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Developmental Biology

भेदभाव और Apoptosis Homeostasis के माध्यम से वयस्क जीवों में वसाकोशिका नंबर का विनियमन की व्यवस्था

Published: June 3, 2016 doi: 10.3791/53822
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Medicine 3, Rheumatology and Immunology, Universitätsklinikum Erlangen, 2Nikolaus Fiebiger Center of Molecular Medicine, Universitätsklinikum Erlangen

Introduction

विश्व स्वास्थ्य संगठन से 2014 की रिपोर्ट के अनुसार, दुनिया की वयस्क आबादी का 39% अधिक वजन है, और 13% मोटापे से ग्रस्त 1 है। निकट भविष्य में, अधिक वजन वाले लोगों बुजुर्ग आबादी का एक महत्वपूर्ण अनुपात शामिल होंगे। मोटापा और उम्र बढ़ने के एक महत्वपूर्ण विशेषता रुग्णता और मृत्यु दर 2 के संबंध में वसा का अनियंत्रण है। Adipokines, वसा ऊतकों (एटी) द्वारा स्रावित प्रोटीन, मोटापा जैसे उपापचयी सिंड्रोम ट्रिगर और 2 मधुमेह 3 टाइप कर सकते हैं। चयापचय रोगों ज्यादातर जो विस्तार 4 में परिणाम adipocytes के लिपिड बूंदों में अत्यधिक ऊर्जा भंडारण, के कारण होता है। यह आदेश इसे नियंत्रित करने के अवसर खोजने के लिए कारणों और विस्तार के आणविक तंत्र निर्धारित करने के लिए ब्याज की इसलिए है।

ओवर-पोषण में विस्तार है, जो दो घटनाओं से नियंत्रित किया जाता है की ओर जाता है: adipocytes के लिपिड बूंदों में अत्यधिक ऊर्जा भंडारण, एक प्रक्रियाअतिवृद्धि के लिए अग्रणी (वसाकोशिका आकार में वृद्धि), और वृद्धि वसाजनन भी वसाकोशिका हाइपरप्लासिया 5 के रूप में जाना जाता है। वसाजनन multipotent mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) adipocytes में की भेदभाव की एक प्रक्रिया है। सबसे पहले, MSCs प्रतिबद्धता चरण के दौरान preadipocytes में विकसित। दूसरे, preadipocytes आगे परिपक्व और कार्यात्मक adipocytes 6 की सुविधाओं को प्राप्त करने के लिए अलग। कई प्रतिलेखन कारक जैसे जिंक उंगली प्रोटीन 423 (Zfp423) और जल्दी बी सेल कारक 1 (Ebf1) के रूप में preadipocyte निर्धारण के लिए मास्टर नियामकों, के रूप में पहचान की गई है। जबकि Zfp423 जल्दी प्रतिबद्धता लाती है, Ebf1 वसाकोशिका पूर्वज 6 की पीढ़ी के लिए आवश्यक है। टर्मिनल भेदभाव कसकर एक ट्रांसक्रिप्शनल झरना, जिससे peroxisome proliferator सक्रिय रिसेप्टर γ (PPARγ) आवश्यक प्रतिलेखन कारक 7 द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इसके अलावा कुंजी transcriptional कारकों CCAAT / बढ़ाने बाध्यकारी प्रोटीन (सी हैं/ ईबीपी) परिवार के सदस्यों (यानी, सी / EBPα, सी / EBPβ, और सी / EBPδ), kruppel-जैसे कारकों (KLFs), शिविर उत्तरदायी तत्व बाध्यकारी प्रोटीन (CREB) और जल्दी विकास प्रतिक्रिया 20 (Krox20) 6।

हाल ही में, यह दिखाया गया है कि उत्प्रेरक प्रोटीन -1 (एपी -1) परिवार वसाकोशिका भेदभाव प्रक्रिया 8,9 में शामिल है। AP-1 परिवार के एक dimeric प्रोटीन जटिल, Fos, जून और / या सक्रिय प्रतिलेखन कारक (एटीएफ) के सदस्यों से बना द्वारा बनाई है। Fos से संबंधित प्रतिजन 1 और 2 (फ्रा -1 और फ्रा -2) वसाकोशिका भेदभाव को विनियमित करने में सक्षम हैं। फ्रा-1 सी / EBPα 8 बाधा, जबकि फ्रा-2 नियंत्रण वसाकोशिका कारोबार 9 से वसाकोशिका भेदभाव impairs। फ्रा -2 जिससे न केवल वसाकोशिका भेदभाव के दौरान PPARγ2 अभिव्यक्ति के दमन से वसाकोशिका संख्या कम हो जाती है, लेकिन यह भी हाइपोक्सिया-inducible कारकों (HIFs) अभिव्यक्ति का सीधा दमन के माध्यम से वसाकोशिका apoptosis कम हो जाती है। HIF परिवार एक HETE हैrodimeric प्रतिलेखन कारक जटिल, HIF-1α, HIF-2α और HIF-1β की रचना की। Heterodimers एक ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील HIF-α प्रोटीन (HIF-1α या HIF-2α) और ऑक्सीजन असंवेदनशील HIF-1β सबयूनिट 10 से मिलकर बनता है। Normoxia के दौरान, HIF-α प्रोटीन पाली ubiquitinylated कर रहे हैं और अंत में proteasomes 11 से अपमानित कर रहे हैं। hypoxic शर्तों, विस्तार के दौरान कम से में होने वाली तहत, HIF-α प्रोटीन नहीं रह hydroxylated हैं। वे इसलिए अनिवार्यता से व्यक्त HIF-1β के साथ स्थिर और फार्म dimers हो जाते हैं। HIF प्रतिक्रिया तत्वों द्वारा नियंत्रित जीन के सक्रियण angiogenesis, चयापचय, और सूजन 12 के विनियमन में शामिल है। दरअसल, HIF-1α ग्लूकोज सहिष्णुता उत्प्रेरण, ऊर्जा व्यय और लिपिड के परिधीय उपयोग बाधा, साथ ही द्वारा लेप्टिन का स्तर और HFD प्रेरित यकृत स्टीटोसिस 13 को बढ़ाने के द्वारा शिथिलता एटी बढ़ावा देता है। इसके अलावा, HIF-1α adipocy को नियंत्रित करता हैते apoptosis में विवो और इन विट्रो 9 में।

वर्तमान प्रोटोकॉल स्थिति में अध्ययन वयस्क चूहों में वसाकोशिका homeostasis के आणविक विशेषताओं को जानने के लिए के लिए तरीके का वर्णन है। इससे पता चलता है कि कैसे apoptosis, प्रसार और vivo में इन विट्रो में adipocytes के भेदभाव हाइपोक्सिया द्वारा विनियमित किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, हम Fabp4-CreERT चूहों 9 के साथ फ्रा -2 alleles floxed ले जाने चूहों पार करके उत्पन्न फ्रा -2 के वसाकोशिका विशिष्ट विलोपन के साथ चूहों का उपयोग करें। Fabp4-CRE ईआरटी चूहों का उपयोग करके, विलोपन वसाकोशिका विशिष्ट और tamoxifen इंजेक्शन 14 से inducible है। वयस्क मॉडल के लिए, tamoxifen के इंट्रा पेरिटोनियल इंजेक्शन 6 सप्ताह की उम्र में शुरू लगातार 5 दिनों में प्रदर्शन कर रहे हैं। इस प्रकार, चूहों से पहले विश्लेषण किया जाता है 6 सप्ताह के लिए एक सामान्य आहार या उच्च वसा वाले आहार के अधीन हैं। इस अध्ययन में इस्तेमाल चूहों एक C57BL6 पृष्ठभूमि के आधार पर इस तरह के पुरुष थे एस्ट्रोजेन के रूप में महिला हार्मोन, से बचने के लिए, शरीर में वसा वितरण 15 को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। एक और आनुवंशिक पृष्ठभूमि का उपयोग करना भी लिपिड प्रबंधन 16 में तनाव संबंधी मतभेद के कारण, चयापचय phenotype बदल सकता है।

इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है ऊतक विज्ञान का उपयोग कर हाइपोक्सिया के तहत कम से विश्लेषण करने के लिए कैसे करें और कैसे immunohistochemistry और जीन की रूपरेखा का विश्लेषण करती है का उपयोग कर वसाकोशिका apoptosis, प्रसार और इन विवो में भेदभाव यों की। अध्ययन में इन विट्रो प्रयोगों, दिखा कैसे प्राथमिक वसाकोशिका भेदभाव और apoptosis हाइपोक्सिया के लिए जोखिम से बदल विश्लेषण करने के साथ पूरा हुआ।

Protocol

नैतिकता वक्तव्य: पशु जर्मन पशु कल्याण अधिनियम के दिशा निर्देशों का पालन मानकीकृत की स्थिति में रखे जाते हैं। पशु एक मानक आहार और पानी यथेच्छ खिलाया और एक 12 घंटे के दिन / रात के चक्र के साथ रखा जाता है। जानवरों के साथ सभी प्रयोगों स्थानीय आचार समिति द्वारा अधिकृत हैं।

1. वयस्क पुरुषों में वसाकोशिका homeostasis के विवो विश्लेषण में

  1. विवो में हाइपोक्सिया यों, पहले चूहों के शरीर के वजन का निर्धारण, तो 60 मिलीग्राम / ठोस pimonidazole हाइड्रोक्लोराइड के किग्रा शरीर के वजन इंट्रा-peritoneally इंजेक्षन (उदाहरण के लिए: इंजेक्षन 1.5 मिलीग्राम एक 25 ग्राम माउस में)। Pimonidazole एक प्रभावी hypoxic मार्कर, जो प्रोटीन, पेप्टाइड्स और एमिनो एसिड में thiol समूहों के साथ adducts रूपों और एक विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है।
  2. चूहों बलिदान और perigonadal वसा पैड (चित्रा 1) को हटा दें।
    1. इंजेक्शन के बाद 45 मिनट, सीओ 2 asphyxiation और बाद में ग्रीवा अव्यवस्था से चूहों बलिदान। </ Li>
    2. चूहों के अंग नीचे पिन (चित्र 1 में सचित्र) और पेरिटोनियल गुहा खुला। बाएँ और दाएँ perigonadal पेरिटोनियल गुहा के अंदर (अधिवृषणी) वसा पैड निकालें।
      नोट: फैट पैड के रूप में चित्र 1 में दिखाया पेरिटोनियल पत्रक द्वारा अधिवृषण करने के लिए बाध्य कर रहे हैं (perigonadal वसा पैड तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं)।
    3. वसा पैड से जननांगों ऊतकों को हटाने के लिए ध्यान रखना। वसा पैड वजन निर्धारित अनुपात की गणना करने के लिए: वसा पैड वजन (छ) शरीर के वजन (छ) प्रति।

आकृति 1
चित्रा 1: चूहों के पेरिटोनियल गुहा में perigonadal वसा पैड का स्थान। बलिदान के बाद वयस्क चूहों में वसा perigonadal स्थानीयकरण का चित्र। Perigonadal वसा पैड तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। वी करने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण iew।

  1. एक मात्रात्मक जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल संकलन करने के लिए, शाही सेना को अलग करने के लिए एक perigonadal वसा पैड का उपयोग करें। नोट: जब तक ऊतक संसाधित किया जाता है, -80 डिग्री सेल्सियस पर या तरल नाइट्रोजन स्थिरीकरण में शाही सेना समाधान में दुकान ऊतकों के नमूनों।
    1. वसा पैड homogenize करने के लिए, 1 मिलीलीटर guanidine आइसोथियोसाइनेट और फिनोल के एकल चरण समाधान के लिए वसा पैड जोड़ें। (30 सेकंड के ठहराव के साथ 2 बार 20 सेकंड,) 6500 rpm पर एक homogenizer में ऊतक को कुचलने के लिए चीनी मिट्टी के मोती (1.4 मिमी) युक्त ट्यूबों का प्रयोग करें।
    2. शाही सेना को अलग रूप में (Chomczynski और Sacchi 17 से एकल कदम विधि) इस प्रकार है।
      1. चरणों को अलग करने के लिए, microcentrifuge ट्यूब homogenized वसा पैड हस्तांतरण, 0.2 मिलीग्राम मात्रा क्लोरोफॉर्म जोड़ने के लिए, 15 सेकंड के लिए हिला, कमरे के तापमान पर 5 मिनट और सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 12,000 XG लिए सेते हैं। एक नया microcentrifuge ट्यूब में ऊपरी जलीय चरण (लगभग 400 μl), जो आरएनए होता है, स्थानांतरण। शामिल न करें डीएनए शामिलआईएनजी अंतरावस्था या प्रोटीन युक्त फिनोल चरण।
      2. आरएनए वेग, isopropanol के 1 मात्रा जोड़ने, मिश्रण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं (यह भी -20 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते संभव है)। 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र। isopropanol सतह पर तैरनेवाला ध्यान से निकालें। 10 मिनट के लिए 12,000 XG के सेंट्रीफ्यूज कदम के साथ 75% इथेनॉल के साथ दो बार धोएं।
      3. कमरे के तापमान पर लगभग 10 मिनट के लिए उपजी आरएनए सूखने के बाद, 50 μl में इसे भंग एच 2 ओ (RNase मुक्त)। इस सुविधा के लिए, 65 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए सेते हैं।
        नोट: -80 डिग्री सेल्सियस पर या लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में 75% इथेनॉल में शाही सेना रखें।
      4. एक 260/280 द्वारा शाही सेना की तैयारी यों (इष्टतम भागफल 1.8 और 2.2 के बीच है) और एक 260 से एकाग्रता की गणना:
        1 समीकरण
    3. डीएनए संक्रमण से बचने के लिए, पचाने आरएनए तैयारी के 1 माइक्रोग्राम10 μl की मात्रा में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1 यू DNase मैं के साथ। 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय।
      नोट: यह कदम वैकल्पिक है।
    4. आरएनए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस प्रतिक्रिया एकल असहाय सीडीएनए, मात्रात्मक पीसीआर आवेदन के लिए उपयुक्त उत्पन्न करने के लिए युक्त 1 माइक्रोग्राम आरएनए तैयारी के 10 μl का प्रयोग करें। घटकों और उनके मात्रा में 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं।
    5. एक मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए एक पीसीआर मास्टर मिश्रण का उपयोग करें। पूरे वसा पैड में चयापचय परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए, एटी समस्थिति (तालिका 2) और 3 टेबल में सूचीबद्ध पीसीआर स्थितियों में शामिल जीनों के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करें।
    6. वास्तविक समय पीसीआर डेटा विश्लेषण।
      1. आधारभूत (चित्रा 2), आम तौर पर 1 से 15 चक्र, जहां प्रतिदीप्ति संकेतों में कोई बदलाव नहीं हुआ है परिभाषित करें। वास्तविक समय पीसीआर सॉफ्टवेयर, आधारभूत प्रतिदीप्ति के लिए और आंतरिक संदर्भ डाई करने के लिए विशिष्ट प्रतिदीप्ति संकेतों normalizes ROX, जिसके परिणामस्वरूपप्राइमरों द्वारा विशिष्ट संकेतों के परिमाण, डेल्टा आर.एन. (ΔRn)।
      2. प्रवर्धन वक्र के घातीय चरण के भीतर सीमा निर्धारित करें। चौराहे दहलीज चक्र (सीटी) को परिभाषित करता है। सीटी मूल्य के आधार पर, रिश्तेदार अभिव्यक्ति (ΔCt) और गुना परिवर्तन (ΔΔCt) की गणना:
        1 समीकरण
        1 समीकरण
अंग खंड μl / प्रतिक्रिया
10x आरटी बफर 2.0
25x dNTP मिक्स (100 मिमी) 0.8
10x आरटी रैंडम प्राइमर 2.0
MultiScribe रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस 1.0
Nuclease मुक्त एच 2 ओ 4.2
1 माइक्रोग्रामआरएनए 10
कुल प्रति प्रतिक्रिया 20

तालिका 1: रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस प्रतिक्रिया एकल असहाय सीडीएनए उत्पन्न करने के लिए संबंधित मात्रा के साथ घटकों।

