Introduction
Hemostas kräver den kombinerade och reglerad verksamhet av celler, proteiner, joner och vävnader i en begränsad Spatiotemporal sammanhang en. Okontrollerad aktivitet kan leda till blödning eller trombos och sjuklighet eller dödlighet i ett spektrum av sjukdomar relaterade till blodkoagulering. En mikroflödessystem flödeskammaren experiment är en utmanande teknik som härmar hemostas in vitro. Detta tillvägagångssätt möjliggör undersökning av det komplexa samspelet mellan processer som deltar i hemostas med en ledande roll för blodplättar.
Efter kärlskada, blodplättar följa de exponerade subendoteliala matris (glyko) proteiner för att förhindra blodförlust. Efter vidhäftning, trombocyter aktivera och aggregat som svar på auto- och parakrin signal som slutligen leder till bildandet av ett nätverk av trombocyter, stabiliseras genom fibrin och resulterar i en fast, sår tätnings tromb 2. Till skillnad från de flesta andra tester trombocytfunktionen, erfament med flödeskamrarna ta hänsyn till den fysikaliska parametern av blodflödet och därför inverkan av reologin på de deltagande cellerna och biomolekyler 3,4.
Flödeskammare experiment har genererat landmärke insikter i hemostas och trombos genom att variera nyckelparametrar som påverkar hemostatiska (sub) processer inklusive vidhäftande matris, reologi och flödesprofiler, cellulär sammansättning, förekomsten av gifter eller droger, jonstyrka och många fler. Under de senaste två decennierna har låg genomströmning flödeskammarexperiment kräver stora provvolymer (10-100 ml) utvecklats till mikroflödeskammare ofta består av små parallellplattkammare och inklusive modern teknik för perfusion helblod vid kontrollerade vägg skjuvningsbetingelser 5. Microscaling har ökat betydligt analys genomströmning främst eftersom installations hårdvara har förenklat och mindre (blod) volym krävs, vilket gör experimentet mer tillgänglig och versatile. Till exempel, kan blod från små försöksdjur nu användas utan att man behöver offra djur. Blodprov av genetiskt modifierade möss har därmed hjälpt till att identifiera viktiga molekyler som främjar eller hämmar hemostas och i nya grundläggande insikter 6.
Specialiserade forskningslaboratorier ofta fortfarande använda skräddarsydda flödeskammare till exempel från polydimetylsiloxan (PDMS) 7 som polymeriserar på lithographed formar som kan blueprinted av programvara. Den resulterande kammaren är billig, för engångsbruk och kan lätt demonteras för post hoc-analys. Dessutom, i princip varje mönster av fartyg, inklusive bifurkationer eller skarpa svängar kan byggas på kommando. Denna fördel är också dess nackdel eftersom standardiseringen var redan det primära problemet med flödeskammarexperiment och PDMS skräddarsydd kammare har inte hjälpt detta. Ovanpå denna fråga, beläggning (villkor), fluorescerande prober, antikoagulantia, tempratur och tid mellan provtagning och analys är alla dåligt standardiserade åtta. Standardisering av dessa variabler är en utmaning, men ändå för att möjliggöra jämförelse av resultaten mellan laboratorier. Det här ämnet är huvudämne av International Society på Thrombosis and Haemostasis i vetenskaplig och standardisering kommittén för Biorheology 9,10.
Blodplättskoncentrat (PC) är transfusioner i patienter som lider av olika sjukdomar som orsakar trombocytopeni och / eller blödning. Men blodplättar i PC är kända för att okänsliga, särskilt som en funktion av lagringstiden 11, en försämring process i samband med åldrande och som vanligtvis kallas förvaring av blodplättar skada. Det hävdas ibland att sådana blodplättar åter i omlopp en gång transfusion 12, men bevis för detta är knappa. Vidare är funktionaliteten av trombocyter som utgör en PC inte rutinmässigt testas eftersom förhållandet mellan sådana analyser ochterapeutisk eller profylaktisk effekt är oklar 13. Mikroflödessystem flödeskammare erbjuder ett sätt att undersöka trombocytfunktionen i datorn för att optimera kedjan av manipulationer mellan insamling och utfärdande. Det är ett kraftfullt forskningsverktyg för direkta (parade) jämförelser av PC som vi tidigare har publicerats 14,15 och beskrivs här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer de institutionella etiska riktlinjer för forskning på mänskliga prover och informerat samtycke erhölls från alla givare inblandade. Godkännande av de experiment som beskrivs här erhölls från Institutional Review Board i Antwerpen Universitetssjukhuset.
