Introduction
Ifølge 2014 rapport fra Verdens helseorganisasjon, 39% av verdens voksne befolkning er overvektig, og 13% er overvektige 1. I nær fremtid vil vektige mennesker utgjør en betydelig andel av den eldre befolkningen. Et viktig trekk ved fedme og aldring er feilregulering av fett i forhold til sykelighet og dødelighet to. Adipokines, proteiner utskilt av fettvev (AT), kan utløse metabolske syndromer som fedme og type 2 diabetes tre. Metabolske sykdommer er for det meste forårsaket av overdreven energilagring i lipid dråper av adipocytter, noe som resulterer i ekspansjon AT 4. Det er derfor av interesse å finne årsakene og de molekylære mekanismene for AT utvidelse for å finne muligheter for å kontrollere den.
Over-ernæring fører til AT ekspansjon, som reguleres av to hendelser: dreven energilagring i lipid dråper av adipocytter, en prosesssom fører til hypertrofi (økning i adipocyttdifferensiering størrelse), og økt adipogenese, også kjent som adipocytt hyperplasia 5. Adipogenese er en prosess for differensiering av multipotente stamceller (MSC) til adipocytter. For det første, MSC utvikle seg til preadipocytes i forpliktelsesfasen. Dernest preadipocytes ytterligere differensiere å tilegne funksjonene i modne og funksjonelle adipocytter 6. Flere transkripsjonsfaktorer har blitt identifisert som mester regulatorer for preadipocyte bestemmelse som sink finger protein 423 (Zfp423) og tidlig B-celle faktor 1 (Ebf1). Mens Zfp423 induserer tidlig satsing, er Ebf1 nødvendig for generering av adipocyte forfedre 6. Terminal differensiering er strengt kontrollert av en transkripsjons cascade, der peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor γ (PPARy) er den avgjørende transkripsjonsfaktor 7. Ytterligere sentrale transkripsjonsfaktorene er CCAAT / enhancer-bindende protein (C/ EBP) familiemedlemmer (dvs. C / EBPα, C / EBPβ, og C / EBPδ), kruppel-lignende faktorer (KLFs), cAMP responsive element binding protein (CREB) og tidlig vekstrespons 20 (Krox20) 6.
Nylig har det blitt vist at den aktivator protein-1 (AP-1) familien er involvert i adipocyttdifferensiering prosessen 8,9. AP-1-familien er dannet av et dimerisk protein kompleks, som består av Fos, juni og / eller aktivering av transkripsjonsfaktoren (ATF) medlemmer. Fos-relaterte antigen 1 og 2 (FRA-1 og Fra-2) er i stand til å regulere adipocyttdifferensiering. Fra-en svekker adipocyte differensiering ved å hemme C / EBPα 8, mens Fra-2 kontroller adipocyte omsetning ni. Fra-2 dermed ikke bare reduserer fettceller nummeret ved å undertrykke PPARγ2 uttrykk under adipocyte differensiering, men også reduserer fettceller apoptose gjennom direkte undertrykkelse av hypoksi-induserbar faktorer (HIFs) uttrykk. Den HIF-familien er en heterodimeric transkripsjonsfaktor kompleks, som består av HIF-1α, HIF-2α og HIF-1β. Heterodimerene består av et oksygenfølsomt HIF-α protein (HIF-1α eller HIF-2α) og den oksygen-insensitive HIF-1β subenhet 10. Under normoxia, HIF-α proteiner er poly-ubiquitinylated og endelig degradert av proteasomer 11. Under hypoksiske betingelser, som opptrer i AT under ekspansjon, HIF-α-proteiner ikke lenger er hydroksylert. De blir derfor stabilisert og danner dimerer med konstitutivt uttrykt HIF-1β. Transkripsjonen aktivering av gener kontrollert av HIF responselementer er involvert i regulering av angiogenese, metabolisme, og betennelse 12. Faktisk fremmer HIF-1α AT dysfunksjon ved å indusere glukosetoleranse, inhibering av energiforbruket og perifere bruk av lipid, samt ved å øke leptin nivå og HFD-fremkalt hepatisk steatose 13. Videre regulerer HIF-1α adipocyte apoptose in vivo og in vitro 9.
Den nåværende protokollen beskriver metoder for å studere AT status å avdekke molekylære egenskapene til adipocyte homeostase hos voksne mus. Den viser hvordan apoptose, proliferasjon og differensiering av adipocytter in vivo og in vitro kan reguleres ved hypoksi. For å gjøre dette, bruker vi mus med adipocyte bestemt sletting av Fra-2 genereres ved å krysse mus bærer Fra-2 floxed alleler med Fabp4-CreERT mus 9. Ved å bruke Fabp4-Cre ERT mus, er slettingen adipocyte spesifikke og induserbar av tamoxifen injeksjon 14. For den voksne modellen, intra peritoneal injeksjoner av tamoxifen utført over 5 sammenhengende dager med start i en alder av 6 uker. Således blir musene utsatt for en normal diett eller høy-fett diett i 6 uker før analysen er ferdig. Musene som ble anvendt i denne studien ble hann basert på en C57BL6 bakgrunn for å unngå kvinnelige hormoner, for eksempel østrogener, Vist seg å regulere kroppens fettfordeling 15. Ved hjelp av en annen genetisk bakgrunn kan også endre metabolsk fenotype, på grunn av belastningsskader relaterte forskjeller i lipid ledelse 16.
Denne protokollen demonstrerer hvordan å analysere på under hypoksi ved hjelp av histologi og hvordan å kvantifisere adipocyte apoptose, proliferasjon og differensiering in vivo ved hjelp av immunhistokjemi og genet profilering analyser. Studien er fullført ved in vitro forsøk, viser hvordan å analysere primære adipocyttdifferensiering og apoptose forandres ved eksponering for hypoksi.
Protocol
ETIKK UTTALELSE: Dyr er plassert i standardiserte forhold følgende retningslinjene fra den tyske dyrevernloven. Dyrene ble foret med en standard diett og vann ad libitum og holdt med en 12 timers dag / natt syklus. Alle forsøk med dyr er godkjent av lokale etikkomité.