आधिकारिक पूरा नाम प्रतीक अनुक्रम 3'-> 5'
आगे रिवर्स
वसाजनन डेल्टा-तरह 1 Homolog (pref -1) Dlk1 GACACTCGAAGCTCA
CCTGG 		GGAAGGCTGGGACGG
GAAAT
प्रारंभिक बी सेल कारक 1 Ebf1 CCACCATCGACTACGG
सीटीटीसी 		TCCTGGTTGTTGTGGGG
CATC
जिंक उंगली प्रोटीन 423 Zfp423 GTGCCCAGGAAGAAGA
CGTA 		GGCGACGTGGATCTGA
ATCT
फैटी एसिड बाध्यकारी प्रोटीन 4 (AP2) Fabp4 TCACCTGGAAGACAGCT
CCTC 		AAGCCCACTCCCACTTC
TTTC
CCAAT / बढ़ाने बाध्यकारी प्रोटीन (सी / ईबीपी), अल्फा Cebpa AAGAGCCGCGACA
AGGC 		GTCAGCTCCAGCACCT
TGTG
CCAAT / बढ़ाने बाध्यकारी प्रोटीन (सी / ईबीपी), बीटा Cebpb TTTCGGGACTTGATGC
AATC 		CCGCAGGAACATCTTT
AAGG
शिविर उत्तरदायी तत्व बाध्यकारी प्रोटीन 1 Creb1 ACTCAGCCGGGTACT
ACCAT 		TTGCTGCCTCCCTGTT
सीटीटीसी
CCAAT / बढ़ाने बाध्यकारी प्रोटीन (सी / ईबीपी), डेल्टा Cebpd CAGCGCCTACATTGAC
TCCA 		GTTGAAGAGGTCGGCG
AAGA
Kruppel-जैसे कारक 4 Klf4 GCAGTCACAAGTCCCC
TCTC TAGTCACAAGTGTGGG
TGGC
जल्दी विकास प्रतिक्रिया 2 (Krox20) Egr2 AGGCGGTAGACAAAATC
CCAG 		GATACGGGAGATCCAG
GGGT
Peroxisome proliferator सक्रिय रिसेप्टर गामा Pparg AGAGGTCCACAGAGCTG
ATTC 		GATGCACTGCCTATGAGC
ACTT
lipogenesis Acetyl-coenzyme एक carboxylase अल्फा Acaca TGGGGACCTTGTCTTCA
TCAT 		ATGGGCGGAATGGTCTC
TTTC
फैटी एसिड synthase Fasn ACATCCTAGGCATCC
बेहूदा 		CCGAGTTGAGCTGGGT
Tagg
Stearoyl-Coenzyme एक desaturase 1 Scd1 CGGGATTGAATGTTCTTG
TCGT 		TTCTTGCGATACACTCTG
GTGC
lipolysis Patatin-तरह phospholipase डोमेन containiएनजी 2 Pnpla2 AAGGACCTGATGACCA
CCCT 		CCAACAAGCGGATGGT
GAAG
फैटी एसिड तेज लेपोप्रोटीन lipase LPL GTATCGGGCCCAGCAA
CATTATCC 		GCCTTGCTGGGGTTTTC
TTCATTC
CD36 प्रतिजन Cd36 GTCTTCCCAATAAGCATGT
CTCC 		ATGGGCTGTGATCGGA
ACTG
हाइपोक्सिया हाइपोक्सिया inducible कारक 1, अल्फा सबयूनिट Hif1a CCTGCACTGAATCAAGAG
GTGC 		CCATCAGAAGGACTTGCT
GGCT
Endothelial पीए डोमेन प्रोटीन 1 (के रूप में भी जाना जाता है: HIF-2alpha) Epas1 CAAGCTGAAGCTAAAG
CGGC 		TTGGGTGAATTCATCG
gggg
वॉन Hippel-Lindau ट्यूमर शमन VHL ACCGAGGTCATCTTTG
GCTC 		TTCCGCACACTTGGGT
AGTC
Aryl हाइड्रोकार्बन रिसेप्टर परमाणु translocator (के रूप में भी जाना जाता है: HIF-1beta) ARNT TGGGTCATCTTCTCGC
GGTT 		TGTCCTATCTGAGCAT
CGTG

तालिका 2: संबंधित वसाकोशिका homeostasis का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों के अनुक्रम के साथ जीन की सूची।

चरण तापमान (डिग्री सेल्सियस) समय (मिनट: सेकंड)
पोलीमरेज़ सक्रियण पकड़ 95 10:00
पीसीआर 40 चक्रों Denaturize 95 0:15
एनीलिंग / एक्सटेंशन 60 1:00
पिघलने वक्र 60 करने के लिए 95 0.5 डिग्री सेल्सियस / सेक

