Introduction
Hämostase erfordert die kombinierte Aktivität und regulierte von Zellen, Proteinen, Ionen und Gewebe in einem eingeschränkten Raum - Zeit - Rahmen 1. Unkontrollierte Aktivität kann in einem Spektrum von Erkrankungen zu Blutungen oder Thrombosen und Morbidität oder Mortalität führen zu Blutgerinnung im Zusammenhang. Ein mikrofluidischen Strömungskammer Experiment ist eine anspruchsvolle Technik , die Hämostase in vitro nachahmt. Dieser Ansatz ermöglicht Untersuchung des komplexen Zusammenspiel von Prozessen, die Teil der Hämostase mit einer führenden Rolle für Blutplättchen nehmen.
Gefäßverletzung folgenden haften Blutplättchen an den exponierten subendothelialen Matrix (Glyko) Proteine Blutverlust zu verhindern. Folgende Adhäsion, Blutplättchen zu aktivieren und zu aggregieren in Reaktion auf auto- und parakrine Signalisierung , die schließlich zur Bildung eines Plättchens Netzwerk führt, durch Fibrin stabilisiert , und was zu einer festen, gewickelten Thrombus 2 abdichtet. Im Gegensatz zu den meisten anderen Thrombozytenfunktionstests, Erfahgen mit Strömungskammern , um die physikalischen Parameter des Blutflusses und damit den Einfluss der Rheologie auf den beteiligten Zellen und Biomolekülen Berücksichtigung 3,4.
Strömungskammer Experimente durch Variation Schlüsselparameter Grenzstein Einblicke in Hämostase und Thrombose erzeugt, die hämostatische (sub) beeinflussen Prozesse, einschließlich der Klebstoffmatrix, Rheologie und Strömungsprofile, zellulären Zusammensetzung, die Anwesenheit von Toxinen oder Medikamente, die Ionenstärke und viele mehr. In den vergangenen zwei Jahrzehnten geringen Durchsatz Flusskammer Experimente erfordern große Probenvolumina (10-100 ml) wurden zu mikrofluidischen Kammern oft entwickelt , bestehend aus kleinen Parallelplattenkammern und moderne Technologie auch für die Perfusion von Vollblut bei kontrollierter Wandscherbedingungen 5. Microscaling hat sich deutlich Assay Durchsatz meist erhöht, weil die Hardware-Setup vereinfacht und weniger (Blut) Volumen benötigt wird, wodurch das Experiment zugänglicher und Versatile. Zum Beispiel Blut von kleinen Labortieren kann nun ohne die Notwendigkeit verwendet werden, um Tiere zu opfern. Blutproben von gentechnisch veränderten Mäusen haben damit in der Identifizierung von Schlüsselmoleküle Förderung oder Hemmung Hämostase und in neue basische Erkenntnisse 6 unterstützt.
Spezialisierte Forschungslaboratorien noch oft nach Maß Strömungskammern zum Beispiel aus Polydimethylsiloxan (PDMS) 7 verwenden , die auf lithogr Formen polymerisieren , die durch Software blueprinted werden kann. Die resultierende Kammer ist billig, Einweg und kann leicht für die Post-hoc-Analyse zerlegt werden. Darüber hinaus grundsätzlich jede Konstruktion von Schiffen, einschließlich Abzweigungen oder scharfe Kurven kann auf Befehl gebaut werden. Dieser Vorteil ist auch seine Nachteile, da die Standardisierung war bereits das primäre Problem mit Strömungskammer Experimente und PDMS Maß Kammern haben dies nicht unterstützt. Am Anfang dieser speziellen Frage, Beschichtung (Bedingungen), Fluoreszenzsonden, Antikoagulans, Temperatur und Zeit zwischen Probenahme und Analyse sind alle schlecht 8 standardisiert. Die Standardisierung dieser Variablen ist eine Herausforderung, aber dennoch den Vergleich der Ergebnisse zwischen den Laboratorien erforderlich zu ermöglichen. Dieses Thema ist das Hauptthema der Internationalen Gesellschaft für Thrombose und Hämostase in Wissenschaft und Standardisierung Unterausschuss für Biorheology 9,10.
