducerede mængde enzym. For betingelse F (0,1 ug), enzymkoncentrationen i agarose er under grænsen, der vil give den diffuserende enzym, der skal visualiseres som den bevæger sig gennem agarose, hydrolysere substratet. Den mikroobjektglas diffusion assay blev også kørt anvendelse af oprensede Bacillus subtilis peptidoglycan som substrat (figur 2). Mens zone er mindre defineret end set ved helcelle Salmonella enterica skyldes tilbageholdenhed af peptidoglycan til jævnt suspendere i agarose, hydrolysen af peptidoglycan af den ukendte antimikrobielle enzym er tydelig.
Farvestoffet-frigivelsesassay er en mere følsom og alsidig assay end mikroobjektglas diffusion assay, som tillader en nedre detektionsgrænse og variationen af miljømæssige faktorer, der påvirker enzymreaktionen. I de repræsentative assays, blev temperaturen varieret for at bestemme den optimale temperatur for den antimikrobielle enzym, bestemt til at være 35 ° C i PBS (figur 3). Denne optimale ses tydeligt i reaktionsupernatanter som forøgede mængder af blå farve (figur 3B) samt repræsenteret i aktivitetsenheder afledt af absorbansmålinger ved 595 nm (figur 3A). Detalsidighed af farvestoffet-release assay tillader forskeren at variere ikke kun temperaturer, men også reaktionen puffer og bufferkomponenter til hurtigt bestemme optimale inkubationsbetingelser for en given enzym.
Aktivitetsniveauet for det ukendte antimikrobielle enzym (figur 4) og α-chymotrypsin kontrol enzym (figur 5) blev målt ved det fastslåede optimale inkubationstemperatur på 35 ° C i PBS mod RBB-mærket Bacillus subtilis varmedræbt substrat. Sammenligning af resultaterne fra figur 4 og figur 5 viser, at den ukendte antimikrobielle enzym har næsten dobbelt affiniteten for B. subtilis substrat. Desuden har den α-chymotrypsin kontrol ikke helt fordøje varmedræbt B. subtilis substrat i brønden (data ikke vist). Aktiviteten af α-chymotrypsin kontrol begynder til pladeau omkring 0,3 mg sammenlignet med den fortsatte stigning i aktivitetsenheder tværs af alle enzym beløb til ukendte antimikrobielle enzym (figur 4 og figur 5). Dette kan indikere, at ukendte enzym har en større langvarig aktivitet eller at der er et større antal spaltningssteder rådighed for enzymet i B. subtilis substrat.
Figur 1:. Enzymaktivitet mod Salmonella enterica helcelle Substrat Den mikroobjektglas diffusion assay blev anvendt til kvalitativt evaluere aktiviteten af et ukendt protein antimikrobielt mod varmedræbt Salmonella enterica subsp enterica (ATCC 10708).. Protein- masser af det ukendte antimikrobielle suspenderet i phosphatbufret saltvand (PBS), der blev tilsat til de respektive brønde idias omfattede 25 ug (godt A), 15 ug (godt B), 10 ug (godt C), 5 ug (godt D), 1 pg (godt E), og 0,1 pg (godt F). PBS alene blev anvendt til negative kontroller af assayene. Zoner af lysis blev afbildet efter en 6 timers inkubation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Enzymaktivitet Against Bacillus subtilis peptidoglycan Cell Wall The mikroobjektglas diffusion assay blev anvendt til kvalitativt evaluere aktiviteten af et ukendt protein antimikrobielt mod peptidoglycan af Bacillus subtilis 168. Suspenderet i 20 pi PBS, 10 pg af den ukendte antimikrobielle blev tilsat til brønd A af microslides. PBS alene blev anvendt som en negativkontrol for assayet (brønd B). Zonen af lyse blev afbildet efter en 6-timers inkubation ved 37 ° C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Optimal reaktionstemperatur i en protein Antimikrobiel Alsidigheden af farvestoffet-release assay tillader variation af fysiske og kemiske parametre, såsom inkubationstemperaturer og puffere, for at bestemme deres indflydelse på aktiviteten af enzymet af interesse 6. Som illustreret i denne figur, blev aktiviteten af det ukendte protein antimikrobielle (1 ug) evalueret i PBS mod RBB-mærkede varmedræbte Bacillus subtilis under en række inkubationstemperaturer. Vises som aktivitetsenheder (AU) i (A), absorbansen af RBB-bound produkter frigivet i supernatanten efter hydrolyse blev målt ved 595 nm under anvendelse af en mikroplade-spektrofotometer. Ved hver temperatur betingelse blev reaktioner med tilsat intet enzym anvendes til at