Introduction
Enligt 2014 rapport från Världshälsoorganisationen, är 39% av världens vuxna befolkning överviktig, och 13% är feta 1. Inom en snar framtid, kommer överviktiga människor utgör en betydande andel av den äldre befolkningen. Ett viktigt särdrag av fetma och åldrande är dysreglering av fett i förhållande till morbiditet och mortalitet 2. Adipocytokiner proteiner som utsöndras av fettvävnad (AT), kan utlösa metabolt syndrom såsom fetma och typ 2-diabetes tre. Metabola sjukdomar är mestadels orsakas av överdriven energilagring i lipiddropparna av adipocyter, vilket resulterar i AT expansions 4. Det är därför av intresse att fastställa orsakerna och de molekylära mekanismerna för AT expansion för att hitta möjligheter att kontrollera det.
Over-nutrition leder till AT expansion, vilken regleras av två händelser: överdriven lagringsenergi till lipiddropparna av adipocyter, en processvilket leder till hypertrofi (ökning av fettceller storlek), och ökad adipogenes, även känd som fettceller hyperplasi 5. Adipogenes är en process av differentiering av multipotenta mesenkymala stamceller (MSC) till adipocyter. För det första MSC utvecklas till preadipocyter under fas engagemang. För det andra, preadipocyter differentiera vidare att förvärva funktioner i mogna och funktionella adipocyter 6. Flera transkriptionsfaktorer har identifierats som huvudregulatorer för preadipocyt bestämning, såsom zinkfingerprotein 423 (Zfp423) och tidig B-cellsfaktor 1 (Ebf1). Medan Zfp423 inducerar tidig engagemang, är Ebf1 erfordras för generering av adipocyt progenitorer 6. Terminal differentiering är hårt styrd av en transkriptions kaskad, varvid peroxisomproliferator-aktiverad receptor γ (PPARy) är den väsentliga transkriptionsfaktorn 7. Ytterligare viktiga transkriptionsfaktorer är CCAAT / enhancer-bindande protein (C/ EBP) familjemedlemmar (dvs. C / EBPα, C / EBPp och C / EBPδ), kruppel-liknande faktorer (KLFs), cAMP responsiva elementet bindande protein (CREB) och tidig tillväxtrespons 20 (Krox20) 6.
Nyligen har det visats att den aktivatorprotein-1 (AP-1) familj är involverat i adipocytdifferentiering processen 8,9. AP-1-familjen är bildad av ett dimert proteinkomplex bestående av Fos, Jun och / eller aktiverande transkriptionsfaktor (ATF) medlemmar. Fos-relaterade antigen 1 och 2 (Fra-1 och Fra-2) kan reglera adipocytdifferentiering. Fra-1 försämrar adipocytdifferentiering genom att hämma C / EBPα 8, medan Fra-2 kontroller adipocyt omsättning 9. Fra-2 därigenom inte bara minskar fettceller nummer genom att undertrycka PPARy2 uttryck under adipocytdifferentiering, men också minskar fettceller apoptos genom direkt repression av hypoxi-inducerbara faktorer (HIFS) uttryck. HIF familjen är en heterodimeric transkriptionsfaktorkomplex, som består av HIF-1α, HIF-2α och HIF-1β. De heterodimerer består av en syrekänslig HIF-α-protein (HIF-1α eller HIF-2α) och syret okänsliga HIF-1β subenhet 10. Under normoxi, HIF-α proteiner är poly-ubiquitinylated och slutligen bryts ned av proteasomer 11. Under hypoxiska betingelser, som förekommer i AT under expansion, HIF-α proteiner är inte längre hydroxylerade. De blir därför stabiliserade och bildar dimerer med konstitutivt uttryckt HIF-1β. Transkriptionsaktivering av gener styrs av HIF responselement är inblandade i regleringen av angiogenes, metabolism och inflammation 12. I själva verket befrämjar HIF-1α AT dysfunktion genom att inducera glukostolerans, att inhibera energiförbrukning och perifer användning av lipid, samt genom att öka leptin nivå och HFD-inducerad leversteatos 13. Dessutom HIF-1α reglerar adipocyte apoptos in vivo och in vitro 9.
Det nuvarande protokollet beskriver metoder för att studera vid status att reda ut de molekylära egenskaper fettceller homeostas hos vuxna möss. Den visar hur apoptos, proliferation och differentiering av adipocyter in vivo och in vitro kan regleras av hypoxi. För att göra detta använder vi möss med fettceller specifik borttagning av Fra-2 genereras genom att korsa möss som bär Fra-2 floxed alleler med Fabp4-CreERT möss 9. Genom att använda Fabp4-Cre ERT möss, är raderingen fettceller specifika och induceras av tamoxifen injektion 14. För den vuxna modellen, är intraperitoneal injektioner av tamoxifen utförs under 5 på varandra följande dagar med början vid en ålder av 6 veckor. Således är de möss som utsätts för en normal diet eller fettrik diet under 6 veckor innan analysen utförs. De möss som användes i denna studie var män baserad på en C57BL6 bakgrund att undvika kvinnliga hormoner, såsom östrogener, Visat att reglera kroppens fettfördelningen 15. Med en annan genetisk bakgrund kan också förändra den metaboliska fenotypen, på grund av belastningsrelaterade skillnader i fetthantering 16.
Detta protokoll visar hur man analyserar på under hypoxi med hjälp av histologi och hur att kvantifiera fettceller apoptos, proliferation och differentiering in vivo med hjälp av immunhistokemi och gen profilering analyser. Studien är genomförd av in vitro experiment, som visar hur man analyserar primära adipocytdifferentiering och apoptos ändras genom exponering för hypoxi.
Protocol
ETIK ANALYS: djuren hålls i standardiserade förhållanden som motsvarar riktlinjerna i den tyska djurskyddslagen. Djuren utfodras med en standarddiet och vatten ad libitum och hölls med en 12 tim dag / natt cykel. Alla experiment med djur har godkänts av den lokala etiska kommittén.
