Introduction
Hemostaz kısıtlı zamanmekansal bağlamda 1 hücreleri, proteinler, iyonlar ve dokuların kombine ve düzenlenmiş aktivite gerektirir. Kontrolsüz etkinliği kan pıhtılaşması ile ilgili bozuklukların bir spektrum içinde kanama ve tromboz ve morbidite ve mortaliteye neden olabilir. Bir mikroakışkan akış odası deneyi in vitro hemostazisi taklit zorlu bir tekniktir. Bu yaklaşım, kan trombositlerin için öncü bir role sahip hemostaz katılan süreçlerin karmaşık etkileşimin soruşturma sağlar.
vasküler hasar ardından, trombositler, kan kaybını önlemek için maruz subendotelyal matris (gliko) proteinlere yapışır. Yapışma ardından, trombositler aktive ve yanıt olarak agrega matik ve nihayet bir trombosit ağının oluşumu, fibrin tarafından stabilize ve bir firmaya neden neden parakrin sinyal için, trombüs 2 sızdırmazlık yara. Diğer çoğu trombosit fonksiyon testleri, deney aksineAkış odaları ile ments dikkate kan akımının fiziksel parametre ve bu nedenle katılımcı hücreler ve biyomoleküllerin 3,4 tarihinde reolojinin etkisini alır.
Akış odası deneyleri yapışkan matrisi, reoloji ve akış profilleri, hücresel kompozisyon, toksinler veya ilaç, iyonik kuvvet ve daha birçok varlığı da dahil olmak üzere süreçler hemostatik (alt) etkileyen önemli parametreler değiştirilerek hemostaz ve tromboz dönüm noktası anlayışlar yarattı. Son yirmi yılda, büyük örneklem hacimleri (10-100 ml) gerektiren düşük verim akım odası deneyleri mikroakışkan odaları genellikle küçük paralel plaka odadan oluşan ve kontrollü duvar kesme koşullarında 5 de tam kan perfüze için modern teknolojiyi dahil etmek gelişmiştir. donanım kurulum basitleştirilmiş ve daha az (kan) hacmi gereklidir çoğunlukla nedeniyle Microscaling önemli ölçüde deneme daha erişilebilir ve Versati render tahlil verimi arttıle. Örneğin, küçük laboratuar hayvanlarından kan Böylece hayvanlar kurban gerek kalmadan kullanılabilir. Genetiği değiştirilmiş farelerin kan örnekleri böylece hemostaz teşvik veya inhibe anahtar moleküller belirlenmesinde ve yeni temel anlayışlar 6 yardımcı olmaktadır.
Özel araştırma laboratuarları çoğu hala yazılım tarafından blueprinted edilebilir Baskılı kalıplara polimerize polidimetilsiloksan (PDMS) 7 den, örneğin özel yapılmış akış odaları kullanın. Ortaya çıkan odası, ucuz tek kullanımlık ve kolayca post hoc analizi için demonte edilebilir. Ayrıca, temelde gemiler de dahil olmak üzere bifurkasyonlarında veya keskin dönüşler herhangi bir tasarım komutu üzerine inşa edilebilir. Bu avantaj da standardizasyon zaten akış odası deneyleri ile birincil sorun bu yana olumsuz ve PDMS özel odalar bu destekli değil yaptı. Bu belirli bir sorunun üstüne kaplama (şartlar), floresan probları, antikoagülan, geçici üzerindenumune alma ve analiz arasındaki kısa süreli olarak ve zaman tüm kötü 8 standardize edilmiştir. Bu değişkenlerin Standardizasyon zorlu ama yine de laboratuarlar arasında sonuçların karşılaştırılmasına olanak gerekmektedir. Bu konu Biorheology 9,10 Bilimsel ve Standardizasyon alt komite Tromboz ve hemostaz üzerine International Society önemli bir konudur.
