Introduction
Ifølge 2014 rapporten fra World Health Organization, 39% af verdens voksne befolkning er overvægtige, og 13% er overvægtige 1. I den nærmeste fremtid, vil overvægtige mennesker udgør en betydelig del af den ældre befolkning. Et vigtigt træk ved fedme og aldring er dysregulering af fedt i forhold til morbiditet og mortalitet 2. Adipokiner, proteiner udskilles af fedtvæv (AT), kan udløse metabolisk syndrom som fedme og type 2 diabetes 3. Metaboliske sygdomme er oftest forårsaget af overdreven energilagring i lipid-dråber af adipocyter, hvilket resulterer i AT ekspansion 4. Det er derfor af interesse at fastslå årsagerne og de molekylære mekanismer i AT ekspansion for at finde muligheder for at kontrollere det.
Over-ernæring fører til AT ekspansion, som reguleres af to begivenheder: overdreven energilagring i lipid dråber af adipocytter, en procesfører til hypertrofi (stigning i adipocyt størrelse), og øget adipogenese, også kendt som adipocyt hyperplasi 5. Adipogenese er en proces med differentiering af multipotente mesenchymstamceller (MSC) til adipocyter. For det første, MSC udvikle sig præadipocytter under engagement fase. For det andet præadipocytter yderligere differentierer at erhverve funktionerne i modne og funktionelle adipocytter 6. Adskillige transkriptionsfaktorer er blevet identificeret som master-regulatorer til preadipocyte bestemmelse, såsom zink finger protein 423 (Zfp423) og tidlig B-celle faktor 1 (Ebf1). Betragtninger Zfp423 inducerer tidlig engagement, er Ebf1 nødvendig for generering af adipocyt stamfædre 6. Terminal differentiering er stramt styret af en transkriptionel kaskade, hvorved peroxisomproliferatoraktiverede receptor γ (PPARy) er den afgørende transskription faktor 7. Yderligere vigtige transkriptionelle faktorer er CCAAT / enhancer-bindingsprotein (C/ EBP) familiemedlemmer (dvs. C / EBPα, C / EBPβ, og C / EBPδ), kruppel-lignende faktorer (KLFs), cAMP responsive element bindende protein (CREB) og tidlig vækst respons 20 (Krox20) 6.
For nylig er det blevet vist, at aktivatorproteinet-1 (AP-1) familie er involveret i adipocytdifferentiering proces 8,9. AP-1 familie er dannet af et dimert proteinkompleks, sammensat af Fos, Jun og / eller aktiverende transskriptionsfaktor (ATF) medlemmer. Fos-relateret antigen 1 og 2 (Fra-1 og Fra-2) er i stand til at regulere adipocytdifferentiering. Fra-1 hæmmer adipocytdifferentiering ved inhibering C / EBPα 8, hvorimod Fra-2 kontroller adipocyt omsætning 9. Fra-2 derved ikke kun formindsker adipocyt nummer ved at undertrykke PPARγ2 ekspression under adipocytdifferentiering, men også nedsætter adipocyt apoptose ved direkte undertrykkelse af hypoxi-inducerbare faktorer (HIFs) ekspression. HIF-familien er et HETErodimeric transskriptionsfaktor kompleks sammensat af HIF-1α, HIF-2α og HIF-1β. Heterodimererne består af et oxygen-sensitive HIF-α-proteinet (HIF-1α eller HIF-2α) og oxygen-ufølsomme HIF-1β underenhed 10. Under normoxi, HIF-α proteiner er poly-ubiquitinylated og endelig nedbrydes af proteasomer 11. Under hypoxiske betingelser, der forekommer i AT under ekspansion, HIF-α proteiner ikke længere hydroxylerede. De bliver derfor stabiliseret og danne dimerer med konstitutivt udtrykte HIF-1β. Transkriptionel aktivering af gener styres af HIF respons elementer er involveret i reguleringen af angiogenese, stofskifte, og inflammation 12. Faktisk HIF-1α fremmer AT dysfunktion ved at inducere glukosetolerance, inhibering energiforbrug og perifer brug af lipid, samt ved at øge leptin niveau og HFD-induceret hepatisk steatose 13. Endvidere HIF-1α regulerer adipocyte apoptose in vivo og in vitro 9.
Den nuværende protokol beskriver metoder til at studere AT status at optrævle de molekylære karakteristika adipocyt homeostase i voksne mus. Den viser, hvordan apoptose, proliferation og differentiering af adipocytter in vivo og in vitro kan reguleres af hypoxi. For at gøre dette, bruger vi mus med adipocyt specifik sletning af Fra-2 genereret ved at krydse mus bærer Fra-2 floxet alleler med Fabp4-CreERT mus 9. Ved at bruge Fabp4-Cre ERT mus, sletningen er adipocytspecifikke og inducerbar med tamoxifen injektion 14. For den voksne model, er intra peritoneale injektioner af tamoxifen udført over 5 dage i træk startende i en alder af 6 uger. Således er musene udsat for en normal kost eller kost med højt fedtindhold i 6 uger før analysen udføres. Musene anvendt i denne undersøgelse var mænd baseret på en C57BL6 baggrund at undgå kvindelige hormoner, såsom østrogener, Vist at regulere fedtdistributionen 15. Brug en anden genetisk baggrund kan også ændre den metaboliske fænotype, skyldes stamme-relaterede forskelle i lipid management 16.
Denne protokol demonstrerer, hvordan man analyserer AT under hypoxi hjælp histologi og hvordan at kvantificere adipocyt apoptose, proliferation og differentiering in vivo ved hjælp af immunhistokemi og gen-profilering analyser. Undersøgelsen er gennemført ved in vitro-forsøg, der viser, hvordan man analyserer primær adipocytdifferentiering og apoptose ændres ved eksponering for hypoxi.
Protocol
ETIK ERKLÆRING: Dyrene er opstaldet i standardiserede betingelser svarer til retningslinjerne i den tyske dyreværnsloven. Dyrene fodres en standard diæt og vand ad libitum og holdes med en 12 hr dag / nat cyklus. Alle eksperimenter med dyr er godkendt af de lokale etiske komité.