तालिका 3: वास्तविक समय पीसीआर की स्थिति।

चित्र 2
चित्रा 2:। वास्तविक समय पीसीआर प्रवर्धन की अवस्था के लक्षण यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. वसाकोशिका homeostasis के ऊतकीय विश्लेषण करने के लिए, दूसरी perigonadal वसा पैड का उपयोग करें। ऊतक सूखना मत करो!
    1. पीबीएस बफर formaldehyde रात भर, आयल में एम्बेड 3.7% में वसा पैड फिक्स (18 के रूप में कहीं वर्णित निर्देशों का पालन) और 2-5 माइक्रोन मोटी वर्गों (अधिकतम 5 माइक्रोन) में एम्बेडेड ऊतक में कटौती।
    2. hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला के बाद एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप में क्षेत्र और वसाकोशिका आकार के अनुसार adipocytes की संख्या का निर्धारण: <राजभाषा>
    3. xylene में 5 मिनट के लिए 3 बार धोने और 100% इथेनॉल में 2 मिनट और 96% इथेनॉल में 2 मिनट के लिए 2 बार के लिए खंड rehydrate 2 बार की Deparaffinize वर्गों। अंत में, 5 मिनट के लिए आसुत एच 2 ओ में खंड धो लें।
    4. आसुत एच 2 ओ के साथ 5 कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए और 5 मिनट के लिए एच 2 ओ में धो: hematoxylin के साथ दाग, 1 पतला। Eosin समाधान के साथ दाग 30 सेकंड के लिए (20 मिलीलीटर 5% eosin वाई / 210 मिलीलीटर एच 2 ओ / 25 μl हिमनदों एसिटिक एसिड आसुत) और 5 मिनट के लिए एच 2 ओ के साथ फिर से धो लें।
    5. 5 मिनट के लिए 2 मिनट, और xylene के लिए 96% इथेनॉल और 100% इथेनॉल का उपयोग कर 2 बार प्रत्येक वर्गों निर्जलीकरण 3 बार। निर्जल बढ़ते एजेंट के साथ वर्गों माउंट।
    6. एक उज्ज्वल क्षेत्र खुर्दबीन के नीचे वर्गों का मूल्यांकन। कैसे ImageJ 1.48v 19 के साथ adipocytes का विश्लेषण करने का एक प्रतिनिधि उदाहरण छवि में दिखाया गया है। 3: क्षेत्र के प्रति कोशिकाओं (माइक्रोन 2), की संख्या सेल क्षेत्र (एक्स 10 3 माइक्रोन 2
    7. ImageJ 1.48v के साथ खंड के चित्र खोलें। छवि के मापदंडों लंबाई की एक इकाई के बजाय पिक्सल में संकेत कर रहे हैं, तो पैमाने को समायोजित।
    8. उपकरण पट्टी में * सीधे लाइन * का चयन करें और पैमाने पर पट्टी के संदर्भ द्वारा एक ज्ञात दूरी के लिए लाइन को समायोजित। विश्लेषण करने के लिए जाओ -> सेट स्केल लाइन की दूरी पिक्सेल में दिखाया गया है;। ज्ञात दूरी और लंबाई की इकाई, जैसे, माइक्रोन जोड़ें। ठीक से पुष्टि करें। तस्वीर का आकार और मापदंडों का विश्लेषण लंबाई की इकाई को देखते हुए में संकेत कर रहे हैं।
    9. adipocytes के मापदंडों का निर्धारण करने के लिए, सीमा समायोजित करें। छवि के लिए जाने -> समायोजित करें -> दहलीज थ्रेसहोल्ड खिड़की खोलने के लिए। निम्नलिखित सेटिंग्स का चयन करें: थ्रेशोल्डिंग विधि: चूक; दहलीज रंग: बी और डब्ल्यू, रंग अंतरिक्ष: HSB। तस्वीर अब काले और सफेद में दिखाया गया है। समायोजितचमक सफेद adipocytes स्पष्ट करने और काले कहनेवाला रिक्त स्थान को बंद करने के लिए, छवि में के रूप में। 3 बी।
    10. उपकरण पट्टी में * बहु बिंदु * चयन के साथ प्रति माइक्रोन 2 (चित्रा 3E) वसाकोशिका की संख्या की गणना और उनकी गिनती के लिए प्रत्येक कोशिका के निशान।
    11. वसाकोशिका आकार निर्धारित करने के लिए, उपकरण पट्टी में फिर से चयन * सीधे लाइन * और एक वसाकोशिका (चित्रा 3 सी) के व्यास आकर्षित। विश्लेषण करने के लिए जाओ -> उपाय और एक नया विंडो दिखाई देगा, माइक्रोन व्यास की लंबाई के साथ।
    12. वसाकोशिका क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए, चयन * छड़ी (अनुरेखण) उपकरण * और वसाकोशिका अंदर क्लिक करें। वसाकोशिका की भीतरी दीवार लाल (चित्रा 3 डी) में चयनित है। विश्लेषण करने के लिए जाओ -> उपाय और एक नया विंडो दिखाई देगा, माइक्रोन 2 में इस वसाकोशिका के क्षेत्र के साथ।
  • immunohist के लिएइस प्रकार के रूप ochemistry, के लिए एंटीबॉडी और TdT की मध्यस्थता dUTP बायोटिन निक अंत लेबलिंग (TUNEL) धुंधला अनुभाग को तैयार:
    1. xylene में 5 मिनट के लिए 3 बार धोने और 100% इथेनॉल में 2 मिनट और 96% इथेनॉल में 2 मिनट के लिए 2 बार के लिए खंड rehydrate 2 बार की Deparaffinize वर्गों। अंत में, आसुत एच 2 ओ में खंड धोने
    2. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए, proteinase कश्मीर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ऊतक अनुभाग को पचाने के काम समाधान (10 मिमी Tris / एचसीएल, पीएच 7.4-8 में 20 माइक्रोग्राम / एमएल) और पीबीएस के साथ कुल्ला।
  • गीला कक्षों में एंटीबॉडी धुंधला प्रदर्शन करना:
    1. अंतर्जात peroxidase को ब्लॉक करने के लिए, 10 मिनट के लिए पीबीएस में 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग बाद में पीबीएस में 5 मिनट के लिए 2 बार धोने के साथ। एंटीबॉडी के unspecific बाध्यकारी ब्लॉक करने के लिए, पीबीएस में 10% सीरम का उपयोग करें। माध्यमिक एंटीबॉडी के मेजबान के सीरम का प्रयोग करें, इस मामले में बकरी।
    2. धुंधला के लिए, apoptosis, प्रसार और हाइपोक्सिया पता लगाने के लिए एंटीबॉडी (का उपयोग
    3. बढ़ाने के लिए संकेत एक biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें, कमजोर पड़ने के साथ 5 तालिका में सूचीबद्ध हैं। हाइपोक्सिया का पता लगाने के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एचआरपी संयुग्मित खरगोश विरोधी FITC का उपयोग करें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। वर्गों 2 बार पीबीएस के साथ 5 मिनट धो लें।
      नोट: FITC-MAb1 साथ हाइपोक्सिया धुंधला के लिए, कदम 1.4.4.4 को छोड़) और कदम 1.4.4.5 के साथ जारी रखने के लिए)।
    4. प्रत्येक स्लाइड के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए biotinylated peroxidase h 50 μl के साथ 50 μl avidin समाधान (इस विधि के रूप में भी avidin / बायोटिन एबीसी जटिल तैयार करने के लिए कहा जाता है) पूर्व सेते हैं और फिर एक और 45 मिनट के लिए वर्गों को जोड़ने। पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 2 बार धोएं।
    5. peroxidase सब्सट्रेट समाधान में वर्गों सेते हैं जब तक धुंधला अधिक तीव्र हो (5 से 10 मिनट के बीच) है। 5 मिनट के लिए धो आसुत साथएच 2 ओ
    6. आसुत एच 2 ओ के साथ 5 कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए और 5 मिनट के लिए एच 2 ओ में धो: counterstaining के लिए, hematoxylin के साथ दाग पतला 1।
    7. 5 मिनट के लिए 2 मिनट, और xylene के लिए 96% इथेनॉल और 100% इथेनॉल में वर्गों निर्जलीकरण 2 बार प्रत्येक 3 बार। coverslips और निर्जल बढ़ते एजेंट के साथ वर्गों सील। एक उज्ज्वल क्षेत्र खुर्दबीन के नीचे वर्गों का मूल्यांकन।
  • TUNEL परख द्वारा apoptosis निर्धारण करते हैं और निर्माता के निर्देशों का पालन करें:
    1. 450 μl लेबल समाधान में 50 μl एंजाइम समाधान जोड़ें। तब histologic वर्गों पर 50 μl TUNEL प्रतिक्रिया मिश्रण लागू करते हैं और अंधेरे में एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं। वर्गों 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3 बार धोएं और प्रतिदीप्ति DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining के लिए सहित बढ़ते मध्यम के साथ माउंट।
    2. 100 गुना Magnificat के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के अंतर्गत खंड का मूल्यांकन आयन। Fluorescein की माप के लिए 488 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें और 515-565 एनएम (हरे रंग की लेजर) के बीच का पता लगाने; DAPI बारे में 360 एनएम पर उत्तेजित और जब डीएनए (नीले लेजर) के लिए बाध्य 460 एनएम के बारे में उत्सर्जन करता है।
    3. DAPI और fluorescein के ओवरले यों:
      1 समीकरण

    • चित्र तीन
    चित्रा 3:। वसा पैड वर्गों में वसाकोशिका विशेषताओं का विश्लेषण एक उच्च वसा वाले आहार (HFD) या सामान्य आहार (एनडी) एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ साथ इलाज नर चूहों के perigonadal वसा पैड की धारा चित्र (एक); , क्षेत्र (डी) और प्रति मिमी 2 (ई) वसाकोशिका सेल नंबर ImageJ 1.48v साथ मात्रा निर्धारित कर रहे हैं, सीमा काले और सफेद (ख) और वसाकोशिका आकार (ग लंबाई) में निकाला जाता है।च = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    शेयर एकाग्रता घोला
    apoptosis Cleaved कस्पासे 3 (Asp175) (5A1E) खरगोश एमएबी 1: 2,000
    प्रसार शुद्ध माउस एंटी ह्यूमन Ki-67 क्लोन B56 (Ruo) 1:50
    हाइपोक्सिया HIF-1 अल्फा एंटीबॉडी 1: 100
    FITC-MAb1 1: 100

    सारणी 4: संबंधित एटी वर्गों के immunohistological धुंधला के लिए इस्तेमाल कमजोर पड़ने के साथ एंटीबॉडी।

    एंटीबॉडी घोला
    biotinylated विरोधीमाउस आईजीजी (एच + L) 1: 200
    biotinylated विरोधी माउस आईजीजी (एच + L) 1: 200
    एचआरपी conjugates खरगोश विरोधी FITC 1: 100

    तालिका 5: immunohistological धुंधला के लिए इस्तेमाल कमजोर पड़ने के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी।

