Introduction
Hemostase vereist de gecombineerde en gereguleerde activiteit van cellen, eiwitten, ionen en weefsels in een beperkte spatiotemporele context 1. Ongecontroleerde activiteit kan leiden tot bloedingen of trombose en morbiditeit of mortaliteit in een spectrum van aandoeningen gerelateerd aan bloedstolling. Een microfluïdische stroom kamer experiment is een uitdagende techniek die hemostase nabootst in vitro. Deze aanpak maakt het mogelijk onderzoek naar de complexe samenspel van processen die deelnemen aan hemostase met een hoofdrol voor bloedplaatjes.
Na vasculair letsel, bloedplaatjes zich aan het blootgelegde subendotheliale matrix (glyco) proteïnen bloedverlies te voorkomen. Na hechting, bloedplaatjes activeren en aggregaat in reactie op auto- en paracriene signalering die uiteindelijk leidt tot de vorming van een bloedplaatjes netwerk gestabiliseerd door fibrine en resulteert in een stevig gewikkelde afdichtende trombus 2. In tegenstelling tot de meeste andere bloedplaatjes functietesten, experimenten met stroomkamers rekening houden met de fysische parameter van de bloedstroom en derhalve de invloed van reologie de deelnemende cellen en biomoleculen 3,4.
Stromingskamer experimenten landmark inzichten in hemostase en trombose gegenereerd door het variëren sleutelparameters die invloed hemostatische (sub) processen inclusief de klevende matrix, reologie en stromingsprofielen, cellulaire samenstelling, aanwezig toxinen of drugs, ionsterkte en veel meer. In de afgelopen twee decennia, lage omzet stroom kamer experimenten die grote steekproef volumes (10-100 ml) hebben zich ontwikkeld tot microfluïdische kamers vaak bestaat uit kleine parallelle plaat kamers en met moderne technologie voor het perfuseren volbloed bij gecontroleerde shear omstandigheden 5. Microscaling is sterk toegenomen test throughput vooral omdat de hardware-installatie is vereenvoudigd en minder (bloed) volume nodig is, waardoor het experiment toegankelijker en Versatile. Bijvoorbeeld kan bloed van kleine proefdieren nu gebruikt worden zonder de noodzaak om dieren te offeren. Bloedmonsters van genetisch gemodificeerde muizen hebben dus geholpen bij de identificatie van de belangrijkste moleculen bevorderen of remmen van hemostase en in de roman van basisinzichten 6.
Onderzoekslaboratoria gespecialiseerde vaak nog gebruik maken van custom made stroom kamers bijvoorbeeld uit polydimethylsiloxaan (PDMS) 7, dat polymeriseert op gelithografeerde mallen die kunnen worden blueprinted door software. De resulterende kamer is goedkoop, wegwerpbaar en kan gemakkelijk worden gedemonteerd voor post hoc analyse. Bovendien, in principe elk ontwerp van schepen, waaronder vertakkingen of scherpe bochten kan worden gebouwd op commando. Dit voordeel is ook een nadeel omdat standaardisatie was al de voornaamste probleem met de stroom kamer experimenten en PDMS maat gemaakt kamers hebben dit niet geholpen. Op de top van deze kwestie, coating (omstandigheden), fluorescerende probes, antistollingsmiddel, temperature en de tijd tussen bemonstering en analyse zijn allemaal slecht gestandaardiseerd 8. Standaardisatie van deze variabelen is een uitdaging, maar toch nodig om de vergelijking van de resultaten tussen laboratoria mogelijk te maken. Dit onderwerp is het belangrijkste onderwerp van de International Society op trombose en Haemostase in wetenschappelijke en standaardisatie subcomité biorheology 9,10.