1. In vivo analyse af adipocyt Homeostase hos voksne mænd
- For at kvantificere hypoxi in vivo, først bestemme legemsvægt af musene, derefter injicere 60 mg / kg legemsvægt af fast pimonidazole hydrochlorid intraperitonealt (for eksempel: injicere 1,5 mg i en 25 g mus). Pimonidazole er en effektiv hypoksisk markering, som danner addukter med thiolgrupper i proteiner, peptider og aminosyrer og detekteres af et specifikt antistof.
- Sacrifice mus og fjern perigonadal fedtpuder (Figur 1).
- 45 min efter injektion, ofrer mus ved CO 2 kvælning og efterfølgende cervikal dislokation. </ Li>
- Pin ned lemmerne af mus (som illustreret i figur 1) og åbne bughulen. Fjern den venstre og den højre perigonadal (epididymal) fedtpude inde i bughulen.
Bemærk: Fat pad er bundet til epididymis af de peritoneale foldere, som vist i figur 1 (perigonadal fedtpuder er angivet med pile). - Sørge for at fjerne de gonadale væv fra fedtpuden. Bestem fedtpude vægte til at beregne forholdet: fedtpudevægt (g) pr legemsvægt (g).
Figur 1: Placering af perigonadal fedtpuder i bughulen af mus. Billede af perigonadal fedt lokalisering i voksne mus efter aflivning. Perigonadal fedtpuder er angivet med pilene. Klik her for at view en større version af dette tal.
- For at udarbejde en kvantitativ genekspression profil, bruge en perigonadal fedt pad til at isolere RNA. Bemærk: Indtil vævet forarbejdes, lagre vævsprøver i RNA stabilisering opløsning ved -80 ° C eller i flydende nitrogen.
- At homogenisere fedtpuden, tilføje fedtpuden til 1 ml enfaset opløsning af guanidinisothiocyanat og phenol. Brug reagensglas indeholdende keramiske perler (1,4 mm) for at knuse vævet i en homogenisator ved 6.500 rpm (2 gange 20 sekunder, med 30 sek pause).
- Isoler RNA som følger (single-trins metode Chomczynski og Sacchi 17).
- At adskille faserne, overføres homogeniseret fedt pad til mikrocentrifugerør, tilsæt 0,2 ml volumen chloroform, omrystes i 15 sekunder, inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur og centrifugeres 12.000 xg i 5 min. Overfør den øvre vandige fase (ca. 400 pi), som indeholder RNA, til et nyt mikrocentrifugerør. Medtag ikke DNA-indeholdeing mellemfasen eller den proteinholdige phenolfasen.
- Til udfældning af RNA, tilsættes 1 volumen isopropanol, blandes og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C (det er også muligt at inkubere ved -20 ° C natten over). Centrifuger ved 12.000 xg i 10 min. Fjern isopropanol supernatant omhyggeligt. Vask to gange med 75% ethanol med centrifuge trinnene 12.000 xg i 10 min.
- Efter tørring af det udfældede RNA til omkring 10 minutter ved stuetemperatur, opløses den i 50 pi H2O (RNase-frit). For at lette dette inkuberes i 2 minutter ved 65 ° C.
Bemærk: Hold RNA i 75% ethanol ved -80 ° C eller i flydende nitrogen til langvarig opbevaring. - Kvantificere de RNA-præparater ved A 260/280 (optimal kvotienten er mellem 1,8 og 2,2), og beregne koncentrationen af A 260:
- For at undgå DNA-kontaminering, fordøje 1 ug af RNA-præparatmed 1 U DNase I i 30 minutter ved 37 ° C i et volumen på 10 pi. Inaktivere ved 65 ° C i 10 minutter.
Bemærk: Dette trin er valgfrit. - Anvende 10 pi RNA præparat indeholdende 1 ug RNA til revers transkriptase reaktionen til at generere enkeltstrenget cDNA, der er egnet til kvantitativ PCR applikation. Komponenterne og deres beløb er anført i tabel 1.
- Brug en PCR Master Mix for en kvantitativ realtids-PCR-reaktion. For at bestemme metaboliske ændringer i hele fedtpude, anvender specifikke primere for gener involveret i AT homeostase (tabel 2) og PCR-betingelserne anført i tabel 3.
- Real-time PCR dataanalyse.
- Definer baseline (figur 2), der normalt cyklus 1 til 15, hvor der ikke er nogen ændring i fluorescens-signaler. Real-time PCR software normaliserer specifikke fluorescenssignaler til basislinjen fluorescens og til den interne reference farvestof, ROX, hvilket resulterer istørrelsen af de specifikke signaler af primerne, delta Rn (ΔRn).
- Indstil tærsklen inden for den eksponentielle fase af amplifikationen kurven. Skæringspunktet definerer tærskelcyklen (Ct). Baseret på CT-værdi, beregnes den relative ekspression (ACt) og folden ændring (ΔΔCt):
| Komponent | Volumen pl / reaktion |
| 10x RT Buffer | 2.0 |
| 25x dNTP Mix (100 mM) | 0,8 |
| 10x RT Tilfældige Primere | 2.0 |
| MultiScribe revers transkriptase | 1.0 |
| Nuclease-free H2O | 4.2 |
| 1 ugRNA | 10 |
| I alt pr reaktion | 20 |
Tabel 1: Komponenter med respektive volumen for revers transkriptase reaktionen til at generere enkeltstrenget cDNA.
