Abstract
De meeste studies op morfogenese zowel kwalitatief beschrijvingen hoe anatomische eigenschappen worden beïnvloed door de verstoring van specifieke genen en genetische pathways. Kwantitatieve beschrijvingen zijn zelden uitgevoerd, hoewel genetische manipulaties produceren een reeks van fenotypische effecten en variaties worden waargenomen, zelfs tussen individuen binnen de controlegroepen. Opkomende bewijs dat morfologie, afmeting en locatie van organellen een eerder ondergewaardeerd, maar fundamentele rol in cel functie en overleving spelen. Hier hebben we stap voor stap instructies voor het uitvoeren van kwantitatieve analyses van fenotypen in de Drosophila larvale neuromusculaire junctie (NMJ). Wij gebruiken verscheidene betrouwbare immuno-histochemische markers gecombineerd met bio-imaging technieken en morfometrische analyses om de effecten van genetische mutaties op specifieke cellulaire processen te onderzoeken. In het bijzonder richten we ons op de kwantitatieve analyse van fenotypes van invloed zijn morfologie, grootte en positie van nuclei in de dwarsgestreepte spieren van Drosophila larven. De Drosophila larven NMJ is een waardevol experimenteel model om de moleculaire mechanismen van de structuur en functie van het neuromusculaire systeem, zowel in gezondheid en ziekte te onderzoeken. Echter, de methoden hier beschreven worden toegepast op andere systemen.
Protocol
1. Experimentele Voorbereiding
Opmerking: Dissecties en procedures immuno-histochemie in sectie 2 en 3 worden uitgevoerd in overeenstemming met referenties 3-6, maar met modificaties.
- Bereid 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en PBS bevattende 0,1% Triton-X 100 (PBT). Houd ze op ijs.
- Bereid Bouin's fixatief (15 picrinezuur: 10 Formaldehyde: 1 ijsazijn). Maak deze reagens fris.
- Selecteer clean roestvrij staal minutien pinnen en fijne tang.
- Bereid dissectie platen die een Sylgard schijf in een 5 cm petrischaal.
2. Dissectie van onderdanen van derde instar larvale NMJs
- Pick zwervende derde instar larven uit een flacon of een fles met een penseel en plaats ze in een 2 cm petrischaal met 4 ° C PBS wegspoelen de voedselresten.
- Plaats een larve op de top van de Sylgard oppervlak van de dissectie plaat en zorg ervoor dat het positioned met de dorsale zijde naar boven, zodat de twee longitudinale tracheale buizen zijn verschijnen boven.
- Met behulp van de tang om de pin te houden, pin de larve naar beneden aan zijn voorste einde, recht onder de mond haak. Strek de larve zo veel mogelijk en pin haar achterste eind naar beneden.
- Voeg genoeg PBS zoutoplossing om de muren van de plaat te bereiken en volledig onder te dompelen de larve.
- Herhaal de procedure van stap 2,1-2,3 andere larven van hetzelfde genotype. Een enkele 5 cm petrischaal dissectie plaat kan gemakkelijk geschikt voor maximaal 8 larven.
- Met behulp van de micro-dissectie schaar, iets til de dorsale cuticula en een kleine horizontale incisie in het achterste uiteinde in de buurt van de pin.
- Plaats schaar in de incisie, snijd de larve helemaal aan het voorste uiteinde langs de middellijn tussen de twee longitudinale stukken van de luchtpijp. Zorg ervoor dat de middellijn bezuinigingen zijn oppervlakkig genoeg om alleen passeren de nagelriem en om te voorkomen dat het doorsnijden van de spieren aande buikzijde.
- Aan elk uiteinde, geknipt twee inkepingen zowel links als rechts.
- Open de filet door twee pennen aan beide zijden van de voorste insnijding. Herhaal hetzelfde met het achterste einde. Bij het plaatsen van de pennen, zorg ervoor dat het lichaam muur gespreid.
- Reinig de inwendige organen met behulp van een tang en PBS zoutoplossing. Laat het centrale zenuwstelsel intact. Voorzichtig rekken de larve met hoek pinnen totdat het volledig gestrekt is, maar zorg ervoor dat de spieren niet tijdens dit proces zijn gescheurd.
- Herhaal deze procedure voor dissectie andere larven op dezelfde dissectie plaat.
- Wassen met PBS zoutoplossing driemaal de inwendige organen te verwijderen.
- Vervang de PBS met Bouin's fixatief en reactie bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Was verscheidene malen met PBT.
- Verwijder voorzichtig de pennen en de overdracht van alle preparaten, die nu tamelijk stijf, in een 1,5 ml micro-centrifugebuis voor immuno-kleuring.
3. Immuno-histochemische kleuring van Drosophila NMJs met antilichamen specifiek voor Spieren en myonuclei
- Snel spoel de larvale filets in PBT.
- Blokkeer de preparaten door incubatie met 10% normaal geit serum (NGS) in PBT gedurende 2 uur onder constant roeren.
