Introduction
Hemostase krever den kombinerte og regulert aktivitet av celler, proteiner, ioner og vev i en begrenset tid og rom sammenheng en. Ukontrollert aktivitet kan føre til blødning og trombose og sykelighet eller dødelighet i et spektrum av sykdommer relatert til blodkoagulasjon. En microfluidic flyt kammer eksperimentet er en utfordrende teknikk som etterligner hemostase in vitro. Denne tilnærmingen gjør etterforskningen av det komplekse samspillet mellom prosesser som tar del i hemostase med en ledende rolle for blodplater.
Etter vaskulær skade, blodplater holder seg til utsatt subendotelmatriksen (glyko) proteiner for å forhindre blodtap. Etter adhesjon, blodplater aktivere og aggregat i respons til automa- og parakrin signalering, som til slutt fører til dannelsen av et blodplate-nettverk, stabilisert av fibrin, og som resulterer i en fast, tettviklet trombe 2. I motsetning til de fleste andre platefunksjonstester, opplementer med strømningskamre ta hensyn til den fysiske parameteren av blodstrøm og dermed påvirkning av reologien for de deltagende celler og biomolekyler 3,4.
Flow kammer eksperimenter har generert landemerke innsikt i hemostase og trombose ved å variere viktige parametere som påvirker hemostatisk (sub) behandler inkludert lim matrise, reologi og strømningsprofiler, mobilnettet sammensetning, tilstedeværelse av giftstoffer eller narkotika, ionestyrke og mange flere. I de siste to tiårene, har lav gjennomstrømning flyt kammer eksperimenter som krever store prøvevolumer (10-100 ml) utviklet seg til å microfluidic kamre ofte består av små parallell-plate kamre og inkludert moderne teknologi for perfusert fullblod ved kontrollerte veggen skjærbetingelser 5. Microscaling har økt betydelig analyse gjennomstrømming mest fordi maskinvaren oppsett har forenklet og mindre (blod) volum er nødvendig, rende forsøket mer tilgjengelig og versatile. For eksempel kan blod fra små forsøksdyr nå brukes uten å måtte ofre dyr. Blodprøver av genmodifiserte mus har dermed hjulpet i identifisering av nøkkelmolekyler som fremmer eller hemmer hemostase og i nye grunnleggende innsikt 6.
Spesialiserte forskningslaboratorier ofte fortsatt bruke skreddersydde flyt kamre for eksempel fra polydimethylsiloxane (PDMS) 7 som polymeriserer på lithographed muggsopp som kan blueprinted av programvare. Den resulterende kammeret er billig, engangsbruk og lett kan demonteres for post hoc-analyse. Videre, i utgangspunktet noen design av skip, inkludert bifurcations eller skarpe svinger kan bygges på kommando. Denne fordelen er også sine ulemper siden standardisering var allerede det primære problemet med flyt kammer eksperimenter, og PDMS skreddersydde kamre har ikke hjulpet dette. På toppen av dette spesielle problemet, belegg (tilstander), fluorescerende prober, antikoagulerende, temperature og tiden mellom prøvetaking og analyse er alle dårlig standardisert 8. Standardisering av disse variablene er utfordrende, men likevel nødvendig for å tillate sammenligning av resultater mellom laboratorier. Dette emnet er den viktigste gjenstand for International Society på Trombose og Hemostase i vitenskap og standardisering underkomité for Biorheology 9,10.
Blodplatekonsentrater (PC) blir overført i pasienter som lider av forskjellige sykdommer som forårsaker trombocytopeni og / eller blødning. Men blodplater i PC er kjent for å desensibilisere, særlig som funksjon av lagringstid 11, en forringelse prosess knyttet til aldring, og vanligvis betegnet som blodplate-lagrings lesjon. Det er noen ganger hevdet at slike blodplater gjenopprette i omløp når transfundert 12, men bevisene for dette er mangelvare. Videre er funksjonaliteten av blodplater som utgjør en PC ikke rutinemessig undersøkt fordi forholdet mellom slike analyser ogterapeutisk eller profylaktisk effekt er uklart 13. Microfluidic flyt kamre tilby et middel for å undersøke blodplatefunksjon i PC for å optimalisere kjeden av manipulasjoner mellom innsamling og utstedelse. Det er et kraftig forskningsverktøy for direkte (paret) sammenligninger av PC som vi tidligere har publisert 14,15 og er beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger de institusjonelle etiske retningslinjer for forskning på humane prøver og informert samtykke ble innhentet fra alle givere involvert. Godkjenning for forsøkene beskrevet her ble innhentet fra institusjonelle gjennomgang styret i Antwerpen universitetssykehus.