1. I Vivo Analyse av adipocyte Homeostase hos voksne menn
- For å kvantifisere hypoksi in vivo, først bestemme kroppsvekten til musene, og deretter injisere 60 mg / kg kroppsvekt av faststoff pimonidazole hydroklorid intra-peritonealt (for eksempel: injisere 1,5 mg til en 25 g mus). Pimonidazole er en effektiv hypoksisk markør, som danner addukter med tiolgrupper i proteiner, peptider og aminosyrer, og blir detektert av et spesifikt antistoff.
- Sacrifice mus og fjerne perigonadal fettputer (figur 1).
- 45 min etter injeksjon, ofre musene av CO 2 kvelning og påfølgende halshugging. </ Li>
- Peke ut lemmer mus (som illustrert i figur 1) og åpne bukhulen. Ta til venstre og høyre perigonadal (epididymal) fettpute inne i bukhulen.
Merk: Fett pute er bundet til epididymis by the peritoneal brosjyrer som vist i figur 1 (perigonadal fettputer er angitt med pilene). - Vær nøye med å fjerne gonadale vev fra fett puten. Bestemme fettpute vekter for å beregne forholdet: fett puten Vekt (g) pr kroppsvekt (g).
Figur 1: Plassering av perigonadal fettputer i bukhulen til mus. Bilde av perigonadal fett lokalisering i voksen mus etter offer. Perigonadal fett pads er indikert med pilene. Klikk her for å vIEW en større versjon av dette tallet.
- For å kompilere en kvantitativ genekspresjon profil, bruker en perigonadal fettpute for å isolere RNA. Merk: Til vevet er behandlet, lagre vevsprøver i RNA-stabilisering løsning ved -80 ° C eller i flytende nitrogen.
- For å homogenisere fett puten, legger fettet puten til 1 ml enfase løsning av guanidinisotiocyanat og fenol. Bruke rør som inneholder keramiske korn (1,4 mm) for å knuse vevet i en homogenisator ved 6500 rpm (2 ganger 20 sekunder, med 30 sek pause).
- Isolere RNA som følger (single-trinns metode ved Chomczynski og Sacchi 17).
- For å separere fasene, overføring homogenisert fettpute til mikrosentrifugerør, tilsett 0,2 ml volum kloroform, rystes i 15 sek, inkuber i 5 minutter ved romtemperatur og sentrifuger 12 000 xg i 5 minutter. Overfør den øvre vandige fasen (ca. 400 ul), som inneholder RNA, inn i en ny mikrosentrifuge-rør. Ikke ta med DNA-inneholdeing inter eller den proteininneholdende fenol fase.
- For å utfelle RNA, tilsett 1 volum av isopropanol, blandes og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C (det er også mulig å inkubere ved -20 ° C natten over). Sentrifuger ved 12.000 xg i 10 min. Fjern isopropanol supernatanten forsiktig. Vask to ganger med 75% etanol med sentrifuger trinn på 12 000 xg i 10 min.
- Etter tørking av den utfelte RNA for rundt 10 minutter ved romtemperatur, oppløse den i 50 ul H2O (RNase-fri). For å lette dette, inkuberes i 2 minutter ved 65 ° C.
Merk: Hold RNA i 75% etanol ved -80 ° C eller i flytende nitrogen for langtidslagring. - Kvantifisere RNA forberedelsene av A 260/280 (optimal kvotienten er mellom 1,8 og 2,2) og beregne konsentrasjonen av A 260:
- For å unngå DNA-kontaminering, fordøye 1 ug av RNA fremstillingenmed en U-DNase I i 30 minutter ved 37 ° C i et volum på 10 pl. Inaktivere ved 65 ° C i 10 min.
Merk: Dette trinnet er valgfritt. - Bruke 10 ul RNA-preparat inneholdende 1 ug RNA for revers transkriptase reaksjon for å generere enkeltkjedet cDNA, egnet for kvantitativ PCR program. Komponentene og deres beløp er oppført i Tabell 1.
- Bruk en PCR Master Mix for en kvantitativ real-time PCR reaksjon. For å bestemme metabolske endringer i hele fettpute, bruke spesifikke primere for gener som er involvert i AT-homeostase (tabell 2) og PCR-betingelser som er oppført i tabell 3.
- Real-time PCR dataanalyse.
- Definer grunnlinjen (figur 2), normalt syklus 1 til 15, hvor det ikke er noen endring i fluorescens-signaler. Den real-time PCR programvare normaliserer spesifikke fluorescens-signaler til grunnlinjen og fluorescensen til den interne referanse fargestoff, ROX, noe som resulterer iomfanget av de konkrete signaler av primere, delta Rn (ΔRn).
- Innstill terskel i den eksponensielle fase av forsterkningskurven. Skjæringspunktet definerer terskelsyklusen (Ct). Basert på CT verdi, beregne den relative uttrykk (ΔCt) og fold endring (ΔΔCt):
| Komponent | Volume III / reaksjon |
| 10x RT Buffer | 2.0 |
| 25x dNTP Mix (100 mm) | 0.8 |
| 10x RT Tilfeldige Primere | 2.0 |
| MultiScribe revers transkriptase | 1.0 |
| Nukleasefritt H 2 O | 4.2 |
| 1 mikrogramRNA | 10 |
| Totalt per reaksjon | 20 |
Tabell 1: Komponenter med tilsvarende volum for revers transkriptase reaksjon for å generere enkeltkjedet cDNA.