Bloedplaatjes concentraten (PC) transfusie bij patiënten die lijden aan verschillende ziekten die trombocytopenie en / of bloeden veroorzaken. Maar bloedplaatjes PC is bekend dat ongevoelig, met name in functie van de opslagtijd 11, een verouderingsproces gekoppeld aan veroudering en aangeduid als bloedplaatjes opslag laesie. Er wordt wel eens beweerd dat dergelijke plaatjes te herstellen in omloop eenmaal transfusie 12, maar bewijs hiervoor is schaars. Bovendien wordt de functionaliteit van bloedplaatjes die een PC niet routinematig getest omdat de relatie tussen deze bepalingen entherapeutische of profylactische werkzaamheid onduidelijk 13. Microfluïdische stroom kamers bieden een middel om de functie van de bloedplaatjes in de PC te onderzoeken om de keten van manipulaties tussen inzameling en afgifte te optimaliseren. Het is een krachtige research tool voor directe (gepaarde) een vergelijking van de pc, zoals we eerder hebben gepubliceerd 14,15 en wordt hier beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de institutionele ethische richtlijnen voor onderzoek naar menselijke monsters en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle betrokken donoren. Goedkeuring voor de hier beschreven experimenten werd verkregen van de institutionele review board van het Universitair Ziekenhuis Antwerpen.
Opmerking: De temperatuur indicaties zijn altijd kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven.
1. Voorbereiding Flow Kamer Setup
- Het voorbereiden van Lanes, Tubing and Pins
- Vortex de collageensuspensie krachtig en verdund 1/20 in de isotonische glucoseoplossing door de leverancier geleverd aan een eindconcentratie van 50 ug / ml.
Let op: We maken gebruik van paarden pees collageen, voornamelijk samengesteld uit type I vezels. Paarden collageen type I wordt vaak aangeduid als "Horm" collageen en is de gouden standaard voor dit type assay 9 zowel historische en biologische redenen. Humaan type III collageen kunnen ook worden gebruikt, maar the fibrillen vacht minder goed en de bloedplaatjes respons is niet zo sterk. Andere coatings oppervlakken kunnen ook worden gebruikt, bijvoorbeeld von Willebrand factor (VWF), fibrinogeen, fibronectine, laminine, vitronectine, trombospondine-1 of combinaties van deze 16. - Neem een nieuwe disposable biochip van container van de provider. De afmetingen van de biochips die hier gebruikt zijn 0.4W x 0,1H x 20L in mm 3.
- Pipet 0,8 ui in de lane (s) van de microfluïdische biochip aan het ene uiteinde van de chip en merk als outlet. Zorg ervoor dat de baan is gevuld 5/6 met het collageen bevattende coating oplossing bereid in 1.1.1. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen.
Noot: Kanalen worden gedeeltelijk bekleed om ophoping van collageen vezels te voorkomen bij de ingang van het kanaal (zie bespreking). - Incubeer bij 4 ° C gedurende 4 uur of een nacht in een bevochtigde en gesloten houder.
- Blokkeer de gecoate kanalen pipetteren blokkerende buffer (1,0% (w / v) runderserumalbumine eend 0,1% (w / v) glucose in 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) gebufferde zoutoplossing (HBS; 0,9% (w / v) NaCl, pH 7,4) aan het andere uiteinde en waardering als inlaat. Zorg ervoor dat de baan volledig is gevuld met de blokkerende buffer vermijden luchtbellen.
- Snijd buis op gelijke lengte (12 cm). Gebruik één per rijstrook en verbindt u elke buis met een pin. Zo zal een experiment waarin twee voorwaarden in duplo vereist vier buizen rekt en vier pennen te bereiden.
- Spoel de buis met gedestilleerd water met behulp van een spuit en een 26 G naald of de bijbehorende connectoren.
- Verzadigen van de buis met blokkerende buffer. In gesloten en bevochtigde container gedurende ten minste 1 uur.
- Vortex de collageensuspensie krachtig en verdund 1/20 in de isotonische glucoseoplossing door de leverancier geleverd aan een eindconcentratie van 50 ug / ml.
- Het voorbereiden Pomp en spruitstuk
- Spoel de pomp en spruitstuk met gedestilleerd water, verwijder luchtbellen.