1. In vivo analys av fettceller Homeostasis hos vuxna män
- För att kvantifiera hypoxi in vivo, först bestämma kroppsvikten hos mössen, sedan injicera 60 mg / kg kroppsvikt av fast pimonidazole hydroklorid intraperitonealt (till exempel: injicera 1,5 mg i en 25 g mus). Pimonidazole är en effektiv hypoxisk markör, som bildar addukter med tiolgrupper i proteiner, peptider och aminosyror och detekteras av en specifik antikropp.
- Offra möss och avlägsna de perigonadal fettkuddarna (Figur 1).
- 45 min efter injektion, offra möss av CO 2 kvävning och efterföljande halsdislokation. </ Li>
- Stift ner lemmar möss (såsom visas i fig 1) och öppna den peritoneala kaviteten. Ta bort den vänstra och högra perigonadal (epididymal) fettkudden i bukhålan.
Anmärkning: Fett pad är bundna till epididymis från de peritoneala broschyrer såsom visas i figur 1 (perigonadal fettkuddar är indikerade med pilar). - Var noga med att ta bort de gonadala vävnader från fettkudden. Bestämma fettkudde vikter för att beräkna förhållandet: fettkudden vikt (g) per kroppsvikt (g).
Figur 1: Placering av perigonadal fettkuddarna i peritonealhålan hos möss. Bild av perigonadal fett lokalisering i vuxna möss efter offer. Perigonadal fettkuddar indikeras av pilarna. Klicka här för att visa b en större version av denna siffra.
- Att sammanställa en kvantitativ genuttryck profil använder en perigonadal fettkudde för att isolera RNA. Obs: Till vävnaden bearbetas, lagra vävnadsprover i RNA-stabilisering lösning vid -80 ° C eller i flytande kväve.
- Att homogenisera fettkudden, lägga fettkudden till 1 ml enfaslösning av guanidinisotiocyanat och fenol. Använda rör innehållande keramiska pärlor (1,4 mm) för att krossa vävnad i en homogenisator vid 6500 varv per minut (2 gånger 20 sek, med 30 sek paus).
- Isolera RNA enligt följande (single-steg metod Chomczynski och Sacchi 17).
- Att separera faserna, överföra homogeniserad fettkudden till mikrocentrifugrör, tillsätt 0,2 ml volym kloroform, skaka i 15 sekunder, inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur och centrifugera 12.000 xg under 5 minuter. Överför den övre vattenhaltiga fasen (omkring 400 | il), som innehåller RNA, in i ett nytt mikrocentrifugrör. Ta inte med DNA-innehållaing inter eller proteininnehållande fenolfasen.
- För att fälla ut RNA, tillsätt 1 volym isopropanol, blanda och inkubera i 15 min vid 4 ° C (det är också möjligt att inkubera vid -20 ° C över natten). Centrifugera vid 12.000 xg under 10 min. Avlägsna isopropanol supernatanten försiktigt. Tvätta två gånger med 75% etanol med centrifug stegen av 12.000 xg i 10 min.
- Efter torkning av det utfällda RNA: t för omkring 10 minuter vid rumstemperatur, lös den i 50 | il H2O (RNas-fri). Att underlätta detta, inkubera under 2 min vid 65 ° C.
Obs: Håll RNA i 75% etanol vid -80 ° C eller i flytande kväve för långtidslagring. - Kvantifiera RNA förberedelser A 260/280 (optimal kvoten är mellan 1,8 och 2,2) och beräkna koncentrationen av A 260:
- För att undvika DNA-kontaminering, smälta 1 ug av RNA-beredningmed en U DNas I under 30 minuter vid 37 ° C i en volym av 10 | il. Inaktivera vid 65 ° C under 10 min.
Obs: Det här steget är valfritt. - Använd 10 pl RNA-preparat innehållande 1 ^ g RNA för omvänt transkriptas-reaktion för att generera enkelsträngade cDNA, som lämpar sig för kvantitativ PCR applikation. Komponenterna och deras mängder är listade i tabell 1.
- Använda en PCR Master Mix för en kvantitativ realtids-PCR-reaktionen. För att bestämma metabola förändringar i hela fettkudden, använda specifika primers för gener som är involverade i AT homeostas (tabell 2) och PCR-villkor som anges i tabell 3.
- Realtids-PCR dataanalys.
- Definiera baslinjen (Figur 2), normalt cykel 1 till 15, där det inte finns någon förändring i fluorescenssignaler. Den realtids-PCR programvara normaliserar specifika fluorescenssignaler till baslinjen fluorescens och den interna referens färgämnet ROX, vilket resulterar istorleken av de specifika signaler av primrarna, delta Rn (ΔRn).
- Ställa in tröskeln inom den exponentiella fasen av amplifieringen kurvan. Skärningspunkten definierar tröskelcykeln (Ct). Baserat på CT värdet, beräkna det relativa uttrycket (ΔCt) och förändringen vecket (ΔΔCt):
| Komponent | Volym ^ il / reaktion |
| 10x RT Buffert | 2,0 |
| 25x dNTP Mix (100 mM) | 0,8 |
| 10x RT Random Primers | 2,0 |
| MultiScribe Reverse Transcriptase | 1,0 |
| Nukleasfritt H2O | 4,2 |
| 1 ^ gRNA | 10 |
| Totalt per reaktion | 20 |
Tabell 1: Komponenter med respektive volym för omvänt transkriptas reaktion för att generera enkelsträngade cDNA.