Obs: Temperatur indikationer är alltid rumstemperatur, om inte annat anges.
1. Förberedelse Flow avdelningen Setup
- Förbereda Lanes, slangar och Pins
- Vortex kollagen suspensionen kraftigt och späd 1/20 i isoton glukoslösning tillhandahålls av tjänsteleverantören till en slutlig koncentration av 50 mikrogram / ml.
Obs: Vi använder häst senkollagen, huvudsakligen består av typ I fibriller. Hästkollagen typ I är ofta kallad "Horm" kollagen och är den gyllene standarden för denna typ av analys 9 för både historiska och biologiska skäl. Human typ III kollagen kan också användas, men the fibriller päls mindre väl och svar trombocyter är inte lika stark. Andra beläggning av ytor kan också användas, t ex von Willebrand-faktor (vWF), fibrinogen, fibronektin, laminin, vitronektin, trombospondin-1 eller kombinationer av dessa 16. - Ta en ny engångs biochip från leverantörens behållaren. Dimensionerna hos de biochips används här är 0,4 W x 0,1H x 20L i mm 3.
- Pipett 0,8 pl i banan (s) i mikroflödes biochip i ena änden av chip och märket som utlopp. Se till att den kö är fylld 5/6. Med kollageninnehållande beläggningslösningen som framställts i 1.1.1. Säkerställa att det inte finns några luftbubblor.
Note: kanaler är delvis belagda för att undvika ackumulering av kollagenfibrer vid ingången till kanalen (se diskussion). - Inkubera vid 4 ° C under 4 h eller över natten i en fuktsatt och sluten behållare.
- Blockera de belagda kanalerna genom pipettering blockeringsbuffert (1,0% (vikt / volym) bovint serumalbumin end 0,1% (vikt / volym) glukos i 10 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) buffrad saltlösning (HBS; 0,9% (vikt / volym) NaCl, pH 7,4) vid den andra änden och märket som inlopp. Se till att den kö är helt fylld med den blockerande buffert undvika luftbubblor.
- Skära röret vid samma längd (12 cm). Använd en per körfält och ansluter varje slang med en PIN-kod. Till exempel kommer ett experiment som jämför två villkor, kördes i duplikat kräver fyra slangar sträckor och fyra stift att vara förberedd.
- Rensa slangen med destillerat vatten med användning av en spruta och en 26 G-nål eller de medföljande kontakterna.
- Mätta slang med blockeringsbuffert. Butik i ett stängt och befuktad behållare för ett minimum av en timme.
- Vortex kollagen suspensionen kraftigt och späd 1/20 i isoton glukoslösning tillhandahålls av tjänsteleverantören till en slutlig koncentration av 50 mikrogram / ml.
- Förbereda Pump och insugningsrör
- Skölj pumpen och grenröret med destillerat vatten, ta bort luftbubblor.
- Aspirera blockerande buffert ur biochip lane (er) med användning av den fasta 10 pl spets vid utloppet. Rengör ytan avden biochip med en precision dammfri torka och denaturerad alkohol för att avlägsna tryck och damm.
- Fäst biochip på ett automatiserat mikroskop scenen. Om mer än ett körfält används samtidigt i en körning, ansluter åtta körfält grenrör splitter till biochip utlopp.
Obs: De åtta-lane grenrör splitter är en del av maskinvaran (figur S1) som är ansluten till pumpen och biochip. Det tillåter drift av alla tillgängliga (åtta) körfält på en biochip eller en kombination av körfält som kan vara operatör definieras i den medföljande programvaran. - Använd stiften i slangen för att fixera dem i biochip inloppet. Placera den andra änden av slangen (utan stift) i ett 1,5 ml koniskt provrör fyllt med HBS. Skölj alla slangar och deras anslutna banor med 1 ml HBS använder pumpen, för att avlägsna resten blockeringsbuffert och dåligt vidhäftande kollagen.