- Zuig het blokkerende buffer uit de biochip lane (s) met behulp van de vaste 10 ul tip bij de uitlaat. Reinig het oppervlak vande biochip met een precisie stofvrije af te vegen en Gedenatureerde alcohol te prenten en stof te verwijderen.
- Bevestig de biochip op een geautomatiseerde microscoop podium. Als er meer dan één rijstrook gelijktijdig wordt gebruikt in een run, sluit de acht-baans manifold splitter aan de biochip stopcontact.
Opmerking: De acht-lane verdeelstuk splitter is een stuk hardware (figuur S1) verbonden met de pomp en de biochip. Het maakt gebruik van alle beschikbare (acht) rijstroken op een biochip of een combinatie van rijbanen-operator gedefinieerd in de bijbehorende software zijn. - Gebruik de pinnen in de buis om ze op te lossen in de biochip inlaat. Plaats het andere uiteinde van de slang (zonder pen) in een 1,5 ml conische reageerbuis gevuld met HBS. Spoel alle leidingen en daarmee verbonden lanen met 1 ml HBS met de pomp, om verwijderen rest blokkeerbuffer en slecht hechtende collageen.
2. Voorbereiding bloedmonsters
- Inzameling en scheiding vanvers volbloed uit een gezonde vrijwilliger. 17
- Verzamel de eerste milliliters bloed in een geëvacueerde buis met Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) als antistollingsmiddel en uitsluitend te gebruiken voor dit monster volledige bloedtelling (CBC) met een geautomatiseerde hematologie-analyse.
- Verzamel een hoeveelheid bloed in een geschikt anticoagulans gebruikt vacuümbuizen. Standaard antistollingsmiddelen stromingskamer experimenten heparine of hirudine als fibrine vormen geen deel uitmaakt van het studieprotocol en natriumcitraat als het.
Opmerking: Heparine werd gebruikt als antistollingsmiddel voor alle in de resultaten beschreven experimenten.
Opmerking: De hoeveelheid bloed is afhankelijk van het aantal experimenten uit te voeren. Ongeveer 1 tube (7 ml) gedurende 3 doorgangen. - Plaats de buizen op een rotator in afwachting van bloed oplossen.
Opmerking: De test moet binnen 3 uur van aderlaten worden afgerond. - Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 250 g om bloedplaatjes rijk plasma te bereiden (PRP). Laat de centrifuge break niet gebruiken om verstoring van de los gepakt pellet te voorkomen.
- Wanneer meer dan één buis werd verzameld, verzamel het bloed in één conische centrifugebuis.
Opmerking: Centrifugeren kan langzamer of minder lang worden uitgevoerd, afhankelijk van de PRP opbrengst en differentiële celtelling "verontreiniging" preferred.
- Wanneer meer dan één buis werd verzameld, verzamel het bloed in één conische centrifugebuis.
- Verwijder de PRP en buffy coat waardoor rode bloedcellen met weinig bloedplaatjes.
Let op: het aantal bloedplaatjes in het verpakte rode cellen fractie 13 ± 5 x 10 3 per il (gemiddelde ± SD, n = 12) gemiddeld in onze handen.
- Blood Reconstitutie
- Dooi bloedgroep AB (Rhesus D-negatief) plasma bij 37 ° C gedurende 5 minuten en 20 seconden per 4 ml.
- Bepaal de hematocriet van de rode bloedcellen bereid in 2.1.5 behulp van een geautomatiseerde hematologie-analyse.
- Bepaal de concentratie van bloedplaatjes in het bloed bank bereid plaatjesconcentraat that wordt gebruikt om reconstitueren boven de rode celfractie.
- Bereken het volume van rode bloedcellen en bloedplaatjes concentraat dat 40% hematocriet en 250 x 10³ bloedplaatjes / ul oplevert in een 1 ml monster.