Trombosit konsantreleri (PC) trombositopeni ve / veya kanamaya neden çeşitli hastalıklardan mustarip hastalarda transfüzyon. Ama PC trombositler özellikle depolama süresinin 11 işlevinde, duyarsız bilinen bir bozulma süreci yaşlanma ve yaygın olarak trombosit saklama lezyon olarak anılacaktır bağlantılı. Bazen bu tür plateletler kez 12 transfüzyon dolaşımda geri iddia edilmektedir, ancak bunun için kanıt azdır. Ayrıca, bir PC oluşturan trombosit işlevselliği rutin test değil çünkü bu tür tahliller arasındaki ilişkiterapötik ya da profilaktik etkisi açık 13'tür. Mikroakışkan akış odaları toplama ve ihracı arasındaki manipülasyonlar zincirini optimize etmek için PC trombosit fonksiyonlarını araştırmak için bir araç sunuyoruz. Biz daha önce 14,15 yayınlanmış ve burada tarif edildiği gibi PC doğrudan (eşli) karşılaştırmalar için güçlü bir araştırma aracıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, insan numuneler üzerinde araştırmalar için kurumsal etik kuralları takip ve bilgilendirilmiş onam ilgili tüm vericilerden elde edildi. Burada tarif edilen deneyler için onay Antwerp Üniversitesi Hastanesi kurumsal inceleme kurulu elde edilmiştir.
Not: belirtilmediği sürece Sıcaklık göstergeleri, her zaman oda sıcaklığı vardır.
1. Hazırlık Akış Odası Kurulumu
- Hazırlama Lanes, Boru ve iğneler
- Vorteks kuvvetli bir şekilde kollajen süspansiyonu ve 50 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyona kadar sağlayıcı tarafından sağlanan izotonik glikoz çözeltisinde 1/20 seyreltin.
Not: Biz esas olarak tip I fibriller oluşur, at tendon kollajen kullanın. At kollajen tip I sık sık "Horm" kolajen olarak adlandırılır ve tarihsel yanı sıra biyolojik nedenlerle hem tahlil 9 bu tür altın standardı mesafesindedir. İnsan tip III kollajen de kullanılabilir, ancak inci edilebilire daha az kat fibrillerinde ve trombosit cevabı kadar güçlü değildir. Diğer kaplama yüzeyleri de, örneğin von Willebrand Faktörü (vWF), fibrinojen, fibronektin, laminin, vitronektin, trombospondin-1 ya da bu 16 kombinasyonları için, kullanılabilir. - sağlayıcının kaptan yeni bir atılabilir Bioçip alın. Burada kullanılan bioçipler boyutları mm 3 0.4 W x 0.1 H x 20L vardır.
- Pipetleyin çıkış olarak çip ve işaretinin bir ucunda mikroakışkan Biochip kulvar (lar) 0.8 ul. şerit 1.1.1 hazırlanan kaplama çözeltisi içeren kollajen ile 5 / 6th dolu olduğundan emin olun. hiç hava kabarcığı olmadığından emin olun.
Not: Kanallar kısmen (tartışma) kanalı girişinde kollajen liflerinin birikmesini önlemek için kaplanır. - nemlendirilmiş ve kapalı bir kap içinde 4 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- / H) inek serumu albumin (w bloke edici tampon (% 1.0 pipetleme kaplanmış kanallarını blokediğer ucu ile gösterirken, d,% 0.1 (a / h) glukoz, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) tamponlu tuzlu su (hacim / hacim) NaCl, pH 7.4% 0.9 (HBA) 'de giriş olarak. şerit tamamen hava kabarcıkları kaçınarak engelleme tamponu ile dolu olduğundan emin olun.
- eşit uzunlukta (12 cm) hortumu kesilir. kulvar başına birini kullanın ve bir iğne ile her tüp bağlayın. Örneğin, iki nüsha halinde çalışan iki koşulları karşılaştıran bir deney, dört boru uzanıyor ve dört pim hazırlanacak gerektirecektir.
- bir şırınga ve bir 26 G iğne ya da eşlik eden bağlayıcıları kullanılarak saf su ile boru durulayın.
- bloklama tamponu ile boru doyurabilecek. 1 saat arasında, en az bir kapalı ve nemli bir kap içinde depolayın.
- Vorteks kuvvetli bir şekilde kollajen süspansiyonu ve 50 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyona kadar sağlayıcı tarafından sağlanan izotonik glikoz çözeltisinde 1/20 seyreltin.
- Pompa ve Manifold hazırlama
- hava kabarcıklarını çıkarmak, pompayı durulayın ve damıtılmış su ile manifoldu.
- çıkışında sabit 10 ul ucunu kullanarak biyoçip şeritli (ler) engelleme tampon aspire. yüzeyini temizleyinhassas silip toz ve denatüre alkol ile Biochip baskılar ve tozunu alın.