Merk: Temperatur indikasjonene er alltid romtemperatur, med mindre spesifisert.
1. Forberedelse Flow Chamber Setup
- Forbereder Lanes, Tubing og Pins
- Vortex kollagensuspensjonen kraftig og fortynnet 1/20 i isotonisk glukoseoppløsning levert av den leverandør til en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml.
Merk: Vi bruker hest sene kollagen, i hovedsak består av type I fibriller. Equine kollagen type I er ofte referert til som "Horm" kollagen og er den gylne standard for denne type av test 9 for både historiske så vel som biologiske grunner. Human type III kollagen kan også brukes, men the fibriller frakk mindre godt og blodplateresponsen er ikke så sterk. Andre belegg flater kan også benyttes, for eksempel von Willebrand faktor (VWF), fibrinogen, fibronektin, laminin, vitronektin, trombospondin-1, eller kombinasjoner av disse 16. - Ta en ny engang biochip fra leverandørens container. Dimensjonene på biochips brukes her er 0.4W x 0,1H x 20L mm 3.
- Pipet 0,8 mL i kjørefelt (e) av mikrofluid biochip på den ene enden av chip og mark som utløp. Kontroller at banen er fylt 5 / sjette med kollagen inneholder beleggsløsning utarbeidet i 1.1.1. Pass på at det ikke er luftbobler.
Note: Kanaler er delvis belagt for å unngå opphopning av kollagenfibre ved inngangen av kanalen (se diskusjon). - Inkuber ved 4 ° C i 4 timer eller over natten i en fuktet og lukket beholder.
- Blokkere de belagte kanalene ved å pipettere blokkeringsbuffer (1,0% (w / v) bovint serumalbumin end 0,1% (vekt / volum) glukose i 10 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) bufret saltoppløsning (HBS, 0,9% (vekt / volum) NaCl, pH 7,4) i den andre enden og mark som innløp. Kontroller at banen er helt fylt med blokkeringsbuffer unngå luftbobler.
- Kutt slangen på lik lengde (12 cm). Bruk én per kjørefelt og koble hver slange med en nål. For eksempel vil et eksperiment sammenligne to forhold, kjøres i duplikat kreve fire rør strekninger og fire pins å være forberedt.
- Skyll røret med destillert vann ved bruk av en sprøyte og en 26 G nål eller de medfølgende kontaktene.
- Mett slanger med blokkeringsbuffer. Oppbevares i en lukket og fuktet beholder for minimum 1 time.
- Vortex kollagensuspensjonen kraftig og fortynnet 1/20 i isotonisk glukoseoppløsning levert av den leverandør til en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml.
- Forbereder Pump og Manifold
- Skyll pumpen og manifold med destillert vann, fjerne luftbobler.
- Aspirer blokkeringsbuffer ut av biochip banen (e) ved hjelp av fast 10 pl spiss ved utløpet. Rengjør overflaten avden biochip med en presisjon støvfritt tørke og denaturert alkohol for å fjerne utskrifter og støv.
- Fest biochip på en automatisert mikroskop scenen. Hvis mer enn ett kjørefelt brukes samtidig i ett løp, koble åttespors manifold splitteren til biochip utløp.
Merk: åttespors manifold splitter er et stykke maskinvare (figur S1) koblet til pumpen og biochip. Det gjør at driften av alle tilgjengelige (åtte) baner på en biochip eller en kombinasjon av baner som kan være operatør definert i den medfølgende programvaren. - Bruk pinner i slangen for å fikse dem i biochip innløpet. Plasser den andre enden av røret (uten pin) i et 1,5 ml konisk reagensrør fylt med HBS. Skyll alle rør og deres tilknyttede baner med 1 ml HBS ved hjelp av pumpen, for derved å fjerne resterende blokkeringsbuffer og løstsittende kollagen.