Opmerking: andere doelstelling titers cellen kunnen willekeurig worden ingesteld, afhankelijk van het onderzoeksprotocol. - Transfer rode bloedcellen en plasma in een nieuwe buis met behulp van een pipet tip geknipt en voeg bloedplaatjesconcentraat tot een monstervolume van 1 ml wordt bereikt.
Opmerking: Afhankelijk van de variabelen onderzocht, moet het plasma fractie gelijk in alle opgeloste monsters zijn omdat plasma heeft een significante invloed op trombusvorming tarief. Bijvoorbeeld, herhaalde vries-dooien en plasma van verschillende donoren of andere anticoagulantia kan het resultaat beïnvloeden. - Meng de bereide bloed voorzichtig door het omkeren en het uitvoeren van een CBC.
- Bereid een "blanco" controlemonster waarin de hoeveelheid bloedplaatjes fractie wordt vervangendoor een gelijk volume van 0,9% (m / v) natriumchloride in water om de concentratie van endogene bloedplaatjes (dan bloedbank bloedplaatjes) in de gereconstitueerde bloed met een CBC bepalen.
- labeling
- Pipet 1 ml gereconstitueerde bloed in een reageerbuis met 1 ul 5 mM calceïne AM (5 uM eindconcentratie).
Opmerking: Andere mobiele kleurstoffen kunnen worden gebruikt 14. - Meng voorzichtig door het omkeren.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C vóór gebruik.
- Pipet 1 ml gereconstitueerde bloed in een reageerbuis met 1 ul 5 mM calceïne AM (5 uM eindconcentratie).
3. Perfusie Assay
- Stel het objectief op de collageenvezels gehecht aan de onderzijde van de banen. Gebruik bij voorkeur fase-contrast of differentieel interferentie contrast (DIC) instellingen voor deze focus strategie. Selecteer 'Set huidige Z voor geselecteerde tegel regio's in het experiment software om de gekozen Z-posities digitaal op te lossen.
- Selecteer een van belang (ROI) in de baan (xy) in het experiment software van de microscope dat tijdens het experiment wordt opgenomen.
Opmerking: De ROI kan elk oppervlak willekeurig gekozen binnen een perfusie lane zijn. Het is raadzaam niet trombusvorming analyseren dichtbij de in- en uitlaat van een rijstrook bijwerkingen van de variabele stromingsprofiel in dat gebied te voorkomen, ook al is relatief klein. De ROI oppervlak moet een groot aantal bloedplaatjes verwezen of trombi te egaliseren van het signaal mogelijk. In dit protocol het ROI is een digitaal aaneengeregen totaal van drie even grote zij-aan-zij beelden waardoor 0,62 mm 2 in het midden van de 2 cm lange laan. - Meng de monsters voorzichtig door het omkeren en plaats deze naast de biochip de geautomatiseerde podium.
- Plaats de buis die is verbonden met de inlaat van de biochip in de reageerbuizen met het gereconstitueerde bloedmonsters.
- Start de pomp op 50 dyne / cm2 (of andere schuifspanningen zoals gewenst) voor deze kanalen in verband met buizen te testenmet het gereconstitueerde bloedmonsters met behulp van de software van de pomp.
Opmerking: Andere schuifspanning kunnen worden gebruikt. - Neem beelden elke 15 seconden gedurende 5 min in real-time via de verwerving en experiment software van de microscoop.
Opmerking: Andere grafieken kan worden gebruikt, afhankelijk van de experimentele set-up.
Opmerking: We gebruiken meestal 100X vergroting (10X objectief en 10X lenzen), maar hoger (of lager) vergroting kan gemakkelijk worden gebruikt als alternatief.
4. Was Out
- Spoel alle slangen aan de uitlaat en met de meerkanaals verdeelstuk of pomp met gedestilleerd water, gevolgd door natriumhypochloriet (bleek) 0,5% (v / v) en tenslotte 0,1 M NaOH in water. Gooi de buis vastgemaakt aan de biochip inlaat als gevaarlijk afval.