- otomatik mikroskop sahnede Bioçip sabitleyin. Birden fazla şeritli bir seferde aynı anda kullanılırsa, biyoçip çıkışına sekiz şerit manifoldu ayırıcı bağlanır.
Not: Sekiz şeritli manifoldu ayırıcı donanım parçasıdır (Şekil S1) pompa ve Biochip bağlı. Bu Bioçip veya operatör tanımlı eden yazılım olabilir şerit kombinasyonuna tüm (sekiz) şerit çalışmasını sağlar. - biochipin girişinde bunları düzeltmek için tüp işaretçilerine kullanın. HBS ile doldurulmuş 1.5 ml konik biçiminde bir test tüpü içinde (PIN olmadan) hortumun diğer ucu yerleştirin. kalan tampon engelleme ve kötü kolajen yapışmış kaldırmak amacıyla, tüm boru ve 1 ml HBS pompa kullanılarak onların bağlı şerit durulayın.
Kan Örneklerinin 2. Hazırlık
- Toplama ve ayırmaSağlıklı bir gönüllüden taze tam kan. 17
- Bir pıhtılaşma önleyici olarak etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden bir tahliye borusu kan ilk mililitre toplamak ve özel olarak otomatik bir hematoloji analiz cihazı ile tam kan sayımı (CBC), bu örnek kullanın.
- tahliye tüpler kullanılarak uygun bir antikoagülan kan hacmi toplayın. oluşumunu fibrin çalışma protokolüne ve sodyum sitrat parçası değilken akış odası deneyleri için standart antikoagülan heparin ya da hirudindir vardır.
Not: Heparin açıklanan tüm deneyler için bir antikoagulan olarak kullanılmıştır.
Not: kan miktarı yapılacak deneyler sayısına bağlıdır. Yaklaşık 3 şerit 1 borusu (7 mi). - Bir rotator bekleyen kan sulandırma üzerinde tüpler yerleştirin.
Not: Tahlil Flebotomi 3 saat içinde tamamlanmalıdır. - Trombosit bakımından zengin plazma 250 g'da 15 dakika boyunca santrifüj (PRP). gevşekçe paketlenmiş pelet olumsuz yönde etkilenmemesi için santrifüj mola kullanmayın.
- Birden fazla tüp toplandı zaman, tek bir konik santrifüj tüpü içinde kan havuzu.
Not: Santrifüj PRP verim ve ayırıcı hücre "kontaminasyon" bağlı, daha yavaş ya da daha az uzun yapılabilir tercih.
- Birden fazla tüp toplandı zaman, tek bir konik santrifüj tüpü içinde kan havuzu.
- Çıkarın ve birkaç trombositler ile dolu kırmızı kan hücrelerinin veren PRP ve buffy coat atın.
Bizim elimizde ortalama ul başına 13 ± 5 x 10 3 paketlenmiş kırmızı hücre fraksiyonunda trombosit sayısı ise (ortalama ± SD, n = 12): Not.
- kan Sulandırma
- 5 dakika ve 4 ml başına 20 saniye süreyle, 37 ° C'de çözülme kan grubu AB (Rhesus D negatif), plazma.
- otomatik bir hematoloji analiz cihazı kullanılarak 2.1.5 hazırlanan paketlenmiş kırmızı kan hücrelerinin hematokriti belirler.
- Kan bankasında trombosit konsantrasyonunu belirlemek trombosit konsantresi tha hazırlanmışT, yukarıda kırmızı hücre fraksiyonu tekrar oluşturmak için kullanılır.
- 1 ml'lik bir örnek% 40 hematokrit ve 250 x 10³ trombosit / ul verecektir eritrosit, trombosit konsantresi hacmini hesaplar.
Not: Hücrelerin Diğer hedef titreleri çalışma protokolüne bağlı olarak, keyfi olarak ayarlanabilir. - Transfer kırpılmış bir pipet ucu kullanılarak ve 1 ml lik bir numune hacmi elde edilene kadar trombosit konsantresi ilave taze tüpe kırmızı kan hücreleri ve plazma paketlendi.