Thrombozytenkonzentrate (PC) sind bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen, die transfused Thrombozytopenie und / oder Blutungen verursachen. Aber Blutplättchen in PC sind bekannt zu desensibilisieren, insbesondere in Funktion der Lagerzeit 11 verbunden eine Verschlechterung Verfahren alterungs- und allgemein als Plättchenspeicher Läsion. Es wird manchmal behauptet , dass solche Thrombozyten bei Zirkulation wiederherzustellen einmal 12 transfused, aber Beweise dafür ist knapp. Ferner ist ein PC die Funktionalität von Plättchen bilden nicht routinemäßig getestet, weil die Beziehung zwischen solchen Assays undtherapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit ist unklar , 13. Mikrofluidik-Strömungskammern bieten ein Mittel der Thrombozytenfunktion in PC zu untersuchen, um die Kette von Manipulationen zwischen Sammlung und die Ausstellung zu optimieren. Es ist ein leistungsfähiges Forschungswerkzeug für die direkte (gepaart) Vergleiche von PC , wie wir zuvor 14,15 veröffentlicht und wird hier beschrieben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieses Protokoll folgt die institutionellen ethischen Richtlinien für die Forschung an menschlichen Proben und informierte Zustimmung wurde von allen Spendern beteiligt erhalten. Zulassung für den hier beschriebenen Experimenten wurde von der Institutional Review Board der Universitätsklinik Antwerpen erhalten.
Hinweis: Temperaturangaben sind immer Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben.
1. Vorbereitung Flusskammer-Setup
- Vorbereiten Lanes, Schläuche und Pins
- Vortex die Kollagensuspension kräftig und verdünnt 1/20 in der isotonischen Glucoselösung vom Anbieter zu einer Endkonzentration von 50 & mgr; g / ml geliefert.
Hinweis: Wir verwenden Kollagen Pferde-Sehne, hauptsächlich bestehend aus Typ-I-Fibrillen. Die Pferde-Kollagen Typ I wird oft bezeichnet als "Horm" Kollagen und ist der goldene Standard für diese Art von Test 9 für sowohl historische als auch biologische Gründe. Menschliche Kollagen Typ III kann auch verwendet werden, aber the Fibrillen weniger gut beschichten und die Blutplättchenantwort ist nicht so stark. Andere Beschichtungsflächen , können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise von Willebrand - Faktor (vWF), Fibrinogen, Fibronectin, Laminin, Vitronektin, Thrombospondin-1 oder Kombinationen dieser 16. - Nehmen Sie eine neue Einweg-Biochips aus dem Behälter des Anbieters. Die Abmessungen der Biochips hier verwendeten 0.4W x 0,1H x 20L in mm 3.
- Pipettieren 0,8 ul in die Spur (en) des mikrofluidischen Biochip an einem Ende des Chips und Marke als Auslass. Stellen Sie sicher, dass die Spur gefüllt ist 5 / 6. mit der kollagenhaltigen Beschichtungslösung in 1.1.1 bereit. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen.
Anmerkung: Die Kanäle sind teilweise zu vermeiden Anhäufung von Kollagenfasern am Eingang des Kanals (siehe Diskussion) beschichtet. - Inkubieren bei 4 ° C für 4 Stunden oder über Nacht in einer befeuchteten und geschlossenen Behälter.
- Blockieren die beschichteten Kanäle durch Pipettieren Blockierungspuffer (1,0% (w / v) Rinderserumalbumin eind 0,1% (w / v) Glucose in 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) gepufferten Salzlösung (HBS; 0,9% (w / v) NaCl, pH 7,4) am anderen Ende und Mark als Einlass. Stellen Sie sicher, dass die Spur vollständig mit dem Blockierungspuffer unter Vermeidung von Luftblasen gefüllt ist.
- Schneiden Sie Schlauch bei gleicher Länge (12 cm). Verwenden Sie eine pro Spur und verbinden jeden Schlauch mit einem Stift. Zum Beispiel kann ein Experiment zwei Bedingungen, führen in doppelter Vergleich wird vier Rohrstrecken und vier Stifte erfordern vorbereitet werden.
- Spülen Sie den Schlauch mit destilliertem Wasser unter Verwendung einer Spritze und einer 26 G-Nadel oder die zugehörigen Anschlüsse.
- Tränken Sie den Schlauch mit Blocking-Puffer. Speicher in einer geschlossenen und befeuchteten Behälter für mindestens 1 Stunde.
- Vortex die Kollagensuspension kräftig und verdünnt 1/20 in der isotonischen Glucoselösung vom Anbieter zu einer Endkonzentration von 50 & mgr; g / ml geliefert.
- Vorbereiten Pumpe und Verteiler
- Spülen Sie die Pumpe und Verteiler mit destilliertem Wasser, Luftblasen zu entfernen.