5. Data Analysis
- Bepaal trombus groeikinetiek de beeldanalyse software. De volgende opdrachten zijn specifiek voor ZEN2012.
- Stel de fluorescentie drempel in het Analyseren Interactive tabblad om de pixel intensiteit die correleert met een positief signaal te definiëren, dat wil zeggen een gehandeld bloedplaatjes of hechtende bloedplaatjes.
- Gebruik Maak de tabellen voor het automatisch genereren van een spreadsheet dat de afzonderlijke oppervlakken (in um 2) van die "objecten" met pixels met een signaal tussen de geselecteerde drempelwaarden zal bevatten. Dit gebeurt voor elk tijdstip.
Let op: Als fluorescentie drempels hebben gekozen, de analyse software detecteert automatisch de 'objecten' in het veld van mening dat de criteria voldoen. Deze objecten zijn trombi, kleine aggregaten van bloedplaatjes of enkele plaatjes en bestrijken een aantal pixels. Elk object is opgenomen in de spreadsheet afzonderlijk. - Bewaar deze spreadsheets in xml-formaat en open ze in een spreadsheet-programmavoor verdere berekeningen.
- Totale de oppervlakten van geselecteerde objecten uit de som en deel het resultaat met de totale oppervlakte van het meetveld (2 pm). Dit zal de relatieve bedekkingsgraad (%) werd verkregen. Doe dit voor elk tijdstip.
- Waarnemingspunt oppervlak dekkingen in functie van de perfusie en bereken de helling door lineaire regressie, waarbij de trombus groei van kinetische dit bepaalde situatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intra-assay variatie tonen werden drie identieke gereconstitueerd volbloedmonsters tegelijkertijd geperfuseerd via collageen beklede oppervlakken (figuur 1). Dit resulteerde in een variatiecoëfficiënt van 8,7%. Deze statistiek suggereert aanvaardbare intra-assay en intralaboratorium variatie toelaat betrouwbare vergelijking tussen gerelateerde steekproeven.
De inlaat van de commerciële stromingskamer hier beschreven loodrecht op de meetkamer en dit kan enigszins turbulent plaats van laminaire stroming op dat punt veroorzaken. Vooral bij experimenten zonder antistolling kan verstopping vanwege de toegenomen contacttijd tussen het bloed en het geïmmobiliseerde agonist veroorzaken. De verstopte inlaat kan het uitlezen stroomafwaarts in de kamer te verwarren. Daarom is de installatie geoptimaliseerd gedeeltelijk de stromingskamer (figuur 2) verlaten bekleden van hetinlaten verstoken van bloedplaatjes agonist, waardoor vroegtijdige activering van primaire en secundaire hemostase vermijden. Gedeeltelijke bekleding van kleefstof oppervlakken wordt bovendien met succes gebruikt door andere onderzoeksgroepen in het veld 16. Daarnaast is deze ongecompliceerde praktische truc is een aanwinst voor de "overgang" zone te bestuderen waar het bloed stroomt over het niet-reactieve (ongecoat) oppervlak blijft over de reactieve (coating) gedeelte.
Transfusie werd gesimuleerd door aanmaken bloed met de gebrekkige component. Hiertoe anti-gecoaguleerd volbloed uit een gezonde donor werd trombocytopenische gemaakt door differentiële centrifugatie en PC bloedplaatjes werden toegevoegd aan bloedplaatjes te verhogen. Een belangrijke vraag was wat het aantal bloedplaatjes te streven? In de meeste gevallen hoeft real-life transfusies niet tot normalisatie van bloedplaatjes in de trombocytopenische patiënt. Liever een waarde boven een bepaalde drempel nagestreefd,hoewel de exacte streefwaarde is slecht gedefinieerd 19. Om de invloed van het variëren van bloedplaatjes op microfluïdische stroomkamers resultaten in de context van bloed reconstitutie begrijpen, werden verschillende reconstructies uitgevoerd met afnemende bloedplaatjes concentraties (figuur 3). Zoals verwacht, lager aantal bloedplaatjes resulteerde in minder hechting in functie van de perfusie tijd. Daarom is binnen een bepaalde studie, het aantal bloedplaatjes moeten worden gestandaardiseerd aan vergelijking tussen steekproef omstandigheden 20 mogelijk te maken. Het simpele feit dat er minder hechting wanneer bloedplaatjes laag betekent echter niet dat de test niet kan worden gebruikt om afzetting van trombocyten meten trombocytopenische monsters omdat microscopie en camera-instellingen worden aangepast om de gevoeligheid te verhogen. Tenslotte, in de meeste gevallen de trombocytopenische monster voor reconstitutie bevat verdere autologe bloedplaatjes die situatie meest veeleisende transfusie patiënten 19 lijkt. Het is currently onduidelijk of en welke rol autologe bloedplaatjes in het kader van transfusie met allogene bloedplaatjes, maar is een interessante vraag voor toekomstig onderzoek.