| Offisiell fullt navn | symbol | Sequence 3 '-> 5' | ||
| Framover | Omvendt | |||
| adipogenesen | Delta-lignende en homologen (pref-1) | Dlk1 | GACACTCGAAGCTCA CCTGG | GGAAGGCTGGGACGG GAAAT |
| Tidlig B-celle faktor 1 | Ebf1 | CCACCATCGACTACGG CTTC | TCCTGGTTGTTGTGGGG CATC | |
| Sink finger protein 423 | Zfp423 | GTGCCCAGGAAGAAGA CGTA | GGCGACGTGGATCTGA ATCT | |
| Fettsyre bindende protein 4 (Ap2) | Fabp4 | TCACCTGGAAGACAGCT CCTC | AAGCCCACTCCCACTTC TTTC | |
| CCAAT / enhancer bindende protein (C / EBP), alfa | Cebpa | AAGAGCCGCGACA AGGC | GTCAGCTCCAGCACCT TGTG | |
| CCAAT / enhancer bindende protein (C / EBP), beta | Cebpb | TTTCGGGACTTGATGC AATC | CCGCAGGAACATCTTT AAGG | |
| cAMP responsive element binding protein 1 | Creb1 | ACTCAGCCGGGTACT ACCAT | TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC | |
| CCAAT / enhancer bindende protein (C / EBP), delta | Cebpd | CAGCGCCTACATTGAC TCCA | GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA | |
| Kruppel-lignende faktor 4 | Klf4 | GCAGTCACAAGTCCCC TCTC TAGTCACAAGTGTGGG TGGC | ||
| Tidlig vekstrespons 2 (Krox20) | Egr2 | AGGCGGTAGACAAAATC CCAG | GATACGGGAGATCCAG GGGT | |
| Peroksisom proliferator aktivert reseptor gamma | Pparg | AGAGGTCCACAGAGCTG ATTC | GATGCACTGCCTATGAGC ACTT | |
| lipogenese | Acetyl-koenzym A karboksylase alfa | Acaca | TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT | ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC |
| Fettsyre syntase | FASN | ACATCCTAGGCATCC GAGA | CCGAGTTGAGCTGGGT Tagg | |
| Stearoyl-Koenzym A desaturase 1 | Scd1 | CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT | TTCTTGCGATACACTCTG GTGC | |
| lipolyse | Patatin lignende fosfolipase domene containing 2 | Pnpla2 | AAGGACCTGATGACCA CCCT | CCAACAAGCGGATGGT Gaag |
| Fettsyre opptak | lipoprotein lipase | LPL | GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC | GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC |
| CD36 antigenet | CD36 | GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC | ATGGGCTGTGATCGGA ACTG | |
| hypoksi | Hypoksi induserbar faktor 1, alfa subenhet | Hif1a | CCTGCACTGAATCAAGAG GTGC | CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT |
| Endothelial PAS domene protein 1 (også kjent som: HIF-2alfa) | Epas1 | CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC | TTGGGTGAATTCATCG GGGG | |
| Von Hippel-Lindau tumor suppressor | VHL | ACCGAGGTCATCTTTG GCTC | TTCCGCACACTTGGGT AGTC | |
| Aryl hydrokarbon reseptor atom Translocator (også kjent som: HIF-1beta) | Arnt | TGGGTCATCTTCTCGC GGTT | TGTCCTATCTGAGCAT CGTG | |
Tabell 2: Liste av gener med sekvensen av de respektive primere anvendt for å analysere adipocytt-homeostase.
| Skritt | Temperatur (° C) | Tid (min: sek) | ||
| polymerase aktivering | Holde | 95 | 10:00 | |
| PCR | 40 sykluser | Denaturize | 95 | 00:15 |
| Gløding / Extension | 60 | 01:00 | ||
| Smelte kurve | 60-95 | 0,5 ° C / sek | ||
Tabell 3: Real-time PCR betingelser.
Figur 2:. Kjennetegn på real-time PCR amplifikasjonskurve Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- For å utføre histologisk analyse av fettceller homeostase, bruker andre perigonadal fett pad. Ikke desiccate vevet!
- Fest fett puten i 3,7% PBS-bufret formaldehyd over natten, bygge inn i parafin (følg instruksjonene som beskrevet andre steder 18) og skjær den innebygde vevet inn 2-5 mikrometer tykke seksjoner (maksimalt fem mikrometer).
- Bestem antall adipocytter per felt og adipocyte størrelse i en lyse-feltet mikroskop etter hematoxylin og eosin (H & E) flekker: <ol>
- Deparaffinize seksjoner av vasking 3 ganger i 5 minutter i xylen og rehydrere seksjon 2 ganger i 2 min i 100% etanol og 2 ganger, 2 min i 96% etanol. Til slutt vaskes den seksjon i destillert H2O i 5 min.
- Flekken med hematoksylin, fortynnet 1: 5 med destillert H2O, i 10 min ved værelsestemperatur og vaskes i H 2 O i 5 minutter. Flekken med eosin-løsning (20 ml 5% eosin Y / 210 ml destillert H2O / 25 ul iseddik) i 30 sekunder og vaskes igjen med H2O i 5 min.
- Dehydrere delene med 96% etanol og 100% etanol 2 ganger hver i 2 min, og xylen 3 ganger i 5 min. Monter delene med vannfri montering agent.
- Vurdere seksjonene under en lyse-feltet mikroskop. Et representativt eksempel på hvordan å analysere adipocytter med ImageJ 1.48v 19 er vist i fig. 3: antall celler pr område (2 mikrometer), celleområde (10 x 3 mikrometer 2
- Åpne bildet av den delen med ImageJ 1.48v. Hvis parameterne av bildet er antydet i piksler i stedet for en lengdeenhet, justere vekten.
- Velg * Lineær * i verktøylinjen og justere linjen til en kjent avstand med henvisning til den målestokken. Gå til Analyze -> Set Scale Avstanden av linjen er vist i piksler;. legge den kjente avstanden og lengdeenhet, f.eks mikrometer. Bekreft med OK. Størrelsen av bildet og analyse av parameterne er angitt i lengdeenhet er gitt.
- For å bestemme parametrene av adipocytter, justere terskelen. Gå til Image -> Adjust -> Terskel for å åpne Threshold vinduet. Velg følgende innstillinger: Terskelverdier metode: Standard, Threshold Farge: B & W; Fargerom: HSB. Bildet vises nå i svart og hvitt. JusterLysstyrke for å fjerne hvite adipocytter og lukke svarte mellomrom mellom, som i fig. 3b.