- Saugen Sie das Blockierungspuffer aus der Biochip-Spur (n) am Ausgang des Fest 10 ul Spitze verwenden. Reinigen Sie die Oberfläche vonfrei wischen und denaturierten Alkohol Drucke und Staub entfernen der Biochip mit einer Genauigkeit Staub.
- Befestigen Sie den Biochip auf einem automatisierten Mikroskoptisch. Wenn mehr als eine Spur gleichzeitig in einem Durchlauf verwendet wird, schließen Sie den Achtweg Verteiler Splitter zum Biochip Steckdose.
Hinweis: Die achtspurige Verteiler Splitter ein Stück Hardware (Abbildung S1) ist mit der Pumpe und dem Biochip verbunden. Es ermöglicht den Betrieb aller verfügbaren (acht) Spuren auf einem Biochip oder eine Kombination von Spuren, die vom Bediener definiert in der zugehörigen Software sein kann. - Verwenden Sie die Stifte in den Schlauch sie in dem Biochip Einlass zu beheben. Legen Sie das andere Ende des Schlauchs (ohne Stift) in einem 1,5 ml konischen Röhrchen mit HBS gefüllt. Spülen Sie alle Schläuche und ihre angeschlossenen Bahnen mit 1 ml HBS mit der Pumpe, um Rest-Blockpuffer zu entfernen und schlecht Kollagen haften.
2. Herstellung von Blutproben
- Sammlung und Trennung vonfrisches Vollblut aus einem gesunden Freiwilligen. 17
- Sammeln Sie die ersten Milliliter Blut in einem evakuierten Rohr (EDTA) als Antikoagulans enthält, und verwenden Sie ausschließlich diese Probe für die komplette Blutbild (CBC) mit einem automatisierten Hämatologie-Analysegerät.
- Sammeln Sie ein Volumen von Blut in einem geeigneten Antikoagulans Vakuumröhren. Standard Antikoagulantien zur Strömungskammer Experimente sind Heparin oder Hirudin, wenn die Bildung Fibrin nicht Bestandteil des Studienprotokolls und Natriumcitrat, wenn es ist.
Hinweis: Heparin wurde als Antikoagulans für alle Experimente verwendet in den Ergebnissen beschrieben.
Anmerkung: Die Menge an Blut auf die Anzahl der Experimente abhängig durchgeführt werden. Etwa 1 Rohr (7 ml) für 3 Spuren. - Die Röhrchen auf einem Rotator anhängige Blut Rekonstitution.
Hinweis: Der Test sollte innerhalb von 3 Stunden von Aderlass abgeschlossen sein. - Zentrifuge für 15 Minuten bei 250 g plättchenreiches Plasma herzustellen (PRP). Verwenden Sie die Zentrifuge nicht brechen Störung des lose gepackten Pellets zu verhindern.
- Wenn mehr als ein Röhrchen gesammelt wurde, bündeln das Blut in einem einzigen konischen Zentrifugationsröhrchen.
Hinweis: Zentrifugierung langsamer oder weniger lange durchgeführt werden kann, abhängig von der PRP-Ausbeute und Differentialzelle "Kontamination" bevorzugt.
- Wenn mehr als ein Röhrchen gesammelt wurde, bündeln das Blut in einem einzigen konischen Zentrifugationsröhrchen.
- Entfernen und entsorgen Sie die PRP und Leukozytenmanschette gepackten roten Blutkörperchen mit wenigen Thrombozyten führt.
Hinweis: Die Thrombozytenzahl in der gepackten roten Blutkörperchen Fraktion 13 ± 5 x 10 3 pro ul (Mittelwert ± SD, n = 12) im Durchschnitt in unseren Händen.
- Blut Rekonstitution
- Thaw Blutgruppe AB (Rhesus-D-negativ) Plasma bei 37 ° C für 5 Minuten und 20 Sekunden pro 4 ml.
- Bestimmen Sie den Hämatokritwert der gepackten roten Blutkörperchen hergestellt in 2.1.5 eine automatisierte Hämatologie-Analysegerät verwendet wird.
- Bestimmen Sie die Blutplättchenkonzentration in der Blutbank vorbereitet Blutplättchenkonzentrat that wird verwendet, um den roten Zellfraktion oben zu rekonstituieren.
- Berechnen Sie das Volumen der gepackten roten Blutkörperchen und Thrombozyten-Konzentrat, das 40% Hämatokrit und 250 x 10³ Blutplättchen / ul in einer 1-ml-Probe ergibt.