2. Framställning av blodprover
- Insamling och separation avfärskt helblod från en frisk frivillig. 17
- Samla in de första milliliter blod i ett evakuerat rör innehållande etylendiamintetraättiksyra (EDTA) som en antikoagulant och uteslutande använda detta prov för fullständig blodstatus (CBC) med en automatiserad hematologianalysator.
- Samla upp en volym av blod i en lämplig antikoagulant med hjälp av evakuerade rör. Standard antikoagulantia för flödeskammar experiment är heparin eller hirudin när fibrinbildning är inte en del av studieprotokollet och natriumcitrat när det är.
Notera: Heparin användes som antikoagulant för alla de experiment som beskrivs i resultaten.
Obs: Mängden blod beror på antalet av experiment som skall utföras. Approximativt 1 rör (7 ml) under 3 körfält. - Placera rören på en rotator i avvaktan på blod beredning.
Obs: Analysen bör vara slutförd inom tre timmar av flebotomi. - Centrifugera i 15 min vid 250 g för att framställa blodplättsrik plasma (PRP). Använd inte centrifug paus för att förhindra störningar av den löst packade pelleten.
- När mer än ett rör samlades upp, samla blodet i en enda konisk centrifugrör.
Anmärkning: Centrifugeringen kan göras långsammare eller mindre lång, beroende på PRP utbytet och differentierad cell "kontaminering" att föredra.
- När mer än ett rör samlades upp, samla blodet i en enda konisk centrifugrör.
- Ta bort och kasta PRP och gula hinnan ger packade röda blodkroppar med några blodplättar.
Obs: Den blodplättsräkning i den packade röda cellfraktionen är 13 ± 5 x 10 3 per il (medelvärde ± SD, n = 12) i genomsnitt i våra händer.
- blod Rekonstitution
- Tina blodgrupp AB (Rhesus D negativ) plasma vid 37 ° C under 5 min och 20 sek per 4 ml.
- Bestämma hematokriten av de packade röda blodkroppar som framställts i 2.1.5 med hjälp av en automatiserad hematologianalysator.
- Avgör koncentrationen trombocyter i blodbanken beredd trombocytkoncentrat that kommer att användas för att rekonstruera den röda cellfraktionen ovan.
- Beräkna volymen av packade röda blodkroppar och blodplättskoncentrat som kommer att ge 40% hematokrit och 250 x 10 ^ blodplättar / ul i ett 1 ml prov.
Obs: Andra mål titer av celler kan sättas godtyckligt, beroende på studieprotokollet. - Överföring packade röda blodkroppar och plasma i ett nytt rör med användning av en klippt pipettspets och tillsätt blodplättskoncentrat, tills en prowolym av 1 ml uppnås.
Obs! Beroende på de variabler som studeras, bör plasmafraktionen vara lika i alla rekonstituerade prov eftersom plasma har ett betydande inflytande på blodproppsbildning takt. Till exempel, upprepad frysning-tining eller plasma som tas från olika donatorer eller på olika antikoagulantia kan påverka resultatet. - Blanda den rekonstituerade blod försiktigt genom att vända och göra en CBC.
- Förbered en "blank" kontrollprov i vilket volymen av blodplättsfraktionen är ersattmed samma volym av 0,9% (m / v) natriumklorid i vatten för att bestämma koncentrationen av endogena blodplättar (dvs icke-blodbanksplättar) i den rekonstituerade blod med hjälp av en CBC.
- märkning
- Pipet 1 ml rekonstituerat blod i ett provrör innehållande 1 | j, l 5 mM Calcein AM (5 | iM slutlig koncentration).
Obs: Andra cell färgämnen kan användas 14. - Blanda försiktigt genom att vända.
- Inkubera under 5 min vid 37 ° C före användning.