    2. वसाकोशिका homeostasis के इन विट्रो विश्लेषण में hypoxia से प्रभावित

    1. चूहों बलिदान और चमड़े के नीचे वसा ऊतकों को हटा दें।
      1. सीओ 2 asphyxiation और बाद में ग्रीवा अव्यवस्था से चूहों बलिदान।
      2. चूहों के अंग नीचे पिन के रूप में 4 चित्र में सचित्र। ऊपरी पैर, कमर और पार्श्व से त्वचा को अलग करें और चित्रा 4 में के रूप में यह नीचे पिन सुइयों के साथ। तब चमड़े के नीचे वसा ऊतकों, जो के आधार पर पीछे स्थित है को दूर पिछले पैरों, वंक्षण आसपास के लिम्फ नोड्स (के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, छोड़ दिया: वसा पैडतीर द्वारा संकेत कर रहा है; सही: वंक्षण लिम्फ नोड तीर द्वारा संकेत)।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: वसा पैड का स्थान। वसा पैड का चित्र; बाएँ तीर वसा पैड से संकेत मिलता है और सही तीर वंक्षण लिम्फ नोड इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    1. पृथक वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (ADSC) के रूप में पहले 20 में वर्णित है।
    2. बीज ADSC 4000 कोशिकाओं / 2 सेमी Dulbecco बार में ईगल संशोधित मध्यम हाम F-12 10% सामान्य बछड़ा सीरम, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.5% Amphotericin बी, 16 माइक्रोन बायोटिन, 18 माइक्रोन के pantothenic एसिड और 100 माइक्रोन के एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक और संस्कृति बढ़ने के आसपास 70 से 80 संगम% है, जो संस्कृति के 4 से 6 दिनों के बाद तक पहुँच जाता है।
    3. Adipogenic भेदभाव प्रेरित।
      1. उपचार trypsin द्वारा सतह से पक्षपाती ADSC निकालें।
        1. मध्यम निकालें, पीबीएस के साथ धोने और 0.025% trypsin समाधान जोड़ने के 2 मिनट के लिए (37 डिग्री सेल्सियस के लिए छोड़ देते हैं) (जब तक कोशिकाओं की सतह से अलग)। इसके तत्काल बाद मध्यम जोड़ने और कोशिकाओं धो लें।
      2. एक Neubauer कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
        1. Neubauer चैम्बर के मध्य क्षेत्र पर गिलास को कवर रखो। सेल निलंबन 01:10 पतला और सेल निलंबन पतला 10 μl के साथ चैम्बर लोड। 4 कोनों पर स्थित चौराहों, प्रत्येक 16 छोटे वर्गों से बना में कोशिकाओं की गणना। मिलीलीटर प्रति सेल नंबर की गणना:
          1 समीकरण
      3. बीज ADSC 12 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में (बिंदु 2.2 में वर्णित के रूप में) और संस्कृति बढ़ने के आसपास 70 से 80% संगम (4 से 6 दिन बाद तक पहुँच)।
      4. adipoge प्रेरित5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, 1 माइक्रोन dexamethasone और 5 माइक्रोन के संस्कृतियों के लिए 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) जोड़कर एनआईसी भेदभाव। मध्यम नवीनीकृत हर 2 दिन। कोशिकाओं को पूरी तरह 7 दिनों के बाद विभेदित किया जाएगा।
    4. adipogenic भेदभाव, तेल लाल हे, जो परिपक्व adipocytes के ट्राइग्लिसराइड्स के धब्बे के साथ दाग का विश्लेषण करने के लिए।
      नोट: कार्य एक धूआं हुड के तहत किया जाना चाहिए!
      1. मध्यम निकालें, पीबीएस के साथ धीरे adipocytes धोने और 2 मिलीलीटर 10% formalin के साथ 60 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक।
      2. तेल लाल हे धुंधला समाधान तैयार करते हैं, आसुत लाल तेल हे शेयर समाधान (300 मिलीग्राम लाल तेल हे पाउडर 100 मिलीलीटर 99% isopropanol में भंग) 2 भागों के साथ एच 2 ओ की 3 भागों मिश्रण और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। एक 0.2 माइक्रोन इंजेक्शन फिल्टर के माध्यम से तेल लाल हे काम कर समाधान फ़िल्टर।
        नोट: काम समाधान 2 घंटे के लिए स्थिर है।
      3. तेल लाल हे धुंधला के लिए, formalin हटाने एच 2 के साथ adipocytes धोने
      4. 100 गुना बढ़ाई के साथ एक चरण विपरीत खुर्दबीन के नीचे प्लेटों का मूल्यांकन। adipocytes के लिपिड लाल दिखाई देगी और नाभिक नीले रंग में दिखाई देगा।
    5. वैकल्पिक कदम: shRNA साथ अभिकर्मक द्वारा ब्याज की जीन चुप्पी।
      1. मध्यम बदलें और सीरम मुक्त माध्यम जोड़ें।
      2. adipocytes के अभिकर्मक के लिए, lipofection का उपयोग करें। निर्माता के निर्देशों का पालन करें और 12 अच्छी तरह से ऊतक प्लेटों प्रति 1 माइक्रोग्राम shRNA का उपयोग करें। लिपिड डीएनए परिसर के अलावा के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए adipocytes सेते हैं।
    6. हाइपोक्सिया के अधीन adipocytes का विश्लेषण करने के लिए, hypoxic शर्तों के तहत कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए एक hypoxic काम स्टेशन या hypoxic इनक्यूबेटर का उपयोग करें। अध्ययन के आधार पर, हाइपोक्सिया ग0.5, 1 या 2% ऑक्सीजन हो ould।
      1. FITC लेबल Annexin वी और बाद फ्लो का विश्लेषण द्वारा apoptosis का विश्लेषण।
        1. एक अतिरिक्त नरम सेल खुरचनी के साथ adipocytes इकट्ठा, पीबीएस के साथ धोने और 100 μl Annexin वी बाध्यकारी बफर करने के लिए 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं को जोड़ने (10 मिमी HEPES / NaOH, पीएच 7.4, 140 मिमी NaCl, 2.5 मिमी 2 CaCl)। Annexin वी FITC की राशि निर्माता से सिफारिश जोड़ें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
        2. माप प्रवाह cytometry के लिए, Annexin वी बाध्यकारी बफर μl 200 जोड़ सकते हैं और परमाणु counterstain के 1 माइक्रोन। हरे और बैंगनी चैनल में प्रतिदीप्ति का निर्धारण करते हैं। (चित्रा 5) कोशिकाओं apoptotic कोशिकाओं के रूप में परिभाषित कर रहे हैं - Annexin वी / परमाणु counterstain + कोशिकाओं माध्यमिक परिगलित और Annexin वी / परमाणु counterstain के रूप में परिभाषित कर रहे हैं।
      2. मात्रात्मक कमी वाली स्थिति के तहत homeostasis निर्धारित करने के लिए वसाकोशिका आरएनए के स्तर का विश्लेषण।
        1. जोड़ना1 मिलीलीटर guanidine आइसोथियोसाइनेट और प्रत्येक के लिए फिनोल के एकल चरण समाधान अच्छी तरह से और 1.3.5.2 के लिए शाही सेना को अलग [Chomczynski और Sacchi 17 से एकल कदम विधि (कदम 1.3.2) का उपयोग] और कदम 1.3.2.1 के रूप में आगे बढ़ना)) ।

    चित्रा 5
    चित्रा 5: प्रवाह cytometry द्वारा वसाकोशिका apoptosis विश्लेषण। के लिए Annexin वी FITC और adipocytes के TO-प्रो -3 धुंधला हो जाना। FACS के डॉट साजिश प्रस्तुतियों कृपया यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

    Representative Results

    हम कैसे के उदाहरण का उपयोग vivo में इन विट्रो में वसाकोशिका homeostasis निर्धारित करने के लिए दिखाने के फ्रा -2 सीए / FL जंगली प्रकार littermates की तुलना में Fabp4-CreERT चूहों। हमारी प्रोटोकॉल को परिभाषित करता है के रूप में वृद्धि हुई वसाकोशिका apoptosis ने संकेत दिया है कि कैसे हाइपोक्सिया की वृद्धि हुई HIF अभिव्यक्ति वसाकोशिका रोग के साथ जोड़ा जाता है।