Not: Plazma trombüs oluşumu oranı üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu değişkenler okudu bağlı olarak, plazma fraksiyonu tüm sulandırılmış örneklerde eşit olmalıdır. Örneğin, sonuç etkileyebilir farklı donörden veya farklı antikoagülan alınan donma-çözülme ya da plazma tekrarladı. - yavaşça ters çevirerek yeniden kan karıştırın ve bir CBC gerçekleştirin.
- trombosit fraksiyonun hacmi ikame edildiği bir "boş" kontrol numunesi hazırlanması% 0.9 su (kütle / hacim) sodyum klorür, aynı hacimde bir CBC kullanılarak yeniden kan endojen trombosit konsantrasyonu (yani, kan bankası trombositler) belirlemek gerekmektedir.
- etiketleme
- Pipet 1 mi 1 ul 5 mM Calcein AM (5 uM nihai konsantrasyon) ihtiva eden bir test tüpüne kan yeniden.
Not: Diğer hücre boyalar 14 kullanılabilir. - ters çevirerek yavaşça karıştırın.
- kullanımdan önce, 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe edilir.
- Pipet 1 mi 1 ul 5 mM Calcein AM (5 uM nihai konsantrasyon) ihtiva eden bir test tüpüne kan yeniden.
3. Perfüzyon Testi
- şerit dibinde yapıştırılır kollajen lifleri üzerinde nesnel odaklanın. İdeal olarak, bu odaklanma stratejisi için faz-kontrast veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) ayarlarını kullanın. dijital seçilen Z-pozisyonları düzeltmek için deneme yazılımı 'seçilen çini bölgeler için ayarlayın akım Z' seçeneğini seçin.
- m deney yazılımı şeritli (xy) ilgi (ROI) bir bölge seçinDeney sırasında kaydedilir icroscope.
Not: ROI keyfi bir perfüzyon şeritte içinde seçilen herhangi bir yüzey alanı olabilir. Nedenle bu göreceli olarak küçük olsa da, bu bölgede değişken akış profilinin yan etkilerden kaçınmak için yakın bir şeritli giriş ve çıkışına trombüs oluşumunu analiz için tavsiye edilir. YG yüzey alanı trombositlerin önemli sayıda içeren ya da sinyal tesviye izin trombüs gerekir. Bu protokolde YG 2 cm uzunluğundaki Lane ortasında 0.62 mm 2'de elde edilen üç eşit yan tarafında bir görüntü dijital olarak dikilmiş toplamıdır. - yavaşça tersini örnekleri karıştırın ve otomatik sahnede Biochip bu sonraki yerleştirin.
- sulandırılmış kan örnekleri içeren test tüplerinde Biochip girişi ile bağlantılı olan boru yerleştirin.
- Test tüplerine bağlı olan kanallar için (istediğiniz gibi ya da diğer kesme stresleri) 50 din / cm2 pompayı başlatınpompa yazılımı kullanılarak yeniden kan örnekleri ihtiva etmektedir.
Not: Diğer kayma gerilmeleri kullanılabilir. - Tutanak görüntüleri mikroskop edinimi ve deney yazılımı kullanarak gerçek zamanlı olarak 5 dakika boyunca her 15 sn.
Not: Diğer zaman serisi deneysel set-up bağlı kullanılabilir.
Not: Genellikle 100X büyütme (10X objektif ve 10X lens) kullanır, ancak daha yüksek (veya daha düşük) büyütme kolayca bir alternatif olarak kullanılabilir.
4. Yıkama Out
- sodyum hipoklorit (çamaşır suyu)% 0.5, ardından her tüp çıkışına bağlı ve damıtılmış su kullanılarak çok kanallı manifoldu veya pompaya bağlı yıkayın (h / h) ve su son olarak 0.1 M NaOH. tehlikeli atık olarak biyoçip girişine tutturulmuş boru atın.
5. Veri Analizi
- görüntü analiz yazılımı ile trombüs büyüme kinetikleri belirleyin. aşağıdaki komutlar ZEN2012 özgüdür.
- Olumlu bir sinyal ile ilişkilidir piksel yoğunluğunu belirlemek için İnteraktif sekmesini Analiz, yani bir yapışık trombosit ya da yapışan trombositler floresan eşiğini ayarlayın.
- Otomatik olarak seçilen eşik arasında bir sinyal ile pikselleri ihtiva eden "nesnelerin" nin (mikron 2) ayrı yüzey alanlarını içerecek bir elektronik tablo oluşturmak için Tablolar oluşturma kullanın. Bu, her bir zaman noktası için gerçekleştirilir.