| Officielt fulde navn | Symbol | Sekvens 3'-> 5' | ||
| Forward | Bagside | |||
| adipogenese | Delta-lignende en homolog (pref-1) | Dlk1 | GACACTCGAAGCTCA CCTGG | GGAAGGCTGGGACGG GAAAT |
| Tidlig B-celle faktor 1 | Ebf1 | CCACCATCGACTACGG CTTC | TCCTGGTTGTTGTGGGG CATC | |
| Zinkfingerproteinet 423 | Zfp423 | GTGCCCAGGAAGAAGA CGTA | GGCGACGTGGATCTGA ATCT | |
| Fedtsyrebindende protein 4 (Ap2) | Fabp4 | TCACCTGGAAGACAGCT CCTC | AAGCCCACTCCCACTTC TTTC | |
| CCAAT / enhancer binding protein (C / EBP), alfa | Cebpa | AAGAGCCGCGACA AGGC | GTCAGCTCCAGCACCT TGTG | |
| CCAAT / enhancer binding protein (C / EBP), beta | Cebpb | TTTCGGGACTTGATGC AATC | CCGCAGGAACATCTTT AAGG | |
| cAMP responsive element bindende protein 1 | Creb1 | ACTCAGCCGGGTACT ACCAT | TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC | |
| CCAAT / enhancer binding protein (C / EBP), delta | Cebpd | CAGCGCCTACATTGAC TCCA | GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA | |
| Kruppel-lignende faktor 4 | Klf4 | GCAGTCACAAGTCCCC TCTC TAGTCACAAGTGTGGG TGGC | ||
| Tidlig vækst svar 2 (Krox20) | Egr2 | AGGCGGTAGACAAAATC CCAG | GATACGGGAGATCCAG GGGT | |
| Peroxisomproliferatoraktiveret receptor gamma | Pparg | AGAGGTCCACAGAGCTG ATTC | GATGCACTGCCTATGAGC ACTT | |
| lipogenese | Acetyl-coenzym A-carboxylase alpha | Acaca | TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT | ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC |
| Fedtsyresyntase | Fasn | ACATCCTAGGCATCC GAGA | CCGAGTTGAGCTGGGT TAGG | |
| Stearoyl-coenzym A desaturase 1 | SCD1 | CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT | TTCTTGCGATACACTCTG Konkurrence på gasmarkedet | |
| lipolyse | Patatin-lignende phospholipase domæne containing 2 | Pnpla2 | AAGGACCTGATGACCA CCCT | CCAACAAGCGGATGGT Gaag |
| Fedtsyre optagelse | lipoproteinlipase | LPL | GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC | GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC |
| CD36-antigenet | CD36 | GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC | ATGGGCTGTGATCGGA ACTG | |
| hypoxi | Hypoxi inducerbar faktor 1, a-underenhed | HIF1A | CCTGCACTGAATCAAGAG Konkurrence på gasmarkedet | CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT |
| Endotel PAS domænenavn protein 1 (også kendt som: HIF-2alpha) | EPAS1 | CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC | TTGGGTGAATTCATCG GGGG | |
| Von Hippel-Lindau tumor suppressor | VHL | ACCGAGGTCATCTTTG GCTC | TTCCGCACACTTGGGT AGTC | |
| Aryl kulbrinte receptor nukleare translokatoren (også kendt som: HIF-1 beta) | Arnt | TGGGTCATCTTCTCGC GGTT | TGTCCTATCTGAGCAT CGTG | |
Tabel 2: Liste over gener med sekvensen af de respektive primere anvendt til at analysere adipocyt homeostase.
| Trin | Temperatur (° C) | Tid (min: sek) | ||
| aktivering Polymerase | Holde | 95 | 10:00 | |
| PCR | 40 cykler | Denaturize | 95 | 00:15 |
| Hydraulik / Extension | 60 | 01:00 | ||
| kurve Melting | 60 til 95 | 0,5 ° C / sekund | ||
Tabel 3: Real-time PCR-forhold.
Figur 2:. Karakteristik af real-time PCR-amplifikation kurven Klik her for at se en større version af dette tal.
- For at udføre histologiske analyse af adipocyt homeostase, bruge den anden perigonadal fedt pad. Må ikke tørre ud vævet!
- Fastgør fedt puden i 3,7% PBS-buffer formaldehyd natten, integrere i paraffin (følg instruktionerne som beskrevet andetsteds 18) og skære den indlejrede væv i 2-5 um tykke sektioner (maksimum 5 pm).
- Bestem antallet af fedtceller pr felt og adipocyt størrelse i et lyst-felt mikroskop efter hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning: <ol>
- Afparaffiniser sektioner ved vask 3 gange i 5 minutter i xylen og rehydrere sektionen 2 gange i 2 min i 100% ethanol og 2 gange i 2 min i 96% ethanol. Endelig vaske afsnittet i destilleret H2O i 5 min.
- Pletten med hematoxylin, fortyndet 1: 5 med destilleret H2O, i 10 minutter ved stuetemperatur og vaskes i H2O i 5 min. Pletten med eosin-opløsning (20 ml 5% eosin Y / 210 ml destilleret H2O / 25 pi iseddikesyre) i 30 sekunder og vask igen med H2O i 5 min.
- Dehydrere sektioner ved hjælp 96% ethanol og 100% ethanol 2 gange hver i 2 minutter, og xylen 3 gange i 5 min. Monter sektioner med vandfri montering agent.
- Vurdere sektionerne under en lys-felt mikroskop. Et repræsentativt eksempel på hvordan man analyserer adipocytter med ImageJ 1.48v 19 er vist i fig. 3: antal celler pr område (um 2), celleareal (x 10 3 um 2
- Åbn billede af afsnittet med ImageJ 1.48v. Hvis parametrene af billedet angivet i pixels i stedet for en længdeenhed, justere skalaen.
- Vælg * Lige linie * i værktøjslinjen og justere linjen til en kendt afstand i forhold til den skala bar. Gå til Analyser -> Set Scale Afstanden linjen er vist i pixels;. tilsæt kendt afstand og enheden af længden, fx um. Bekræft med OK. Størrelsen af billedet og analysen af parametrene er angivet i længdeenheden givet.
- For at bestemme parametrene for adipocyter, justere tærsklen. Gå til Image -> Tilpas -> Threshold at åbne Threshold vinduet. Vælg følgende indstillinger: Thresholding metode: Standard; Threshold farve: B & W, Farverum: HSB. Billedet vises nu i sort og hvid. JusterLysstyrke for at rydde hvide adipocytter og lukke sorte intercellulære rum, som i fig. 3b.