| Officiell fullständiga namn | Symbol | Sekvensen 3'-> 5' | ||
| Framåt | Omvänd | |||
| adipogenes | Delta-like en homolog (pref-1) | Dlk1 | GACACTCGAAGCTCA CCTGG | GGAAGGCTGGGACGG GAAAT |
| Tidig B-cellsfaktor 1 | Ebf1 | CCACCATCGACTACGG CTTC | TCCTGGTTGTTGTGGGG CATC | |
| Zinkfingerprotein 423 | Zfp423 | GTGCCCAGGAAGAAGA CGTA | GGCGACGTGGATCTGA ATCT | |
| Fettsyrabindande protein 4 (Ap2) | Fabp4 | TCACCTGGAAGACAGCT CCTC | AAGCCCACTCCCACTTC TTTC | |
| CCAAT / förstärkare bindande protein (C / EBP), alfa | Cebpa | AAGAGCCGCGACA AGGC | GTCAGCTCCAGCACCT TGTG | |
| CCAAT / förstärkare bindande protein (C / EBP), beta | Cebpb | TTTCGGGACTTGATGC AATC | CCGCAGGAACATCTTT AAGG | |
| cAMP responselementet bindande protein 1 | Creb1 | ACTCAGCCGGGTACT ACCAT | TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC | |
| CCAAT / enhancer bindningsprotein (C / EBP), delta | Cebpd | CAGCGCCTACATTGAC triklorisocyanursyra | GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA | |
| Kruppel-liknande faktor 4 | Klf4 | GCAGTCACAAGTCCCC TCTC TAGTCACAAGTGTGGG TGGC | ||
| Tidig tillväxtsvar 2 (Krox20) | EGR2 | AGGCGGTAGACAAAATC CCAG | GATACGGGAGATCCAG GGGT | |
| Ppar gamma | PPARG | AGAGGTCCACAGAGCTG ATTC | GATGCACTGCCTATGAGC ACTT | |
| lipogenes | Acetyl-koenzym A karboxylas alfa | Acaca | TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT | ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC |
| Fettsyrasyntas | Fasn | ACATCCTAGGCATCC GAGGIG | CCGAGTTGAGCTGGGT TAGG | |
| Stearoyl-koenzym A-desaturas 1 | Scd1 | CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT | TTCTTGCGATACACTCTG Konkurrens mellan gasleverantörerna | |
| lipolys | Patatin liknande fosfolipas domän containing 2 | Pnpla2 | AAGGACCTGATGACCA CCCT | CCAACAAGCGGATGGT GAAG |
| Fettupptaget | lipoproteinlipas | LPL | GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC | GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC |
| CD36-antigen | CD36 | GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC | ATGGGCTGTGATCGGA ACTG | |
| hypoxi | Hypoxi inducerbara faktor 1, alfa-subenhet | Hif1a | CCTGCACTGAATCAAGAG Konkurrens mellan gasleverantörerna | CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT |
| Endothelial PAS-domän protein 1 (även känd som: HIF-2alpha) | Epas1 | CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC | TTGGGTGAATTCATCG GGGG | |
| Von Hippel-Lindaus tumörsuppressor | VHL | ACCGAGGTCATCTTTG GCTC | TTCCGCACACTTGGGT AGTC | |
| Arylkolvätereceptor nukleär transloka (också känd som: HIF-1 beta) | Arnt | TGGGTCATCTTCTCGC GGTT | TGTCCTATCTGAGCAT CGTG | |
Tabell 2: Lista av gener med sekvensen av respektive primers som användes för att analysera adipocyt homeostas.
| Steg | Temperatur (° C) | Tid (min: sek) | ||
| polymeras aktivering | Håll | 95 | 10:00 | |
| PCR | 40 cykler | Denaturize | 95 | 00:15 |
| Glödgning / förlängning | 60 | 01:00 | ||
| smältkurva | 60 till 95 | 0,5 ° C / sek | ||
Tabell 3: realtids-PCR förhållanden.
Figur 2:. Kännetecken för realtids-PCR amplifieringskurvan Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- För att utföra histologiska analysen av fettceller homeostas använder andra perigonadal fettkudden. Inte uttorka vävnaden!
- Fäst fettkudden i 3,7% PBS-buffrad formaldehyd under natten, bädda in i paraffin (följ instruktionerna som beskrivs på annat håll 18) och skär den inbäddade vävnaden i 2-5 um tjocka sektioner (högst 5 pm).
- Bestäm antalet adipocyter per fält och fettceller storlek i en ljus-fält mikroskop efter hematoxylin och eosin (H & E) färgning: <ol>
- Avparaffinera sektioner genom tvättning 3 gånger i 5 minuter i xylen och rehydrera sektionen 2 gånger under 2 min i 100% etanol och 2 gånger för 2 min i 96% etanol. Slutligen, tvätta det avsnitt i destillerat H2O under 5 min.
- Fläcken med hematoxylin, späddes 1: 5 med destillerat H2O, under 10 min vid rumstemperatur och tvätta i H2O under 5 min. Fläcken med eosin-lösning (20 ml 5% eosin Y / 210 ml destillerat H2O / 25 ^ il isättika) under 30 sek och tvätta igen med H2O under 5 min.
- Dehydrera sektioner med hjälp 96% etanol och 100% etanol 2 gånger vardera under 2 minuter, och xylen 3 gånger under 5 min. Montera sektionerna med vattenfri monteringsmedel.
- Utvärdera avsnitten under en ljus-fält mikroskop. Ett representativt exempel på hur man analyserar adipocyter med ImageJ 1.48v 19 visas i fig. 3: antal celler per area (^ m 2), cellarean (x 10 3 | im 2
- Öppna bilden av avsnittet med ImageJ 1.48v. Om parametrarna för bilden anges i pixlar i stället för en längdenhet, justera skalan.
- Välj * Rät linje * i verktygsfältet och justera linjen till ett känt avstånd med hänvisning till skal. Gå Analysera -> Set Skala Avståndet linjen visas i pixlar,. lägga det kända avståndet och längdenhet, t.ex., um. Bekräfta med OK. Storleken på bilden och analysen av parametrarna anges i längdenhet ges.
- För att bestämma parametrarna för de adipocyter, justera tröskeln. Gå till Bild -> Justera -> Tröskel att öppna Threshold fönstret. Välj följande inställningar: Tröskling metod: Standard; Threshold färg: B & W, Färgrymd: HSB. Bilden visas nu i svart och vitt. justeraLjusstyrka för att rensa vita adipocyter och stänga svarta intercellulära utrymmena, som i fig. 3b.