Not: floresan eşikleri seçti edildikten sonra, analiz yazılımı otomatik olarak kriterleri yerine görünüm alanına 'nesneleri' olarak algılar. Bu nesneler trombüsler, küçük trombosit agrega veya tek trombositler ve piksel sayısını kapsamaktadır. Her nesne ayrı ayrı e-tabloda listelenir. - xml formatında bu elektronik tabloları kaydedin ve bir elektronik tablo programı bunları açıksonraki hesaplamalar için.
- Toplamı ile seçilen nesnelerin toplam yüzey alanları ve ölçüm alanına (mikron 2) toplam alanın tarafından sonucu bölün. Bu göreceli yüzey kaplama (%) verecektir. Her zaman noktası için bunu.
- Perfüzyon, zamanın bir fonksiyonu olarak, bu yüzey Kapsamlı Konu ve söz konusu durumun trombüs büyümesi kinetiğini sonuçta, doğrusal regresyon ile eğimi hesaplanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analiz içi varyasyon göstermek için, üç aynı yeniden tam kan numuneleri kollajen kaplı yüzeylerin (Şekil 1) üzerinde eşzamanlı olarak perfüze edildi. Bu% 8.7 bir farklılaşma katsayısı ile sonuçlanmıştır. Bu istatistik ile ilgili örnekler arasında kıyas izin kabul edilebilir içi tahlil ve laboratuvarda varyasyon göstermektedir.
Burada tarif ticari akış odasının giriş ölçüm gözüne dik olan ve bu da o noktada laminer akış hafif türbülanslı neden olabilir. Özellikle antikoagülasyon olmayan deneylerde Bu, kan ve hareketsizleştirilmiş agonist arasında artan temas süresi tıkanmaya sebep olabilir. tıkanmış giriş odasında aşağı okuma karıştırabilir. Bu nedenle, kurulum, kısmen akış odası (Şekil 2) terk kaplayarak optimizetrombosit agonist yoksun girişleri, böylece primer ve sekonder hemostaz zamansız aktivasyonunu önler. Yapışkan yüzeylerin kısmi kaplama üstelik başarıyla alanda 16 diğer araştırma grupları tarafından kullanılır. Buna ek olarak, bu basit, pratik hile reaktif olmayan (kaplanmamış) yüzey üzerinde akan kan reaktif (kaplı) bölümü üzerinde devam ettiği "geçiş" bölgesini incelemek için bir varlıktır.
Transfüzyon eksik bileşeni ile kan sulandırılması ile simüle edilmiştir. Bu amaçla, sağlıklı bir donörün trombosit sayısını arttırmak için ilave edildi diferansiyel santrifügasyon ve PC trombositlerinde trombositopenik hale getirilir tam kan antikoagüle. Burada önemli bir soru nasıl trombosit için amaç saymak oldu? Çoğu durumda, gerçek hayat transfüzyonu trombositopenik hastada trombosit sayısı normalleşmesi yol açmaz. Daha ziyade belli bir sınırın üzerinde bir değer amaçlanmaktadır,tam hedef değer olmasına rağmen 19 kötü tanımlanmış. Kan sulandırma bağlamında mikroakışkan akış odaları sonuçlar üzerine trombosit sayımı değişen etkisini anlamak için, çeşitli reconstitutions trombosit yoğunlukları (Şekil 3) azalan ile gerçekleştirildi. Beklendiği gibi, düşük trombosit sayımı perfüzyon, zamanın bir fonksiyonu olarak az yapışma ile sonuçlanmıştır. Bu nedenle, belirli bir çalışmanın içinde, trombosit sayımı örnek koşulları 20 arasında karşılaştırma izin standardize edilmelidir. trombosit sayımları ancak mikroskop ve kamera ayarları duyarlılığı artırmak için adapte edilebilir, çünkü deney trombositopenik örneklerinde trombosit birikimini ölçmek için kullanılamaz anlamına gelmez düşük az yapışma olduğunu gerçeği. Son olarak, bir çok durumda, yeniden oluşturulmak üzere kullanılan trombositopenik örnek hasta 19 talep en nakli durum benzer kalan otolog trombositler de içerir. Bu Curr olduğunueğer ne otolog trombositlerin rolü allojenik trombositler ile transfüzyon bağlamında ancak gelecekteki araştırmalar için ilginç bir sorudur isteğinizle belirsiz.