- Tæl antallet af fedtcellerne pr um 2 (figur 3e) med den * multi-point * valg i værktøjslinjen og markere hver celle til tælling.
- For at bestemme adipocyt størrelse, skal du vælge * Straight line * igen på værktøjslinjen og trække diameter en adipocyt (figur 3c). Gå til Analyser -> Mål og et nyt vindue vises, med længden af diameteren i um.
- For at bestemme adipocyt område, skal du vælge * Wand (sporing) værktøj * og klik inde i fedtcellerne. Den indre væg af adipocyt er valgt i rød (figur 3d). Gå til Analyser -> Mål og et nyt vindue vises, med arealet af denne adipocyt i um 2.
- Afparaffiniser sektioner ved vask 3 gange i 5 minutter i xylen og rehydrere sektionen 2 gange i 2 min i 100% ethanol og 2 gange i 2 min i 96% ethanol. Endelig vaske afsnittet i destilleret H2O
- For antigen hentning, fordøje vævssnittet i 30 minutter ved 37 ° C med proteinase K arbejdsopløsning (20 ug / ml i 10 mM Tris / HCl, pH 7,4-8) og skyl med PBS.
- At blokere endogen peroxidase, bruge 3% hydrogenperoxid i PBS i 10 minutter, med efterfølgende vask 2 gange i 5 minutter i PBS. For at blokere uspecifik binding af antistoffer, bruge 10% serum i PBS. Brug serummet fra værten for det sekundære antistof, i dette tilfælde ged.
- For farvningen, bruge antistoffer til apoptose, spredning og hypoxi detektion (
- At forstærke signalet bruge et biotinyleret sekundært antistof, med fortyndingen som anført i tabel 5. For hypoxia detektion, bruge HRP konjugeret kanin-anti-FITC som det sekundære antistof. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Vask afsnittene 2 gange 5 min med PBS.
Bemærk: For hypoxi farvning med FITC-MAb1, springe trin 1.4.4.4), og fortsætte med trin 1.4.4.5).- For hvert objektglas, præ-inkuber 50 pi avidin opløsning med 50 pi biotinyleret peroxidase H i 30 minutter ved stuetemperatur (denne metode er også omtalt som avidin / biotin ABC-kompleks formulering) og hældes derefter afsnittene i yderligere 45 min. Vask 2 gange i 5 minutter med PBS.
- Inkuber sektionerne i peroxidasesubstrat opløsning, indtil farvningen bliver mere intens (mellem 5 til 10 min). Vask i 5 minutter med destilleretH 2 O.
- For kontrastfarvning, pletten med hæmatoxylin fortyndet 1: 5 med destilleret H2O i 10 minutter ved stuetemperatur og vask i H2O i 5 min.
- Dehydrer sektioner i 96% ethanol og 100% ethanol 2 gange hver i 2 minutter, og xylen 3 gange i 5 min. Forsegl sektioner med dækglas og vandfri montage middel. Vurdere sektionerne under en lys-felt mikroskop.
- At forstærke signalet bruge et biotinyleret sekundært antistof, med fortyndingen som anført i tabel 5. For hypoxia detektion, bruge HRP konjugeret kanin-anti-FITC som det sekundære antistof. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Vask afsnittene 2 gange 5 min med PBS.
- Der tilsættes 50 pi enzymopløsning i 450 pi label løsning. Derefter anvende 50 pi TUNEL reaktionsblandingen på histologiske snit og inkuberes i 60 minutter ved 37 ° C i en fugtig atmosfære i mørke. Vask afsnittene 3 gange med PBS i 5 minutter og montere med Fluorescensmonteringsmedium herunder DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) for kontrastfarvning.
- Vurdere afsnit under et fluorescens mikroskop med 100 gange Magnificat ion. Til måling af fluorescein bruge en excitationsbølgelængde på 488 nm og detektere mellem 515-565 nm (grøn laser); DAPI exciterer ved ca. 360 nm og emitterer ved ca. 460 nm, når bundet til DNA (blå laser).
- Kvantificere overlejringer af DAPI og fluorescein:
Figur 3:. Analyse adipocyt egenskaber i fedt pad punkter PUNKT billeder af perigonadal fedt pude af hanmus blev behandlet med en kost med højt fedtindhold (HFD) eller normal kost (ND) med en lys-felt mikroskop (a); tærsklen justeres i sort og hvid (b) og adipocyt størrelse (længde c), område (d) og adipocyt celleantal pr mm 2 (e) kvantificeres med ImageJ 1.48v.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
| stamkoncentration | fortynding | |
| Apoptose | Kløvede caspase-3 (Asp175) (5A1E) Kanin mAb | 1: 2.000 |
| Proliferation | Renset Mouse Anti-Human Ki-67 klon B56 (RUO) | 01:50 |
| hypoxi | HIF-1 alpha-antistof | 1: 100 |
| FITC-MAb1 | 1: 100 |
Tabel 4: Antistoffer med respektive fortynding anvendes til immunhistologisk farvning af AT sektioner.
| antistof | fortynding |
| biotinyleret antimuse-IgG (H + L) | 1: 200 |
| biotinyleret anti-muse-IgG (H + L) | 1: 200 |
| HRP konjugater kanin-anti-FITC | 1: 100 |
Tabel 5: Sekundære antistoffer med fortynding anvendes til immunohistologisk farvning.
2. In vitro analyse af fedtcellerne Homeostase Påvirket af hypoxi
- Sacrifice mus og fjerne det subkutane fedtvæv.
- Sacrifice musene ved CO 2 kvælning og efterfølgende cervikal dislokation.
- Pin ned lemmerne af mus som vist i figur 4. Tag skindet fra det øvre ben, lænd og flanke og pin det ned med nåle som i figur 4. Tag derefter subkutane fedtvæv, som er placeret posteriort ved basis af den bagben, der omgiver de inguinale lymfeknuder (som vist i figur 4, venstre: subkutant fedt pads angivet med pilene; højre: inguinal lymfeknude angivet ved pilen).