- Tell antall fettceller per mikrometer 2 (figur 3e) med * multi-punkt * valg i verktøylinjen og markere hver celle for telling.
- For å bestemme adipocyte størrelse, velger du * Lineær * igjen i verktøylinjen og tegne diameteren på en adipocyte (figur 3c). Gå til Analyser -> Mål og et nytt vindu vil vises, med lengden av diameteren i pm.
- For å bestemme adipocyte området velger * Wand (sporing) verktøy * og klikk inne i adipocyte. Den indre vegg av fettceller er valgt i rødt (figur 3d). Gå til Analyze -> Mål og et nytt vindu vil dukke opp, med areal på denne adipocyte i mikrometer to.
- Deparaffinize seksjoner av vasking 3 ganger i 5 minutter i xylen og rehydrere seksjon 2 ganger i 2 min i 100% etanol og 2 ganger, 2 min i 96% etanol. Til slutt, vaske seksjon i destillert H 2 O.
- For antigen henting, fordøye vevet seksjon i 30 minutter ved 37 ° C med Proteinase K-arbeidsløsning (20 ug / ml i 10 mM Tris / HCl, pH 7,4 til 8) og skyll med PBS.
- For å blokkere endogen peroksidase, bruke 3% hydrogenperoksid i PBS i 10 minutter, med etterfølgende vasking 2 ganger i 5 minutter i PBS. For å blokkere uspesifikk binding av antistoffer, bruker 10% serum i PBS. Bruk serumet til verten av det sekundære antistoff, i dette tilfellet geit.
- For flekker, bruker antistoffer for apoptose, spredning og hypoksi deteksjon (
- For å forsterke signalet bruker en biotinylert sekundært antistoff, med fortynningen som er oppført i tabell 5. For hypoksi deteksjon, bruker HRP konjugert kanin anti-FITC som det sekundære antistoff. Inkuber i 1 time ved romtemperatur. Vask seksjoner 2 ganger 5 min med PBS.
Merk: For hypoksi farging med FITC-MAb1, hopper du over trinn 1.4.4.4) og fortsett med trinn 1.4.4.5).- For hvert lysbilde, pre-inkubere 50 ul avidin løsning med 50 ul biotinylert peroksidase H i 30 minutter ved romtemperatur (denne fremgangsmåten er også referert til som avidin / biotin-kompleks ABC formulering) og deretter legge til seksjonene for en annen 45 min. Vask 2 ganger i 5 minutter med PBS.
- Inkuber seksjonene i peroksydasesubstrat oppløsning inntil fargingen blir mer intens (mellom 5 og 10 min). Vask i 5 minutter med destillertH 2 O.
- For kontra, flekken med hematoksylin fortynnet 1: 5 med destillert H2O i 10 min ved værelsestemperatur og vaskes i H 2 O i 5 minutter.
- Dehydrere seksjoner i 96% etanol og 100% etanol 2 ganger hver i 2 min, og xylen 3 ganger i 5 min. Forsegle seksjoner med Dekk og vannfri monteringsmiddel. Vurdere seksjonene under en lyse-feltet mikroskop.
- For å forsterke signalet bruker en biotinylert sekundært antistoff, med fortynningen som er oppført i tabell 5. For hypoksi deteksjon, bruker HRP konjugert kanin anti-FITC som det sekundære antistoff. Inkuber i 1 time ved romtemperatur. Vask seksjoner 2 ganger 5 min med PBS.
- Tilsett 50 mL enzymløsning i 450 mL label-løsning. Påfør deretter 50 pl TUNEL reaksjonsblandingen på histologiske seksjoner og inkuberes i 60 min ved 37 ° C i en fuktig atmosfære i mørket. Vask seksjoner 3 ganger med PBS i 5 minutter og monter med fluorescens monteringsmedium inkludert DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) for kontra.
- Vurdere delen under en fluorescens mikroskop med 100 ganger magnificat ion. For måling av Fluorescein bruke en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm, og påvise mellom 515-565 nm (grønn laser); DAPI hisser på ca 360 nm og avgir på ca 460 nm når bundet til DNA (blå laser).
- Kvantifisere overlegg av DAPI og Fluorescein:
Figur 3:. Analysere adipocyte egenskapene i fettputeseksjoner § bilder av perigonadal fettpute av mannlige mus behandlet med en fettrik diett (HFD) eller normal diett (ND) med en lys-feltet mikroskop (a); terskelen blir justert inn i svart og hvitt (b), og fettceller størrelse (lengde, c), området (d) og adipocytt celletall per mm 2 (e) blir kvantifisert med ImageJ 1.48v.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Stock konsentrasjon | fortynning | |
| apoptose | Spaltede Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Kanin mAb | 1: 2000 |
| Proliferation | Renset Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (Ruo) | 01:50 |
| hypoksi | HIF-1 alfa Antistoff | 1: 100 |
| FITC-MAb1 | 1: 100 |
Tabell 4: Antistoffer med respektive fortynning brukes for immunhistokjemi farging av AT seksjoner.
| antistoff | fortynning |
| biotinylert antimus IgG (H + L) | 1: 200 |
| biotinylert anti mus IgG (H + L) | 1: 200 |
| HRP-konjugater kanin-anti-FITC | 1: 100 |
Tabell 5: Sekundære antistoffer med fortynning som brukes for immunhistokjemi flekker.
2. In Vitro Analyse av adipocyte Homeostase Påvirket av Hypoksi
- Sacrifice mus og fjerne det subkutane fettvev.
- Ofre mus ved CO 2 kvelning og påfølgende halshugging.
- Peke ut lemmer mus som vist i Figur 4. Løsne hud fra låret, kam og flanke og pin det ned med nåler som i Figur 4. Ta deretter subkutant fettvev, som ligger bakre ved foten av bakbena, som omgir inguinale lymfeknuter (som vist i figur 4, venstre: subkutant fett putes angitt med pilene; høyre: inguinale lymfeknuter er indikert med pilen).