Na inzameling van bloed van gezonde vrijwillige donoren, wordt volbloed vaak gekoeld tot en component voorbereiding gehouden bij constante kamertemperatuur voorafgaand. Bloedplaatjes zijn echter gevoelig voor temperatuurveranderingen. Figuur 4 toont het effect van verminderde temperaturen na bloedafname en tijdens perfusie. Trombi bleken langzamer te bouwen wanneer het bloed werd afgekoeld tot kamertemperatuur (Figuur 4A) in vergelijking met een identiek (gepaard) monster gedurende het onderzoek (figuur 4B) gehouden bij 37 ° C.
In omloop, bloedplaatjes binden aan vaartuig letsel sites in omstandigheden van verhoogde muur shear stress. Variërend afschuifsnelheden in microfluïdische stroom kamers coated met VWF / fibrinogeen resulteerde in verschillen totaal bloedplaatjesadhesie op het eindpunt (figuur 5A) en trombus groeikinetiek (Figuur 5B).
Tenslotte, om te demonstreren hoe microfluïdische flow cellen kunnen worden gebruikt om PC voor transfusie onderzoeken trombus groeikinetiek in functie van PC opslag onderzocht. Alle variabelen in de steekproef voorbereiding en experimentele set-up werden gestandaardiseerd gedurende de studieperiode. Vandaar de enige variabele parameter is PC opslagtijd. Figuur 6 toont afnemende groei trombus in functie van de opslagtijd die het effect van bloedplaatjes opslag laesie hemostase in vitro.
Figuur 1:. Intra-assay variatie in microfluïdische flow chamber experimenten microfluïdische flo w kamer experimenten werden uitgevoerd op geïmmobiliseerd collageen bij 50 dynes / cm². Alle drie identieke bereide complete bloedmonsters werden geperfundeerd parallel en tegelijkertijd. De resultaten worden getoond als range (snorharen) voor oppervlakte dekking in functie van de perfusie tijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Gedeeltelijk beklede kanaal (A) collageenvezels gevisualiseerd door fasecontrast microscopie werden alleen in de beklede gebied gevonden. (B) een foto nadat 5 minuten perfusie met calceïne AM gemerkte gereconstitueerde volledige bloedmonster 50 dynes gepompt / cm 2 weergegeven. Beide afbeeldingen werden genomen bij een vergroting van 100X. ig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Trombus groei kinetiek afhankelijk van het aantal bloedplaatjes in opgeloste bloed (A) Bloed werd opgelost met behulp van een bloedbank bloedplaatjes concentraat waardoor verschillende bloedplaatjes concentraties:. 245 x 10³ / ul (●), 42 x 10³ / ul (■) en 12 x 10³ / ul (▲). Microfluïdische flow chamber experimenten met collageen beklede kanalen werden gelijktijdig uitgevoerd voor alle drie monsters bij een afschuifspanning van 50 dyne / cm². (B) De hellingen berekend door lineaire regressie van de ruwe gegevens in paneel A afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Temperatuur en microfluïdische stroomkamers totaal bloed verzameld in héparine vacutainers werd bewaard gedurende 15 min in een waterbad bij kamertemperatuur (A) of bij 37 ° C (B). Microfluïdische perfusie op geïmmobiliseerd collageen bij een afschuifspanning van 50 dyne / cm2 werd uitgevoerd. Snap shots op het eindpunt (5 min perfusie) zijn afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Rol van schuifspanning op bloedplaatjesadhesie aan geïmmobiliseerd VWF / fibrinogeen (A). Vier identieke, calceïne AM gelabeld, opnieuw samengesteld volbloedmonsters werden geperfuseerd