Figur 4: Placering af spæk pads. Billede af subkutant fedt pad; de venstre pile angiver spæk pad og retten pilen angiver lyskelymfeknuder lymfeknude. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Isolere adipøst afledte stamceller (ADSC) som tidligere beskrevet 20.
- Seed ADSC 4.000 celler / cm2 i Dulbeccos modificerede Eagles medium-Hams F-12 suppleret med 10% normalt kalveserum, 1% penicillin / streptomycin, 0,5% amphotericin B, 16 pM biotin, 18 uM pantothensyre og 100 uM ascorbinsyre og vokse kultur til sammenflydning omkring 70 og 80%, Som nås efter 4 til 6 dages dyrkning.
- Fremkald adipogenisk Differentiering.
- Fjern det vedhængende ADSC fra overfladen ved trypsinbehandling.
- Fjern mediet, vask med PBS, og der tilsættes 0,025% trypsin-opløsning (forvarmet til 37 ° C) i 2 minutter (indtil celler løsnes fra overfladen). Umiddelbart tilføje medium og vask cellerne.
- Tæl celler ved hjælp af et Neubauer kammer.
- Sæt lampeglasset på det centrale område af Neubauer kammeret. Fortynd cellesuspensionen 1:10 og indlæse kammer med 10 pi fortyndet celle suspension. Tæl cellerne i 4 kvadrater placeret ved hjørnerne, hver består af 16 mindre kvadrater. Beregn celletallet pr ml:
- Sæt lampeglasset på det centrale område af Neubauer kammeret. Fortynd cellesuspensionen 1:10 og indlæse kammer med 10 pi fortyndet celle suspension. Tæl cellerne i 4 kvadrater placeret ved hjørnerne, hver består af 16 mindre kvadrater. Beregn celletallet pr ml:
- Seed ADSC (som beskrevet under punkt 2.2) i 12-brønds dyrkningsplader og vokse kultur til konfluens ca. 70 til 80% (efter 4 til 6 dage).
- Fremkald adipogenic differentiering ved tilsætning af 5 ug / ml insulin, 1 pM dexamethason og 5 uM 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) til kulturerne. Forny mediet hver 2 dage. Celler vil blive fuldt differentieret efter 7 dage.
- Fjern det vedhængende ADSC fra overfladen ved trypsinbehandling.
- For at analysere adipogenisk differentiering, pletten med Oil Red O, der farver triglycerider af modne adipocytter.
Bemærk: Arbejdet skal udføres under en emhætte!- Fjern mediet, vaskes adipocytter forsigtigt med PBS og fikseres cellerne i 60 min med 2 ml 10% formalin.
- Til fremstilling Oil Red O-farvning opløsning, bland 3 dele af rød olie O stamopløsning (300 mg rød olie O pulver opløst i 100 ml 99% isopropanol) med 2 dele destilleret H2O og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Filter Oil Red O arbejder løsning gennem et 0,2 um indsprøjtning filter.
Bemærk: Arbejdsgruppen opløsning er stabil i 2 timer. - For Oil Red O farvning, fjerne formalin, vask adipocytter med H2
- Evaluere pladerne under et fasekontrastmikroskop med 100 gange forstørrelse. De lipider i adipocytter vises rødt og kernerne vil blive vist blå.
- Valgfri trin: Silence genet af interesse ved transfektion med shRNA.
- Skift medium og tilsæt serum-frit medium.
- Til transfektion af fedtceller, bruge lipofektion. Følg producentens anvisninger og bruge 1 pg shRNA pr 12-brønds væv plader. Efter tilsætning af lipid-DNA-kompleks, inkuberes adipocytter i 48 timer ved 37 ° C.
- At analysere adipocytter udsat for hypoxi, bruge en hypoxisk arbejdsstation eller hypoxisk inkubator for at opretholde cellerne under hypoxiske betingelser. Afhængig af undersøgelsen, hypoxi could være 0,5, 1 eller 2% oxygen.
- Analyser apoptose med FITC-mærket Annexin V og efterfølgende flowcytometri analyser.
- Saml adipocyter med en ekstra blød celleskraber, vask med PBS, og der tilsættes 1 x 10 6 celler til 100 pi Annexin V-bindingsbuffer (10 mM Hepes / NaOH, pH 7,4; 140 mM NaCl; 2,5 mM CaCl2). Tilsæt mængden af Annexin V-FITC anbefales af producenten, og der inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
- For flowcytometri måling, tilsættes 200 pi Annexin V-bindende buffer og 1 uM af nuklear kontrastfarve. Bestem fluorescens i grøn og violet kanal. Annexin V + / nuklear kontrastfarve + celler defineres som sekundær nekrotisk og annexin V + / nuklear modfarve - celler er defineret som apoptotiske celler (figur 5).
- Kvantitativt analysere adipocyt RNA-niveauet til at bestemme homeostase under hypoxiske betingelser.
- Tilføje1 ml enfaset løsning af guanidinisothiocyanat og phenol til hver brønd og isolere RNA [anvendes enkelt-trins metode Chomczynski og Sacchi 17 (trin 1.3.2)] og fortsætte som i trin 1.3.2.1) til 1.3.5.2) .
- Analyser apoptose med FITC-mærket Annexin V og efterfølgende flowcytometri analyser.
Figur 5: adipocyt apoptose analyse ved flowcytometri. Dot plot præsentationer af FACS for Annexin V-FITC og TO-PRO-3 farvning af adipocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Representative Results
Vi viser hvordan du kan afgøre adipocyt homeostase in vivo og in vitro ved hjælp af eksemplet med Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus sammenlignet med vildtype-kuld. Vores definerer, hvordan øget HIF ekspression af hypoxi er korreleret med adipocyt dysfunktion som angivet med øget adipocyt apoptose.