Anmerkung: Weitere Ziel Titer von Zellen kann beliebig eingestellt werden, abhängig von der Studienprotokoll. - Transfer der roten Blutzellen und Plasma in ein frisches Röhrchen verpackt ein abgeschnittenes Pipettenspitze verwendet und Plättchenkonzentrat hinzufügen, bis ein Probenvolumen von 1 ml erreicht ist.
Hinweis: In Abhängigkeit von den untersuchten Variablen sollte die Plasmafraktion in allen rekonstituierten Proben gleich sein, weil Plasma einen signifikanten Einfluß auf die Thrombusbildung Rate hat. Zum Beispiel, wiederholte Einfrieren und Auftauen oder Plasma von verschiedenen Spendern oder auf verschiedenen Antikoagulantien genommen kann das Ergebnis beeinflussen. - Mischen Sie das aufgelöste Blut sanft durch Umdrehen und führen Sie einen CBC.
- Bereiten Sie eine "leere" Kontrollprobe, in der das Volumen der Thrombozytenfraktion ersetzt wirddurch das gleiche Volumen von 0,9% (m / v) Natriumchlorid in Wasser , um die Konzentration von endogenen Thrombozyten (dh nicht-Blutbank - Blutplättchen) in dem rekonstituierten Blut unter Verwendung eines CBC zu bestimmen.
- Beschriftung
- Pipette 1 ml rekonstituiert Blut in einem Teströhrchen, enthaltend 1 & mgr; l 5 mM Calcein AM (5 & mgr; M Endkonzentration).
Hinweis: Andere Zellfarbstoffe 14 verwendet werden kann. - Vorsichtig mischen durch Umdrehen.
- Inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° C vor der Verwendung.
- Pipette 1 ml rekonstituiert Blut in einem Teströhrchen, enthaltend 1 & mgr; l 5 mM Calcein AM (5 & mgr; M Endkonzentration).
3. Perfusions-Assay
- Konzentrieren Sie das Ziel auf den Kollagenfasern an der Unterseite der Bahnen verklebt. Idealerweise verwenden Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast (DIC) Einstellungen für diese Fokussierungsstrategie. Wählen Sie 'Set aktuellen Z für ausgewählte Fliese Regionen "in der Experiment-Software digital die ausgewählten Z-Positionen fixieren.
- Wählen Sie eine Region of Interest (ROI) in der Spur (xy) in der Experiment-Software des microscope, die während des Versuchs aufgezeichnet.
Hinweis: Der ROI jeder Oberfläche beliebig innerhalb eines Perfusions-Spur gewählt werden kann. Es ist ratsam, nicht Thrombusbildung nahe dem Ein- und Ausgang einer Spur zu analysieren, um Nebenwirkungen des variablen Strömungsprofil in diesem Bereich zu vermeiden, auch wenn diese relativ klein ist. Die ROI-Oberfläche sollte eine beträchtliche Anzahl von Blutplättchen enthalten oder Nivellierung des Signals zu ermöglichen Thromben. In diesem Protokoll ist die ROI ein digital vernäht Aggregat von drei gleich große Seite-an-Seite - Bilder , was zu 0,62 mm 2 in der Mitte der 2 cm lange Spur. - Mischen Sie die Proben vorsichtig durch Umdrehen und positionieren diese neben dem Biochip auf der automatisierten Bühne.
- Platzieren Sie den Schlauch, der mit dem Einlass des Biochips in den Teströhrchen mit den rekonstituierten Blutproben verbunden ist.
- Starten Sie die Pumpe bei 50 dyn / cm 2 (oder eine andere Scherspannungen wie gewünscht) für diese Kanäle verbunden Röhren zu testenenthaltend die rekonstituierte Blutproben die Software der Pumpe.
Hinweis: Andere Scherspannungen verwendet werden können. - Nehmen Sie Bilder alle 15 Sekunden für 5 Minuten in Echtzeit den Erwerb und Experiment-Software des Mikroskop.
Hinweis: Andere Zeitreihen verwendet werden können, auf dem Versuchsaufbau abhängig.
Anmerkung: Wir verwenden im allgemeinen eine 100-facher Vergrößerung (10X-Objektiv und 10X-Linsen), aber höher (oder niedriger) Vergrößerung einfach als Alternative verwendet werden kann.