over een VWF / fibrinogeen gecoate oppervlak met een variabele shear stress: 4,5 dynes / cm² (●), 50 dynes / cm² (■), 90 dynes / cm² (▲) en 225 dynes / cm² (♦). Na 3 minuten perfusie werd een momentopname genomen van alle vier kanalen. (B) Surface dekkingen in functie van de tijd van de in (A) beschreven monsters worden getoond illustreren verschillen in trombus groei kinetiek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:. Trombusvorming van bloedplaatjes concentraten in functie van de opslagtijd Alle microfluïdische flow chamber experimenten werden uitgevoerd onder gestandaardiseerde omstandigheden aan collageen beklede oppervlakken bij een afschuifsnelheid van 50 dynes / cm 2. Bloed was reconstituted met bloedplaatjes monsters van hetzelfde concentraat in tweevoud getest op dag drie (●), zeven (■) en tien (▲) na de donatie. Surface dekkingen in functie van perfusie tijd zijn afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur S1. Microfluïdische stromingskamer hardwareconfiguratie (A) A Vena 8 Fluor + biochip is gemonteerd op de automatische stand van de microscoop en is verbonden via flexibele slang aan een spuitpomp met spruitstuk de pompfunctie opgesplitst in acht afzonderlijke kanalen. (B) Gereconstitueerde bloed stroomt door de wegwerpbare buis aan de rechterzijde in de geselecteerde kanalen van de biochip (inlaat). De wegwerp buis wordt vastgesteld in de inlaat via een roestvess staal wegwerp pen meegeleverd met de setup. Bloedstroom in (B) is van rechts naar links en wordt opgevangen in lange flexibele buizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microfluïdische flow chamber experimenten zijn een uitstekend hulpmiddel om bloedplaatjesfunctie onderzoeken stromend bloed en worden gebruikt om hemostase in vitro evalueren in verschillende experimentele context. Ondanks de slechte interlaboratoriumproef standaardisatie 9, tonen we aan dat in ons laboratorium de experimentele variatie is aanvaardbaar. Hierdoor kan betrouwbaar vergelijken (gepaard) monsters binnen een gegeven onderzoek. Dit werd gevalideerd met goed gedocumenteerde verschijnsel van bloedplaatjes opslag laesie, hetgeen een nadelig gevolg van bloedplaatjes opslag bloedbank omstandigheden 11. Verder hebben we onlangs de impact van de drie beschikbare pathogeeninactiveringsproces technologieën op de PC functie van de bloedplaatjes in microfluïdische stroom kamers volgende reconstructie van bloed 14,15.
Bloedplaatjes reageren verschillend wanneer biofysische en -chemische parameters zijn gevarieerd 20. Daarom afschuifspanning aantal cellen en cellulaire compositietie, temperatuur, coating, antistollingsmiddel en vele andere factoren kunnen worden gewijzigd in het protocol afhankelijk van de vraagstelling. Dit protocol gebruikt handel verkrijgbare hardware en software, zodat andere laboratoria een soortgelijke analyse uit te voeren. Voor fundamenteel onderzoek doeleinden kan dit een nadeel zijn, vooral omdat de beschikbare hardware is minder veelzijdig dan op maat gemaakte setups. De test op zich is robuust maar reproduceerbaarheid lijdt aan biologische en temporele variatie. Daarom moeten assay monsters zoveel mogelijk worden gekoppeld en bestuderen afmetingen voldoende groot zijn. Monsters moeten ook worden gekoppeld tijd, omdat gereconstitueerd bloed alleen kan worden opgeslagen voor een korte tijd.