- Räkna antalet fettceller per um 2 (figur 3e) med * flerpunkts * val i verktygsfältet och markera varje cell för räkning.
- För att bestämma fettceller storlek, välj * Rät linje * igen i verktygsfältet och dra diameter en fettceller (Figur 3c). Gå Analysera -> Mät och ett nytt fönster kommer att visas, med längden av diametern i nm.
- För att bestämma fettceller, välj * Wand (spårning) verktyg * och klicka i fettceller. Den inre väggen av den fettceller väljs i rött (figur 3d). Gå Analysera -> Mät och ett nytt fönster kommer att visas, med området för denna fettceller i pm 2.
- Avparaffinera sektioner genom tvättning 3 gånger i 5 minuter i xylen och rehydrera sektionen 2 gånger under 2 min i 100% etanol och 2 gånger för 2 min i 96% etanol. Slutligen, tvätta det avsnitt i destillerat H2O
- För antigenåtervinning, smälta vävnadssektionen under 30 min vid 37 ° C med proteinas K arbetslösning (20 | j, g / ml i 10 mM Tris / HCl, pH 7,4-8) och skölj med PBS.
- Att blockera endogen peroxidasaktivitet, använder 3% väteperoxid i PBS under 10 minuter, med efterföljande tvättning 2 gånger under 5 minuter i PBS. Att blockera ospecifika bindningen av antikroppar, använder 10% serum i PBS. Använd serum från värd för den sekundära antikroppen, i det här fallet get.
- För färgning använder antikroppar för apoptos, proliferation och hypoxi upptäckt (
- För att öka den signal använder en biotinylerad sekundär antikropp, med utspädnings såsom anges i tabell 5. För hypoxi detektering, använder HRP-konjugerad kanin-anti-FITC som sekundär antikropp. Inkubera under en timme vid rumstemperatur. Tvätta avsnitt 2 gånger 5 min med PBS.
Obs: För hypoxi färgning med FITC-MAb1, hoppa över steg 1.4.4.4) och fortsätt med steg 1.4.4.5).- För varje bild, pre-inkubera 50 pl avidin lösning med 50 ul biotinylerad peroxidas H i 30 minuter vid rumstemperatur (denna metod också kallas avidin / biotin ABC komplex formulering) och sedan lägga till de avsnitt i ytterligare 45 minuter. Tvätta 2 gånger under 5 min med PBS.
- Inkubera avsnitt i peroxidassubstrat lösning tills färgning bli mer intensiv (mellan 5 och 10 min). Tvätta i 5 minuter med destilleratH2O
- För motfärgning, fläcken med hematoxylin späddes 1: 5 med destillerat H2O under 10 min vid rumstemperatur och tvätta i H2O under 5 minuter.
- Dehydratisera sektioner i 96% etanol och 100% etanol 2 gånger vardera under 2 minuter, och xylen 3 gånger under 5 min. Täta sektioner med täck och vattenfri monteringsmedel. Utvärdera avsnitten under en ljus-fält mikroskop.
- För att öka den signal använder en biotinylerad sekundär antikropp, med utspädnings såsom anges i tabell 5. För hypoxi detektering, använder HRP-konjugerad kanin-anti-FITC som sekundär antikropp. Inkubera under en timme vid rumstemperatur. Tvätta avsnitt 2 gånger 5 min med PBS.
- Tillsätt 50 l enzymlösning i 450 pl label-lösning. Sedan tillämpa 50 pl TUNEL reaktionsblandningen på histologiska sektioner och inkubera i 60 min vid 37 ° C i en fuktad atmosfär i mörker. Tvätta avsnitt 3 gånger med PBS under 5 min och montera med fluorescens monteringsmedium inklusive DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) för motfärgning.
- Utvärdera avsnittet under ett fluorescensmikroskop med 100 gångers magnificat Jon. För mätning av Fluorescein använda en excitationsvåglängd av 488 nm och upptäcka mellan 515-565 nm (grön laser); DAPI hetsar vid ca 360 nm och emitterar vid omkring 460 nm när den är bunden till DNA (blå laser).
- Kvantifiera de över av DAPI och Fluorescein:
Figur 3:. Analysera fettceller egenskaper i fettkudden avsnitt AVSNITT bilder av perigonadal fettkudden manliga möss som behandlats med en fettrik kost (HFD) eller normal kost (ND) med en ljus-fält mikroskop (a); tröskeln justeras i svartvitt (b) och fettceller storlek (längd, c), område (d) och fettceller cellantalet per mm 2 (e) kvantifieras med ImageJ 1.48v.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| förrådskoncentration | utspädning | |
| apoptos | Kluvna Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 1: 2000 |
| Spridning | Renad mus-antihuman Ki-67-klon B56 (RUO) | 01:50 |
| hypoxi | HIF-1-alfa-antikropp | 1: 100 |
| FITC-MAb1 | 1: 100 |
Tabell 4: Antikroppar med respektive utspädning används för immunhistologisk färgning av AT sektioner.
| Antikropp | utspädning |
| biotinylerad antimus-IgG (H + L) | 1: 200 |
| biotinylerad anti-mus IgG (H + L) | 1: 200 |
| HRP-konjugat kanin-anti-FITC | 1: 100 |
Tabell 5: Sekundära antikroppar med utspädning används för immunhistologisk färgning.
2. In vitro analys av fettceller Homeostasis Influerad av hypoxi
- Offra möss och avlägsna den subkutana fettvävnaden.
- Offra möss genom CO 2 kvävning och efterföljande halsdislokation.
- Stift ner lemmarna av möss, såsom visas i fig 4. Dra av huden från den övre benet, rygg och flank och stift ner den med nålar som i fig 4. Ta bort sedan den subkutana fettvävnaden, som ligger posteriort vid basen av den bakben, som omger de inguinala lymfknutor (såsom visas i fig 4, vänster: subkutant fett pads som anges av pilarna; höger: inguinal lymfkörtel som indikeras av pilen).