Sağlıklı gönüllü vericilerden kan toplama sonra, bütün kan genellikle soğutulur ve bileşen hazırlanmadan önce sabit oda sıcaklığında tutuldu. Trombositler sıcaklık değişikliklerine karşı Ancak duyarlıdır. 4 kan alımından sonra ve perfüzyon sırasında azalır sıcaklık etkisini göstermektedir. Trombüs kan oda sıcaklığında (Şekil 4A) kadar soğutuldu zaman özdeş (ikili) numuneye kıyasla daha yavaş oluşturmak için çalışma bulundu (Şekil 4B) içinde 37 ° C 'de muhafaza edilmiştir.
dolaşımda, trombositler yüksek duvar kayma gerilmesi koşullarında damar hasarı sitelere bağlanırlar. mikroakışkan akış odaları c değişen kayma hızlarıVWF oated / fibrinojen bitiş noktasında toplam platelet yapışmasının (Şekil 5A) farklılıklara ve trombüs büyüme kinetikleri (Şekil 5B) için elde edilmiştir.
Son olarak, transfüzyon kullanılan PC araştırmak için nasıl kullanılabileceğini mikroakışkan akış gözlerinden göstermek için, bilgisayar depolama işlevi trombus büyüme kinetikleri araştırılmıştır. numune hazırlama ve deneysel set-up tüm değişkenler çalışma süresi boyunca standardize edildi. Bu nedenle, tek değişken parametre olarak bilgisayar depolama süresi. Şekil 6, in vitro hemostaz trombosit depolama lezyon etkisini gösteren bir depolama, zamanın bir fonksiyonu olarak trombus büyümesini azaltarak gösterir.
Şekil 1:. Mikroakışkan akış odası deneylerde analiz içi varyasyon mikroakışkan flo W odası deneyler 50 din / cm² immobilize kollajen üzerinde gerçekleştirilmiştir. Üç özdeş yeniden tam kan örnekleri paralel olarak ve aynı zamanda perfüze edildi. Sonuçlar perfüzyon zamanın bir fonksiyonu olarak yüzey kapsama alanı için aralık (bıyıkları) olarak gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:., Evre zıtlığı mikroskopisi ile görselleştirildi kısmen kaplanmış kanal (A), kolajen lifleri, sadece kaplı bölge bulundu. (B) 50 din pompalanır bir Calcein AM yeniden etiketli tam kan örneği ile perfüzyonun 5 dakika sonra bir anlık / cm2 gösterilmektedir. Her iki fotoğraf 100X büyütmede alınmıştır. ig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: trombüs büyüme kinetiği sulandırılmış kandaki trombosit sayısı bağlıdır (A) Kan, kan bankası trombosit kullanılarak yeniden çözüldü farklı platelet konsantrasyonlarını veren konsantresi:. 245 x 10³ / ul (●), 42 x 10³ / ul (■) ve 12 x 10³ / ul (▲). kollajen kaplı kanalları mikroakışkan akış odası deneyleri / cm² 50 din bir kesme stresinde üç örnek için eş zamanlı olarak yapıldı. (B) gösterilmiştir Panel A ham verilerin lineer regresyon ile hesaplanan yamaçlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Sıcaklık ve mikroakışkan akış gözlerinden heparin vacutainers toplanan tam kan, oda sıcaklığında (A) veya 37 ° C (B) bir su banyosu içinde 15 dakika boyunca korunmuştur. 50 din bir kesme stresinde immobilize kollajen mikroakışkan perfüzyon / cm2 uygulandı. Bitiş noktası (5 dk perfüzyon) tasvir edilmektedir Snap çekim. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: hareketsizleştirilmiş VWF / Fibrinojen platelet yapışması üzerinde kayma stresin (A). Dört özdeş, Calcein, etiketli tam kan yeniden AM4,5 din / cm² (●), 50 din / cm² (■), 90 din / cm² (▲) ve 225 din / cm² (♦): numuneler değişken kayma gerilmesi ile bir VWF / fibrinojen kaplı yüzey üzerinde perfüze edildi. perfüzyon 3 dakika sonra, bir çırpıda atış dört kanal alındı. (A) 'da tarif numunelerin zamanın fonksiyonu (B) Yüzey teminatları trombüs büyüme kinetiği farklılıklar gösteren gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6:. Trombosit Trombüs formasyonu depolama, zamanın bir fonksiyonu