- Pipet 1 ml rekonstituerat blod i ett provrör innehållande 1 | j, l 5 mM Calcein AM (5 | iM slutlig koncentration).
3. Perfusion Assay
- Fokus målet på kollagenfibrer vidhäftade vid botten av körfält. Helst använder faskontrast eller differential interferens kontrast (DIC) inställningar för att fokusera strategi. Välj "Ställ in aktuell Z för utvalda kakel regioner" i försöket programvara för att digitalt korrigera de valda Z-positioner.
- Välja en region av intresse (ROI) i körfältet (xy) i experimentet mjukvaran i microscope som kommer att spelas in under experimentet.
Obs! ROI kan vara vilken yta godtyckligt vald inom en perfusion körfält. Det är inte tillrådligt att analysera trombbildning nära in- och utlopp av ett körfält så för att undvika biverkningar av flödesprofilen variabel i denna region, även om detta är relativt liten. ROI ytarea bör innehålla ett betydande antal blodplättar eller tromber för att tillåta utjämning av signalen. I detta protokoll ROI är en digitalt sydd sammanlagt tre lika stora sida vid sida bilder resulterar i 0,62 mm 2 i mitten av 2 cm lång bana. - Blanda proverna försiktigt genom att vända och placera dessa bredvid biochip på den automatiserade scenen.
- Placera slangen som är ansluten till inloppet av biochip i provrör innehållande de rekonstituerade blodprover.
- Starta pumpen vid 50 dyn / cm 2 (eller andra skjuvspänningar såsom önskas) för de kanaler som är länkade till provrörinnehåller de ombildade blodprover med hjälp av programvaran för pumpen.
Anmärkning: Andra skjuvspänningar kan användas. - Spela in bilder var 15 sekund under 5 minuter i realtid med hjälp av förvärv och experimentera programvara mikroskopet.
Obs: Andra tidsserie kan användas beroende på försöksuppställningen.
Obs: Vi använder i allmänhet en 100 gångers förstoring (10X objektiv och 10X objektiv), men högre (eller lägre) förstoring kan lätt användas som ett alternativ.
4. Skölj
- Tvätta ur alla slangar fäst till utloppet och i anslutning till flerkanalsgrenrör eller pump med användning av destillerat vatten, följt av natriumhypoklorit (blekmedel) 0,5% (volym / volym) och slutligen 0,1 M NaOH i vatten. Kasta slangen fästs på biochip inloppet som farligt avfall.
5. Dataanalys
- Bestäm trombtillväxt kinetik med bildanalysmjukvara. Följande kommandon är specifika för ZEN2012.
- Ställ fluorescens tröskel i Analysera Interactive fliken för att definiera pixel intensitet som korrelerar med en positiv signal, dvs en vidhäftade blodplättar eller vidhäftande trombocyter.
- Använd Skapa tabeller för att automatiskt generera ett kalkylark som innehåller de separata ytor (i fim 2) av dessa "objekt" som innehåller pixlar med en signal mellan de valda tröskelvärdena. Detta utförs för varje tidpunkt.
Obs! När tröskelvärden fluorescens har valt, känner analysprogram automatiskt "objekt" i synfältet som uppfyller kriterierna. Dessa objekt är tromber, små blodplättsaggregat eller enstaka blodplättar och täcka ett antal bildpunkter. Varje objekt finns med i kalkylbladet separat. - Spara dessa kalkylblad i XML-format och öppna dem i ett kalkylprogramför ytterligare beräkningar.
- Totalt ytan för de markerade objekten genom summering och dividera resultatet med den totala ytan av mätningen fältet (im 2). Detta kommer att ge den relativa yttäckning (%). Gör så för varje tidpunkt.
- Plotta dessa ytan omfattningar i funktion av perfusion tid och beräkna lutningen genom linjär regression, vilket gav den trombtillväxt kinetiska av ett visst tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera intra-analysvariation var tre identiska rekonstituerade helblodsprover perfusion samtidigt över kollagenbelagda ytor (Figur 1). Detta resulterade i en variationskoefficient av 8,7%. Denna statistik tyder acceptabelt inom analys och intralaboratory variation medger tillförlitlig jämförelse mellan relaterade prover.