subtrahere effekten af enhver frigjort farvestof, der førte fra inkubation ved de forskellige temperaturer. Reaktionen supernatanter svarende til hvert inkubationstemperaturen blev afbildet før absorbans måling (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Aktivitet Range for et protein Antimikrobiel Aktiviteten interval for det ukendte protein antimikrobielle blev målt som aktivitetsenheder efter overnight inkubationer for 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, og 1000 ng som målt ved BCA protEin assay (A). For disse reaktioner, RBB-mærkede B. subtilis substrat niveauet blev forøget til opnåelse af en optisk densitet på 5,0 ved 595 nm for at sikre, at reaktionen med det højeste mængde enzym (1.000 ng) ikke fuldstændigt hydrolysere alle tilgængelige substrat inden reaktionen inkubationsperiode. Kontrol reaktioner med tilføjet nogen enzym blev brugt til at trække virkningerne af en frigivet farvestof forårsaget af alene inkubation. Reaktionen supernatanter svarende til hvert enzym beløb blev afbildet før absorbansmålinger (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Aktivitet Område for α-chymotrypsin Aktiviteten interval for α-chymotrypsin blev målt som activity enheder efter overnight inkubationer for 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, og 1000 ng enzym (A). For disse reaktioner, RBB-mærkede B. subtilis substrat niveauet blev forøget til opnåelse af en optisk densitet på 5,0 ved 595 nm for at sikre, at reaktionen med det højeste mængde enzym (1.000 ng) ikke fuldstændigt hydrolysere alle tilgængelige substrat inden reaktionen inkubationsperiode. Kontrol reaktioner med tilføjet nogen enzym blev brugt til at trække virkningerne af en frigivet farvestof forårsaget af alene inkubation. Reaktionen supernatanter svarende til hvert enzym beløb blev afbildet før absorbansmålinger (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den mikroobjektglas diffusion assay og farvestoffet-frigivelsesassay tilvejebringer fordele for detektion og karakterisering af hidtil uidentificerede protein antimikrobielle midler. Disse hurtige og følsomme metoder tillader high-throughput screening af organismen source-biblioteker til identifikation af enzymer af interesse forud for investere større forskningsressourcer. Som høj profil målenzymer er identificeret, kan variationer af detektions- assays anvendes til hurtigt at detektere enzym eller at bestemme biokemiske karakteristika af enzymet. For eksempel under en flertrins proteinoprensning ordning fastsætter mikroobjektglas diffusion assay kan hurtigt påvise fraktioner indeholdende enzymet af interesse. Derudover kan reaktionen optima for enzymet bestemmes ved ændring af reaktionsbetingelserne buffere og inkubationstemperaturer i farvestoffet-release assay.
Rækken af enzym masse, der kræves til detektion i mikroobjektglas diffusion assay er en funktion af enzym træk ennde egenskaber. begrænsninger af assayet Detection kræver almindeligvis anvendelsen af højere mængder af enzym end farvestoffet-release assay. I denne undersøgelse sammenligning af påvisningsgrænserne for den mikroobjektglas diffusion assay (figur 1) til farvestoffet-frigivelsesassay (figur 4) viste, at mikroobjektglas diffusion assay er en mindre følsom teknik end farvestoffet-release assay. Når enzymkoncentrationen er ikke en bekymring, det mikroobjektglas analysen giver mulighed for hurtig indledende screening af biblioteker til produktion af protein antimikrobielle stoffer mod mål substrater med lave arbejdskraftomkostninger og udstyr krav. Selv om det indebærer større indsats og udstyr, farvestoffet-frigivelsesassay er mere følsom og reproducerbar, hvilket gav kvantitative resultater, der tillader sammenligning mellem farvestof-frigivelse assays af samme eller forskellige enzymer for et givet substrat. De to metoder er let udføres i de fleste mikrobiologiske laboratorier uden behov for højt specialiseret instrumentering. I reprætive assays, kontrol enzym, α-chymotrypsin, blev påvist ved mængder så lave som 100 ng (figur 5) ved anvendelse af farvestof-frigivelse-assay, mens den minimale mængde påvist i mikroobjektglas diffusion assayet var 1 pg (data ikke vist).