Figur 4: Placering av subkutana fettkuddar. Bild av underhudsfett pad; vänster pilarna indikerar den subkutana fettkudden och den högra pilen indikerar inguinal lymfkörtel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Isolera adipos-härledda stamceller (ADSC) såsom tidigare beskrivits 20.
- Utsäde ADSC 4.000 celler / cm 2 i Dulbeccos modifierade Eagles medium-Hams F-12 kompletterat med 10% normalt kalvserum, 1% penicillin / streptomycin, 0,5% amfotericin B, 16 | iM biotin, 18 pM pantotensyra och 100 ^ M askorbinsyra och odla kulturen till konfluens runt 70-80%, Som uppnås efter 4 till 6 dagars odling.
- Framkalla adipogena Differentiering.
- Avlägsna vidhäftande ADSC från ytan genom trypsinbehandling.
- Avlägsna mediet, tvätta med PBS och tillsätt 0,025% trypsinlösning (förvärmd till 37 ° C) under 2 min (till dess att cellerna lossnar från ytan). Omedelbart lägga mediet och tvätta cellerna.
- Räkna cellerna med hjälp av en Neubauer kammare.
- Sätt skyddsglaset på den centrala delen av Neubauer kammare. Späd cellsuspensionen 1:10 och ladda kammaren med 10 pl utspädda cellsuspensionen. Räkna cellerna i 4 rutor belägna i hörnen, var och en består av 16 mindre kvadrater. Beräkna antalet celler per ml:
- Sätt skyddsglaset på den centrala delen av Neubauer kammare. Späd cellsuspensionen 1:10 och ladda kammaren med 10 pl utspädda cellsuspensionen. Räkna cellerna i 4 rutor belägna i hörnen, var och en består av 16 mindre kvadrater. Beräkna antalet celler per ml:
- Seed ADSC (som beskrivs i punkt 2.2) i 12-brunnsodlingsplattor och växa kultur till konfluens cirka 70 till 80% (uppnås efter 4 till 6 dagar).
- inducera adipogenic differentiering genom tillsats av 5 | j, g / ml insulin, 1 | iM dexametason och 5 pM 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX) till kulturerna. Förnya mediet var 2 dagar. Celler kommer att vara fullt differentierade efter 7 dagar.
- Avlägsna vidhäftande ADSC från ytan genom trypsinbehandling.
- För att analysera adipogena differentiering, fläcken med Oil Red O, som färgar triglycerider av mogna adipocyter.
Obs: Arbetet måste utföras under ett dragskåp!- Avlägsna mediet, tvätta adipocyter försiktigt med PBS och fixera cellerna under 60 minuter med 2 ml 10% formalin.
- Att förbereda Oil Red O färgning lösning, blanda 3 delar av den röda oljan O stamlösning (300 mg Red Oil O pulver upplöstes i 100 ml 99% isopropanol) med 2 delar destillerat H2O och inkubera under 10 minuter vid rumstemperatur. Filtrera Oil Red O arbetslösning genom ett 0,2 pm injektionsfilter.
Obs: Arbets lösning är stabil i 2 timmar. - För Oil Red O färgning, avlägsna formalin, tvätta adipocyter med H 2
- Utvärdera plattorna under ett faskontrastmikroskop med 100 gångers förstoring. Lipiderna i adipocyter visas röda och kärnorna visas blå.
- Valfritt steg: tysta genen av intresse genom transfektion med shRNA.
- Ändra mediet och tillsätt serumfritt medium.
- För transfektion av adipocyter, använda lipofektion. Följ tillverkarens instruktioner och använda ett ig shRNA per 12-brunnars vävnadsplattor. Efter tillsats av lipid-DNA-komplex, inkubera adipocyter under 48 h vid 37 ° C.
- För att analysera adipocyter utsätts för hypoxi, använda en hypoxisk arbetsstation eller hypoxisk inkubator för att hålla cellerna under hypoxiska betingelser. Beroende av studien, hypoxi could vara 0,5, 1 eller 2% syre.
- Analysera apoptos genom FITC-märkt Annexin V och efterföljande flödescytometri analyser.
- Samla adipocyter med en extra mjuk cellskrapa, tvätta med PBS och tillsätt 1 x 10 6 celler till 100 ^ il Annexin V-bindningsbuffert (10 mM Hepes / NaOH, pH 7,4; 140 mM NaCl; 2,5 mM CaCl2). Lägga till mängden Annexin V-FITC som rekommenderas av tillverkaren och inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
- För flödescytometri mätning, tillsätt 200 l Annexin V bindande buffert och 1 | iM av nukleär motfärg. Bestäm fluorescens i grönt och violett kanal. Annexin V + / nukleär motfärg + celler definieras som sekundära nekrotisk och Annexin V + / nukleär motfärg - celler definieras som apoptotiska celler (Figur 5).
- Kvantitativt analysera fettceller RNA för att bestämma homeostas under hypoxiska betingelser.
- Lägg till1 ml enfaslösning av guanidinisotiocyanat och fenol till varje brunn och isolera RNA [med användning av enkel-stegsmetod genom Chomczynski och Sacchi 17 (steg 1.3.2)] och fortsätt som i stegen 1.3.2.1) till 1.3.5.2) .
- Analysera apoptos genom FITC-märkt Annexin V och efterföljande flödescytometri analyser.
Figur 5: adipocyt apoptos-analys med flödescytometri. Punktdiagram presentationer av FACS för Annexin V-FITC och TO-PRO-3-färgning av adipocyter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Vi visar hur man bestämmer fettceller homeostas in vivo och in vitro med hjälp av exempel på Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT möss jämfört med vildtyp kullsyskon. Vår protokoll definierar hur ökad HIF uttryck av hypoxi är korrelerad med fettceller dysfunktion som indikeras av ökad fettceller apoptos.