Inloppet till kommersiella flödeskammaren vi beskriver här är vinkelrät mot mätkammaren och detta kan leda till något turbulent i stället för laminärt flöde vid den punkten. Särskilt i experiment utan antikoagulation detta kan orsaka igensättning på grund av den ökade kontakttiden mellan blodet och den immobiliserade agonist. Den igensatt inlopp kan förbrylla avläsning nedströms i kammaren. Därför var inställnings optimeras genom att delvis belägga flödeskammaren (fig 2) som lämnarinlopp saknar blodplättagonist, varigenom man undviker olägliga aktivering av primär- och sekundär hemostas. Partiell beläggning av vidhäftande ytor är dessutom framgångsrikt används av andra forskargrupper inom området 16. Dessutom är denna enkla praktiska trick en tillgång för att studera "övergången" zon där blod strömmar över den icke-reaktiva (obelagda) ytan fortsätter över den reaktiva (belagd) portion.
Transfusion simulerades genom rekonstituering av blod med den bristfälliga komponenten. För detta ändamål, antikoagulerat helblod från en frisk givare gjordes trombocytopenisk genom differentialcentrifugering och PC trombocyter tillsattes för att öka antalet trombocyter. En viktig fråga här var vad blodplättar att sträva efter? I de flesta fall behöver verkliga trans inte leda till normalisering av blodplättar i trombocytopen patienten. Snarare ett värde över en viss tröskel är avsedd för,även om den exakta målvärdet är dåligt definierad 19. För att förstå inverkan av varierande trombocyter på mikroflödessystem flödeskammare utfall i samband med blod beredning, har flera reconstitutions utförts med minskande koncentrationer blodplättar (Figur 3). Som väntat, lägre trombocytantal resulterade i mindre vidhäftning i funktion av perfusion tid. Därför inom en given studie, trombocyter bör standardiseras för att möjliggöra jämförelser mellan provförhållanden 20. Enbart det faktum att det finns färre vidhäftning när trombocyter är låga innebär dock inte att analysen inte kan användas för att mäta blodplättbeläggning i trombocytopeni prover eftersom mikroskopi och kamerainställningar kan anpassas för att öka känsligheten. Slutligen, i de flesta fall, den trombocytopenisk provet användas för beredning innehåller resten autologa blodplättar, som liknar situationen i de flesta transfusion krävande patienter 19. Det är currlunda oklart om och vilken roll autologa blodplättar är i samband med transfusion med allogena blodplättar, men är en intressant fråga för framtida forskning.
Efter insamling av blod från friska frivilliga givare är helblod ofta kyls till och hålls vid konstant rumstemperatur före beredning komponent. Blodplättar är emellertid känsliga för temperaturförändringar. Figur 4 visar effekten av minskade temperaturer efter bloduppsamling och under perfusion. Tromber befanns bygga långsammare när blodet kyldes till rumstemperatur (Figur 4A) jämfört med en identisk (parad) prov som hölls vid 37 ° C genom hela studien (figur 4B).
I omlopp, trombocyter binder till kärlskada platser i förhållanden med förhöjd vägg skjuvspänningen. Varierande skjuvhastigheter i mikroflödessystem flödeskamrarna coated med VWF / fibrinogen resulterade i skillnader för total trombocytvidhäftning vid slutpunkten (figur 5A) och för tromb tillväxt kinetik (figur 5B).
Slutligen, för att visa hur mikroflödesflödeskammare kan användas för att undersöka dator som används för transfusion, har tromb tillväxt kinetik i funktion av PC-lagrings undersökas. Alla variabler i provberedning och försöksuppställningen standardiserades under hela studieperioden. Hence, var den enda variabla parametern PC lagringstid. Figur 6 indikerar minskande trombtillväxt som funktion av lagringstiden visar effekten av lagringsmediumet för blodplättar lesion på hemostas in vitro.