Figur 4: Plassering av underhudsfett pads. Bilde av underhudsfett pad; venstre piler indikerer underhudsfett puten og høyre pil indikerer lyskelymfeknute. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Isoler adipose-avledet stamceller (ADSC) som tidligere beskrevet 20.
- Seed ADSC 4000 celler / cm2 i Dulbeccos modifiserte Eagles medium-Hams F-12 supplert med 10% normalt kalveserum, 1% penicillin / streptomycin, 0,5% amfotericin B, 16 uM biotin, 18 uM pantotensyre og 100 mM askorbinsyre og vokse kultur til konfluens rundt 70 til 80%, Som oppnås etter 4 til 6 dagers dyrking.
- Fremkall Adipogenic Differensiering.
- Fjern det heft ADSC fra overflaten ved trypsinbehandling.
- Fjern medium, vaskes med PBS og tilsett 0,025% trypsin-oppløsning (forvarmet til 37 ° C) i 2 minutter (inntil cellene løsner fra overflaten). Umiddelbart legge medium og vaske cellene.
- Tell cellene ved bruk av et Neubauer kammer.
- Sett glassdekselet på det sentrale området av Neubauer kammeret. Fortynn cellesuspensjonen 01:10 og laste kammer med 10 mL fortynnet cellesuspensjon. Telle celler i 4 ruter plassert i hjørnene, hver består av 16 mindre firkanter. Beregn celle nummer per ml:
- Sett glassdekselet på det sentrale området av Neubauer kammeret. Fortynn cellesuspensjonen 01:10 og laste kammer med 10 mL fortynnet cellesuspensjon. Telle celler i 4 ruter plassert i hjørnene, hver består av 16 mindre firkanter. Beregn celle nummer per ml:
- Seed ADSC (som beskrevet i punkt 2.2) i 12-brønners kulturplater og vokse kultur til konfluens rundt 70 til 80% (oppnådd etter 4 til 6 dager).
- Fremkall adipogenic differensiering ved tilsetning av 5 ug / ml insulin, 1 uM deksametason og 5 mM 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX) til kulturene. Forny medium hver 2 dager. Celler vil være fullt differensiert etter 7 dager.
- Fjern det heft ADSC fra overflaten ved trypsinbehandling.
- Å analysere adipogenic differensiering, flekken med Oil Red O, som flekker triglyserider av modne adipocytter.
Merk: Arbeidet må utføres under en avtrekkshette!- Fjern mediet, vaske adipocytter forsiktig med PBS og fikse cellene i 60 min med 2 ml 10% formalin.
- For å fremstille Oil Red O farging oppløsning, blande 3 deler av det røde olje O stamoppløsning (300 mg Red Oil O pulveret oppløses i 100 ml 99% isopropanol) med 2 deler destillert H2O og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Filter Oil Red O arbeidsløsning gjennom et 0,2 mikrometer injeksjon filter.
Merk: Arbeidsoppløsningen er stabil i 2 timer. - For Oil Red O flekker, fjerne formalin, vaske adipocytter med H 2
- Vurdere platene under et fasekontrastmikroskop med 100 ganger forstørrelse. Lipidene i adipocytter vises røde og kjernene vil vises blått.
- Valgfritt trinn: Silence genet av interesse ved transfeksjon med shRNA.
- Endre medium og tilsett serumfritt medium.
- For transfeksjon av adipocytter, bruker lipofeksjon. Følg produsentens instruksjoner og bruk en mikrogram shRNA per 12-brønners vev plater. Etter tilsetning av lipid-DNA-kompleks, inkuber adipocytter i 48 timer ved 37 ° C.
- Å analysere adipocytter utsatt for hypoksi, bruk en hypoksisk arbeidsstasjon eller hypoksisk inkubator for å holde cellene i henhold hypoksiske forhold. Avhengig av studien, hypoksi could være 0,5, 1 eller 2% oksygen.
- Analyser apoptose av FITC-merket Annexin V og påfølgende flowcytometri analyser.
- Samle adipocytter med en ekstra myk celleskraper, vask med PBS og tilsett 1 x 10 6 celler til 100 ul Annexin V-bindingsbuffer (10 mM Hepes / NaOH, pH 7,4; 140 mM NaCl; 2,5 mM CaCl2). Legg mengden av Annexin V-FITC som anbefales av produsenten, og inkuber ved romtemperatur i 15 min.
- For flowcytometri måling, tilsett 200 mL Annexin V-bindingsbuffer og en mikrometer atom counterstain. Bestemme fluorescensen i det grønne og fiolette kanal. Annexin V + / kjerne counterstain + celler er definert som sekundær nekrotisk og annexin V + / kjerne counterstain - celler er definert som apoptotiske celler (figur 5).
- Kvantitativt analysere adipocytt-RNA-nivå for å bestemme homeostase i henhold hypoksiske betingelser.
- Legg til1 ml enfase oppløsning av guanidin-isotiocyanat og fenol til hver brønn og isolere RNA [ved anvendelse av enkelt-trinns metode av Chomczynski og Sacchi 17 (trinn 1.3.2)] og går frem som i trinn 1.3.2.1) for å 1.3.5.2) .
- Analyser apoptose av FITC-merket Annexin V og påfølgende flowcytometri analyser.
Figur 5: adipocytt apoptose analyse ved strømningscytometri. Prikkplott presentasjoner av FACS for Annexin V-FITC og TO-PRO-tre farging av adipocytter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Representative Results
Vi viser hvordan man skal bestemme adipocytt homeostase in vivo og in vitro ved hjelp av eksempel på Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus sammenlignet med villtype-kullsøsken. Vår protokollen definerer hvordan økt HIF uttrykk ved hypoksi er korrelert med adipocyte dysfunksjon som indikert av økt adipocyte apoptose.