    वृद्धि वसाकोशिका आकार और उच्च वसा वाले आहार में क्षेत्र (HFD) इलाज चूहों

    ओवर-पोषण, अन्य कारकों के बीच, वसाकोशिका अतिवृद्धि, लिपिड बूंदों में अत्यधिक ऊर्जा भंडारण की वजह से में यह परिणाम है। वसाकोशिका आकार और क्षेत्र अतिवृद्धि का सूचक है। सामान्य से वसा पैड के वर्गों (एन डी, चित्रा 6A) और उच्च वसा वाले आहार (HFD, चित्रा 6B) चूहों के साथ ही वसाकोशिका आकार और क्षेत्र के quantifications स्पष्ट रूप से दिखाने वसाकोशिका 6 सप्ताह के बाद अतिवृद्धिHFD, के एस जो HFD इलाज चूहों (चित्रा 6C और डी) में वृद्धि हुई वसाकोशिका आकार से संकेत दिया है।

    वयस्क की वसा ऊतकों (एटी) में वृद्धि की हाइपोक्सिया फ्रा -2 सीए / FL Fabp4-CreERT चूहों में वृद्धि हुई HIF-1α स्तर और वसाकोशिका apoptosis की ओर जाता है

    एटी में हाइपोक्सिया के vivo स्थिति निर्धारित करने के लिए फ्रा -2 सीए / FL Fabp4-CreERT चूहों के बाद 12 सप्ताह की उम्र में फ्रा -2 विलोपन 6 सप्ताह का विश्लेषण किया और जंगली प्रकार littermates के साथ तुलना कर रहे हैं। Pimonidazole intraperitoneally एक प्रभावी हाइपोक्सिया मार्कर के रूप में चूहों को दिलाई है; यह nontoxic और एटी में वितरित करने के लिए सक्षम है। विवो में से कम में hypoxic adipocytes प्रतिरक्षाऊतकरसायन एंटीबॉडी धुंधला (चित्रा 7A) द्वारा परिभाषित कर रहे हैं। इसके अलावा, चूहों में एटी की वृद्धि की hypoxic स्थिति में वृद्धि हुई HIF-1α सकारात्मक ए डी आई पी के साथ हैocytes रूप immunohistochemical धुंधला चित्रा 7b), जो HIF-1α अभिव्यक्ति के स्तर और अपने लक्ष्य जीन 9 की मात्रा का ठहराव द्वारा पुष्टि की है ने संकेत दिया। इसके अतिरिक्त, फ्रा -2 से एटी वर्गों के TUNEL के धुंधला FL / FL Fabp4-CreERT चूहों और नियंत्रण littermates (चित्रा 7C) से पता चलता है कि वृद्धि की वसाकोशिका apoptosis हाइपोक्सिया और HIF-1α अभिव्यक्ति की उपस्थिति के साथ जोड़ा जाता है।

    हाइपोक्सिया प्रेरित वसाकोशिका apoptosis के माध्यम से प्राथमिक adipocytes में HIF-1α अभिव्यक्ति में वृद्धि

    इन विट्रो में वसाकोशिका apoptosis का विश्लेषण करने के लिए, हम वसा पैड से उत्पन्न adipocytes के रूप में कहीं 20 में वर्णित का उपयोग करें। जैसी कि उम्मीद थी, adipocytes में HIF-1α अभिव्यक्ति हाइपोक्सिया (चित्रा 8A) के 24 घंटे के बाद बढ़ जाती है। आगे HIF-1α गतिविधियों, HIF लक्ष्य की शाही सेना के स्तर के विश्लेषण करने के लिएऐसे INOS (inducible नाइट्रिक ऑक्साइड synthase) के रूप में जीन qPCR द्वारा मात्रा रहे हैं। चित्रा 8b पता चलता है कि hypoxic शर्तों के तहत HIF-1α की वृद्धि की अभिव्यक्ति INOS mRNA स्तर में वृद्धि हुई की ओर जाता है। चूंकि हम पहले से ही विवो (चित्रा 8) कि adipocytes में HIF-1α अभिव्यक्ति वृद्धि की वृद्धि हुई वसाकोशिका apoptosis के साथ संबद्ध में दिखाया गया है, apoptosis भी इन विट्रो संस्कृतियों में Annexin वी धुंधला द्वारा hypoxic शर्तों के तहत मात्रा निर्धारित है। इन विवो डेटा (चित्रा 7) के अनुरूप, एक वृद्धि HIF-1α स्तर कमी वाली स्थिति से प्रेरित वृद्धि हुई वसाकोशिका apoptosis के साथ है (चित्रा 8B)। इसके अलावा, कि hypoxic प्रेरित apoptosis साबित करने के लिए HIF-निर्भर है; HIF-1α या HIF-2α जंगली प्रकार या फ्रा -2 चूहों की कमी से निकाली गई adipocytes में शाही सेना के हस्तक्षेप से खामोश है। बढ़ी हुई वसाकोशिका apoptosis HIF-1α या HIF-2α मुंह बंद करने की बहाली के रूप में Annexin द्वारा दिखाए चित्रा 8b में वी धुंधला हो जाना, साबित करना है कि हाइपोक्सिया सेंसर HIF-α वसाकोशिका apoptosis नियंत्रित करता है।

    चित्रा 6
    चित्रा 6: वृद्धि वसाकोशिका आकार और उच्च वसा वाले आहार (HFD) चूहों में इस इलाके पुरुष जंगली प्रकार सामान्य आहार (एनडी) के साथ खिलाया चूहों के perigonadal वसा पैड से वर्गों (क, ख) एच एंड ई धुंधला (क) या उच्च। वसा आहार (HFD) (ख) 6 सप्ताह के लिए। बार्स 500 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। (ग, घ) (ख) 6 सप्ताह के लिए एन डी (क) या HFD के साथ खिलाया प्रकार के जंगली चूहों के perigonadal वसा पैड से वसाकोशिका आकार (सी) और क्षेत्र (घ) के quantifications। एन = 10. डेटा ± SEM के रूप में मतलब मूल्यों को दिखाया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण Student's टी -Test उपयोग किया गया था। *** पी <0.0001।: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

    चित्रा 7
    चित्रा 7: वृद्धि HIF-1α स्तर और apoptosis वयस्क की फ्रा -2 सीए / FL Fabp4-CreERT चूहों adipocytes में। हाइपोक्सिया (क) और HIF-1α (ख) पुरुष फ्रा -2 सीए / FL Fabp4-creERT चूहों और पुरुष नियंत्रण littermates 6 सप्ताह के बाद tamoxifen के इंजेक्शन से कम में धुंधला हो जाना। बढ़ाई 20X, 40X डालें। काला तीर hypoxic क्षेत्रों और HIF-1α सकारात्मक कोशिकाओं से संकेत मिलता है। (ग) में TUNEL के धुंधला फ्रा -2 सीए / FL Fabp4-CreERT चूहों और नियंत्रण littermates tamoxifen के इंजेक्शन के बाद 6 सप्ताह में। बढ़ाई 20X, 40X डालें। काला तीर TUNEL पॉजिटिव कोशिकाओं से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा लूथर एट से संशोधित किया गया हैअल। 9। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    आंकड़ा 8
    8 चित्रा:। हाइपोक्सिया से प्रेरित प्राथमिक adipocytes में वृद्धि HIF-1α अभिव्यक्ति और वसाकोशिका apoptosis (क) वास्तविक समय पीसीआर HIF-1α और hypoxic कक्षों में रखा प्राथमिक adipocytes में HIFs लक्ष्य INOS mRNA स्तर के विश्लेषण के संकेत समय बिंदुओं पर विश्लेषण किया। (ख) से अलग प्राथमिक adipocytes में Annexin वी FACS धुंधला द्वारा apoptosis की मात्रा फ्रा -2 सीए / FL Fabp4-CreERT चूहों या जंगली प्रकार नियंत्रण श नियंत्रण या HIF-1α या HIF-2α के खिलाफ श प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और हाइपोक्सिया के अंतर्गत रखा 24 घंटे के लिए (1% 2 हे)। यह आंकड़ा लूथर एट अल से संशोधित किया गया है। टी परीक्षण का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था दिखाए जाते हैं। * पी <0.05 और ** पी <0.01 महत्वपूर्ण के रूप में स्वीकार कर रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    Discussion