Øget fedtcellerne størrelse og område i fedtrig kost (HFD) behandlede mus
Over-ernæring, blandt andre faktorer, resulterer i adipocyt hypertrofi, forårsaget af overdreven energilagring i lipiddråber. Fedtcellerne størrelse og område er en indikator for hypertrofi. Sektioner af fedtpuden fra normal (ND, figur 6a) og kost med højt fedtindhold (HFD; figur 6b) mus samt kvantificering af fedtcellerne størrelse og område viser tydeligt adipocyt hypertrofi efter 6 ugers af HFD, som er angivet med forøget adipocyt størrelse i HFD behandlede mus (figur 6C og D).
Øget hypoxi i fedtvævet (AT) af voksne Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus fører til øget HIF-1α niveau og adipocyt apoptose
For at bestemme in vivo status hypoxi i AT, Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus analyseret 6 uger efter Fra-2 deletion i en alder af 12 uger og sammenlignet med vildtype-kuld. Pimonidazole administreres til musene intraperitonealt som en effektiv hypoxi markør; det er ikke-toksisk og i stand til at distribuere i AT. Hypoksiske adipocytter i AT in vivo er defineret ved immunhistokemisk antistoffarvning (figur 7a). Endvidere er den øgede hypoksiske status af AT i mus ledsages af øget HIF-1α positive ADIPocytes angivet ved immunhistokemisk farvning Figur 7b), hvilket bekræftes ved kvantificering af HIF-1α ekspressionsniveauer og sine mål gener 9. Derudover TUNEL-farvning af AT sektioner fra Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus og kontroldyr fra samme kuld (fig 7C) viser, at øget adipocyt apoptose er korreleret med tilstedeværelsen af hypoxia og HIF-1α ekspression.
Øget HIF-1α udtryk i primære adipocytter gennem hypoxi induceret adipocyt apoptose
For at analysere adipocyt apoptose in vitro, bruger vi adipocytter genereret fra subkutane fedt pads som beskrevet andetsteds 20. Som forventet er den HIF-1α ekspression i adipocytter steg efter 24 timer af hypoxi (figur 8A). For yderligere at analysere HIF-1α aktiviteter, RNA niveauer af HIF målgener, såsom Inos (inducerbar nitrogenoxidsyntase) kvantificeres ved qPCR. Figur 8b viser, at den øgede ekspression af HIF-1α under hypoxiske betingelser fører til forøget Inos mRNA-niveau. Da vi allerede har vist in vivo (figur 8), at forøget HIF-1α ekspression i adipocytter korrelerer med øget adipocyt apoptose, er apoptose også kvantificeret i in vitro kulturer ved Annexin V-farvning under hypoxiske betingelser. I overensstemmelse med in vivo-data (figur 7), er en øget HIF-1α niveau ledsages af øget adipocyt apoptose induceret af hypoxiske betingelser (figur 8b). Endvidere at bevise, at hypoxisk-induceret apoptose er HIF-afhængig; HIF-1α eller HIF-2α er tavse af RNA-interferens i adipocytter afledt fra vildtype- eller Fra-2 deficiente mus. Den øgede adipocyt apoptose genoprettes ved silencing HIF-1α eller HIF-2α som vist ved Annexin V farvning i figur 8b, der beviser, at hypoxi sensor HIF-α regulerer adipocyt apoptose.
Figur 6: Øget adipocyt størrelse og område i fedtrig kost (HFD) mus (a, b) H & E farvning af snit fra perigonadal fedt pude af hanmus vildtype fodret med normal kost (ND) (a) eller høj. -fat kost (HFD) (b) i 6 uger. Søjler repræsenterer 500 um. (C, d) kvantificering af adipocyt størrelse (c) og areal (d) fra perigonadal fedtpude af mus vildtype fodret med ND (a) eller HFD (b) i 6 uger. n = 10. Data er vist som middelværdier ± SEM. Statistisk analyse blev udført under anvendelse studerendes t-test. *** P <0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Øget HIF-1α niveau og apoptose i adipocytter af voksne FRA-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus. Hypoxi (a) og HIF-1α (b) farvning i AT af mandlige Fra-2 fl / fl Fabp4-creERT mus og mandlige kontroldyr fra samme kuld 6 uger efter tamoxifen injektion. Forstørrelse 20X, indsætte 40X. Sorte pile angiver hypoxiske områder og HIF-1α positive celler. (C) TUNEL farvning i Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus og kontroldyr fra samme kuld ved 6 uger efter tamoxifen injektion. Forstørrelse 20X, indsætte 40X. Sorte pile angiver TUNEL-positive celler. Dette tal er blevet ændret fra Luther etal. 9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8:. Øget HIF-1α udtryk og adipocyt apoptose i primære adipocytter induceret af hypoxi (a) Real-time PCR-analyse af HIF-1α og HIFs mål Inos mRNA-niveauer i primære adipocytter placeret i hypoxiske kamre analyseret på de angivne tidspunkter. (B) Kvantificering af apoptose ved Annexin V FACS farvning i primære adipocytter isoleret fra Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus eller kontroller vild type transficeret med sh kontrol eller sh plasmid mod HIF-1α eller HIF-2α og anbragt under hypoxi (1% O2) i 24 timer. Dette tal er blevet ændret fra Luther et al.