Forudsat nytte som en kvalitativ påvisning assay for antimikrobielle enzymer, har en række variationer af diffusion assay rapporteret 11,13. Ved at gennemgå disse analyser blev mikroobjektglas diffusion assay udviklet for sin relativt høj følsomhed som en indledende screening og for dens lette reaktion overholdelse. Modificeret fra arbejdet i Lachica et al. 11, hvori agarose overlays blev anvendt til at detektere produktionen af nukleaser af stammer af Staphylococcus aureus, den mikroobjektglas diffusion assay fungerer på samme måde som den radiale immunodiffusionsmetoden 14 som proteinet diffunderer fra brønden ind i agarose indeholdende substratet. Den radiale immunodiffusionen metode stopper udvidelsen af zonen af immunofældning når systemet når en kompleksdannelse ligevægt mellem den diffuserende antigen og antistof i agarose. I modsætning hertil er substratet af mikroobjektglas diffusion assay oprindeligt fordøjet af den spredende protein antimikrobielle i et stadigt voksende zone af lyse omkring brønden. Den stigende diameter af zonen fortsætter indtil enzymet mister aktivitet eller substratet er opbrugt. Hastigheden for produktionen af den zone af lyse er levendegjort som renheden, og dermed den specifikke aktivitet af enzymet eller koncentrationen af enzymet til brønden stiger.
For kvantitativt at vurdere den enzymatiske aktivitet af protein antimikrobielle stoffer mod varmedræbt B. subtilis, farvestoffet-release assay blev valgt. Kolorimetriske assays under anvendelse af Remazol brilliant blue R-farvestof (RBB) -mærkede substrater tillader alsidig og følsom evaluering af protein antimikrobiel aktivity. Enzymatisk hydrolyse af RBB-mærket substrat resulterer i frigivelse af opløselige blå produkter, der let kan måles med et spektrofotometer ved 595 nm. Adskillige variationer af RBB farvestof-frigivelsesassay, udviklet til at karakterisere andre protein antimikrobielle enzymer, viser fleksibiliteten i dette assay til anvendelse med andre substrater. For eksempel i bestemmelse af virkningerne af lysostaphin bakteriolytisk aktivitet, Zhou et al., Rapporterede et farvestof-frigivelse under anvendelse af RBB-farvet stafylokokceller og stafylokok peptidoglycan som substrater 12. I en modifikation af anvendelsen af denne RBB dye-frigivelsesassay blev RBB-mærket Micrococcus luteus substrat foreslået til anvendelse som et hurtige og følsomme midler til at diagnosticere og screening for sygdomme, såsom bakteriel infektion og tilstedeværelsen af en malign carcinom, som kan korreleres til humane lysozym ekspressionsniveauer i blodserum 15. Desuden RBB-mærkede bakterielle celle substrater har enLSO blevet anvendt i et zymogram metode til påvisning af lysozym 16.
Vi demonstrerer den sænkede detektionsgrænsen, bekvemmelighed og reproducerbarhed af farvestoffet-frigivelsesassay, der giver mulighed for hurtig screening bibliotek til enzymproduktion. Ændringer af analysen giver mulighed for efterfølgende kvantitative biokemiske karakterisering analyser, herunder effekter af temperatur, pH og saltindhold samt virkningerne af andre proteolytiske enzymer på aktiviteten af antimikrobielle proteiner 6. Desuden kan den kvantitative dye-frigivelsesassay anvendes til at sammenligne aktiviteterne i flere enzymer til et givet substrat. RBB dye-frigivelsesassay har rapporteret anvendelighed til enzymer med aktivitet mod polysaccharider foruden karakterisering og påvisning af protein antimikrobielle midler. Pettersson og Eriksson rapporterede et assay til påvisning endoglycanase aktivitet ved anvendelse af amorfe, RBB-farvet polysaccharid perler af cellulose, xylan, mannan, og gældsbevisi 17. I en udvidelse af disse resultater blev en følsom metode til påvisning af chitinase enzymer produceret af Bacillus thuringiensis Bt-107 udviklet ved hjælp af kolloid chitin mærket med RBB 18. Fra disse og andre studier har kommercielt tilgængelige kilder til RBB-farvet substrater opstået til anvendelse i detektion af glycolytiske aktivitet, herunder dem mod keratin, amylopectin, amylose, glycogen, laminarin, d-xylan, Azo-byg glucan og stivelse.