2. Utarbeidelse av blodprøver
- Samling og separering avfriskt fullblod fra en frisk frivillig. 17
- Samle de første milliliter blod i et evakuert rør som inneholder Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) som en antikoagulant og utelukkende bruke denne prøven for telling av blodceller (CBC) med en automatisk hematologianalysator.
- Samle et volum av blod i et egnet antikoaguleringsmiddel ved hjelp av evakuerte rør. Standard antikoagulanter for strømningskammerforsøk er heparin eller hirudin når fibrin formasjon er ikke en del av studieprotokollen og natriumsitrat når det er.
Merk: Heparin ble anvendt som antikoagulant for alle forsøkene beskrevet i resultatene.
Merk: Mengden av blod avhenger av det antall eksperimenter som skal utføres. Omtrent ett rør (7 ml) i 3 baner. - Plasser rørene på en rotator i påvente av blod tilberedning.
Merk: Analysen skal være fullført innen tre timer fra blodprøvetaking. - Sentrifuger i 15 minutter ved 250 g for å fremstille blodplaterikt plasma (PRP). Ikke bruk sentrifugen pause for å hindre forstyrrelse av løst pakket pellet.
- Når mer enn ett rør ble oppsamlet, stort forråd av blod i en enkelt konisk sentrifugerøret.
Merk: Sentrifugering kan gjøres langsommere eller mindre lang, avhengig av PRP utbyttet og differensial celle "forurensning" foretrukket.
- Når mer enn ett rør ble oppsamlet, stort forråd av blod i en enkelt konisk sentrifugerøret.
- Fjern og kast PRP og buffy coat som gir røde blodceller med få blodplater.
Merk: platetallet i den pakkede røde blodlegemer fraksjon er 13 ± 5 x 10 3 per mikroliter (gjennomsnitt ± SD, n = 12) i gjennomsnitt i våre hender.
- Blood Tilberedning
- Tine blodtype AB (Rhesus D-negativ) plasma ved 37 ° C i 5 minutter og 20 sekunder per 4 ml.
- Bestem hematokrit av røde blodceller utarbeidet i 2.1.5 ved hjelp av en automatisert hematologi analysator.
- Bestem platekonsentrasjon i blodbanken fremstilt blodplatekonsentrat that skal brukes til å rekonstituere det røde cellefraksjon ovenfor.
- Beregn volum av pakkede røde blodceller og blodplatekonsentrat som vil gi 40% hematokritt, og 250 x 10³ blodplater / pl i en 1 ml prøve.
Note: Andre mål-titere av celler kan stilles vilkårlig, avhengig av studieprotokollen. - Overføring pakkede røde blodceller og plasma til et friskt rør ved hjelp av en avkuttet pipettespiss og legge til blodplatekonsentrat til et prøvevolum på 1 ml er nådd.
Merk: Avhengig av variablene studert, bør plasmafraksjonen være lik i alle utblandede prøvene fordi plasma har en betydelig innflytelse på trombedannelse rate. For eksempel, gjentatte fryse-tining eller plasma tatt fra forskjellige givere eller på forskjellige antikoagulanter kan påvirke resultatet. - Bland den rekonstituerte blodet forsiktig ved å snu og utføre en CBC.
- Fremstille en "blank" kontrollprøve hvor volumet av blodplatefraksjonen er erstattetav det samme volum av 0,9% (m / v) natriumklorid i vann for å bestemme konsentrasjonen av endogene blodplater (dvs. ikke-blodbank blodplater) i den rekonstituerte blod ved bruk av en CBC.
- merking
- Pipettér 1 ml rekondisjonert blod i et reagensrør inneholdende 1 pl 5 mM Calcein AM (5 mM endelig konsentrasjon).
Merk: Andre cellefargestoffer kan brukes 14. - Bland forsiktig ved å snu.
- Inkuber i 5 min ved 37 ° C før bruk.
- Pipettér 1 ml rekondisjonert blod i et reagensrør inneholdende 1 pl 5 mM Calcein AM (5 mM endelig konsentrasjon).