Discussion
Adipocyter karakteriseres fænotypisk ved deres størrelse, antal og areal, afslører adipocyt hyperplasi og hypertrofi, fremkaldt af overdreven energilagring på grund af over-ernæring 5. Disse begivenheder, der førte til fedtsyre dysregulering og efterfølgende metabolisk syndrom er også, med øget fedtmasse med bevarede stofskifte, som også omtales som "sunde" fedt ekspansion. For eksempel Kusminski et al. 21 viste, at mus med massive fedt ekspansion forblive metabolisk sunde, hvilket tyder på, at fedt ekspansion er ikke nødvendigvis knyttet til metabolisk syndrom og skal være omhyggeligt fast besluttet på at vurdere egenskaberne ved de adipocytter. Den fedtvæv (AT) spiller en central rolle i reguleringen af kroppens stofskifte. AT er den største endokrine organ, der kan påvirke dyslipidæmi, aterosklerose, hyperinsulinæmi og hyperglykæmi 3. Evaluering AT homeostase og den molekylære mechanisms regulerer det kan give en bedre forståelse af metaboliske lidelser. Derfor unraveling de mekanismer, der regulerer adipocytdifferentiering, ville adipocyt størrelse og fedt pad masse bidrage til at udvikle nye terapeutisk behandling af fedme lidelser. Brug af in vivo og in vitro metoder, er det muligt at bestemme rollen af fødevarer og genekspressions indvirkninger på adipocytdifferentiering og aktivitet. For at bestemme AT homeostase, bestemme balancen mellem adipocytdifferentiering, proliferation og apoptose som foreslået af vores protokol er lige så vigtig som at analysere glukose og insulin metabolisk respons 22-24.
Ekspression profilering analyser af gener involveret i adipogenese, lipogenese, lipolyse, fedtsyre optagelse, hypoxi, apoptose og proliferation i primære adipocytter og visceralt AT er en high throughput fremgangsmåde til opnåelse af en oversigt på adipocyt homeostase og deres mulige dysfunktion.Interessante kandidater bør analyseres nærmere på proteinniveau ved Western blot eller immunohistologisk farvning. At opnå optimale resultater gennem realtids-PCR-system under anvendelse af usymmetriske cyaninfarvestoffer, bør koncentrationerne af cDNA i området fra 1 til 10 ng og de optimale primerkoncentrationer området fra 50 til 900 nm testes for at minimere ikke-specifik amplifikation. De kritiske komponenter er primerne; for hvert forsøg, skal kontrolleres nøje for at sikre specificiteten og udelukke dannelsen af primer-dimerer smeltekurveme. Derfor anbefales anvendelse af en negativ kontrol med H2O i stedet for cDNA. Endvidere er kommercielt tilgængelige usymmetriske cyaninfarvestoffer tilvejebragt som masterblandinger der indeholder en passiv henvisning farvestof (såsom ROX) for at tilvejebringe en intern reference signal. CDNA-signalet normaliseres under dataanalyse til ROX signaler at korrigere well-to-well signal udsving. Et andet punkt, der skal overvejes for at etablere en good qPCR system er valget af husholdning genet. For hver betingelse, er flere husholdningsgener anvendes, fx HPRT, β-actin, GAPDH, β-2-MG eller HSP90.
HIF proteiner stabiliseret ved hypoxiske betingelser er master-regulatorer bestemmer ikke kun adipocytter overlevelse, men også metaboliske ændringer, såsom glucose, insulin tolerance og fedtstofskiftet 11,25,26. At fastslå hypoxiske områder i fedtpuden, er HIF-1α bestemmes i AT sektioner ved immunhistokemi. Da HIF proteiner hurtigt nedbrydes inden for 5 til 10 min under normoksiske betingelser, bør proceduren og fiksering af fedtet pad for den histologiske analyse tæt kontrolleret for at undgå latenstid. Derfor, for at sikre hypoksi ikke kun gennem HIF-farvning, er pimonidazole anvendes til at bestemme hypoxiske områder i AT. Pimonidazole er i stand til at distribuere i væv, som det allerede blev vist i knogler 27Og effektivt markere hypoxiske områder ved binding til thiolholdige proteiner specifikt i hypoxiske celler, som yderligere påvist i histologiske snit ved specifik antistofbinding 28. Imidlertid kan andre markører og fremgangsmåder anvendes til at analysere hypoxi pathway. For eksempel inddragelse af prolyl hydroxylase (PHD) enzym, som fremkalder hydroxylering af prolinrester under normoxi, samt von Hippel-Lindau (VHL) protein, som genkender hydroxylerede proliner og inducere poly-ubiquitinering at mediere proteasomalaktivitet HIF nedbrydning, skal analyseres for en fuld oversigt af vejen 29,30. Desuden ville allestedsnærværende påvisning af HIFs også bestemme proteinstabilitet og nedbrydning, der kan ændre 31,32.
Desuden er proliferation med Ki67 og apoptose ved TUNEL-farvning bestemmes in vivo ved farvning af AT histologiske snit. Kvantificering af spredning af Ki67 og enpoptosis af TUNEL eller Annexin V farvning gennem flowcytometri analyse udføres også 33. Proliferation kunne selvfølgelig måles ved andre teknikker såsom analyser af adipocyt cellecyklus, som ikke er behandlet af måling af Ki67 positive celler. Desuden kan apoptose undersøgelse fra TUNEL være afsluttet ved FACS analyser af Annexin V og TOP-PR-3, som vil bestemme indholdet af nekrose versus apoptose celledød proces. Apoptose er en grundlæggende fremgangsmåde til programmet for celledød, hvilket er vigtigt for AT homeostase. Faktisk dysregulering af adipocyt apoptose tidligere er blevet impliceret i processer, der bidrager til fedme og lipodystrofi 34. Desuden er der i 2011, Keuper et al. Forbundet fedtvæv betændelse til adipocyt apoptose. De viste, at makrofager induceret apoptose i præadipocytter og adipocytter, hvilket igen tiltrækker makrofager. Rekrutteringen af makrofager accelererer inflammation, hvilket contributes til metabolisk syndrom såsom glucose og insulin tolerance 35. Men adipocyt apoptose er stadig en dårligt undersøgt fænomen, trods den hypotese, at inducerede adipocyt apoptose kan føre til vægttab.