    Adipocytes, उनके आकार, संख्या और क्षेत्र से phenotypically विशेषता है की वजह से वसाकोशिका हाइपरप्लासिया और अतिवृद्धि, अत्यधिक ऊर्जा भंडारण से प्रेरित खुलासा ओवर-पोषण 5। इन घटनाओं के फैटी एसिड अनियंत्रण और बाद में उपापचयी सिंड्रोम के लिए अग्रणी भी संरक्षित metabolisms, जो भी "स्वस्थ" वसा विस्तार में जाना जाता है के साथ वृद्धि हुई वसा द्रव्यमान का राज्य हैं। उदाहरण के लिए, Kusminski एट अल। 21 से पता चला है कि बड़े पैमाने पर वसा विस्तार के साथ चूहों पाचन स्वस्थ रहने, सुझाव है कि वसा विस्तार जरूरी उपापचयी सिंड्रोम से जुड़ा हुआ नहीं है और ध्यान से adipocytes की विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। वसा ऊतकों (एटी) शरीर के चयापचय के नियमन में एक निर्णायक भूमिका निभाता है। पर सबसे बड़ी एंडोक्राइन अंग है कि dyslipidemia, atherosclerosis, hyperinsulinemia और hyperglycemia 3 को प्रभावित कर सकता है। homeostasis और आणविक मीटर की ऊंचाई पर मूल्यांकनयह विनियमित करने echanisms चयापचय प्रणाली के विकारों का एक बेहतर समझ अनुमति दे सकता है। इसलिए, तंत्र वसाकोशिका भेदभाव को विनियमित करने unraveling, वसाकोशिका आकार और वसा पैड बड़े पैमाने पर मोटापा विकारों के लिए नए चिकित्सीय उपचार विकसित करने के लिए मदद मिलेगी। Vivo में इन विट्रो तरीकों में उपयोग करना, यह वसाकोशिका भेदभाव और गतिविधि पर खाद्य और जीन अभिव्यक्ति प्रभावों की भूमिका निर्धारित करने के लिए संभव है। एटी homeostasis निर्धारित करने के लिए, के रूप में सुझाव दिया द्वारा हमारे प्रोटोकॉल ग्लूकोज और इंसुलिन चयापचय प्रतिक्रिया 22-24 का विश्लेषण करने के रूप में महत्वपूर्ण है वसाकोशिका भेदभाव, प्रसार और apoptosis के बीच संतुलन का निर्धारण।

    अभिव्यक्ति की रूपरेखा प्राथमिक adipocytes में वसाजनन, lipogenesis, lipolysis, फैटी एसिड तेज, हाइपोक्सिया, apoptosis और प्रसार में शामिल जीनों का विश्लेषण करती है और आंत एटी वसाकोशिका homeostasis और उनके संभावित रोग पर एक सिंहावलोकन प्राप्त करने के लिए एक उच्च throughput विधि है।दिलचस्प उम्मीदवारों आगे पश्चिमी धब्बा या immunohistological धुंधला द्वारा प्रोटीन के स्तर पर विश्लेषण किया जाना चाहिए। भोंडा जाती रंगों का उपयोग वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली के माध्यम से इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, सीडीएनए की सांद्रता 1 से 10 एनजी को लेकर और 50 से 900 एनएम को लेकर इष्टतम प्राइमर सांद्रता अविशिष्ट प्रवर्धन कम करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण घटक प्राइमरों कर रहे हैं; प्रत्येक रन के लिए, पिघलने घटता सख्ती विशिष्टता को सुनिश्चित करने और प्राइमर dimers के गठन के बाहर करने के लिए नियंत्रित किया जा करने की जरूरत है। इसलिए, साथ सीडीएनए के बजाय एच 2 ओ एक नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग की सिफारिश की है। इसके अलावा, वाणिज्यिक उपलब्ध भोंडा जाती रंगों मास्टर घोला जा सकता है कि एक निष्क्रिय संदर्भ डाई (जैसे ROX) के रूप में शामिल एक आंतरिक संदर्भ संकेत प्रदान करने के रूप में प्रदान की जाती हैं। सीडीएनए संकेत अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से संकेत उतार चढ़ाव को दूर करने के ROX संकेतों के डेटा विश्लेषण के दौरान सामान्यीकृत है। एक और बात के क्रम में एक goo स्थापित करने के लिए विचार किया जानाडी qPCR प्रणाली गृह व्यवस्था जीन की पसंद है। हर हालत के लिए, कई गृह व्यवस्था जीन, उपयोग किया जाता है जैसे, HPRT, β-actin, GAPDH, β-2-मिलीग्राम या HSP90।

    HIF प्रोटीन की कमी वाली स्थिति से स्थिर न केवल adipocytes अस्तित्व को निर्धारित मास्टर नियामकों, लेकिन यह भी जैसे ग्लूकोज, इंसुलिन सहिष्णुता और लिपिड चयापचय 11,25,26 के रूप में चयापचय में परिवर्तन, कर रहे हैं। वसा पैड में hypoxic क्षेत्रों का पता लगाने के लिए, HIF-1α immunohistochemistry द्वारा वर्गों में चुना गया है। चूंकि HIF प्रोटीन तेजी से normoxic शर्तों के तहत 5 से 10 मिनट के भीतर अपमानित कर रहे हैं, प्रक्रिया और histological विश्लेषण के लिए वसा पैड के निर्धारण कसकर विलंबता समय से बचने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए। इसलिए, न केवल HIF धुंधला के माध्यम से हाइपोक्सिया सुनिश्चित करने के लिए, pimonidazole में hypoxic क्षेत्रों का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। के रूप में यह पहले से ही हड्डियों 27 में दिखाया गया था Pimonidazole, ऊतकों में वितरित करने के लिए सक्षम है, और प्रभावी ढंग से विशेष hypoxic कोशिकाओं में thiol युक्त प्रोटीन है, जो आगे विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी 28 से histological वर्गों में पता चला है के बंधन से hypoxic क्षेत्रों को चिह्नित। हालांकि, अन्य मार्करों और तरीकों हाइपोक्सिया मार्ग का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, prolyl hydroxylase (पीएचडी) एंजाइम, जो normoxia के तहत प्रोलाइन अवशेषों की hydroxylation प्रेरित है, साथ ही वॉन Hippel-Lindau (VHL) प्रोटीन है, जो hydroxylated prolines को समझते हैं और पाली ubiquitination प्रेरित proteasomal HIF मध्यस्थता करने की भागीदारी गिरावट, मार्ग 29,30 की एक पूरी अवलोकन के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए। इसके अलावा, HIFs की सर्वव्यापक का पता लगाने के भी प्रोटीन स्थिरता और गिरावट है कि 31,32 बदल किया जा सकता का निर्धारण होता है।

    इसके अलावा, Ki67 द्वारा प्रसार और TUNEL धुंधला द्वारा apoptosis एटी histological वर्गों का धुंधला के माध्यम से विवो में निर्धारित कर रहे हैं। Ki67 और एक से प्रसार की मात्राप्रवाह cytometry विश्लेषण के माध्यम से TUNEL या Annexin वी धुंधला द्वारा poptosis भी 33 से बाहर किया जाता है। प्रसार निश्चित रूप से इस तरह के वसाकोशिका सेल चक्र है, जो Ki67 सकारात्मक कोशिकाओं की माप से संबोधित नहीं है के विश्लेषण के रूप में अन्य तकनीकों से मापा जा सकता है। इसके अलावा, TUNEL द्वारा apoptosis अध्ययन FACS Annexin वी और टॉप-पीआर 3 जो गल जाना बनाम apoptosis कोशिका मृत्यु की प्रक्रिया के स्तरों का निर्धारण करेगा के विश्लेषण द्वारा पूरा किया जा सकता। Apoptosis कोशिका मृत्यु का कार्यक्रम है, जो homeostasis के लिए महत्वपूर्ण है के लिए एक बुनियादी प्रक्रिया है। दरअसल, वसाकोशिका apoptosis के अनियंत्रण मोटापे से योगदान की प्रक्रिया में पहले से फंसाया और 34 lipodystrophy कर दिया गया है। इसके अलावा, 2011 में, Keuper एट अल। वसाकोशिका apoptosis से जुड़े वसा ऊतकों में सूजन। वे कहते हैं कि मैक्रोफेज preadipocytes और adipocytes, जो बारी में मैक्रोफेज को आकर्षित करने में प्रेरित apoptosis दिखाया। मैक्रोफेज की भर्ती accelerates सूजन है, जो contrजैसे ग्लूकोज और इंसुलिन सहिष्णुता 35 के रूप में चयापचय सिंड्रोम के लिए ibutes। हालांकि, वसाकोशिका apoptosis अभी भी एक खराब अध्ययन घटना, परिकल्पना है कि प्रेरित वसाकोशिका apoptosis वजन कम करने के लिए ले जा सकता है के बावजूद है।