3. Perfusjons analyse
- Fokus sikte på kollagenfibre adherert på bunnen av banene. Bruk helst fase-kontrast eller differensial interferens kontrast (DIC) innstillinger for å fokusere strategien. Velg "Set gjeldende Z for utvalgte fliser regioner" i forsøket programvare til digitalt fikse de valgte Z-stillinger.
- Velg en region av interesse (ROI) i kjørefeltet (xy) i forsøket programvaren til microscope som vil bli tatt opp under forsøket.
Merk: ROI kan være hvilken som helst overflate område vilkårlig valgt innenfor et perfusjon kjørefelt. Det er ikke tilrådelig å analysere trombedannelse nær inn- og utløp av en lane så for å unngå alvorlige bivirkninger av den variable strømningsprofilen i dette området, selv om dette er forholdsvis liten. ROI overflatearealet bør inneholde et betydelig antall blodplater eller tromber for å tillate utjevning av signalet. I denne protokollen avkastningen er et digitalt sydd aggregat av tre like store side-by-side-bilder som resulterer i 0,62 mm 2 i midten av 2 cm lang kjørefelt. - Bland prøvene forsiktig ved å snu og plassere disse ved siden av biochip på automatisert scenen.
- Plasser røret som er forbundet med innløpet av biochip i reagensglass inneholdende rekonstituert blodprøver.
- Start pumpen på 50 dyn / cm 2 (eller andre skjærspenninger som ønsket) for kanalene knyttet til å teste rørsom inneholder de rekonstituerte blodprøver ved hjelp av programvaren for pumpen.
Merk: Andre skjærspenninger kan brukes. - Rekord bilder hver 15 sek i 5 min i sanntid ved hjelp av oppkjøp og eksperimentere programvare av mikroskopet.
Merk: Andre tidsserier kan brukes avhengig av det eksperimentelle oppsettet.
Merk: Vi bruker vanligvis en 100X forstørrelse (10X objektiv og 10X linser), men høyere (eller lavere) forstørrelse kan lett brukes som et alternativ.
4. Vask Out
- Vaske ut all slange festet til utløpet, og som er koblet til flerkanalfordeleren eller pumpen ved hjelp av destillert vann, etterfulgt av natriumhypokloritt (blekemiddel) 0,5% (v / v) og til slutt 0,1 M NaOH i vann. Kast slangen festet til biochip innløp som farlig avfall.
5. Data Analysis
- Bestem trombe vekstkinetikk med bildeanalyse programvare. Følgende kommandoer er spesifikke for ZEN2012.
- Sett fluorescens terskel i Analyser Interaktiv fanen for å definere piksel intensitet som korrelerer med et positivt signal, dvs. et levd plate eller sitter fast blodplater.
- Bruk lage tabeller for å automatisk generere et regneark som skal inneholde de separate flater (i mikrometer 2) av disse "objektene" som inneholder bildepunkter med et signal mellom de valgte terskler. Dette blir utført for hvert tidspunkt.
Merk: Når fluorescens terskler har vært valgt, oppdager analyse programvare automatisk 'objekter' i synsfeltet som oppfyller kriteriene. Disse objektene er tromber, små plateaggregater eller enkeltplater og dekker et antall piksler. Hvert objekt er oppført i regnearket separat. - Lagre disse regnearkene i xml-format og åpne dem i et regnearkprogramfor videre beregninger.
- Totalt den flater av de valgte objekter ved summering og dele resultatet med det totale arealet av målefeltet (mikrometer 2). Dette vil gi den relative overflatedekning (%). Gjør det for hvert tidspunkt.
- Plotte disse overflatedeknings som funksjon av perfusjon tid og beregne helningen ved lineær regresjon, hvilket ga tromben vekstkinetiske av den aktuelle tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere intra-assay variasjon, ble tre identiske rekonstituerte helblodprøver perfusert samtidig over kollagen-belagte overflater (figur 1). Dette resulterte i en variasjonskoeffisient på 8,7%. Denne statistikken antyder akseptabelt intra-assay og intralaboratory variasjon tillater pålitelig sammenligning mellom relaterte prøvene.