Økt adipocyte størrelse og området fettrik diett (HFD) behandlede mus
Over-ernæring, blant annet resulterer i adipocyte hypertrofi, forårsaket av overdreven energilagring i lipid dråper. Fettceller størrelse og område er en indikator på hypertrofi. Deler av fett puten fra normal (ND, figur 6a) og fettrik diett (HFD, figur 6b) mus samt kvantifisering av adipocyte størrelse og området viser tydelig adipocyte hypertrofi etter 6 ukerss av HFD, som indikert ved økt adipocytt størrelse i HFD behandlede mus (figur 6c og d).
Økt hypoksi i fettvev (AT) av voksen Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus fører til økt HIF-1α nivå og adipocyte apoptose
For å bestemme in vivo status av hypoksi i AT, Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus analysert 6 uker etter Fra-2 sletting i en alder av 12 uker og sammenlignet med vill-type kullsøsken. Pimonidazole blir administrert til musene intraperitonealt som en effektiv hypoksi markør; det er ikke-toksisk og i stand til å fordele inn i AT. Hypoksiske adipocytter i AT in vivo er definert ved immunhistokjemisk farging antistoff (figur 7a). Videre er øket hypoksiske status av AT i mus følges av økt HIF-1α positiv ADIPocytes som indikert ved immunhistokjemisk farging 7b), noe som bekreftes av kvantifisering av HIF-1α uttrykk nivåer og sine mål gener 9. I tillegg TUNEL-farging av AT seksjoner fra Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus og kontroll littermates (figur 7c) viser at økt adipocytt apoptose er korrelert med nærvær av hypoksi og HIF-1α uttrykk.
Økt HIF-1α uttrykk i grunnskolen adipocytter gjennom hypoksi indusert adipocyte apoptose
For å analysere adipocyte apoptose in vitro, bruker vi adipocytter generert fra subkutane fettputer som beskrevet andre steder 20. Som forventet, er det HIF-1α ekspresjon i adipocytter øket etter 24 timer av hypoksi (figur 8a). For ytterligere å analysere HIF-1α aktiviteter, RNA nivåer av HIF målgener som Inos (induserbar nitrogenoksidsyntase) blir kvantifisert ved qPCR. Figur 8b viser at den økte ekspresjon av HIF-1α henhold hypoksiske betingelser fører til økt Inos mRNA-nivå. Siden vi allerede har vist in vivo (figur 8) som økte HIF-1α ekspresjon i adipocytter korrelerer med økt adipocyttdifferensiering apoptose, blir apoptose også kvantifisert ved in vitro kulturer av Annexin V-farging i henhold til hypoksiske betingelser. I samsvar med in vivo-data (figur 7), er en øket HIF-1α nivå ledsages av økt adipocytt apoptose indusert ved hypoksiske betingelser (figur 8b). Dessuten, for å bevise at hypoksisk-indusert apoptose er HIF avhengig; HIF-1α eller HIF-2α er brakt til taushet av RNA interferens i adipocytter stammer fra villtype eller Fra-to mangelfull mus. Den økte adipocyte apoptose gjenopprettes ved å stanse HIF-1α eller HIF-2α som vist ved Annexin V flekker i figur 8b, som beviser at hypoksi sensor HIF-α regulerer adipocyte apoptose.
Figur 6: Økt adipocyte størrelse og området fettrik diett (HFD) mus (a, b) H & E farging av deler fra perigonadal fettpute av mannlige villtype mus matet med normal diett (ND) (a) eller høy. -fat kosthold (HFD) (b) i 6 uker. Barer representerer 500 mikrometer. (C, d) Kvantifiseringen av adipocytt-størrelse (c) og området (d) fra den perigonadal fettpute av villtype-mus ble matet med ND (a) eller HFD (b) i 6 uker. n = 10. Data er vist som middelverdier ± SEM. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av studentens t-test. *** P <0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Økt HIF-1α nivå og apoptose i adipocytter voksen FRA-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus. Hypoksi (a) og HIF-1α (b) farging i AT av hann Fra-2 fl / fl Fabp4-creERT mus og mannlige kontroll littermates 6 uker etter injeksjonen tamoxifen. Forstørrelse 20X, setter 40X. Svarte piler indikerer hypoksiske områder og HIF-1α positive celler. (C) TUNEL flekker i Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus og kontrollkullsøsken 6 uker etter tamoxifen injeksjon. Forstørrelse 20X, setter 40X. Svarte piler indikerer tunel positive celler. Dette tallet har blitt forandret fra Luther etal. 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8:. Økt HIF-1α uttrykk og adipocyte apoptose i primær adipocytter indusert av hypoksi (a) Real-time PCR-analyse av HIF-1α og HIFs mål Inos mRNA nivåer i grunnskolen adipocytter plassert i hypoksiske kamre analysert på angitte tidspunkter. (B) Kvantifisering av apoptose ved Annexin V FACS flekker i grunnskolen adipocytter isolert fra Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT mus eller vill-type kontroller transfektert med sh kontroll eller sh plasmid mot HIF-1α eller HIF-2α og plassert under hypoksi (1% O 2) i 24 timer. Dette tallet har blitt forandret fra Luther et al.
Discussion
Adipocytter er preget fenotypisk av deres størrelse, antall og areal, avslører adipocyte hyperplasi og hypertrofi, indusert av overdreven energilagring på grunn av over-ernæring fem. Disse hendelsene som fører til fettsyren feilregulering og påfølgende metabolske syndrom er også slår fast av økt fettmasse med bevarte metabolisms, som også er referert til som "sunt" fett ekspansjon. For eksempel, Kusminski et al. 21, viste at mus med massiv fett utvidelse forblir metabolsk sunne, noe som tyder på at fett ekspansjonen er ikke nødvendigvis knyttet til metabolsk syndrom og må være nøye bestemt for å vurdere egenskapene til adipocytter. Fettvev (AT) spiller en sentral rolle i reguleringen av kroppens stoffskifte. AT er det største endokrine organ som kan påvirke dyslipidemi, aterosklerose, hyperinsulinemi og hyperglykemi tre. Vurderer AT homeostase og molekyl mechanisms regulerer det kunne gi en bedre forståelse av metabolske sykdommer. Derfor rakne mekanismene som regulerer adipocyte differensiering, adipocyte størrelse og fettpute masse vil bidra til å utvikle ny terapeutisk behandling for fedme lidelser. Ved hjelp av in vivo og in vitro fremgangsmåter, er det mulig å bestemme rollen til mat og genekspresjon virkninger på adipocyttdifferensiering og aktivitet. For å bestemme AT homeostase, bestemme balansen mellom adipocyte differensiering, proliferasjon og apoptose som foreslått av vår protokoll er like viktig som å analysere glukose og insulin metabolske responsen 22-24.