- Incubeer een reeks ontleed NMJs in PBT met 5% van NGS en een konijn anti-lamine-antilichaam (bij een concentratie van 1: 500) en van een cavia anti-DVAP antilichaam (bij een concentratie van 1: 500) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° C overnacht. De anti-DVAP antilichaam kleurt de dwarsgestreepte spieren, terwijl het anti-lamine kleuring de contour van myonuclei detecteert.
- Was eenmaal snel in PBT aan de antilichamen in overmaat te verwijderen. Wassen in PBT gedurende 2 uur door het veranderen van de PBT buffer elke 15 min.
- Incubeer de monsters in PBT met 5% NGS en fluorescent gelabelde secundaire antilichamen bij 1: 500 verdunning gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Dezelfde monsters cEen onderworpen aan kleuring met antilichamen meerdere tegelijk als secundaire antilichamen geconjugeerd met verschillende chromoforen worden gebruikt.
- Verwijderen secundaire antilichamen en was in PBT gedurende 2 uur door het veranderen van de PBT buffer elke 15 min.
- Om het interieur vlekken van de myonuclei was de monsters drie keer met PBS en gaat u als volgt te werk:
- Voeg de nucleaire marker TO-PRO-3 bij een verdunning van 1: 1000 in PBS en incubeer gedurende 20 minuten onder constant roeren. Deze markering wordt in dit onderzoek maar elk andere in de handel verkrijgbaar nucleaire marker kan eveneens worden gebruikt.
- Was snel drie keer in PBS voor de montage.
4. Montage van monsters op de dia's
- Pick-up van de monsters met een tang uit de 1,5 ml micro-centrifugebuis en leg ze op een verwerking dia.
- Door het gebruik van micro-dissectie schaar, knip de kop en de staart van de filets en zijn interne oppervlak omhoog.
- Bereid the montage dia door wikkelen rond drie stroken cellulose tape aan weerszijden van een clean dia op een afstand van ongeveer 1 cm van elkaar. Zodra het dekglaasje wordt geplaatst bovenop de twee stroken wordt een gat worden gegenereerd die voorkomt afvlakking van de monsters. Dit is cruciaal als driedimensionaal volume renderings van constructies nodig zijn.
- Doe een druppeltje van ongeveer 20 ui van het fixeermiddel in het midden van de bevestiging schuif tussen de drie cellulose tape strips.
- Na het verspreiden van de montage medium met schone tang, sleept u de ontleed larven aan de montage van dia in de montage medium, waarbij het interne oppervlak omhoog. Probeer ze te monteren in rijen van vier of vijf.
- Voorzichtig laat een dekglas op de top van de montage-glijbaan en ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen worden gegenereerd. Sluit de dia met transparante nagellak. Laat de monsters drogen gedurende ten minste 10 minuten voor de beeldvorming.
5. Confocale instellingen for Imaging
Opmerking: Beelden die in deze studie worden genomen met een Nikon A1R confocale eenheid geïntegreerd op Ti: E omgekeerde microscoop. Echter een confocale microscoop met een minimum van 3 lasersensoren in het golflengtegebied van 488 nm, 561 nm en 642 nm en een 3 kanaals detectiesysteem is hiervoor geschikt.
- Zet de lasers, detector unit, kwik lamp, het podium controller, microscoop en de PC. Start de besturingssoftware en zet de schuif op het podium houder.
- Om beeldvorming sneller, selecteert u te maken en markeer alle regio's van belang (ROI) op het monster met behulp van een 20X objectief.
- Voorzichtig swing het neusstuk naar de 60X hogere vergroting objectief (60X Plan Apo VC / NA 1,4 olie).
- Breng een druppel immersie olie op het objectief en selecteer een van de gemarkeerde ROI van XYZ overzicht venster op de computer.
- Begin imaging met behulp van de volgende optische instellingen: Selecteer de eerste dichroïsche spiegel: 405/488/561/640. Selecteer 488 nm laser met emissie filter 525/50 nm in kanaal 1, 561 nm laser met 595/50 emissie filter in kanaal 2 en 642 nm laser met een lange-pass filter 650 nm in kanaal 3.
- Gebruik de volgende scaninstellingen voordat beeldverwerving: Selecteer Galvano scanner; Scan richting: één manier; Scansnelheid: 0,5 frames per seconde.
- Selecteer Channel serie kanaal doorbloeding te voorkomen.
- Stel de pin-hole size tot 1 luchtig unit. Scannen en stel het laservermogen, detectie Gain en Offset op de juiste wijze voor elk kanaal pixel verzadiging en achtergrond niveau te voorkomen.
- Acquire z-stacks met behulp van voxel grootte van 0,2 x 0,2 x 0,5 micrometer 3 voor alle ROI en de dia voorbereidingen. Als de beelden zullen worden onderworpen aan deconvolutie dan de voxel grootte ingesteld op 0.06 x 0.06 x 0.15 pm 3.
- Bewaar afbeeldingen in .nd2 bestandsformaat of .ics formaat.