Innløpet av den kommersielle strømningskammeret vi beskrive her er vinkelrett på målekammeret, og dette kan føre til noe turbulent i stedet for laminær strømning ved det punktet. Spesielt i forsøkene uten antikoagulerende dette kan føre til tilstopping på grunn av den økte kontakttid mellom blodet og den immobiliserte agonist. Den tette innløpet kan forvirre avlesning nedstrøms i kammeret. Derfor oppsettet ble optimalisert ved delvis å belegge strømningskammeret (figur 2) som forlaterviker blottet for blodplate agonist, og dermed unngå for tidlig aktivering av primær og sekundær hemostase. Delvis belegg av klebeflatene er dessuten med hell brukes av andre forskningsgrupper innen 16. I tillegg er denne enkle praktiske knep en ressurs for å studere "overgang" sone hvor blod som strømmer over den ikke-reaktive (ubelagt) overflate fortsetter over det reaktive (belagt) porsjon.
Transfusjon ble simulert ved rekonstituering av blod med mangelfull komponent. For dette formål, antikoagulert helt blod fra en frisk donor ble gjengitt trombocytopenisk ved differensialsentrifugering og PC-blodplater ble tilsatt for å øke blodplatetallet. Et viktig spørsmål her er hva trombocytter å satse på? I de fleste tilfeller trenger virkelige transfusjoner ikke føre til normalisering av blodplatetall i trombocytopenisk pasienten. I stedet for en verdi over en viss terskelverdi er beregnet for,selv om den eksakte mål verdien er dårlig definert 19. For å forstå påvirkning av varierende platetall på microfluidic flyt kamre utfall i forbindelse med blod tilberedning, ble flere reconstitutions utført med synkende platekonsentrasjoner (figur 3). Som forventet, lavere blodplatetall resulterte i mindre adhesjon som funksjon av tid perfusjon. Derfor innenfor en gitt studie, trombocytter, skal standardiseres for å tillate sammenligning mellom prøveforhold 20. Bare det faktum at det er færre heft når trombocytter er lav betyr imidlertid ikke at analysen ikke kan brukes til å måle blodplate deponering i trombocytopeni prøver fordi mikroskopi og kamerainnstillinger kan tilpasses for å øke følsomheten. Endelig, i de fleste tilfeller, trombocytopenisk prøven anvendt til rekonstituering inneholder resten autolog blodplater som ligner den situasjonen i de fleste transfusjon krevende pasienter 19. Det er Currently uklart om og hvilken rolle autologe blodplater er i sammenheng med transfusjon med allogene blodplater, men er et interessant spørsmål for videre forskning.
Etter samling av blod fra friske frivillige givere, blir helblod ofte avkjølt til og holdt ved konstant romtemperatur før komponenten forberedelse. Blodplater er imidlertid følsomme for temperaturforandringer. Figur 4 viser effekten av redusert temperaturer etter blodprøvetakingen og under perfusjon. Tromber ble funnet å bygge mer langsomt når blodet ble avkjølt til værelsestemperatur (figur 4A) sammenlignet med en identisk (sammenkoblet) prøven ble holdt ved 37 ° C gjennom hele undersøkelsen (figur 4B).
I omløp, blodplater binde til fartøyet skader områder i forhold til forhøyet veggen skjærspenning. Varierende skjærhastigheter i microfluidic flyt kamre coated med VWF / fibrinogen resulterte i forskjeller for total blodplateadhesjon ved endepunktet (figur 5A) og for trombe vekstkinetikk (figur 5B).
Til slutt, for å demonstrere hvordan mikrofluidstrømningskamre kan brukes til å undersøke PC anvendes for transfusjon, ble tromben vekstkinetikk i funksjonen til PC lagring undersøkes. Alle variablene i prøvepreparering og eksperimentelle oppsettet ble standardisert gjennom hele studieperioden. Derfor er den eneste variable parameteren var PC lagringstid. Figur 6 viser avtagende trombe vekst som funksjon av lagringstiden demonstrere effekten av blodplate-lagrings lesjon på hemostase in vitro.