4. Waschen Out
- Auswaschen alle Schläuche mit dem Auslass angebracht ist und mit dem Mehrkanal-Verteilerpumpe oder mit destilliertem Wasser, gefolgt von Natriumhypochlorit (Bleichmittel) 0,5% (v / v) und schließlich 0,1 M NaOH in Wasser. Entsorgen Sie den Schlauch an den Biochip Einlass als gefährlicher Abfall zu merken.
5. Datenanalyse
- Bestimmen Sie Thrombus Wachstumskinetik mit der Bildanalyse-Software. Die folgenden Befehle sind spezifisch für ZEN2012.
- Stellen Sie die Fluoreszenzschwelle in der Interactive Registerkarte Analysieren Sie die Pixelintensität zu definieren , die mit einem positiven Signal korreliert, dh einem anhaftenden Blutplättchen oder anhaftenden Blutplättchen.
- Verwenden Sie Tabellen erstellen , um automatisch eine Tabelle erstellen , die die einzelnen Oberflächenbereiche (in & mgr; m 2) dieser "Objekte" Pixel enthält , mit einem Signal zwischen den ausgewählten Schwellenwerten enthalten. Dies wird für jeden Zeitpunkt durchgeführt.
Hinweis: Sobald Fluoreszenz Schwellen gewählt haben, automatisch die Analysesoftware "Objekte" im Sichtfeld, die die Kriterien erfüllen, erkennt. Diese Objekte sind Thromben, kleine Blutplättchenaggregaten oder einzelne Plättchen und umfassen eine Anzahl von Pixeln. Jedes Objekt wird in der Tabelle gesondert aufgeführt. - Speichern Sie diese Tabellen im XML-Format und öffnen Sie sie in einem Tabellenkalkulationsprogrammfür weitere Berechnungen.
- Insgesamt die Oberflächenbereiche der ausgewählten Objekte durch Summierung und teilt das Ergebnis durch die Gesamtfläche des Meßfeldes (& mgr; m 2). Dadurch wird die relative Flächendeckung (%) ergeben. Tun Sie dies für jeden Zeitpunkt.
- Plotten diese Flächenbedeckungen in Funktion der Perfusionszeit und berechnen die Steigung durch lineare Regression, den Thrombus Wachstums kinetischer dieser bestimmten Bedingung erhalten wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um zu zeigen , Variation intra-assay, drei identische rekonstituierten Vollblutproben wurden gleichzeitig über Kollagen - beschichteten Oberflächen (Abbildung 1) perfundiert. Dies führte zu einem Variationskoeffizienten von 8,7%. Diese Statistik deutet darauf hin, akzeptabel Intra-Assay und labor Variation zuverlässigen Vergleich zwischen verwandten Proben ermöglicht.
Der Einlass der kommerziellen Strömungskammer wir hier beschreiben, ist senkrecht zur Messkammer und diese leicht turbulent an diesem Punkt anstelle einer laminaren Strömung verursachen. Insbesondere in Versuchen ohne Gerinnungshemmung verursachen kann dies aufgrund der erhöhten Kontaktzeit zwischen dem Blut Verstopfungen und dem immobilisierten Agonist. Der verstopfte Einlass kann das Auslesen durcheinander bringen stromabwärts in der Kammer. Daher wurde die Einrichtung durch teilweises Beschichten der Strömungskammer (2) optimiert Verlassen derEinlässe frei von Thrombozyten-Agonisten, wodurch die Vermeidung vorzeitigen Aktivierung von primären und sekundären Hämostase. Partielle Beschichtung von Klebeflächen zudem erfolgreich von anderen Forschungsgruppen im Bereich 16 verwendet. Darüber hinaus ist diese einfache praktische Trick eine Bereicherung der "Übergang" Zone zu untersuchen, wo das Blut über die nicht-reaktiven (unbeschichteten) Oberfläche fließt der reaktiven weiter über (beschichtet) Teil.