Ökad fettceller storlek och området i fettrik kost (HFD) behandlade möss
Över näring, bland andra faktorer, resulterar i adipocyt hypertrofi, som orsakas av överdriven energilagring i lipiddroppar. Fettceller storlek och området är en indikator på hypertrofi. Delar av fettkudden från normal (ND, Figur 6a) och fettrik kost (HFD, figur 6b) möss samt kvantifieringar av fettceller storlek och området visar tydligt fettceller hypertrofi efter sex veckors från HFD, vilket indikeras av en ökad adipocyt storleken i HFD behandlade möss (Figur 6c och d).
Ökad hypoxi i fettvävnad (AT) av vuxna Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT möss leder till ökad HIF-1α nivå och fettceller apoptos
För att bestämma status in vivo av hypoxi i AT, Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT möss analyserat 6 veckor efter Fra-2 deletion vid en ålder av 12 veckor och jämfördes med vildtyp kullsyskon. Pimonidazole administreras till mössen intraperitonealt som en effektiv hypoxi markör; den är icke-toxisk och i stånd att fördela i ATn. Hypoxiska adipocyter i AT in vivo definieras av immunohistokemisk färgning antikropp (figur 7a). Vidare är den ökade hypoxisk status för AT i möss åtföljs av ökad HIF-1α positiv ADIPocytes som indikeras av immunhistokemisk färgning Figur 7b), vilket bekräftas av kvantifiering av HIF-1α uttrycksnivåer och dess mål gener 9. Dessutom, TUNEL-färgning av AT sektioner från Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT möss och kontrollkull (Figur 7C) visar att ökad fettceller apoptos är korrelerad med förekomsten av hypoxi och HIF-1α uttryck.
Ökad HIF-1α uttryck i primära adipocyter genom hypoxi-inducerad fettceller apoptos
För att analysera fettceller apoptos in vitro, använder vi adipocyter genereras från subkutana fettkuddar som beskrivs på annan plats 20. Som väntat är HIF-1α uttryck i adipocyter ökade efter 24 timmar av hypoxi (figur 8a). För att ytterligare analysera HIF-1α aktiviteter, RNA-nivåer av HIF målgener som Inos (inducerbart kväveoxidsyntas) kvantifieras av qPCR. Figur 8b visar att ökat uttryck av HIF-1α under hypoxiska förhållanden leder till ökad Inos mRNA-nivå. Eftersom vi redan har visat in vivo (figur 8) som ökade HIF-1α uttryck i adipocyter korrelerar med ökad fettceller apoptos är apoptos också kvantifieras in vitro kulturer genom Annexin V färgning under hypoxiska betingelser. Överensstämmer med de in vivo-data (Figur 7), är en ökad HIF-1α nivån åtföljs av ökad adipocyt apoptos inducerad av hypoxiska förhållanden (figur 8b). Dessutom, för att bevisa att hypoxisk apoptos är HIF-beroende; HIF-1α eller HIF-2α tystas genom RNA-interferens i adipocyter som härrör från vild-typ eller Fra-2 bristfällig möss. Den ökade fettceller apoptos återställs genom att tysta HIF-1α eller HIF-2α vilket framgår av Annexin V färgning i figur 8b, som visar att hypoxi sensor HIF-α reglerar fettceller apoptos.
Figur 6: Ökad fettceller storlek och området fettrik diet (HFD) möss (a, b) H & E-färgning av sektioner från perigonadal fettkudden manliga vildtyp möss som utfodrats med normal diet (ND) (a) eller hög. -fat diet (HFD) (b) under 6 veckor. Staplar representerar 500 ^ m. (C, d) kvantifieringar av fettceller storlek (c) och området (d) från perigonadal fettkudden av vildtyp möss som utfodrats med ND (a) eller HFD (b) under 6 veckor. n = 10. Data visas som medelvärden ± SEM. Statistisk analys utfördes med användning av studentens t-test. *** P <0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Ökad HIF-1α nivå och apoptos i adipocyter av vuxna Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT möss. Hypoxi (a) och HIF-1α (b) färgning i AT av manlig Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT möss och manliga kontrollkull 6 veckor efter tamoxifen injektion. Förstoring 20X sätter 40X. Svarta pilar indikerar hypoxiska områden och HIF-1α positiva celler. (C) TUNEL-färgning i Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT möss och kontrollkull 6 veckor efter tamoxifen injektion. Förstoring 20X sätter 40X. Svarta pilar indikerar TUNEL-positiva celler. Denna siffra har ändrats från Luther etal. 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8:. Ökad HIF-1α uttryck och fettceller apoptos i primära adipocyter inducerade av hypoxi (a) Realtids-PCR-analys av HIF-1α och HIFS mål Inos mRNA-nivåer i obearbetad adipocyter placerade i hypoxiska kammare analyseras vid de angivna tidpunkterna. (B) Kvantifiering av apoptos genom Annexin V FACS färgning i primär adipocyter isolerade från Fra-2 fl / fl Fabp4-CreERT möss eller vildtyp kontroller transfekterade med sh kontroll eller sh plasmid mot HIF-1α eller HIF-2α och hänförts till hypoxi (1% O2) i 24 timmar. Denna siffra har ändrats från Luther et al.