Figur 1:. Intra-assay variation i mikroflödessystem flödeskammarexperiment mikroflödessystem flo w kammar Experimenten utfördes på immobiliserat kollagen på 50 dyn / cm ^. Alla tre identiska rekonstituerade helblodprover perfunderades parallellt och på samma gång. Resultaten visas som avstånds (whiskers) för yttäckning i funktion av perfusion tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Delvis belagd kanal (A) Kollagenfibrer visualiserade genom faskontrastmikroskopi påträffades endast i den belagda regionen. (B) En ögonblicksbild efter 5 min av perfusion med en kalcein AM märkt rekonstituerade helblodsprov pumpas på 50 dyn / cm 2 visas. Båda bilderna togs vid en 100 gångers förstoring. ig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: tromb tillväxt kinetik beror på blodplättar i rekonstituerade blod (A) Blod rekonstitueras med en blodbank trombocytkoncentrat ger olika koncentrationer trombocyter. 245 x 10 / il (●), 42 x 10 / il (■) och 12 x 10 ^ / pl (▲). Mikroflödesflödeskammar experiment med kollagenbelagda kanaler utfördes samtidigt för alla tre prover vid en skjuvspänning av 50 dyn / cm. (B) Backarna beräknas genom linjär regression av rådata i panel A avbildas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Temperatur och mikroflödesflödeskamrarna Helblod uppsamlades i heparin Vacutainers bevarades under 15 min i ett vattenbad vid rumstemperatur (A) eller vid 37 ° C (B). Mikroflödes perfusion på immobiliserat kollagen vid en skjuvspänning av 50 dyn / cm 2 utfördes. Snapshots vid slutpunkten (5 min perfusion) skildras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Rollen av skjuvspänning på trombocytvidhäftning till immobiliserat VWF / fibrinogen (A). Fyra identiska, kalcein AM-märkta, rekonstituerad helblodprover perfusion över en VWF / fibrinogen belagda ytan med skjuvspänning variabel: 4,5 dyn / cm (●), 50 dyn / cm (■), 90 dyn / cm (▲) och 225 dyn / cm (♦). Efter 3 minuters perfusion, var en ögonblicksbild tas till alla fyra kanalerna. (B) Surface omfattningar i funktion av tiden av proven som beskrivs i (A) visas illustrerar skillnader i trombostillväxt kinetik. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. Trombbildning av blodplättkoncentrat i funktion av lagringstiden Alla mikroflödesströmningskammare Experiment utfördes under standardiserade förhållanden på kollagenbelagda ytor vid en skjuvhastighet av 50 dyn / cm 2. Blod var reconstitats med prover plätt av samma koncentrat testades i duplikat på dag tre (●), sju (■) och tio (▲) efter donationen. Surface omfattningar i funktion av perfusion tid skildras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur S1:. Installationskammare hårdvara Mikroflödes flöde (A) En Vena 8 Fluoro + biochip är monterad på den automatiserade skede av mikroskop och är ansluten via en flexibel slang till en sprutpump med samlingsröret för att dela pumpfunktionen i åtta separata kanaler. (B) Beredd blod strömmar genom engångs slangen på höger sida i de valda kanalerna i biochip (inlopp). Engångs slangen fixeras i inloppet genom en rostfritt sstift engångs ess stål medföljer installationen. Blodflödet i (B) är från höger till vänster och samlas i långa flexibla slangar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroflödesflödeskammare experiment är ett utmärkt verktyg för att undersöka trombocytfunktion i strömmande blodet och används för att utvärdera hemostas in vitro i olika experimentella sammanhang. Trots dålig provnings standardisering 9, visar vi att inom vårt laboratorium den experimentella variationen är acceptabel. Detta gör det möjligt att på ett tillförlitligt jämföra (parade) prover inom en given studie. Detta validerades med hjälp av väldokumenterade fenomenet lagring av blodplättar lesion, som är en skadlig konsekvens av lagring av blodplättar i blodet bankförhållanden 11. Dessutom nyligen publicerade vi effekterna av tre tillgängliga patogeninaktivering teknik funktions PC plätt i mikroflödessystem flödeskammare efter beredning av blod 14,15.