Transfusions wurde simuliert, indem Blut mit der mangelhaften Komponente Rekonstitution. Zu diesem Zweck wird antikoaguliertes Vollblut von einem gesunden Spender thrombozytopenische durch differentielle Zentrifugation und PC Blutplättchen gemacht wurde zugegeben Thrombozytenzahlen zu erhöhen. Eine wichtige Frage hier war, was Thrombozytenzahl für Ziel? In den meisten Fällen Bluttransfusionen real-life nicht zu einer Normalisierung der Thrombozytenzahl im thrombozytopenische Patienten. Vielmehr ein Wert über einer bestimmten Schwelle angestrebt,obwohl die genaue 19 Zielwert schlecht definiert. Um zu verstehen , den Einfluss unterschiedlicher Thrombozytenzahlen auf mikrofluidischen Strömungskammern Ergebnisse im Zusammenhang mit der Blut Rekonstitution wurden mehrere Rekonstruktionen durchgeführt mit abnehmender Thrombozytenkonzentrationen (Abbildung 3). Wie erwartet, niedriger führte Thrombozytenzahl in weniger Haftung in Abhängigkeit von Perfusionszeit. Daher innerhalb einer gegebenen Studie sollte die Thrombozytenzahl standardisiert werden 20 Vergleich zwischen Probenbedingungen zu ermöglichen. Die bloße Tatsache, dass es weniger Haftung, wenn die Thrombozytenzahl gering bedeutet jedoch nicht, dass der Test nicht die Blutplättchenablagerung in thrombozytopenische Proben verwendet werden können, zu messen, weil die Mikroskopie und die Kameraeinstellungen angepasst werden kann, die Empfindlichkeit zu erhöhen. Schließlich ist in den meisten Fällen verwendet die thrombozytopenische Probe zur Rekonstitution enthält Rest autologe Blutplättchen , die die Situation in den meisten Transfusionspatienten ähnelt anspruchs 19. Es ist currhängig unklar, ob und was im Zusammenhang mit der Transfusion mit allogenen Blutplättchen die Rolle von autologem Thrombozyten ist aber eine interessante Frage für die zukünftige Forschung.
Nach dem Sammeln von Blut von gesunden freiwilligen Spendern wird Vollblut oft abgekühlt und gehalten bei einer konstanten Raumtemperatur vor der Komponente Vorbereitung. Blutplättchen sind jedoch empfindlich gegenüber Temperaturänderungen dar. 4 die Wirkung der verminderten Temperaturen nach der Blutentnahme zeigt und während der Perfusion. Thromben gefunden langsamer aufbauen , wenn das Blut auf Raumtemperatur (4A) abgekühlt wurde , verglichen mit einem identischen (gepaart) Probe gehalten bei 37 ° C während der gesamten Studie (4B).
Im Kreislauf binden Blutplättchen an Gefäßverletzungsstellen unter den Bedingungen der erhöhten Wandschubspannung. Unterschiedliche Scherraten in mikrofluidischen Strömungskammern coated mit VWF / resultierte Fibrinogen in Differenzen für Gesamt Thrombozytenadhäsion am Endpunkt (5A) und für Thrombus Wachstumskinetik (5B).
Schließlich zeigen, wie mikrofluidischen Strömungskammern verwendet werden kann, um PC für die Transfusion, wurde in Abhängigkeit von der PC Speicher Thrombus Wachstumskinetik verwendet untersuchen sucht. Alle Variablen in der Probenvorbereitung und Versuchsaufbau wurden während der gesamten Studiendauer standardisiert. Daher ist die einzige variable Parameter war PC Lagerzeit. 6 zeigt in Abhängigkeit von der Lagerungszeit Thrombuswachstum Verringern der Wirkung von Thrombozytenspeicher Läsion auf Hämostase in vitro demonstriert.
Abb . 1: Intra-Assay - Variation in mikrofluidischen Strömungskammer Experimente Mikrofluidik flo w Kammer Experimente wurden bei 50 dyn / cm² an immobilisiertem Kollagen durchgeführt. Alle drei identische rekonstituierten Vollblutproben wurden in parallel und gleichzeitig perfundiert. Die Ergebnisse werden als Bereich (Whiskers) gezeigt für Oberflächenabdeckung in Abhängigkeit von Perfusionszeit. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 2: teilweise beschichteten Kanal (A) Kollagenfasern durch Phasenkontrastmikroskopie sichtbar gemacht wurden nur in den beschichteten Bereich gefunden. (B) Eine Momentaufnahme nach 5 min der Perfusion mit Calcein AM Vollblutprobe bei 50 dyn gepumpt Rekonstitution beschriftet / cm 2 dargestellt. Beide Bilder wurden mit einer 100-facher Vergrößerung. ig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Thrombus Wachstumskinetik hängen von der Thrombozytenzahl in rekonstituierten Blut (A) Blut rekonstituiert wurde eine Blutbank Plättchen mit Konzentrat verschiedenen Thrombozytenkonzentrationen ergeben. 