6. Berekening van de afstand tussen de kernen binnen Striated60, Spieren door de methode van de Nearest Neighbor Analysis
- Voor deze analyse gebruikt confocale beelden tonen larvale lichaam muur spieren gekleurd met antilichamen tegen DVAP spieren visualiseren en met lamine antilichamen en een nucleaire marker om de kernen te markeren.
- Om de dichtstbijzijnde afstand tussen de kernen te schatten, gebruiken meetpunten binnen de MeasurementPro module van de beeldanalyse software (bijv Imaris). Andere soortgelijke softwaretoepassingen voor beeldanalyse kan worden gebruikt voor hetzelfde doel.
- Open de confocale beelden. Om te starten, dubbelklik op het pictogram software. Sleep de confocale z-stack beelden in de Arena.
- Dubbelklik op de afbeeldingen om ze automatisch te openen in de Surpass View, onder de bar icoon menu hulpmiddel
. Het Overtreffen View heeft drie belangrijke werkruimte panelen: Area View, Object List en Object Properties Area. - Maak een volume gerenderd timage kanaal RIE door te klikken op het menu icoon 3D-weergave
. - Klik op de Points icon nieuwe meting
van de Objecten werkbalk en volg de wizard creatie die in Object Properties Area verschijnt. - Vanuit de wizard voor het maken selecteert u het tabblad Bewerken en vervolgens specifiek kanaal. Selecteer de nucleaire marker of Lamin kanaal om de kernen te markeren.
- Zet de aanwijzer naar de Select modus door op de tab Esc op het toetsenbord.
- Pas de grootte van de 3D cursor doos met de muis wiel om een bepaalde kern in het beeld. Voeg een meetpunt door de Shift-toets en linker muisklik op dezelfde kern.
- Voeg het tweede punt op een nabijgelegen kern op dezelfde spieren door het herhalen van de voorafgaande stappen. Een lijn wordt automatisch gemaakt tussen de twee punten en de gemeten afstand tussen de twee kernen weergegeven. De afstand tussen de twee kernen worden nu geregistreerd als een statistische variabele in de Object Properties de omgeving onder het tabblad Statistieken> Detail> Afstand data.
- Herhaal de procedure van stap 6,6-6,10 alle kernen rond een bepaalde kern.
- Van Statistieken> Detail> Distance gegevens tonen van alle verzamelde meetpunten, selecteert u de kortste afstand.
- Door te klikken op de Export statistieken over Tab display naar Bestand
beschikbaar onder de Object Properties Area, worden de gegevens opgeslagen op een spreadsheet. - Herhaal dezelfde procedure voor de andere omliggende kernen en voor een geselecteerd aantal spiervezels per genotype.
- Met behulp van de geëxporteerd naar een spreadsheet-bestand gegevens, het berekenen van de gemiddelde kortste afstand (D ave) voor alle M-nummer van de spieren met behulp van de volgende vergelijking:
oad / 53821 / 53821eq1.jpg "/>
Di is de kortste afstand tot het naburige kern voor een bepaalde nucleus i waarbij i varieert van 0 tot N en N het aantal kernen per geanalyseerde spier. De som van de waarden van j = 0 tot j = m geeft het M aantal geanalyseerde spieren. - U kunt ook gebruik maken van Spots tovenaar Schepping en Spots Spots kortste afstand naar de gemiddelde afstand tot de dichtstbijzijnde naburige kern te schatten. Hiervoor wordt een Matlab uitbreidingsmodule nodig.
- Dubbelklik op een specifiek beeld op het beeld een 3D-volume Arena en zal worden getoond in het gebied. Klik op het icoon Object Creatie en voeg nieuwe Spots
in de werkbalk Objecten. - Vanuit de wizard voor het maken van de Object Properties Area, klikt u op de optie Skip automatisch aanmaken, bewerken Handmatig.
- Selecteer de Lamin of nucleaire marker kanaal om de kernen te geven.
- Shift ingedrukt en klik op left muisknop op de kernen van een specifieke spier in het beeld. Een plek op elke kern zal verschijnen.
- Selecteer Spots Spots kortste afstand vermeld onder het tabblad Extra in de Object Properties Area. Selecteer Spots Statistieken onder de Result-modus en een Matlab-venster verschijnt.
- Onder de tab Statistieken, selecteer Gedetailleerde en vervolgens specifieke waarden. Op de Distmin en de waarden van de minimale afstanden voor elke kern verschijnt.
- Exporteer de gegevens naar een spreadsheet-bestand en bereken het gemiddelde van deze afstanden per spier. Herhaal dit voor alle spieren van een bepaald genotype.
- Dubbelklik op een specifiek beeld op het beeld een 3D-volume Arena en zal worden getoond in het gebied. Klik op het icoon Object Creatie en voeg nieuwe Spots
. Het Overtreffen View heeft drie belangrijke werkruimte panelen: Area View, Object List en Object Properties Area. 
. 
van de Objecten werkbalk en volg de wizard creatie die in Object Properties Area verschijnt. 
beschikbaar onder de Object Properties Area, worden de gegevens opgeslagen op een spreadsheet. 
in de werkbalk Objecten. 7. Het bepalen van de vorm van de kernen binnen de Body-muur spieren van Drosophila Larven
- Voor deze analyse gebruiken confocale beelden van het lichaam muur spieren gekleurd met lamine en een nucleaire marker om de kernen te visualiseren.