Trombocyter reagerar olika när biofysiska och-kemiska parametrar varieras 20. Därför skjuvspänning, antalet celler och cellulära composition, temperatur, beläggning, antikoagulerande och många fler faktorer kan modifieras inom detta protokoll beroende på frågeställningen. Detta protokoll använder endast kommersiellt tillgängliga hård- och mjukvara, vilket gör att andra laboratorier för att utföra en liknande analys. För grundläggande forskningsändamål kan detta vara en nackdel särskilt eftersom den tillgängliga hårdvaran är mindre flexibla än skräddarsydda inställningar. Analysen i sig är robust men reproducerbarhet lider av biologiska och tidsmässiga variationer. Därför analysprover måste paras så mycket som möjligt och studera storlekar bör vara tillräckligt stor. Prover måste också paras ihop i tid, eftersom rekonstituerade blod endast kan lagras under en kort tid.
Även mikroflödessystem flödeskammare för trombocytfunktionen studier har ökat forskningsområdet, bör försiktighet iakttas för att overinterpret beroendet trombocyter på blod reologi. För det första är inte fysiologisk den rektangulära formen av flödet kammaren, but det bästa vi har att tillåta optisk fokus på växande tromber. För det andra blodkärl inte gjord av plast och påverkan av blodkärlens elasticitet på trombocytfunktionen kan därför inte studeras i detta protokoll. För det tredje, får hjärtat pulserande flöde, medan sprutpumpar är mer linjär (även om också något pulserande). Slutligen, fibrillärt kollagen typ I är den standard som används för studier av blodplättar enligt flöde, som är av animaliskt ursprung. Notera dock, fibrillärt kollagen typ I och kliniska resultat för trombocytfunktionen korrelerar väl i många fall som framgår av årtionden av erfarenhet (ljustransmission) aggregometry 21,22.
Det finns många analyser för att studera trombocytfunktionen 23. De flesta av dessa adress en eller ett par funktioner trombocyter samtidigt sätta blodplättar att arbeta i (modeller) hemostas. Realtids avbildning av blodproppsbildning som visats här är den mest omfattande hittills. Detta innebär att de flesta aspekter av platelet svar på kärlskada är inkluderade. Unika fördelar är inkluderandet av blodflödet och närvaron av alla blodkroppar. Analysen är känslig för de för närvarande använda läkemedlen för trombocythämmande behandling 24 samt genetiska förändringar som resulterar i funktion 25 avvikande blodplättar. Detta visar dess värde som en relevant indikator av trombocytfunktionen. Den omfattande karaktär denna analys innebär dock också att det är mindre analytisk än de analyser som mäter särdrag plätt svar. Effekter av blod bank manipulationer på blodplättskoncentrat kan därför genom plockas upp av flödeskammaranalyser, men att tolka vad som orsakar dem, krävs ytterligare analys. Till exempel, våra data tyder på att temperaturen påverkar trombocytadhesion avsevärt i mikroflödessystem flödeskammare. Men ytterligare detaljerad analys har visat att kylda blodplättar ändrar form och kluster GPIbα receptorer 26.
et al. 16 visade betydelsen av substrat definition trombocyter systembiologi. Dessutom är kombinationen av varierande skjuvhastigheter i funktion av substratet viktigt eftersom bindning av blodplättar till immobiliserat VWF kommer att kräva höga skjuvhastigheter, medan detta är mindre viktig för bindning till kollagen. Därför, beroende på forskningsfråga, val kan göras på vilka substrat och deras respektive flödeshastigheter är som skall ingå.
Avslutningsvis presenterar vi ett protokoll för mikroflödessystem flödeskammar experiment för att studera trombocytfunktionen inom ramen för blodbanker och transfusionsmedicin. Standardiseringsarbetet pågår 9,10,28-30 och de flesta av dessa rekommendationer ingår i protokollet presenteras. Ombildning av blod är en modell förtransfusion men ytterligare valideringsarbete bör ange relevans för kliniska resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1,000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5 ml | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15 ml | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in Figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in Figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4) |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1 M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