Expression profilering analyser av gener involvert i adipogenesen, lipogenese, lipolyse, fettsyreopptak, hypoksi, apoptose og proliferasjon i grunnskolen adipocytter og visceral AT er en høy gjennomstrømning metode for å skaffe en oversikt over adipocyte homeostase og deres mulige dysfunksjon.Interessante kandidater bør videre analysert på proteinnivået ved western blot eller immunhistokjemi flekker. For å oppnå optimale resultater gjennom sanntids-PCR-system ved hjelp av usymmetriske cyaninfargestoffer, bør konsentrasjonen av cDNA fra 1 til 10 ng og de optimale primer-konsentrasjoner i området 50-900 nM bli testet for å minimalisere ikke-spesifikk amplifisering. De kritiske komponenter er prim; for hvert løp, smeltekurver må være strengt kontrollert for å sikre spesifisitet og for å utelukke dannelse av primer dimer. Derfor, ved hjelp av en negativ kontroll med H2O i stedet for cDNA er anbefalt. Videre er kommersielt tilgjengelige usymmetriske cyaninfargestoffer tilgjengelig som stamblandinger som inneholder en passiv referansefarvestoff (for eksempel ROX) for å gi en intern referansesignal. CDNA signal normaliseres i løpet av data analyse til ROX signaler for å korrigere brønn-til-brønn signalsvingninger. Et annet punkt som skal vurderes for å etablere en good qPCR-system er valget av husholdningsgenet. For hver tilstand er flere housekeeping gener brukes, f.eks HPRT, β-aktin, GAPDH, β-2-MG eller HSP90.
HIF proteiner stabilisert av hypoksiske forhold er master regulatorer som bestemmer ikke bare adipocytter overlevelse, men også metabolske endringer, for eksempel glukose, insulin toleranse og lipidmetabolismen 11,25,26. For å fastslå hypoksiske områder i fett puten, er HIF-1α bestemt i AT deler av immunhistokjemi. Siden HIF proteiner blir raskt nedbrutt i løpet av 5 til 10 minutter under normoksisk forhold, bør fremgangsmåten og fiksering av fettpute for histologisk analyse bli kontrollert for å unngå tidsforsinkelse. Derfor, for å sikre hypoksi ikke bare gjennom HIF-farging, blir pimonidazole brukes til å bestemme hypoksiske områder i AT. Pimonidazole er i stand til distribusjon i vev, som det ble allerede vist i bein 27Og effektivt å markere hypoksiske områder ved binding til tiol-inneholdende proteiner spesifikt i hypoksisk celler, som er videre oppdaget i histologiske snitt ved spesifikk antistoffbinding 28. Imidlertid kan andre markører og metoder som brukes til å analysere den hypoksi pathway. For eksempel, involvering av prolylhydroksylase (PHD) enzymet, som induserer hydroksylering av prolinrester i henhold normoxia, samt von Hippel-Lindau (VHL) protein, som gjenkjenner hydroksylerte proliner og indusere poly-ubiquitinering å mediere proteasomal HIF degradering, må analyseres for en full oversikt over veien 29,30. Videre vil allestedsnærværende deteksjon av HIFs også bestemme proteinstabilitet og nedbrytning som kan endre 31,32.
Videre er spredning av Ki67 og apoptose ved TUNEL farging fastsatt in vivo gjennom farging av AT histologiske snitt. Kvantifisering av spredning av Ki67 og enpoptosis ved TUNEL eller Annexin V-farging ved strømningscytometri-analyse blir også utført 33. Spredning kan selvfølgelig måles ved andre teknikker som for eksempel analysene av fettceller cellesyklus, som ikke er adressert ved måling av Ki67-positive celler. Videre kan apoptose studie av TUNEL være ferdig innen FACS analyser av Annexin V og TOP-PR-3 som vil bestemme nivåene av nekrose versus apoptose celledødsprosess. Apoptose er en grunnleggende prosess for programmet for celledød, noe som er viktig for AT homeostase. Faktisk feilregulering av adipocyte apoptose har vært innblandet tidligere i prosesser som bidrar til fedme og lipodystrofi 34. Videre, i 2011, Keuper et al. Knyttet fettvev betennelse i adipocyte apoptose. De viste at makrofager indusert apoptose i preadipocytes og adipocytter, som i sin tur tiltrekker makrofager. Rekrutteringen av makrofager akselererer betennelse, noe som kontributes til metabolske syndromer som glukose og insulin toleranse 35. Imidlertid er adipocytt apoptose fremdeles en dårlig studert fenomen, til tross for den hypotese at induserte apoptose adipocytt kan føre til redusert vekt.