- De vorm van myonuclei, maatregel bolvormigheid evalueren (gedefinieerd als de verhouding van de surslagvlak van een bol met hetzelfde volume als de gegeven kern, het oppervlak van de kern) of ellipticiteit (onderscheidt afgeplatte / uitgerekte ellipsoïden, sferoïden).
- Open de afbeelding zoals eerder beschreven. Klik op het icoon Objecten werkbalk toevoegen Nieuwe Surfaces
. - In de wizard creatie die in de Object Properties Area verschijnt, selecteert u de nucleaire marker kleuring als de Bron Kanaal naar de kernen weer te geven.
- Stel de optie Absolute intensiteit als de drempel. Zorg ervoor dat de meeste kernen tonen een vlotte en niet overbelast weergave door verandering van de waarde op de drempelkromme. Tegelijkertijd, te voorkomen dat de aanwezigheid van gaten of onvolledige masker aan een kern met dezelfde curve.
- Gebruik de Filter hulpmiddel om eventuele ruis in de oppervlakte rendering uit te sluiten. Onder het tabblad Bewerken van het nieuw opgerichte oppervlaktelaag, Split of de kernen oppervlakken die ten onrechte zijn opnieuw samenvoegenndered.
- Exporteren naar een spreadsheet dossier van de ellipticiteit en bolvormigheid waarden van het oppervlak gesmolten kernen die beschikbaar zijn op het tabblad statistieken zijn.
- U kunt ook gebruik maken van ImageJ of Fiji software om de circulariteit van kernen meten waar de Circulariteit (C) wordt gedefinieerd als C
. Een waarde van één staat voor een perfecte cirkel, terwijl een waarde naderen nul duidt op een toenemende langwerpige vorm. - Maak een maximale intensiteit projecties van de z-stacks van het menu Images> Stapels> Z Project. Stel projectie type Max Intensity.
- Splits de kanalen en kies het nucleaire marker kanaal.
- Vanuit het hoofdmenu, selecteer Afbeelding> Aanpassen> Drempel.
- Segment de kernen door instelling van de intensiteit drempel. Als de nabijgelegen kernen zijn gesegmenteerd als een eenheid, klik op Proces> Binary> Watershed hulpmiddel om de kernen te verbreken.
- Vanuit het hoofdmenu, selecteer Bewerken> Sverkiezing> Maak selectie.
- Voeg alle geselecteerde ROI om de ROI Manager door te klikken op het menu Analyseren> Extra> ROI Manager. In het venster ROI Manager klik op Toevoegen. In hetzelfde venster selecteert u Meer> Split.
- Selecteer vormbeschrijvingen in Analyze> Set Metingen. In het venster ROI Manager klikt u op het tabblad Maatregel. Dit zal een lijst met circulariteit waarden van alle geselecteerde kernen weer te geven.
- Bovendien, om de nucleaire volume te meten, volg oppervlak wizard voor het maken gebruik van de nucleaire marker kleuring kanaal, zoals beschreven in de subrubrieken 7,3-7,7.
. 
. Een waarde van één staat voor een perfecte cirkel, terwijl een waarde naderen nul duidt op een toenemende langwerpige vorm. 8. 3D Volume Renderings van Selected kernen binnen de Drosophila larven Body-wall Spieren aan de intranucleaire Localization van een specifiek eiwit Evalueer
- Gebruik confocale beelden rapportage lichaamswand spieren gekleurd met een nucleaire marker en met antilichamen die specifiek lamine en DVAP.
- Open de foto's van de inleiding van de software en de select specifieke kern te analyseren. Dit kan gedaan worden door het selecteren van het hoofdmenu-item Bewerken> Crop 3D.
- Volg oppervlak wizard voor het maken gebruik van lamin kanaal zoals beschreven in paragraaf 7,3-7,7.
- Zodra het oppervlak is gemaakt, klikt u op Bewerken in het Objects Properties Area en selecteer vervolgens Mask Alle om het signaal in de kern te isoleren. Dit creëert een nieuw venster.
- Selecteer DVAP signaal van de Select Channel drop-down menu. Selecteer de DVAP immuno-reactiviteit signaal in de kern door te klikken op de optie Set Voxels Outside The Surface naar nul. Een nieuwe gemaskerde kanaal wordt gemaakt en is verkrijgbaar in de etalage correctie voor selectie.