    वर्तमान प्रोटोकॉल ऐसे प्रसार, apoptosis और इन विवो में हाइपोक्सिया के रूप में अलग-अलग घटना का अध्ययन करने के प्रतिरक्षाऊतकरसायन दृष्टिकोण का उपयोग करता है। इसलिए, ऊतक 4% formaldehyde है, जो एक महत्वपूर्ण कदम है के साथ तय हुई थी। एक विस्तारित ऊतक निर्धारण समय epitopes, जो एंटीबॉडी के लिए गैर-सुलभ हो जाते हैं बदलने के लिए होता है। इसके विपरीत, एक छोटी निर्धारण समय अभिकर्मकों के epitopes की संवेदनशीलता बढ़ जाती है। निर्धारण की सिफारिश की इष्टतम समय 24 घंटा है। इसके अलावा, वर्गों की मोटाई भी उनके epitopes के लिए बाध्य एंटीबॉडी प्रभावित करती है; इष्टतम मोटाई 2 से 5 माइक्रोन के बीच और है। धारा 5 माइक्रोन से अधिक गहरा वृद्धि हुई बाध्यकारी साइटों के कारण झूठी सकारात्मक परिणाम दे देंगे। इसके विपरीत, एसections पतले से कम 2 माइक्रोन कम बाध्यकारी साइटों होते हैं और सकारात्मक क्षेत्रों में अच्छी तरह से परिभाषित नहीं कर रहे। इसके अलावा महत्वपूर्ण कारकों एंटीबॉडी ही है, ऊष्मायन समय, एकाग्रता और यहां तक ​​कि तापमान है, जो विशिष्ट epitopes के लिए बाध्य की गुणवत्ता को प्रभावित कर रहे हैं। इसलिए, एंटीबॉडी एकाग्रता और ऊष्मायन समय सत्यापित हर हालत के लिए आवश्यक है।

    अध्ययन पूरा करने के लिए हम इन विट्रो वसाकोशिका भेदभाव प्रोटोकॉल है, जो अलग-अलग उपचार, उत्तेजना या सह-संस्कृतियों के द्वारा बढ़ाया जा सकता है प्रदान करते हैं। इन विट्रो वसाकोशिका संस्कृतियों में उपयोग करके, यह वसाकोशिका भेदभाव और कार्यों में दोष का निर्धारण करने के लिए संभव है। विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, सभी प्राथमिक कोशिकाओं के लिए के रूप में, स्वस्थ व्यवहार और ADSCs और adipocytes की उपस्थिति काफी महत्वपूर्ण है। विघटन, cytoplasmic vacuolations और / या टुकड़ी गिरावट के संकेत, अपर्याप्त मध्यम, माइक्रोबियल संदूषण या प्राथमिक के वार्धक्य का संकेत हैंकोशिकाओं। इस प्रोटोकॉल वसा पैड ऊतक से अलग adipocytes उपयोग कर रहा है, यह भी संभव है जबकि mesenchymal स्टेम सेल के रूप में अन्य प्रोटोकॉल 36 से वर्णित अस्थि मज्जा से अलग उपयोग करें। नवीनतम stromal कोशिकाओं पूर्वज है, जो अतिरिक्त भेदभाव समस्याओं वसाकोशिका भेदभाव की बहुत जल्दी कदम पर होने वाली प्रतिबिंबित हो सकता है शामिल है, यह हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल में याद किया जा सकता है। इसके अलावा, ADSCs तेजी से (एक सप्ताह के भीतर 10 से अधिक बार) का विस्तार किया जा सकता है, और कुछ मार्ग के बाद लंबे समय तक सुसंस्कृत ADSCs अभी भी अपने mesenchymal pluripotency 37,38 बरकरार रहती है। एक और लाभ यह ADSCs का उपयोग करते हुए कि एक बड़ी आसानी से, मानव के लिए स्विच कर सकते हैं ADSCs लिपोसक्शन द्वारा रोगियों जो एक सरल और कम आक्रामक तरीका है से काटा जा सकता है के बाद से है।

    में एक अंत: स्रावी ढंग से कई अन्य अंगों को प्रभावित करती है के रूप में, प्रोटोकॉल adipokines को बढ़ाया जाना चाहिए। जैसे लेप्टिन, adiponectin, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (TNF) एक Adipokines,एन डी रेजिसटिन, adipocytes द्वारा स्रावित वसा चयापचय, ऊर्जा homeostasis और इंसुलिन के प्रति संवेदनशीलता 39 को नियंत्रित करने से चयापचय रोगों को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है। इसलिए, सीरम और वसाकोशिका secretome विश्लेषण किया जाना चाहिए। ऐसे आईएल -6 के रूप में एटी रोग, adipokines और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स, के मामले में, इस तरह के यकृत और अग्न्याशय, और मांसपेशी समारोह 4 के रूप में अंगों के अनियंत्रण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। आदेश प्रणालीगत अंग में शिथिलता को बाहर करने के लिए, पशु मॉडल या सेल संस्कृतियों उत्तेजना और तेज ग्लूकोज में उनकी प्रतिक्रिया के लिए परीक्षण किया जा सकता है।

    यहाँ हम और vivo में adipocytes के बुनियादी राज्य का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और इन विट्रो में वसाकोशिका homeostasis और कार्यक्षमता के आणविक तंत्र प्रकट करते हैं।

    Disclosures

    लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

    Acknowledgments

    लेखकों कृपया चाहते हैं पांडुलिपि proofreading के लिए डेटा और डॉ बी Grötsch तैयार करने के लिए डॉ जे लूथर और लालकृष्ण Ubieta धन्यवाद। यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-एमी नोथेर) द्वारा समर्थित किया गया।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RNAlater solution Ambion AM7021 RNA stabilization solution
    High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368813
    SYBR Select Master Mix 4472908
    Purified Mouse Anti-Human Ki-67 BD Biosciences 550609 Clone B56 (RUO)
    Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) 550609 Proliferation marker
    FITC Annexin V BioLegend 640906
    Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb Cell signalling 9664S Clone 5A1E
    Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb 9664 Apoptosis marker
    Lipofectamine2000 Reagent  Invitrogen 11668-027
    TO-PRO-3 Iodide T3605 Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm
    Mayer’s hemalum Merck 109249 hematoxylin
    pegGOLD TriFast Peqlab 30-2030 TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol
    Percellys Ceramic Kit 1.4 mm 91-PCS-CK14 tubes containing ceramic beads (1.4 mm)
    Precellys 24 91-PCS24 homogenizer
    HIF-1 alpha Antibody Pierce PA1-16601
    HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 700505 Hypoxia marker
    In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein Roche 11 684 795 001 TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) 
    Eosin Sigma 318906
    DNase I Solution (1 unit/µl) Thermo Scientific EN0525
    biotinylated anti mouse IgG (H+L) Vector Laboratories BA-9200
    biotinylated anti mouse IgG (H+L) BA-1000
    Vectastain ABC Kit PK-4000
    VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI H-1200

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    विकास जीवविज्ञान अंक 112 adipocytes adipocytes भेदभाव वसाकोशिका अनियंत्रण वसा ऊतकों हाइपोक्सिया HIF1α उपापचयी सिंड्रोम मोटापा उम्र बढ़ने
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    Bozec, A., Hannemann, N. Mechanism… More

    Bozec, A., Hannemann, N. Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis. J. Vis. Exp. (112), e53822, doi:10.3791/53822 (2016).

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