Figur 1:. Intra-assay variasjon i microfluidic flyt kammerforsøk microfluidic flo w kammer eksperimenter ble utført på immobilisert kollagen på 50 dyn / cm. Alle tre identiske rekonstituerte fullblodprøver ble perfusert i parallell og samtidig. Resultatene er vist som område (værhår) for overflatedekning i funksjon av perfusjon tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: delvis belagte kanal (A) kollagenfibre visualisert ved fasekontrastmikroskopi ble funnet bare i den belagte området. (B) Et øyeblikksbilde etter 5 min perfusjon med en Calcein AM merket rekonstituert helblodprøve pumpet 50 dyn / cm 2 er vist. Begge bilder ble tatt på et 100X forstørrelse. ig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: trombe vekstkinetikk avhenger av trombocytter i rekonstituert blod (A) Blood ble rekonstruert ved hjelp av en blodbank blodplatekonsentrat som gir ulike blodplatekonsentrasjoner. 245 x 10³ / mikroliter (●), 42 x 10³ / mikroliter (■) og 12 x 10³ / mikroliter (▲). Mikrofluidstrømningskammer eksperimenter med kollagen belagt kanaler ble utført samtidig for alle tre prøver ved en skjærspenning på 50 dyn / cm. (B) Bakkene beregnet ved lineær regresjon av rådata i panel A er avbildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 4: Temperatur og microfluidic strømningskamrene Helblod oppsamlet i heparin vacutainers ble bevart i 15 min i et vannbad ved romtemperatur (A) eller ved 37 ° C (B). Mikrofluid perfusjon på immobilisert kollagen ved en skjærspenning på 50 dyn / cm 2 ble utført. Snap skudd på endepunktet (5 min perfusjon) er avbildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Role of skjærspenning på blodplateadhesjon til immobilisert VWF / fibrinogen (A). Fire identiske, calcein AM merket, rekonstituert fullblodPrøvene ble perfundert over en VWF / fibrinogen-belagte overflate med varierende skjærspenning: 4,5 dyn / cm (●), 50 dyn / cm (■), 90 dyn / cm (▲) og 225 dyn / cm (♦). Etter 3 minutter av perfusjon, ble en snap shot tatt av alle fire kanaler. (B) Overflate dekning i funksjon av tid av prøvene som er beskrevet i (A) er vist som illustrerer forskjellene i trombe vekstkinetikk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6:. Trombedannelse av blodplatekonsentrater i funksjon av lagringstiden Alle mikrofluidstrømningskammeret eksperimenter ble utført under standardiserte forhold på kollagen-belagte overflater ved en skjærhastighet på 50 dyn / cm 2. Blood var reconstidisjoneres med plateprøver av samme konsentrat testet i duplikat på dag tre (●), sju (■) og ti (▲) post donasjon. Overflate dekning i funksjon av perfusjon tid er avbildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur S1:. Mikrofluidstrømningskammer maskinvarekonfigureringen (A) En Vena 8 fluor + biochip er montert på den automatiserte stadium av mikroskop, og er forbundet via et fleksibelt rør til en sprøytepumpe med manifolden for å splitte pumpefunksjon inn i åtte separate kanaler. (B) Rekonstituert blod strømmer gjennom engangs rør på høyre side inn i de valgte kanaler av biochip (inntak). Engangs slangen er festet i innløpet gjennom en av rustess stål disponibel pin leveres med oppsettet. Blodstrømmen i (B) er fra høyre til venstre og samles i lange fleksible produksjonsrør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrofluidstrømningskammer eksperimenter er et utmerket verktøy for å undersøke blodplatefunksjon i strømmende blod, og blir brukt til å evaluere hemostase in vitro i forskjellige eksperimentelle sammenhenger. Til tross for dårlig Interlaboratory standardisering 9, viser vi at innenfor vårt laboratorium den eksperimentelle variasjon er akseptabelt. Dette gjør det mulig å pålitelig sammenligne (paret) prøver innen en gitt studie. Dette ble bekreftet ved hjelp av godt dokumentert fenomen av blodplate-lagrings lesjon, som er en uheldig konsekvens av blodplate-lagrings i blodbank forhold 11. Videre har vi nylig publisert virkningen av tre tilgjengelige patogen inaktive teknologier på PC platefunksjonen i microfluidic flyt kamre etter rekonstituering av blod 14,15.