Den nåværende protokollen bruker immunhistokjemiske metoder for å studere annet fenomen som spredning, apoptose og hypoksi in vivo. Derfor ble vev fiksert med 4% formaldehyd, som er et kritisk trinn. En utvidet vev fiksering tid fører til forandring av epitoper, som blir ikke-tilgjengelig for antistoffet. I motsetning til dette øker en kort fiksering tid følsomheten av epitoper til reagensene. Den anbefalte optimale tiden for fiksering er 24 timer. Videre er tykkelsen av delene påvirker også antistoffer som binder til sine epitoper; optimale tykkelse er mellom 2 og 5 um. Seksjoner tykkere enn 5 mikrometer vil gi falske positive resultater på grunn av økte bindingssteder. I motsetning til dette, seksjoner tynnere enn 2 um inneholde mindre bindingsseter og positive områder er ikke godt definert. Ytterligere kritiske faktorer er selve antistoffet, inkubasjonstid, konsentrasjon og jevn temperatur, noe som påvirker kvaliteten av den spesifikke binding til epitopene. Derfor validere antistoffkonsentrasjon og inkubasjonstiden er nødvendig for hver tilstand.
For å fullføre studien, gir vi et in vitro adipocyttdifferensiering protokollen, som kan utvides ved forskjellige behandlinger, stimulering eller ko-kulturer. Ved å bruke in vitro adipocyttuttrykte kulturer, er det mulig å fastslå feil i adipocyttdifferensiering og funksjoner. For å få pålitelige resultater, som for alle primære celler, er ganske viktig sunn atferd og utseende på ADSCs og adipocytter. Detaljnivået, cytoplasmatiske vacuolations og / eller løsrivelse er tegn til svekkelse, noe som indikerer utilstrekkelig medium, mikrobiell forurensning eller senescence av primærceller. Denne protokollen er ved hjelp av isolerte adipocytter fra fettpute vev, mens det er også mulig å bruke mesenchymale stamceller isolert fra benmarg som beskrevet av andre protokoller 36. Den siste omfatter stromal stamceller, som kan reflektere ytterligere differensiering problemer som oppstår ved svært tidlig trinn i adipocyte differensiering, kan dette bli savnet i vår nåværende protokollen. Videre kan ADSCs utvides raskt (mer enn 10 ganger i løpet av en uke), og langsiktige kultur ADSCs etter noen passasjer fortsatt beholde sin mesenchymale pluripotency 37,38. En annen fordel ved å bruke ADSCs er at man enkelt kan bytte til menneske, siden ADSCs kan høstes fra pasienter ved fettsuging som er en enkel og minimal invasiv metode.
Som AT påvirker flere andre organer i en endokrin måte, bør protokollen utvides til adipokines. Adipokines, slik som leptin, adiponectin, tumor nekrose faktor-α (TNF) ennd resistin, utskilt av adipocytter er kjent for å påvirke metabolske sykdommer ved å kontrollere fettstoffskiftet, energi homeostase og insulinfølsomhet 39. Derfor bør serum og adipocyttdifferensiering secretome analyser utføres. I tilfelle av AT dysfunksjon, adipokines og pro-inflammatoriske cytokiner, slik som IL-6, kan føre til feilregulering av organer som lever og bukspyttkjertel, og av muskelfunksjon 4. For å utelukke systemisk organdysfunksjon, kunne dyremodeller eller cellekulturer bli undersøkt for sin respons til glukose stimulering og opptak.
Her har vi gi en protokoll for å analysere basistilstanden av AT og adipocytter in vivo og in vitro for å avdekke molekylære mekanismer for adipocyttdifferensiering homeostase og funksjonalitet.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å vennligst takke Dr. J. Luther og K. Ubieta for utarbeidelse av data og Dr. B. Grötsch for korrekturlesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAlater solution | Ambion | AM7021 | RNA stabilization solution |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| SYBR Select Master Mix | 4472908 | ||
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 | BD Biosciences | 550609 | Clone B56 (RUO) |
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) | 550609 | Proliferation marker | |
| FITC Annexin V | BioLegend | 640906 | |
| Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb | Cell signalling | 9664S | Clone 5A1E |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 9664 | Apoptosis marker | |
| Lipofectamine2000 Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| TO-PRO-3 Iodide | T3605 | Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm | |
| Mayer’s hemalum | Merck | 109249 | hematoxylin |
| pegGOLD TriFast | Peqlab | 30-2030 | TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol |
| Percellys Ceramic Kit 1.4 mm | 91-PCS-CK14 | tubes containing ceramic beads (1.4 mm) | |
| Precellys 24 | 91-PCS24 | homogenizer | |
| HIF-1 alpha Antibody | Pierce | PA1-16601 | |
| HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 | 700505 | Hypoxia marker | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Roche | 11 684 795 001 | TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) |
| Eosin | Sigma | 318906 | |
| DNase I Solution (1 unit/µl) | Thermo Scientific | EN0525 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | BA-1000 | ||
| Vectastain ABC Kit | PK-4000 | ||
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | H-1200 |
References
- Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).
- Gong, Z., Muzumdar, R. H. Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging. Int J Endocrinol. , 320482 (2012).
- Deng, Y., Scherer, P. E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).
- Rezaee, F., Dashty, M. Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases. J Diabetes Metab. , 008 (2013).
- Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. The cell biology of fat expansion. J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).
- Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1 (2015).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metab. 4, 263-273 (2006).
- Luther, J., et al. Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy. J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).
- Luther, J., et al. Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia. Cell Death Differ. , (2014).
- Semenza, G. L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).
- Kim, W., Kaelin, W. G. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).
- Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab. 9, 11-22 (2009).
- Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction. Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).
- Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).
- Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin. Diabetes. 55, 978-987 (2006).
- Haluzik, M., et al. Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
- Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Planat-Benard, V., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 109, 656-663 (2004).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).
- Trajcevski, K. E., et al. Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model. PLoS One. 8, 71747 (2013).
- Montgomery, M. K., et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).
- de Queiroz, K. B., et al. Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet. Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).
- Ye, J. Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).
- Xiong, Y., et al. The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).
- Bozec, A., et al. Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia. Nature. 454, 221-225 (2008).
- Varia, M. A., et al. Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).
- Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability. Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).
- Tennant, D. A., et al. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).
- Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool. Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).
- Amelio, I., et al. TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).
- Suga, H., et al. Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. J Diabetes Res. 2015, 970375 (2015).
- Keuper, M., et al. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).
- Sera, Y., et al. Hematopoietic stem cell origin of adipocytes. Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Scherer, P. E. Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ. Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).