Discussion
Adipocyter kännetecknas fenotypiskt av deras storlek, siffror och området, avslöjar fettceller hyperplasi och hypertrofi inducerad av överdriven energilagring på grund av över näring 5. Dessa händelser leder till fettsyra dysreglering och efterföljande metabolt syndrom är också stater ökad fettmassa med bevarade ämnesomsättning, som också betecknas som "friska" fett expansion. Till exempel, et al. Kusminski 21 visade att möss med massiv fett expansionen förblir metaboliskt friska, vilket tyder på att fett expansionen inte nödvändigtvis knuten till metabolt syndrom och måste vara noggrant bestämt sig för att utvärdera särdragen hos de adipocyter. Fettvävnad (AT) spelar en central roll i regleringen av kroppens ämnesomsättning. AT är den största endokrina organ som kan påverka dyslipidemi, ateroskleros, hyperinsulinemi och hyperglykemi 3. Utvärdera AT homeostas och molekyl mechanisms reglerar det kan ge en bättre förståelse av metabola nervsystemet. Därför reda ut de mekanismer som reglerar adipocytdifferentiering skulle fettceller storlek och fettkudden massa bidra till att utveckla ny terapeutisk behandling för fetma störningar. Använda in vivo och in vitro-metoder, är det möjligt att bestämma vilken roll livsmedel och genuttryck påverkan på adipocytdifferentiering och aktivitet. För att bestämma AT homeostas, bestämma balansen mellan adipocytdifferentiering, proliferation och apoptos som föreslagits av våra protokoll är lika viktigt som att analysera glukos och insulin metaboliskt svar 22-24.
Uttrycksprofilering analyser av gener som är involverade i adipogenes, lipogenes, lipolys, fettupptaget, hypoxi, apoptos och proliferation i primär adipocyter och visceral AT är en hög genomströmning metod för att erhålla en översikt över fettceller homeostas och deras eventuella dysfunktion.Intressanta kandidater bör analyseras ytterligare på proteinnivå med Western blot eller immunhistologisk färgning. För att få optimala resultat genom realtids-PCR-system med hjälp av osymmetriska cyaninfärgämnen bör koncentrationerna av cDNA från 1 till 10 ng och de optimala primer koncentrationer som sträcker sig från 50 till 900 nM testas för att minimera ospecifik förstärkning. De kritiska komponenterna är primers; för varje körning, smältkurvoma måste vara strikt kontrollerad för att säkerställa specificiteten och att utesluta bildandet av primerdimerer. Därför, med hjälp en negativ kontroll med H2O istället för cDNA rekommenderas. Vidare är kommersiellt tillgängliga osymmetriska cyaninfärgämnen tillhandahålls som mästare mixar som innehåller en passiv referens färgämne (såsom ROX) för att ge en intern referenssignal. CDNA-signalen normaliseras under dataanalys till ROX-signaler för att korrigera väl till brunnar signalfluktuationer. En annan punkt som skall beaktas för att fastställa en good qPCR-systemet är valet av housekeeping-genen. För varje tillstånd är flera housekeeping-gener som används, till exempel, HPRT, β-aktin, GAPDH, β-2-MG eller HSP90.
HIF proteiner stabiliserade av hypoxiska förhållanden är master regulatorer bestämmer inte bara adipocyter överlevnad, men också metabola förändringar, såsom glukos, insulintolerans och lipidmetabolism 11,25,26. För att fastställa syrefattiga områden i fettkudden, är HIF-1α bestäms i AT sektioner genom immunohistokemi. Eftersom HIF proteiner snabbt bryts ned inom 5 till 10 minuter under normoxiska förhållanden, bör förfarandet och fixering av fettkudden för histologisk analys vara tätt kontrolleras för att undvika latenstid. Därför, för att säkerställa hypoxi inte bara genom HIF färgning, är pimonidazole används för att bestämma hypoxiska områden i AT. Pimonidazole kan distribueras i vävnaderna, som det redan visats i ben 27, Och effektivt markera hypoxiska områden genom att binda till tiolinnehållande proteiner specifikt i hypoxiska celler som vidare detekteras i histologiska sektioner genom specifik antikroppsbindning 28. Emellertid kan andra markörer och metoder användas för att analysera hypoxi-vägen. Till exempel, medverkan av prolyl hydroxylas (PHD) enzym, som inducerar hydroxylering av prolinrester enligt normoxi, liksom von Hippel-Lindau (VHL) protein, som erkänner hydroxylerade proliner och förmå poly-ubikvitinering att förmedla proteasomal HIF nedbrytning, måste analyseras för en fullständig översikt över vägen 29,30. Dessutom skulle allestädes närvarande detektering av HIFS också bestämma proteinets stabilitet och nedbrytning som kan ändra 31,32.
Dessutom är spridningen av Ki67 och apoptos genom TUNEL-färgning bestämdes in vivo genom färgning av AT histologiska sektioner. Kvantifiering av proliferation av Ki67 och enpoptosis av TUNEL eller Annexin V färgning genom flödescytometrianalys utförs också 33. Spridning kan naturligtvis mätas med andra tekniker såsom analyser av fettceller cellcykeln, som inte tas upp i mätningen av Ki67-positiva celler. Dessutom kan apoptos studie av TUNEL fyllas med FACS-analyser av Annexin V och TOP-PR-3 som kommer att bestämma halter av nekros kontra apoptos celldödsprocessen. Apoptos är en grundläggande process för programmet av celldöd, vilket är viktigt för AT homeostas. I själva verket har dysreglering av fettceller apoptos varit inblandad tidigare i processer som bidrar till fetma och lipodystrofi 34. Dessutom i 2011, fettvävnad inflammation Keuper et al. Kopplat till fettceller apoptos. De visade att makrofager inducerad apoptos i preadipocyter och adipocyter, vilket i sin tur drar till sig makrofager. Rekryteringen av makrofager accelererar inflammation, vilket contributes till metabolt syndrom, såsom glukos och insulintolerans 35. Dock är fettceller apoptos fortfarande en dåligt studerade fenomen, trots hypotesen att inducerade fettceller apoptos skulle kunna leda till minskad vikt.