- Om de aanwezigheid van het signaal te visualiseren in de kern te creëren een contour vliegtuig door te klikken op het pictogram Add New Clipping Plane
in de werkbalk Objecten. - Interactief stel de hoek van de clippingvliegtuig en zijn positie aan de verdeling van het signaal in de nucleus te visualiseren.
in de werkbalk Objecten. Representative Results
ALS is een degeneratieve ziekte in het bijzonder van invloed zijn motorische neuronen leiden tot een geleidelijke en fatale verlamming van dwarsgestreepte spieren 7. Missense mutaties in het menselijk-VAMP geassocieerd eiwit B (hVAPB) leiden tot een reeks van motor neuron ziekten, waaronder ALS soort 08-12 augustus. A missense mutatie (V234I) in hVAPB gen is onlangs geïdentificeerd in een geval van typische ALS bij mensen 13. Om zijn pathogene potentieel te beoordelen, genereerden wij transgene vliegt uiting van de hVAPB Drosophila ortholoog DVAP die de ziekte veroorzaken mutatie (DVAP-V260I). De expressie van deze transgene was gericht op de spieren met behulp van de UAS / GAL4-systeem en de spier-specifieke driver BG57-Gal4 14,15. Het effect van DVAP-V260I transgene expressie werd vergeleken en gecontrasteerd met die van twee andere transgenen (DVAP-WT1 en DVAP-WT2), die verschillende niveaus van het wildtype eiwit DVAP 16 expressie. more in het bijzonder, de toename van de DVAP immunoreactiviteit is 2,2 maal hoger dan bij de controles voor de DVAP-WT2 lijn, terwijl DVAP-V260I en DVAP-WT1 vertonen vergelijkbare en lagere niveaus van hetzelfde signaal 16.
Nucleaire veranderingen zijn geassocieerd met veroudering en verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson 17,18. Om te beoordelen of onze vliegen model ALS8 vertoont mogelijke wijzigingen in de architectuur, positie en grootte, we gekleurde kernen binnen dwarsgestreepte spieren van geschikte genotypen met een nucleaire marker en de anti-lamine antilichaam 19-22, waarbij de kern envelop visualiseert. De spieren markeren werd een DVAP antilichaam ook toegevoegd aan dezelfde monsters (figuur 1). Confocale beelden werden verzameld en gedetailleerde morfometrische analyses werden uitgevoerd met een beeldanalyse software. In control spieren werden kernen bleek gelijkmatig verdeeld over de spiervezels terwijl DVAP-V260I en DVAP-WT expressie spieren, kernen vertonen een neiging tot herverdeling nauw verbonden clusters (figuur 1).
We hebben een meest nabije buur analyse een kwantitatieve evaluatie van de verspreiding van kernen langs de spiervezels van elk genotype voeren. Een naaste buur analyse identificeert eerst de dichtstbijzijnde buur voor elke kern door de afstand tussen het middelpunt van een bepaalde kern en het centrum in de andere omliggende kern. Deze procedure wordt vervolgens herhaald voor elk volgend kernen langs de spiervezels. Tenslotte de kortste afstand tussen kernen binnen een bepaalde spier, wordt berekend door het middelen van de kortste afstand van elke kern en zijn naaste buren. (Figuur 2A - C). Vergeleken met controles, spieren die ofwel de DVAP V260I-transgen of de transgenen tot overexpressie het wildtype eiwitPresenteren een drastische vermindering van de gemiddelde kortste afstand tussen kernen en, bijgevolg kernen blijken nauw verbonden in clusters. Het effect van het veroorzaken van ALS alleel DVAP-V260I is ernstiger dan die geassocieerd met de overexpressie van het wildtype eiwit, zelfs als de sterkste DVAP-WT2 transgen wordt gebruikt (Figuur 1 en Figuur 2D).
Overexpressie van ofwel DVAP-V260I of DVAP-WT transgenen vertoont ook een ernstige verslechtering van nucleaire architectuur resulterend in abnormale kernen met een lange structuur (figuur 1). Deze structurele afwijking werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ software waarin cirkelvormigheid wordt gedefinieerd door de formule C 
, Waarbij de breedte lengteverhouding van elke kern met C = 1 die een perfecte cirkel en C = 0 oneindig langgerekte veelhoek meten. in control kernen vertonen een duidelijke ronde vorm, C gelijk aan 1, terwijl in de transgene mutanten een vormverandering met als gevolg verlies van cirkelvormigheid, veroorzaakt een aanzienlijke afwijking van deze waarde (Figuur 1 en Figuur 3).
We vonden ook dat in de spieren expressie dezelfde transgenen, kernen een duidelijk vergrote nucleaire volume weer vergeleken met de controles, hoewel de ALS veroorzakend allel wordt efficiënter induceren dit fenotype in vergelijking met de WT DVAP-transgenen (figuur 4) zijn.
Bijna alle neurodegeneratieve ziekten worden gekenmerkt door de intracellulaire accumulatie van aggregaten die de pathogene eiwit. We maakten 3D-reconstructies en volume renderings kernen en we vonden dat in spieren de expressie of overexpressie mutant transgen het wildtype eiwit, DVAP immunoreactiviteit vormden clusters eennd dat sommige werden gelokaliseerd in de nucleus (figuur 5). Omgekeerd, in control NMJs, DVAP immuno-reactiviteit is vaag verspreid over de spiervezels en het is uitgesloten van de kern 16.