olarak konsantre tüm mikroakışkan akış odası deneyleri 50 din / cm2 'lik bir kesme hızında kollajen kaplı yüzeylerde standart koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Kan reconsti oldugün üç (●) kopya halinde test aynı konsantre trombosit örneklerinde, yedi (■) ve on (▲) sonrası bağış ile değiştirilmemiş. Perfüzyon zaman fonksiyonu tasvir ediliyor yüzey teminatları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil S1:. Mikroakışkan akış odası donanım kurulum (A) Vena 8 Flor + biyoçip mikroskop otomatik sahnede monte edilir ve sekiz ayrı kanallar içine pompalama fonksiyonunu bölmek manifoldu ile bir şırınga pompası esnek boru vasıtasıyla bağlanır. (B) yeniden yapılandırılmış kan Biochip (giriş) seçilen kanallarına sağ tarafta tek kullanımlık tüp içinden akar. tek kullanımlık boru bir stainl ile giriş sabittiress çelik atılabilir pim kurulumu ile birlikte. (B) Kan akımı sağdan sola doğru ve uzun esnek hortumları toplanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroakışkan akış odası deneyleri kan akan trombosit fonksiyonlarını araştırmak için mükemmel bir araçtır ve deneysel bağlamlarda farklı in vitro hemostaz değerlendirmek için kullanılır. Fakir laboratuvarlar arası standardizasyonun 9 rağmen bizim laboratuvar içinde deneysel varyasyon kabul edilebilir olduğunu göstermektedir. Bu güvenilir, belirli bir çalışma içinde (eşli) örnekleri karşılaştırmak için izin verir. Bu kan bankası koşullarında 11 trombosit depolama zararlı sonucudur trombosit depolama lezyonun, iyi belgelenmiş fenomen kullanılarak valide edildi. Ayrıca, son zamanlarda kan 14,15 sulandırıldıktan aşağıdaki mikroakışkan akış gözlerinden PC trombosit fonksiyonu üzerindeki mevcut üç patojen inaktivasyonu teknolojilerinin etkisini yayınladı.
Biyofiziksel ve -Kimyasal parametreler 20 çeşitlidir zaman Trombositler farklı tepki. Bu nedenle, kayma gerilmesi, hücre sayısı ve hücresel BİLEŞİMİyon, sıcaklık, kaplama, antikoagülan ve daha birçok faktör araştırma sorusu bağlı olarak bu protokolde içinde değiştirilebilir. Bu protokol, diğer laboratuarlar benzer bir tahlil yapmak için izin sadece piyasada mevcut donanım ve yazılım araçlarını kullanır. Mevcut donanım ısmarlama kurulumları daha az yönlü çünkü özellikle temel araştırma amaçlı bu bir dezavantaj olabilir. kendi içinde tahlil sağlamdır ama tekrarlanabilirlik biyolojik ve zamansal değişimi muzdarip. Bu nedenle, tahlil, numuneler mümkün olduğu kadar eşleşmiş ve yeterince büyük olmalıdır boyutları çalışma gerekir. Numuneler ayrıca sulandırılmış kan sadece kısa bir süre için saklanabilir, çünkü zaman içinde eşleştirilmiş olması gerekir.
Trombosit fonksiyon çalışmaları için mikroakışkan akış odaları araştırma alanını artırdığını olmasına rağmen, dikkatli kan reolojisi trombosit bağımlılığı gereğinden fazla anlam yüklüyorlar alınmalıdır. İlk olarak, akış odasının dikdörtgen şekli fizyolojik değildir, buEn iyi t biz büyüyen trombüs odaklanarak optik izin vermek zorunda. İkincisi, kan damarları, bu nedenle bu protokol okudu edilemez plastik ve trombosit fonksiyonu üzerindeki kan damarı elastisite etkisi yapılmaz. şırınga pompaları daha doğrusal (her ne kadar az da olsa pulsatil) ise üçüncü, kalp, pulsatil akışına neden olur. Son olarak, kolajen fibril tipi hayvan kökenli olan akışı altında trombosit çalışmaları için kullanılan standart bir malzemedir. Notun Ancak, fibriler tip I kolajen ve (ışık geçirgenliği) onlarca yıllık deneyimi ile gösterildiği gibi trombosit fonksiyonu için klinik sonuçlar 21,22 aggregometri birçok durumda iyi bir korelasyon.