Hoewel microfluïdische stroom kamers voor de bloedplaatjes functie studies op het gebied van onderzoek hebben opgevoerd, moet voorzichtigheid worden genomen om de bloedplaatjes afhankelijkheid van bloedreologie overinterpret. Ten eerste, de rechthoekige vorm van de stromingskamer niet fysiologische, but de beste hebben we optische toestaan gericht groeien trombi. Ten tweede worden de bloedvaten niet gemaakt van plastic en de invloed van bloedvat elasticiteit op bloedplaatjes functie kan daarom niet worden bestudeerd in dit protocol. Ten derde, het hart veroorzaakt pulserende stroom, terwijl de spuit pompen zijn meer lineair (hoewel ook enigszins pulserende). Tenslotte fibrillair type I collageen is het standaardmateriaal voor bloedplaatjesstudies onder flow die van dierlijke oorsprong. Van de nota echter fibrillaire type I collageen en klinische resultaten voor de functie van bloedplaatjes correleren goed in vele gevallen zoals blijkt uit tientallen jaren ervaring in (lichttransmissie) aggregometrie 21,22.
Er zijn veel assays de bloedplaatjesfunctie 23 bestuderen. De meeste van deze adres één of een paar plaatjes functies terwijl het zetten van bloedplaatjes om in te werken (modellen van) hemostase. Real-time beeldvorming van trombusvorming zoals hier aangetoond is het meest omvattende, tot nu toe. Dit betekent dat de meeste aspecten van de plarespons telet om vaartuig verwondingen zijn inbegrepen. Een bijzonder voordeel is de opneming van de bloedstroom en de aanwezigheid van bloedcellen. De test is gevoelig voor de momenteel gebruikte geneesmiddelen tegen antibloedplaatjestherapie 24 alsmede genetische veranderingen waardoor afwijkende bloedplaatjesfunctie 25. Dit toont zijn waarde als een relevante indicator van de functie van de bloedplaatjes. Doordat deze deze test betekent echter ook dat het minder dan analytische assays meten van specifieke kenmerken van de reactie van de bloedplaatjes is. Effecten van bloed bancaire manipulaties op bloedplaatjes concentraten kunnen derhalve opgepikt door stromingskamer assays, maar om te interpreteren wat de oorzaken, is aanvullende analyse nodig. Bijvoorbeeld, onze gegevens blijkt dat de temperatuur sterk beïnvloedt bloedplaatjesadhesie in microfluïdische flow cellen. Maar extra gedetailleerde analyse is gebleken dat gekoelde bloedplaatjes vorm veranderen en cluster GPIba receptoren 26.
et al. 16 aangetoond dat de relevantie van het substraat definitie systeembiologie bloedplaatjes. Bovendien is de combinatie van verschillende afschuifsnelheden in functie van het substraat belangrijk omdat binding van bloedplaatjes aan geïmmobiliseerd VWF hoge afschuifsnelheden nodig, hoewel dit minder belangrijk voor binding aan collageen. Derhalve afhankelijk van de vraagstelling, keuzes worden gemaakt wat substraten en hun respectievelijke stroomsnelheden worden opgenomen.
Tot slot presenteren we een protocol voor microfluïdische stroom kamer experimenten om de functie van bloedplaatjes te bestuderen in het kader van het bloed bankieren en transfusiegeneeskunde. Standaardisatie inspanningen zijn aan de gang 9,10,28-30 en de meeste van deze aanbevelingen zijn opgenomen in het protocol gepresenteerd. De reconstructie van het bloed is een model voortransfusie maar extra validatie werkzaamheden moeten de relevantie voor de klinische resultaten te geven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1,000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5 ml | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15 ml | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in Figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in Figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4) |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1 M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