Det nuvarande protokollet använder immunohistokemiska metoder för att studera olika fenomen som spridning, apoptos och hypoxi in vivo. Därför var vävnads fixerades med 4% formaldehyd, som är ett kritiskt steg. En förlängd vävnadsfixering tiden leder till förändring av epitoperna, som blir icke tillgängliga för antikroppen. Däremot ökar en kort fixering tid känsligheten av epitoper till reagens. Den rekommenderade optimala tiden för fixering är 24 timmar. Dessutom tjockleken av sektionerna påverkar också de antikroppar som binder till deras epitoper; optimala tjockleken är mellan 2 och 5 | im. Sektioner tjockare än 5 | j, m kommer att ge falska positiva resultat på grund av ökade bindningsställen. I kontrast, sections tunnare än 2 um innehåller mindre bindningsställen och positiva områden är inte väl definierade. Ytterligare kritiska faktorer är antikroppen i sig, inkubationstid, koncentration och jämn temperatur, vilket påverkar kvaliteten på den specifika bindningen till epitoperna. Därför validera antikroppskoncentration och inkubationstiden är nödvändigt för varje tillstånd.
För att slutföra studien, ger vi ett in vitro adipocytdifferentiering protokoll, vilket kan förlängas med olika behandlingar, stimulering eller co-kulturer. Genom att använda in vitro fettceller kulturer är det möjligt att bestämma defekter i adipocytdifferentiering och funktioner. För att få tillförlitliga resultat, som för alla primära celler, är mycket viktig hälsosamt beteende och utseende ADSCs och adipocyter. Kornighet, cytoplasmatiska vacuolations och / eller lossnar är tecken på försämring, vilket indikerar otillräcklig medium, mikrobiell förorening eller åldrandet av den primäraceller. Detta protokoll är användning av isolerade adipocyter från fettkudden vävnaden, medan det är lika väl möjligt att använda mesenkymala stamceller isolerade från benmärg såsom beskrivits av andra protokoll 36. Den senaste innefattar stromala stamceller, som är oförenlig med ytterligare differentiering problem som uppstår på mycket tidigt skede av adipocytdifferentiering kan detta missas i vårt nuvarande protokollet. Dessutom kan ADSCs utökas snabbt (mer än 10 gånger inom en vecka), och långsiktiga odlade ADSCs efter vissa passager fortfarande behåller sin mesenkymala pluripotens 37,38. En annan fördel med hjälp av ADSCs är att man enkelt kan byta till människa, eftersom ADSCs kan skördas från patienter med fettsugning som är en enkel och minimalinvasiv metod.
AT påverkar flera andra organ i en endokrin sätt, bör protokollet utvidgas till adipocytokiner. Adipocytokiner, såsom leptin, adiponectin, tumörnekrosfaktor-α (TNF) and resistin, som utsöndras av adipocyter är kända för att påverka metabola sjukdomar genom att styra fettmetabolism, energi homeostas och insulinkänsligheten 39. Därför bör serum och fettceller secretome analyser göras. I fallet med AT dysfunktion, adipocytokiner och pro-inflammatoriska cytokiner, såsom IL-6, kan leda till dysreglering av organ såsom levern och bukspottkörteln, och av muskelfunktion 4. För att utesluta system organsvikt kan djurmodeller eller cellkulturer testas för deras svar på glukosstimulering och upptag.
Här ger vi ett protokoll för analys av den grundläggande tillståndet hos AT och adipocyter in vivo och in vitro för att avslöja molekylära mekanismer för adipocyt homeostas och funktionalitet.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill vänligen tacka Dr J. Luther och K. Ubieta för framställning av data och Dr B. Grötsch för korrekturläsning manuskriptet. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAlater solution | Ambion | AM7021 | RNA stabilization solution |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| SYBR Select Master Mix | 4472908 | ||
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 | BD Biosciences | 550609 | Clone B56 (RUO) |
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) | 550609 | Proliferation marker | |
| FITC Annexin V | BioLegend | 640906 | |
| Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb | Cell signalling | 9664S | Clone 5A1E |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 9664 | Apoptosis marker | |
| Lipofectamine2000 Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| TO-PRO-3 Iodide | T3605 | Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm | |
| Mayer’s hemalum | Merck | 109249 | hematoxylin |
| pegGOLD TriFast | Peqlab | 30-2030 | TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol |
| Percellys Ceramic Kit 1.4 mm | 91-PCS-CK14 | tubes containing ceramic beads (1.4 mm) | |
| Precellys 24 | 91-PCS24 | homogenizer | |
| HIF-1 alpha Antibody | Pierce | PA1-16601 | |
| HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 | 700505 | Hypoxia marker | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Roche | 11 684 795 001 | TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) |
| Eosin | Sigma | 318906 | |
| DNase I Solution (1 unit/µl) | Thermo Scientific | EN0525 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | BA-1000 | ||
| Vectastain ABC Kit | PK-4000 | ||
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | H-1200 |
References
- Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).
- Gong, Z., Muzumdar, R. H. Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging. Int J Endocrinol. , 320482 (2012).
- Deng, Y., Scherer, P. E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).
- Rezaee, F., Dashty, M. Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases. J Diabetes Metab. , 008 (2013).
- Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. The cell biology of fat expansion. J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).
- Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1 (2015).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metab. 4, 263-273 (2006).
- Luther, J., et al. Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy. J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).
- Luther, J., et al. Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia. Cell Death Differ. , (2014).
- Semenza, G. L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).
- Kim, W., Kaelin, W. G. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).
- Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab. 9, 11-22 (2009).
- Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction. Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).
- Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).
- Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin. Diabetes. 55, 978-987 (2006).
- Haluzik, M., et al. Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
- Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Planat-Benard, V., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 109, 656-663 (2004).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).
- Trajcevski, K. E., et al. Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model. PLoS One. 8, 71747 (2013).
- Montgomery, M. K., et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).
- de Queiroz, K. B., et al. Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet. Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).
- Ye, J. Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).
- Xiong, Y., et al. The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).
- Bozec, A., et al. Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia. Nature. 454, 221-225 (2008).
- Varia, M. A., et al. Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).
- Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability. Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).
- Tennant, D. A., et al. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).
- Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool. Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).
- Amelio, I., et al. TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).
- Suga, H., et al. Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. J Diabetes Res. 2015, 970375 (2015).
- Keuper, M., et al. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).
- Sera, Y., et al. Hematopoietic stem cell origin of adipocytes. Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Scherer, P. E. Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ. Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).