Trombosit fonksiyonu 23 incelemek için birçok tahliller vardır. Bu adrese bir ya da trombosit özellikleri bir çift çoğu koyarak trombositler hemostaz (modelleri) çalışmak ise. Burada gösterildiği gibi trombüs formasyonunun gerçek zamanlı görüntü Bugüne kadar, çoğu için geçerlidir. Bu pla en yönlerini demektirdamar sakatlığı TELET tepkisi dahildir. Benzersiz avantajlar kan akımının içerme ve tüm kan hücrelerinin varlığı bulunmaktadır. Deney antitrombosit tedavisi 24 hem de anormal trombosit fonksiyonu 25 sonuçlanan genetik değişiklikleri şu anda kullanılan ilaçlara karşı hassastır. Bu trombosit fonksiyonunun ilgili bir göstergesi olarak değerini göstermektedir. Bu deneyde kapsamlı yapısı yine de trombosit tepkisinin belirli özelliklerini ölçen bu deneylerden daha az analiz olduğunu ima eder. trombosit konsantreleri kan bankacılığı manipülasyon etkileri dolayısıyla akış odası deneyleri tarafından yakalandı, ancak onları neyin neden yorumlamak, ek analiz gereklidir. Örneğin, bizim veri sıcaklığı önemli ölçüde mikroakışkan akış gözlerinden trombosit yapışması etkilediğini göstermektedir. Ancak ek detaylı analiz buzdolabında trombositler şeklini değiştirmek olduğunu göstermiştir ve küme GPIbα 26 reseptörleri.
ve diğ. 16 tarafından son çalışma sistemleri biyoloji Platelet substrat tanımının önemini gösterdi. Bu kolajene bağlanması için daha az önemli olan, hareketsizleştirilmiş VWF trombositlerin bağlanması, yüksek kesme oranları gerektirmektedir çünkü Ayrıca, alt-tabaka bir fonksiyonu olarak kesme oranları değişen kombinasyonu önemlidir. Bu nedenle, araştırma sorusu bağlı olarak, seçimler nasıl yüzeylerde yapılan ve kendi akım hızları dahil edilecek olan edilebilir.
Sonuç olarak, mikroakışkan akış odası deneyleri kan bankacılığı ve transfüzyon tıbbı bağlamında trombosit fonksiyonlarını incelemek için bir protokol mevcut. Standardizasyon çalışmaları 9,10,28-30 devam etmektedir ve bu tavsiyelerin çoğu sunulan protokolde yer almaktadır. kan sulandırma için bir modeldirtransfüzyon ancak ek doğrulama çalışmaları klinik sonuçlar alaka belirtmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| Pipette tips 100-1,000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Tube 5 ml | Simport | 11691380 | |
| Conical tube 15 ml | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in Figure S1 A as 'Biochip' |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing' |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in Figure S1 B as 'Pin' |
| Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4) |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
| 0.1 M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 |
References
- Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 25, 155-167 (2011).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, 1875-1885 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, 636-638 (1979).
- Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84, 289-297 (1996).
- Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets. 23, 501-509 (2012).
- Varga-Szabo, D., et al. The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction. J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).
- Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. Evaluation of hemostasis in flowing blood. Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).
- Heemskerk, J. W. M., et al. Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization. J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).
- Shrivastava, M. The platelet storage lesion. Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).
- Miyaji, R., et al. Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion. Transfusion. 44, 891-899 (2004).
- Goodrich, R. P., et al. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang. 90, 279-285 (2006).
- Van Aelst, B., et al. Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro. Vox Sang. 108, 328-339 (2015).
- Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro. Transfusion. , (2015).
- de Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. Dynamics of platelet thrombus formation. J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).
- Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients. Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).
- Neeves, K. B., et al. Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays. PloS one . 8, e54680 (2013).
- Born, G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature. 194, 927-929 (1962).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).
- Andre, P., et al. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis. Circulation. 108, 2697-2703 (2003).
- Casari, C., et al. von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3. J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).
- Gitz, E., et al. Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts. Haematologica. , (2012).
- Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering. Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future. J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).
- Zwaginga, J. J., et al. Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations. J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).