Blodplater reagere annerledes når biofysiske og-kjemisk parametre er varierte 20. Derfor skjærspenning, cellenummer og mobilnettet sammensetningsjon, temperatur, belegg, antikoagulantia og mange flere faktorer kan endres i løpet av denne protokollen, avhengig av problemstillingen. Denne protokollen bruker kun kommersielt tilgjengelige hard- og software verktøy, slik at andre laboratorier for å utføre en lignende analyse. For grunnleggende forskningsformål kan dette være en ulempe, spesielt fordi den tilgjengelige maskinvaren er mindre allsidig enn skreddersydde oppsett. Analysen i seg selv er robust, men reproduserbarhet lider av biologisk og tidsmessig variasjon. Derfor analyseprøver må kobles sammen så mye som mulig og studere størrelser bør være tilstrekkelig stor. Prøvene må også være koblet sammen i tid, fordi rekonstituert blod kan bare lagres for en kort tid.
Selv microfluidic flyt kamre for blodplatefunksjonsstudier har økt forskningsfeltet, bør man vise forsiktighet til overinterpret plate avhengighet av blod reologi. For det første er ikke fysiologisk den rektangulære formen av strømningskammeret, but den beste vi har å tillate optisk fokus på økende tromber. For det andre, blir blodkar ikke er laget av plast og påvirkning av blodkar elastisitet på blodplatefunksjonen kan derfor ikke undersøkt i denne protokollen. For det tredje fører til at hjertet pulserende strømning, mens sprøytepumper er mer lineær (selv om også litt pulserende). Til slutt, fibrillære type I kollagen er den standard materialet som brukes for blodplate studier henhold strømning, noe som er av animalsk opprinnelse. Notatet er imidlertid fibrillar type I kollagen og kliniske resultater for platefunksjonen korrelerer godt i mange tilfeller som vist ved flere tiårs erfaring i (lysgjennomgang) aggregometry 21,22.
Det finnes mange metoder for å studere platefunksjon 23. De fleste av disse adresse en eller et par plate funksjoner mens du setter blodplater til å jobbe i (modeller av) hemostase. Sanntid avbildning av trombedannelse som demonstrert her er den mest inkluderende, til dags dato. Dette betyr at de fleste aspekter av platelet respons på karskade er inkludert. Unike fordeler er inkluderingen av blodstrøm og tilstedeværelsen av alle blodceller. Analysen er følsom for de for tiden anvendte legemidler for blodplatehemmende behandling 24 så vel som til genetiske endringer som resulterer i unormal blodplatefunksjon 25. Dette demonstrerer dets verdi som et relevant indikator for blodplatefunksjon. Den omfattende karakter av denne analysen innebærer likevel også at det er mindre analytisk enn de forsøk som måler spesifikke funksjoner i blodplate respons. Effekter av blod banktjenester manipulasjoner på trombocyttkonsentrater kan derfor etter plukket opp av flyt kammer analyser, men å tolke hva som forårsaker dem, kreves ytterligere analyse. For eksempel våre data indikerer at temperaturen påvirker i betydelig grad blodplateadhesjon i microfluidic strømningskamre. Men ytterligere detaljert analyse har vist at kjøleplater endre form og cluster GPIbα reseptorer 26.
et al. 16 viste relevansen av underlaget definisjonen til platesystembiologi. Dessuten er kombinasjonen av varierende skjærhastigheter som funksjon av substratet viktig fordi binding av blodplater til immobilisert VWF vil kreve høye skjærhastigheter, selv om dette er mindre viktig for binding til kollagen. Derfor, avhengig av problemstilling, valg kan gjøres på hvilke underlag og deres respektive hastigheter er å bli inkludert.
Som konklusjon, presenterer vi en protokoll for microfluidic strømningskammeret eksperimenter for å studere blodplatefunksjon i sammenheng med blod banktjenester og transfusjonsmedisin. Standardiseringsarbeid pågår 9,10,28-30 og de fleste av disse anbefalingene er inkludert i protokollen presentert. Tilberedning av blod er en modell foroverføring men ytterligere kontroll arbeidet bør indikere relevans for kliniske utfall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1,000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5 ml | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15 ml | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in Figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in Figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4) |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1 M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