. Figuur 1: Confocale beelden van myonuclei binnen dwarsgestreepte spieren die ofwel de DVAP-WT of DVAP-260I transgenen (A) BG57-Gal4 / + controle, (B) BG57, DVAP-V260I, (C) BG57, DVAP-WT1 en (D) BG57, DVAP-WT2 spieren expressie aangegeven transgenen gekleurd met antilichamen specifiek voor DVAP (rood signaal), lamine (groen signaal) en met een nucleaire marker voor de kernen (blauw signaal) te visualiseren. Schaal bar = 30 micrometer Klik hier om te bekijkengrotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Nearest neighbour analyse om de gemiddelde afstand tussen de kern en het ene naaste buur bepalen (B) Representatieve resultaten tonen gewijzigde nucleaire positionering in spieren overexpressie DVAP-WT2 transgen in vergelijking met controles in (A).. Gemiddelde nucleaire afstand spieren van de aangegeven genotypes werd geschat met de formule (C) en de gegevens worden in (D). Larvale NMJs worden gekleurd met antilichamen specifiek voor DVAP (rood signaal), Lamin (groen) en met een nucleaire marker (blauw signaal). Sterren geven de statistische significantie. *** P <0,001, ** p <0,01. Voor de statistische analyse van dit experiment en de experimenten onder een eenzijdige ANOVA-test gerapporteerd werd gebruikt en Tukey's multiple vergelijkende test werd toegepast als een post-hoc proef gesteld wanneer de verschillen tussen genotypen bleken significant door de ANOVA test. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Schaal bar = 30 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Afbeeldingen tonen vertegenwoordiger stappen in de berekening van de nucleaire volume (A) Een representatief beeld dat gesegmenteerd kernen met behulp van de wizard oppervlak schepping. Kernen op de grens van de beelden werden genegeerd. (B) Afbeelding van de nucleaire DVAP signaal nadat het omliggende DVAP kleuring is gemaskeerd door gebruik te maken van het oppervlak gecreëerd in de nucleaire marker kanaal. (C) Toplaag informeert extra parameterswaaronder de nucleaire omvang en bolvormigheid. (D) Gegevens over nucleair volume van de verschillende genotypen. Sterren geven de statistische significantie. Ontleed NMJs werden gekleurd met anti-DVAP antilichamen (rood signaal), anti-Lamin antilichamen (groen signaal) en een nucleaire marker (blauw signaal). *** P <0,001, ** p <0,01. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Schaal bar = 30 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Beelden tonen vertegenwoordiger stappen in de schatting van de nucleaire vorm van ImageJ. Maximale intensiteit projectie van beelden werden geanalyseerd met behulp van ImageJ om circulariteit van de kernen te schatten binnen spieren. (A) Een representatief voorbeeld van de intensiteit projectievan de drie kanalen imago als in stap 7.9 van het protocol. (B) Beeld die stap 7.10 van het protocol in welke kanalen zijn verdeeld en de nucleaire marker kanaal wordt geselecteerd. (C) Een representatief beeld blijkt dat na het aanbrengen intensiteitsdrempel segmenteren de kernen en ROI manager plugin ImageJ, de kernen van belang kunnen worden geselecteerd en hun vorm gemeten door middel vormdescriptors (stappen 7,11-7,15). (D) Kwantificering van de cirkelvormigheid van verschillende genotypen. Op het larvale NMJs rood aangeeft DVAP kleuring terwijl de groene contouren kernen en overeenkomt met het lamine kleuring. Het interieur van elke kern wordt aangeduid in het blauw als gevolg van de kleuring met een nucleaire marker. Sterren geven de statistische significantie. *** P <0,001, ** p <0,01. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Schaal bar = 30 micrometer Klik op haare voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: afbeeldingen tonen specifieke stappen in het creëren van volume renderings van myonuclei. (A) Afbeelding van 3D-intensiteit gemengd uitzicht van de spieren gekleurd met DVAP eiwit (rood), de Lamin (groen) en de DNA-merker (blauw). (B) Afbeelding vertegenwoordigt een oppervlaktelaag gegenereerd door het kanaal lamine segmenteren de kernen. (C) afbeelding die een kern waarin de oppervlaktelaag is gebruikt om de DVAP signalen buiten het geselecteerde kern te maskeren. Geel gemarkeerd is een clipping vlak dat is toegevoegd aan het beeld. De gezichtshoek en de positie kan interactief worden aangepast aan de verdeling van signaal in de nucleus te visualiseren. (D) Een beeld rapportage van een dwarsdoorsnede van het nucleaire oppervlaktelaag gemaakt using de lamin kanaal samengevoegd met ontmaskerd DVAP en nucleaire marker signalen. (E en F) Aanvullende deelbaar volume renderings van dezelfde kern. Schaal bar = 10 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
In het verleden werden morfologische variaties binnen en tussen experimentele groepen nauwelijks rekening gehouden. Echter, de toepassing van kwantitatieve methoden nu de norm vergelijkende studies van morfologie en wiskundige beschrijving van anatomische vormen worden berekend. Het gebruik van kwantitatieve analyses om de gevolgen van genetische manipulaties op specifieke cellulaire processen, houdt belofte bij het verbeteren van ons vermogen om morfologische veranderingen te detecteren en het verbeteren van de nauwkeurigheid waarmee deze veranderingen worden beschreven. Bovendien statistische analyse van kwantitatieve gegevens kunnen we evalueren of waargenomen verschillen significant fenotypes.