245 x 10³ / ul (●), 42 x 10³ / ul (■) und 12 x 10³ / ul (▲). Mikrofluidischen Strömungskammer Experimente mit Kollagen beschichteten Kanäle wurden bei einer Scherspannung von 50 dyn / cm² gleichzeitig für alle drei Proben durchgeführt. (B) Die Steigungen durch lineare Regression der Rohdaten in Feld A berechnet dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 4: Die Temperatur und mikrofluidischen Strömungskammern Vollblut in Heparin Vacutainer gesammelt wurde 15 min in einem Wasserbad bei Raumtemperatur (A) oder bei 37 ° C (B) erhalten. Mikrofluidik - Perfusion an immobilisiertes Kollagen bei einer Schubspannung von 50 dynes / cm 2 durchgeführt wurde. Schnappschüsse am Endpunkt (5 min Perfusion) dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Rolle der Scherbeanspruchung auf die Blutplättchen - Adhäsion an immobilisiertes VWF / Fibrinogen (A). Vier identische, Calcein AM gekennzeichnet, Vollblut rekonstituiertProben wurden mit variablen Schubspannung über eine VWF / Fibrinogen beschichtete Oberfläche perfundiert: 4,5 dyn / cm² (●), 50 dyn / cm² (■), 90 dyn / cm² (▲) und 225 dyn / cm² (♦). Nach 3 Minuten der Perfusion wurde eine Momentaufnahme aller vier Kanäle genommen. (B) Flächendeckungen in Abhängigkeit von der Zeit der Proben in (A) beschrieben sind , gezeigt Unterschiede in Thrombus Wachstumskinetik darstellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 6: Thrombus Bildung von Blutplättchenkonzentraten in Funktion der Lagerzeit Alle mikrofluidischen Strömungskammer Versuche wurden unter standardisierten Bedingungen auf Kollagen beschichteten Oberflächen mit einer Schergeschwindigkeit von 50 dynes / cm 2 durchgeführt. Blut war reconstituierte mit Thrombozyten Proben des gleichen Konzentrat getestet in zweifacher Ausfertigung an Tag drei (●), sieben (■) und zehn (▲) nach der Spende. Flächendeckungen in Abhängigkeit von Perfusionszeit dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung S1:. Mikrofluidik - Strömungskammer Hardware - Setup (A) A Vena 8 Fluoro + Biochip auf der automatisierten Bühne des Mikroskops montiert und wird über flexible Schläuche an eine Spritzenpumpe mit Verteiler zu spalten die Pumpfunktion in acht separate Kanäle verbunden. (B) Rekonstituierte Blut fließt durch die Einwegschlauch auf der rechten Seite in die ausgewählten Kanäle des Biochips (Einlass). Die Wegwerfschlauch wird in den Einlass durch ein stainl festeness Stahl Einweg-Stift mit dem Setup geliefert. Der Blutfluss in (B) von rechts nach links und wird in langen , flexiblen Schläuchen gesammelt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrofluidik - Strömungskammer Experimente sind ein hervorragendes Instrument Thrombozytenfunktion im fließenden Blut zu untersuchen und verwendet werden , die Hämostase in vitro in verschiedenen experimentellen Kontexten zu bewerten. Trotz schlechter Ring Standardisierung 9 zeigen wir , dass in unserem Labor die experimentelle Variation akzeptabel ist. Dies ermöglicht es, zuverlässig zu vergleichen (gepaart) Proben innerhalb einer gegebenen Studie. Dies wurde mit der gut dokumentierten Phänomen der Lagerung von Blutplättchen Läsion validiert, die eine schädliche Folge der Lagerung von Blutplättchen in Blutbank Bedingungen 11 ist. Darüber hinaus veröffentlichten wir vor kurzem die Auswirkungen der drei zur Verfügung stehenden Pathogeninaktivierung Technologien auf dem PC Thrombozytenfunktion in mikrofluidischen Strömungskammern nach der Rekonstitution von Blut 14,15.
Die Blutplättchen reagieren unterschiedlich , wenn biophysikalischen und chemischen Parameter variiert 20 sind. Daher Schubspannung, Zellzahl und Zell composition, Temperatur, Beschichtung, Antikoagulans und viele weitere Faktoren können sich auf der Fragestellung innerhalb dieses Protokoll geändert werden, abhängig. Dieses Protokoll verwendet nur handelsübliche Hard- und Software-Tools, so dass andere Laboratorien einen ähnlichen Test durchzuführen. Für grundlegende Forschungszwecke kann dies ein Nachteil sein, vor allem, weil die zur Verfügung stehende Hardware ist weniger vielseitig als maßgeschneiderte Setups. Der Test selbst ist robust, aber die Reproduzierbarkeit leidet an biologischen und zeitlichen Variation. Daher müssen Assayproben so weit wie möglich zusammengepaßt werden und Größen studieren ausreichend groß sein sollte. Proben müssen auch zeitlich gepaart werden, weil rekonstituiert Blut nur für eine kurze Zeit gespeichert werden können.