I denne undersøgelse udviser vi anvendeligheden af farvestoffet-frigivelsesassay i en mikroplade format, reducere mængden af RBB-mærkede substrat og enzym, der kræves for at producere den kolorimetriske resultat. Som illustreret i figur 4 og figur 5, mikropladen farvestof-frigivelse assay tilvejebringer en lavere detektionsgrænse end den mikroobjektglas diffusion assay for enzymatisk aktivitet detektion. Med hensyn til hurtig udnyttelse, bevarelse af arbejdskraft, og nem fortolkning, mikrofonenroslide diffusion assay tilvejebringer anvendelighed i indledende high-throughput screeninger for tilstedeværelsen af antimikrobiel aktivitet samt indikationen af antimikrobiel protein tilstedeværelse i downstream proteinisolerings- og oprensningstrin. Kombinationen af disse to analyser supplerer hinanden i den indledende screening og ultimativ karakterisering af nye protein antimikrobielle stoffer
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser. The Mitre Corporation er en ikke-for-profit virksomhed, der driver flere føderalt finansierede forsknings- og udviklingscentre (FFRDCs).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid | Becton Dickinson | 3078 | |
| 96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) | Corning, Inc. | 3595 | |
| agarose | Fisher Scientific | BP162-100 | |
| α-chymotrypsin | MP Biomedicals | 215227205 | |
| Bacillus subtilis 168 | American Type Culture Collection | 23857 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| cork borer | Humboldt | H-9661 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| McFarland equivalence standard (2.0) | Fisher Scientific | R20412 | |
| microslides | Fisher Scientific | 22-38-103 | |
| nutrient broth | Fisher Scientific | S25959B | |
| peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 | Sigma-Aldrich | 69554-10MG-F | |
| phosphate-buffered saline (1x) | Teknova | P0200 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Life Technologies | 23227 | |
| Synergy HT microplate spectrophotometer | BioTek Instruments, Inc. | ||
| Remazol brilliant blue R dye (RBB) | Sigma-Aldrich | R8001 | |
| Salmonella enterica subsp. enterica | American Type Culture Collection | 10708 | |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film | Diversified Biotechnology | T-TOPS-50 | |
| UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution | |||
| agarose solution 50 ml PBS 0.25 g agarose |
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution | ||
| nutrient broth medium 4 g nutrient broth 500 ml Type I water |
|||
| 250 mM sodium hydroxide (NaOH) solution 1 g NaOH 99 ml Type I water |
|||
| 200 mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH solution |
References
- Anand, T. P., et al. Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India. Microbiol Res. 161, 252-262 (2006).
- Tagg, J. R., Dajani, A. S., Wannamaker, L. W. Bacteriocins of gram-positive bacteria. Bacteriol Rev. 40, 722-756 (1976).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
- Riley, M. A., Gordon, D. M. The ecological role of bacteriocins in bacterial competition. Trends Microbiol. 7, 129-133 (1999).
- Tenover, F. C. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. Am J Med. 119, S3-S10 (2006).
- Farris, M. H., Steinberg, A. D. Mitrecin A, an endolysin-like bacteriolytic enzyme from a newly isolated soil streptomycete. Lett Appl Microbiol. 58, 493-502 (2014).
- Dehart, H. P., Heath, H. E., Heath, L. S., Leblanc, P. A., Sloan, G. L. The Lysostaphin Endopeptidase Resistance Gene (epr) Specifies Modification of Peptidoglycan Cross Bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol. 61, 2811 (1995).
- Srivastava, K. K., Siddique, I. H. Quantitative chemical composition of peptidoglycan of Listeria monocytogenes. Infect Immun. 7, 700-703 (1973).
- Heilmann, H. D. On the peptidoglycan of the cell walls of Pseudomonas aeruginosa. Eur J Biochem. 31, 456-463 (1972).
- Schumann, P. Taxonomy of Prokaryotes. Rainey, F., Oren, A. 38, Academic Press. (2011).
- Lachica, R. V., Genigeorgis, C., Hoeprich, P. D. Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity. Appl Microbiol. 21, 585-587 (1971).
- Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Anal Biochem. 171, 141-144 (1988).
- Osserman, E. F., Lawlor, D. P. Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia. J Exp Med. 124, 921-952 (1966).
- Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans, J. F. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry. 2, 235-254 (1965).
- Ito, Y., Yamada, H., Imoto, T. Colorimetric assay for lysozyme using Micrococcus luteus labeled with a blue dye, Remazol brilliant blue R, as a substrate. Chem Pharm Bull. (Tokyo). 40, 1523-1526 (1992).
- Hardt, M., Guo, Y., Henderson, G., Laine, R. A. Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions. Anal Biochem. 312, 73-76 (2003).
- Pettersson, B., Eriksson, K. E. A standardized spectrophotometric assay of endoglycanase activities using dyed, amorphous polysaccharides. Anal Biochem. 285, 220-224 (2000).
- Gomez Ramirez, M., Rojas Avelizapa, L. I., Rojas Avelizapa, N. G., Cruz Camarillo, R. Colloidal chitin stained with Remazol Brilliant Blue R, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms and to evaluate chitinases. J Microbiol Methods. 56, 213-219 (2004).