In dwarsgestreepte spieren, kernen er een duidelijke afgeronde structuur en zijn gelijkmatig verdeeld langs de spiervezels. Hoewel de moleculaire mechanismen opzetten en onderhouden grootte, vorm en structuur van kernen niet bekend, deze kern functies waarschijnlijk to een fundamentele rol spelen bij het beheersen van de spierfunctie. Inderdaad, verschillende myopathieën veroorzaakt door mutaties in genen die de morfologie en functie van kernen in spieren. Het functionele belang van vorm en verdeling van de kernen in een cel is niet beperkt tot spieren. Werd bewezen dat de nucleaire defecten ook geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson 18,24. Daarnaast beginnen we aan dat de morfologie, grootte en intracellulaire distributie van andere organellen zoals het endoplasmatisch reticulum en mitochondriën kan functionele gevolgen hebben waarderen. Zo zijn veranderingen in mitochondriale morfologie geassocieerd met neurologische aandoeningen zoals type-1 optische atrofie (OPA1) en Charcot-Marie-Tooth neuropathie Type 2A 25.
Om te helpen bij het proces van het ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze belangrijke processen, stellen wij hoge resolutie confocale combinerengegevens beeldverwerkingssoftware en morfometrische analyses kwantitatief evalueren hoe genetische manipulaties vorm, grootte en positie van kernen kan beïnvloeden in spiervezels. De kracht en veelzijdigheid van Drosophila genetica samen met de zeer stereotiepe aard van het neuromusculaire systeem Drosophila larven de larven NMJ een experimenteel model bijzonder geschikt voor dit type analyse. Op het larvale NMJs kan fenotypische analyse uitgevoerd op één synaps resolutie waardoor een nauwkeurige morfometrische analyse waarbij een aantal NMJs binnen dezelfde vlieg kan worden bestudeerd en zelfs dezelfde identificeerbare NMJ internationaal vergelijkbaar vliegen van verschillende genotypen 3,4.
Fenotypische karakterisering van nucleaire positie, vorm en grootte op de Drosophila larven NMJ begint door het uitvoeren van immunokleuring van ontleed NMJs met antilichamen die spieren en kernen binnen de spieren te markeren. In het protocol beschreven in this papier werden myonuclei gekleurd met polyklonale antilichamen tegen lamine, een marker van de nucleaire envelop, met een nucleaire marker markeren nucleair interieur en met antilichamen die specifiek DVAP om alle spieren vlekken. De lamine antilichamen die in deze experimenten werden vriendelijk verschaft door Paul Fisher 19-22 maar alternatieve anti-lamine antilichamen kunnen worden gebruikt. Bovendien, een aantal andere specifieke voor de nucleaire envelop antilichamen zijn commercieel verkrijgbaar. Tenslotte nucleaire markers, zoals DAPI en propidium jodide, zijn ook beschikbaar zolang spieren kan worden gevisualiseerd door kleuring met anti-actine of anti-tubuline-antilichamen. Als er andere dan de in deze experimentele procedure antilichamen worden toegepast, wordt de immunokleuring protocol extra stappen waarbij fixatie omstandigheden en werken concentraties voor de nieuwe antilichamen zullen moeten worden geoptimaliseerd vereisen. Een cruciale stap in dit protocol, met name wanneer het volume renderings moeten worden geanalyseerd, is the bevestiging van de monsters op de dia. In dit geval is het belangrijk afstandhouders tussen de glijbaan en het dekglaasje zodat de monsters niet geplet omvatten. Drie banden van cellulose tape rond de schuif aan beide zijden van het dekglaasje vormen een gemakkelijke manier om spacers.
Terwijl ImageJ werd gebruikt voor 2D-beelden, de meeste beeld 3D multi-channel van de analyses in dit document, werden gedaan met behulp van Imaris vanwege de beschikbaarheid van in-house. Echter kunnen andere soortgelijke commerciële software pakket worden gebruikt voor deze toepassingen.
Er zijn diverse open-source (bijvoorbeeld ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME en anderen) en commerciële software platforms beschikbaar zijn voor de analyse van de confocale beelden. ImageJ 26, de gratis software van de NIH of de meer verbeterde versie, bekend als Fiji 27, heeft een groot aantal van de invoer filters, macro's en plug-ins beschikbaar voor de wereldwijde imaging community. De meeste van deze plugins zijn gericht op het verwerken van de informatie op een slice-by-slice manier. Er zijn ook plugins beschikbaar voor de visualisatie en analyse van multichannel 3D-beelden. Echter, zijn ze vaak ontworpen voor een specifieke taak en de gebruikers kan nodig zijn om deze plugins uit te breiden of aan te passen aan hun eigen behoeften. Aan de andere kant, commerciële platforms richten relatief onervaren gebruikers en worden vaak gericht op gemak-aan-gebruik, brede dekking van image-processing taken met een ongelooflijke snelheid.