Den nuværende protokol bruger immunhistokemiske metoder til at studere forskellige fænomen som spredning, apoptose og hypoxi in vivo. Derfor blev vævet fikseret med 4% formaldehyd, hvilket er et kritisk trin. En udvidet vævsfiksering tid fører til ændring af epitoper, der bliver ikke-tilgængelig for antistoffet. I modsætning hertil en kort fiksering tid øger følsomheden af epitoper til reagenser. Den anbefalede optimale tidspunkt for fiksering er 24 timer. Desuden er tykkelsen af afsnittene, påvirker endvidere antistoffer, som binder til deres epitoper; optimale tykkelse er mellem 2 og 5 um. Sektioner tykkere end 5 um vil give falske positive resultater som følge af øgede bindingssteder. Derimod stninger tyndere end 2 um indeholder mindre bindingssteder og positive områder er ikke veldefineret. Yderligere kritiske faktorer er antistoffet selv, inkubationstid, koncentration og ensartet temperatur, som påvirker kvaliteten af den specifikke binding til epitoperne. Derfor validering antistofkoncentration og inkubationstiden er nødvendig for hver betingelse.
For at fuldende undersøgelsen, giver vi et in vitro adipocytdifferentiering protokol, som kan forlænges med forskellige behandlinger, stimulering eller co-kulturer. Ved anvendelse af in vitro adipocyt-kulturer, er det muligt at bestemme defekter i adipocytdifferentiering og funktioner. For at opnå pålidelige resultater, som for alle primære celler, den sunde adfærd og udseende af ADSCs og adipocytter er ret vigtigt. Granulering, cytoplasmatiske vacuolations og / eller udstationering er tegn på forringelse, indikerer utilstrækkelig medium, mikrobiel kontaminering eller ældning af den primæreceller. Denne protokol er anvendelse af isolerede adipocytter fra fedtpuden væv, det er så godt muligt at anvende mesenchymale stamcelle isoleret fra knoglemarv som beskrevet af andre protokoller 36. Den seneste omfatter stromale stamceller, som kunne afspejle yderligere differentiering problemer, der opstår ved meget tidligt trin i adipocyt differentiering, kan dette blive savnet i vores nuværende protokol. Desuden kan ADSCs udvides hurtigt (mere end 10 gange inden for en uge), og langsigtede dyrkede ADSCs efter nogle passager stadig bevare deres mesenkymale pluripotens 37,38. En anden fordel ved anvendelse ADSCs er, at man let kan skifte til human, eftersom ADSCs kan høstes fra patienter efter fedtsugning, som er en enkel og minimalt invasiv metode.
Som AT påvirker flere andre organer i en endokrin måde, bør protokollen udvides til adipokiner. Adipokiner, såsom leptin, adiponectin, tumornekrosefaktor-α (TNF) and resistin, der udskilles af adipocytter er kendt for at påvirke metaboliske sygdomme ved at styre fedtstofskiftet, energi-homeostase og insulinfølsomhed 39. Derfor bør udføres serum og adipocyt secretome analyser. I tilfælde af AT dysfunktion, adipokiner og proinflammatoriske cytokiner, såsom IL-6, kan føre til dysregulering af organer såsom lever og pancreas, samt muskelfunktion 4. For at udelukke systemisk organsvigt, kunne dyremodeller eller cellekulturer testes for deres reaktion på glucose stimulation og optagelse.
Her giver vi en protokol for analyse grundtilstanden af AT og adipocytter in vivo og in vitro at afsløre molekylære mekanismer for adipocyt homeostase og funktionalitet.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne venligt takke Dr. J. Luther og K. Ubieta for udarbejdelsen af data og Dr. B. Grötsch for korrekturlæsning manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAlater solution | Ambion | AM7021 | RNA stabilization solution |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| SYBR Select Master Mix | 4472908 | ||
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 | BD Biosciences | 550609 | Clone B56 (RUO) |
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) | 550609 | Proliferation marker | |
| FITC Annexin V | BioLegend | 640906 | |
| Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb | Cell signalling | 9664S | Clone 5A1E |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 9664 | Apoptosis marker | |
| Lipofectamine2000 Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| TO-PRO-3 Iodide | T3605 | Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm | |
| Mayer’s hemalum | Merck | 109249 | hematoxylin |
| pegGOLD TriFast | Peqlab | 30-2030 | TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol |
| Percellys Ceramic Kit 1.4 mm | 91-PCS-CK14 | tubes containing ceramic beads (1.4 mm) | |
| Precellys 24 | 91-PCS24 | homogenizer | |
| HIF-1 alpha Antibody | Pierce | PA1-16601 | |
| HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 | 700505 | Hypoxia marker | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Roche | 11 684 795 001 | TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) |
| Eosin | Sigma | 318906 | |
| DNase I Solution (1 unit/µl) | Thermo Scientific | EN0525 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | BA-1000 | ||
| Vectastain ABC Kit | PK-4000 | ||
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | H-1200 |
References
- Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).
- Gong, Z., Muzumdar, R. H. Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging. Int J Endocrinol. , 320482 (2012).
- Deng, Y., Scherer, P. E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).
- Rezaee, F., Dashty, M. Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases. J Diabetes Metab. , 008 (2013).
- Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. The cell biology of fat expansion. J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).
- Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1 (2015).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metab. 4, 263-273 (2006).
- Luther, J., et al. Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy. J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).
- Luther, J., et al. Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia. Cell Death Differ. , (2014).
- Semenza, G. L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).
- Kim, W., Kaelin, W. G. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).
- Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab. 9, 11-22 (2009).
- Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction. Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).
- Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).
- Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin. Diabetes. 55, 978-987 (2006).
- Haluzik, M., et al. Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
- Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Planat-Benard, V., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 109, 656-663 (2004).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).
- Trajcevski, K. E., et al. Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model. PLoS One. 8, 71747 (2013).
- Montgomery, M. K., et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).
- de Queiroz, K. B., et al. Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet. Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).
- Ye, J. Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).
- Xiong, Y., et al. The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).
- Bozec, A., et al. Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia. Nature. 454, 221-225 (2008).
- Varia, M. A., et al. Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).
- Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability. Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).
- Tennant, D. A., et al. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).
- Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool. Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).
- Amelio, I., et al. TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).
- Suga, H., et al. Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. J Diabetes Res. 2015, 970375 (2015).
- Keuper, M., et al. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).
- Sera, Y., et al. Hematopoietic stem cell origin of adipocytes. Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Scherer, P. E. Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ. Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).