Obwohl mikrofluidischen Strömungskammern für die Thrombozytenfunktion Studien das Forschungsfeld vorangebracht haben, sollte mit Vorsicht vorgegangen werden, um die Thrombozyten Abhängigkeit von Blutrheologie zu überinterpretieren. Erstens ist die rechteckige Form der Strömungskammer nicht physiologischen, but die beste müssen wir optische erlauben auf das Wachstum von Thromben zu konzentrieren. Zweitens Blutgefäße nicht aus Kunststoff und dem Einfluss von Blutgefäßelastizität auf Plättchenfunktion gemacht kann daher nicht in diesem Protokoll untersucht werden. Drittens verursacht das Herz pulsatilen Fluss, während Spritzenpumpen mehr linear (obwohl auch leicht pulsierender) sind. Schließlich habe ich fibrillärem Kollagen Typ ist das Standardmaterial für die Blutplättchen-Studien unter Strömung verwendet, die tierischen Ursprungs ist. Bemerkenswert aber ich fibrillärem Kollagen Typ und klinische Ergebnisse für die Plättchenfunktion korrelieren gut in vielen Fällen als durch Jahrzehnte Erfahrung in der (Lichtdurchlässigkeit) 21,22 Aggregometrie gezeigt.
Es gibt viele Assays , die Thrombozytenfunktion 23 zu untersuchen. Die meisten dieser Adresse ein oder ein paar Plättchen Merkmale während setzen Blutplättchen (Modelle) Hämostase zu arbeiten. Echtzeit-Bildgebung der Thrombusbildung wie hier gezeigt, ist die umfassendste, auf dem Laufenden. Das bedeutet, die meisten Aspekte der platelet Reaktion auf Gefäßverletzung enthalten sind. Einzigartige Vorteile sind die Einbeziehung von Durchblutung und die Anwesenheit aller Blutzellen. Der Test ist empfindlich gegenüber den derzeit verwendeten Arzneimitteln für gerinnungshemmende Therapie 24 sowie genetische Veränderungen durch in aberrant Thrombozytenfunktion 25. Dies zeigt, seinen Wert als relevanter Indikator für die Thrombozytenfunktion. Die umfassende Natur dieses Assays dennoch impliziert auch, dass es weniger als die analytische Assays Besonderheiten der plättchen Reaktion gemessen wird. Auswirkungen von Blutbanken Manipulationen auf die Thrombozytenkonzentrate können daher durch durch Strömungskammer Assays aufgenommen, aber zu interpretieren, was bewirkt, dass sie, ist eine zusätzliche Analyse erforderlich. Zum Beispiel zeigen unsere Daten, dass die Temperatur Thrombozytenadhäsion in mikrofluidischen Strömungskammern signifikant beeinflusst. Aber zusätzliche detaillierte Analyse hat gezeigt , dass Kühl Plättchen ihre Form verändern und Cluster GPIbα Rezeptoren 26.
et al. 16 demonstriert die Bedeutung von Substrat Definition der Systembiologie zur Thrombozyten. Außerdem ist die Kombination von variierenden Scherraten in Abhängigkeit von dem Substrat wichtig, weil auf immobilisierten vWf der Blutplättchen-Bindungs werden hohen Scherraten erfordern, während dies weniger wichtig ist, an Kollagen zu binden. Daher ist je nach Fragestellung können Entscheidungen getroffen werden, auf welchen Substraten und ihre jeweiligen Strömungsgeschwindigkeiten berücksichtigt werden sollen.
Abschließend präsentieren wir ein Protokoll für mikrofluidische Flusskammer Experimente Thrombozytenfunktion im Zusammenhang mit Blutbanken und Transfusionsmedizin zu studieren. Standardisierung Bemühungen sind im Gange 9,10,28-30 und die meisten dieser Empfehlungen sind in dem Protokoll vorgestellt enthalten. Die Rekonstitution von Blut ist ein Modell fürTransfusions aber zusätzliche Validierungsarbeiten sollte die Relevanz für die klinische Ergebnisse zeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1,000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5 ml | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15 ml | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in Figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in Figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4) |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1 M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