De experimentele procedure samen met de kwantitatieve fenotypische analyse beschreven in dit protocol, kan helpen bij het ophelderen van de moleculaire mechanismen die organel morfologie en de verdeling binnen een cel. Deze benadering heeft het duidelijke beperking van de analyse van deze processen op een bepaald eindpunt. Het proces van het controleren morfologie en distributie van organellen waarschijnlijk zeer dynamisch zijn en niet alleen tussen verschillende mobiele ty varieertpes maar ook binnen dezelfde cel afhankelijk van de ontwikkeling of fysiologische toestand. Een verdere uitvoering van deze analyse zou worden vertegenwoordigd door time lapse imaging die toelaat veranderingen in organel morfologie en positie na verloop van tijd te worden gecontroleerd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-Forceps 0.3 mm x 0.25 mm | Fine Science Tools | 11030-12 | |
| Sylgard dissection plates | SIGMA-ALDRICH | 76103 | Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60 °C for at least 24 hr |
| Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection scissors (ultra-fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7 | NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653) | ||
| Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1) | Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706) | ||
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1x PBS + 0.1% Triton | Triton-X100. SIGMA-T8787 | ||
| Normal Goat Serum | SIGMA | G9023 | |
| Guinea Pig anti-DVAP antibody | Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at 1:200 dilution in 5% NGS | ||
| Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Rabbit anti-Lamin antibody | Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS | ||
| TO-PRO-3 | Molecular Probes | T3605 | |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-295G-A555-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-0358G-Cy3-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Vectashield mounting medium for fluorescence | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
- Fortini, M. E., Skupski, M. P., Boguski, M. S., Hariharan, I. K. A survey of human disease gene counterparts in the Drosophila genome. J. Cell Biol. 150 (2), 23-30 (2000).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. JoVE. (24), (2009).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. JoVE. (25), (2009).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Nishimura, A. L., et al. A mutation in the vesicle-trafficking protein VAPB causes late-onset spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis. Am J Hum Genet. 75 (5), 822-831 (2004).
- Chen, H. J., et al. Characterization of the properties of a novel mutation in VAPB in familial amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (51), 40266-40281 (2010).
- Funke, A. D., et al. The P56S mutation in the VAPB gene is not due to a single founder: the first European case. Clin Genet. 77 (3), 302-303 (2010).
- SOD1,ANG,VAPB,TARDBP, and FUS mutations in familial amyotrophic lateral sclerosis: genotype-phenotype correlations. J Med. Genet. Millecamps, S., et al. 47 (8), 554-560 (2010).
- Landers, J. E., et al. New VAPB deletion variant and exclusion of VAPB mutations in familial ALS. Neurology. 70 (14), 1179-1185 (2008).
- Van Blitterswijk, M., et al. VAPB and C9orf72 mutations in 1 familial amyotrophic lateral sclerosis patient. Neurobiol Aging. 33 (12), 2951-2954 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Budnik, V., et al. Regulation of synapse structure and function by the Drosophila tumor suppressor gene dlg. Neuron. 17 (4), 627-640 (1996).
- Sanhueza, M., Zechini, L., Gillespie, T., Pennetta, G. Gain-of-function mutations in the ALS8 causative gene VAPB have detrimental effects on neurons and muscles. Biol Open. 3 (1), 59-71 (2014).
- Worman, H. J., Ostlund, C., Wang, Y. Diseases of the nuclear envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a000760 (2010).
- Liu, G. H., et al. Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2. Nature. 491 (7425), 603-607 (2012).
- Pennetta, G., Hiesinger, P. R., Fabian-Fine, R., Meinertzhagen, I. A., Bellen, H. J. Drosophila VAP-33A directs bouton formation at neuromuscular junctions in a dosage-dependent manner. Neuron. 35 (2), 291-306 (2002).
- Fisher, P. A., Berrios, M., Blobel, G. Isolation and characterization of a proteinaceous subnuclear fraction composed of nuclear matrix, peripheral lamina, and nuclear pore complexes from embryos of Drosophila melanogaster. J Cell Biol. 92 (3), 674-686 (1982).
- Smith, D. E., Fisher, P. A. Identification, developmental regulation, and response to heat shock of two antigenically related forms of a major nuclear envelope protein in Drosophila embryos: application of an improved method for affinity purification of antibodies using polypeptides immobilized on nitrocellulose blots. J Cell Biol. 99 (1), 20-28 (1984).
- Smith, D. E., Gruenbaum, Y., Berrios, M., Fisher, P. A. Biosynthesis and interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during normal growth and in response to heat shock. J Cell Biol. 105 (2), 771-790 (1987).
- Puckelwartz, M. J., et al. Disruption of nesprin-1 produces an Emery Dreifuss muscular dystrophy-like phenotype in mice. Hum Mol Genet. 18 (4), 607-620 (2009).
- Tsujikawa, M., Omori, Y., Biyanwila, J., Malicki, J. Mechanism of positioning the cell nucleus in vertebrate photoreceptors. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (37), 14819-14824 (2007).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 872-884 (2010).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
